CN1916637A - 单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法及其应用，属于药物残留检测领域。本发明以抗呋喃它酮单克隆抗体为介导建立呋喃它酮残留ELISA快速检测方法，可用于制作检测试剂盒和检测试纸条，可方便地对呋喃它酮残留量进行ELISA快速。该方法相对于液质联用色谱仪分析法，对样品的前处理要求较低，分析过程很简单，检测时间较短，而且检测灵敏度也较高，使用成本低。

Description

单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法及其应用

技术领域：

本发明属于药物残留检测领域。

背景技术：

硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗生素，它有非常好的抗菌作用和药理动力学特性，除了作为一种抗生素被应用于兽医医疗中外，它还曾作为猪、禽与水产品促生长的添加剂被广泛应用。但在长时间的实验室研究过程中发现，硝基呋喃类药物及其代谢产物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，鉴于此，欧盟分别于1993年(欧盟法令2901/93)与1995年(欧盟法令1442/95)立法禁止在动物源性食品生产加工过程中使用呋喃它酮(Furaltadone)、呋喃西林(Nitrofurazone)、呋喃咀啶(Nitrofurantoin)与呋喃唑酮(Furazolidone)等四种药物。其后，美国、加拿大、澳新与日本等国均全面禁止使用硝基呋喃类药物。2002年3月我国也将硝基呋喃类药物列为禁用兽药。研究证明，硝基呋喃类药物在动物体内若干小时就会迅速分解成硝基呋喃与各种代谢产物，这些代谢产物与组织内蛋白质形成较为稳定的化合物，该化合物可以在组织中存留较长时间，所以分析此类药物残留时应该对其代谢产物进行检测分析，欧盟等国就是以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃残留的目的。四种硝基呋喃类药物的代谢产物分别对应为：呋喃它酮-3-氨基-5-吗啉基-2-氧唑酮(AMOZ)；呋喃西林-氨基脲(SEM)；呋喃咀啶-1-氨基咀啶(AHD)；呋喃唑酮-3-氨基-2-氧唑酮(AOZ)。

随着我国加入世贸组织一年多以来，欧美日等发达国家利用自身技术优势对我国出口食品及农副产品不断设置新的技术壁垒措施，以达到限制我国食品与农副产品的出口，有关这方面的贸易纠纷接踵而来，欧盟早在2000年初就开始了一项长达42个月的FoodBRAND计划(QLK1-1999-00142)，其主要目的是要求欧盟各认可实验室对食品中硝基呋喃类残留检测方法(包括ELISA与LC-MS-MS方法)进行攻关研究，以为其设置技术壁垒提供技术支持。目前，欧盟规定不得在食品中检测出硝基呋喃类药物四种代谢产物残留，鉴于此，欧盟已研制出液质联用色谱仪检测硝基呋喃类代谢产物的分析方法。而我国原有检测方法仅是针对硝基呋喃类原药的，而且检测方法极为落后，已肯定不能满足出口的需求。

发明内容：

本发明的第一个目的是为人们提供一种呋喃它酮残留快速检测方法。

本发明以抗呋喃它酮单克隆抗体为介导建立呋喃它酮残留ELISA快速检测方法。

呋喃它酮残留的快速检测方法包括以下步骤：

1)将还原好的呋喃它酮与卵清蛋白重氮化法偶联合成抗原AMOZ-OVA；

2)将合成抗原AMOZ-OVA包被到酶标板；

3)以5％脱脂奶粉满孔封闭；

4)磷酸盐缓冲液洗涤，拍干；

5)将抗呋喃它酮单克隆抗体与AMOZ标准液在板外作用后加入到洗涤好的包被板上；

6)磷酸盐缓冲液洗涤，拍干；

7)加入酶标抗体，进行孵育；

8)磷酸盐缓冲液洗涤，拍干；

9)加入底物溶液；

10)加入终止液，终止反应；

11)测定OD_490nm值。

本发明利用免疫学原理制备针对呋喃它酮及其代谢产物呋喃它酮-3-氨基-5-吗啉基-2-氧唑酮(AMOZ)特异的单克隆抗体，建立酶联免疫吸附试验(ELISA)以检测呋喃它酮及其代谢产物呋喃它酮-3-氨基-5-吗啉基-2-氧唑酮(AMOZ)，相对于液质联用色谱仪分析法，其对样品的前处理要求较低，分析过程很简单，检测时间较短，而且检测灵敏度也较高，使用成本低，为我国畜禽产品进出口贸易中氨丙啉药物残留检测提供一种高效、简便的途径。

本发明的第二个目的是为上述单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法提供可方便操作的应用途径。

一种是用于制作呋喃它酮残留ELISA快速检测试剂盒。

检测呋喃它酮残留的试剂盒，包括：

1)包被有合成抗原AMOZ-OVA的聚苯乙烯酶标板；

2)浓缩稀释液；

3)浓缩洗液；

4)抗呋喃它酮单克隆抗体；

5)酶标抗体；

6)底物缓冲液；

7)底物；

8)终止液。

另一种是用于制作呋喃它酮残留ELISA快速检测试纸条。

呋喃它酮残留ELISA快速检测试纸条的制作方法是：

1)胶体金标记抗体：胶体金上标记纯化后的单克隆抗体；

2)喷金：将胶体金标记的抗体喷到玻璃纤维上，制成胶体金垫；

3)制作硝酸纤维素膜：将试纸条中T线和C线喷到硝酸纤维素膜上；

4)将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组装，然后切条。

试剂盒或试纸条分别是单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法的两种应用形式，可为人们快速检测提供方便。

具体实施方式：

(1)抗原合成

首先，还原呋喃它酮：将氨基取代呋喃它酮中的硝基，制成还原的呋喃它酮溶液。

抗原合成采用重氮化法进行偶联。取23mg亚硝酸钾溶于1ml蒸馏水中，以冰水浴调温度至0～5℃；还原好的呋喃它酮溶液，37℃水浴作用20分钟，上清液冷却至4℃左右，调PH值1-2，再缓慢加入亚硝酸钾溶液并不断搅拌，静置反应30min；将100mg的载体蛋白溶于4ml的磷酸盐缓冲液中，冷却至4℃左右，将重氮化药物缓慢加入并不断搅拌，为保持加入过程中PH的稳定，同时加入0.2mol/L NaOH，调PH值至7.4，4℃过夜反应；然后4℃PBS透析偶联后的产物72-96h，每6h换液一次，直至透析液中检测不出任何小分子物质；偶联后的产物以0.45μm滤膜过滤，-20℃分装保存。

(2)动物免疫

用合成的免疫抗原腹腔注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠。免疫程序如下：首免和二免按抗原50μg/只剂量，分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等体积混合(共0.3ml)免疫，免疫间隔期为10天，之后以100μg/只的剂量加强免疫，10天一次共免疫4次，融合前3天再追加免疫一次。

(3)杂交瘤筛选方法的建立

小鼠眼眶采血，分离血清后，将血清作1∶50和1∶100稀释。包被原AMOZ-OVA按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000稀释，之后倍比稀释至1∶64000。用方阵法建立非竞争性间接ELISA方法。ELISA反应程序如下：①AMOZ-OVA用包被缓冲液稀释至适当浓度，每孔100ul，4℃包被过夜，以PBST洗涤3次，每次3min。②用5％脱脂乳满孔封闭，37℃孵育2h，洗涤同上。③将阳性血清稀释后顺序加入，每孔100ul，每一稀释度的阳性血清同时设阴性对照，37℃孵育1h，洗涤同上。④用稀释液将酶标二抗稀释到适当的工作浓度，每孔加100ul，37℃孵育1h，洗涤同上。⑤每孔加新鲜配制的底物使用液100ul，37℃孵育30min。⑥每孔加2N H₂SO₄的终止液50ul。⑦测定OD值，以空白孔调零，以测定孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，判为阳性。

(4)细胞融合与筛选

最后一次免疫后第3天，无菌操作取小鼠的脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞融合。在45～60sec内加入1ml50％的PEG 4000，随即加入大量无血清的DMEM中止反应，静置离心后，用HAT培养液重悬，加入适量的饲养细胞，混匀后铺种于5块96孔细胞培养板，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。待细胞长至孔底的1/10或培养上清变黄时，用已建立的ELISA方法筛选。阳性细胞迅速扩大培养并采用有限稀释法进行亚克隆，并选择优良稳定者建立细胞株。获得能稳定分泌抗AMOZ抗体的杂交瘤细胞株，代号为AMOZ-D4E10。

杂交瘤细胞株AMOZ-D4E10已于2006年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No：1792。

(5)单克隆抗体(McAb)的腹水制备

取10周龄BALB/C小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油0.3ml/只，5-7天后腹腔注射阳性杂交瘤细胞10⁶个/只，待其腹部明显膨胀后抽取腹水，离心取上清冻存并测其效价。

(6)单抗效价测定

试验用品及试剂：ELISA板(包被抗原按1∶40稀释包被)

一抗：①腹水进行1∶500，1∶1000，1∶1 500，1∶2000，1∶2500，1∶3000，1∶3500，1∶4000，1∶4500，1∶5000稀释

②细胞上清  做如下倍比稀释：原液，1∶2，1∶4，…，1∶2048

二抗：羊抗鼠IgG

阳性判定标准：P≥2.1N

检测结果显示：腹水效价为1∶20000，细胞上清效价为1∶256

(7)单抗和包被抗原理想浓度的确定：

以方阵滴定法测定，最后选择OD_490nm值等于1.0左右的包被抗原和单抗的稀释倍数为理想工作浓度。经测定，抗原最佳包被量为0.75ug/孔，单抗最佳稀释倍数为1∶5000。

(8)按照呋喃它酮-3-氨基-5-吗啉基-2-氧唑酮(AMOZ)单克隆抗体介导的AMOZ残留检测方法的建立进行试剂盒的组装。

采用重氮化法进行偶联合成抗原AMOZ-OVA：

还原呋喃它酮：将氨基取代呋喃它酮中的硝基，制成还原的呋喃它酮溶液。

取23mg亚硝酸钾溶于1ml蒸馏水中，以冰水浴调温度至0～5℃；将还原好的呋喃它酮溶液置于37℃水浴作用20分钟，上清液冷却至4℃左右，调PH值1-2，再缓慢加入亚硝酸钾溶液并不断搅拌，静置反应30min；将100mg的卵清白蛋白(OVA)溶于4ml的磷酸盐缓冲液中，冷却至4℃左右，将重氮化药物缓慢加入并不断搅拌，为保持加入过程中PH的稳定，同时加入0.2mol/L NaOH，调PH值至7.4，4℃过夜反应；然后4℃PBS透析偶联后的产物72-96h，每6h换液一次，直至透析液中检测不出任何小分子物质；偶联后的产物，即合成抗原AMOZ-OVA以0.45μm滤膜过滤，-20℃分装保存。

以合成抗原(AMOZ-OVA)加入(包被)96孔酶标板，组装AMOZ-Kit。其主要组成为：8×12孔酶标板；10×浓缩稀释液(0.1M PBS-T，PH 7.2，含0.05％Tween-80，A号瓶)；10×浓缩洗涤液(0.1M PBS-T，PH 7.2，含0.05％Tween-80，B号瓶)；单抗(抗AMOZ单克隆抗体，C号指形管)；HRP标记兔抗鼠IgG(全分子)(D号指形管)；底物溶液(4.86mL 0.1M的柠檬酸溶液和5.14mL 0.2M的磷酸氢二钠溶液的混合液，E号瓶)；双氧水(30％的H₂O₂，G号瓶)；邻苯二胺(OPD片剂，F号指形管)；终止液(2N H₂SO₄，H号瓶)；标准液(蒸馏水溶解稀释的AMOZ标准品，N号指形管)；封板膜；使用说明书。

试剂盒中各组分的制备：

①包被有AMOZ-OVA的聚苯乙烯酶标板：用22mM的碳酸盐溶液将抗原作1∶5000倍稀释，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100μL，置4℃冰箱过夜；用洗液(PBST)洗涤3次，用封闭液(5％的脱脂奶粉)37℃湿盒封闭60分钟，洗液洗3次，干燥后即为反应板。

②浓缩稀释液(10×)：0.1M pH 7.2含0.5％Tween-80的磷酸盐缓冲液(PBST)。按常规法配制，4℃分装保存。

③浓缩洗液(10×)：0.1M pH 7.2含0.5％Tween-80的磷酸盐缓冲液(PBST)。按常规法配制，4℃分装保存。

④抗体：由本室制备，工作浓度为1∶2000，-70℃保存。

⑤酶标抗体：购自Sigma公司。工作浓度为1∶30000，-20℃保存。

⑥底物缓冲液：磷酸氢二钠14.2g，柠檬酸10.5g，加去离子水定容至500mL，分装4℃保存。

⑦底物溶液：在底物缓冲液中加入0.15％的30％的H₂O₂。

⑧终止液：0.2M硫酸溶液。

⑨底物片剂：邻苯二胺片剂。底物片剂在4℃避光保存1年以上应稳定、不变色，放入底物缓冲液中应在2-3分钟溶解。

(9)试纸条的组成及其成份制备

B、按照呋喃它酮-3-氨基-5-吗啉基-2-氧唑酮(AMOZ)单克隆抗体介导的AMOZ残留检测方法的建立进行试纸条的组装。

①胶体金标记抗体：将单克隆抗体纯化后按常规方法进行。具体方法：

a、取522nm胶体金溶液20ml恢复至室温，用1％碳酸钾调至PH8.2；

b、取抗呋喃它酮单克隆抗体12000rpm离心5min，按每毫升胶体金加1微克抗呋喃它酮单克隆抗体的比例，取总量为20微克的抗呋喃它酮单克隆抗体，用PB稀释到1ml体积；

c、将稀释后的抗呋喃它酮单克隆抗体缓慢地逐滴加入到磁力搅拌状态下的胶体金溶液中，室温下搅拌30min；

d、逐滴加入1ml10％BSA至终浓度为0.5％，磁力搅拌30min；

e、置4℃冰箱内2小时，然后8800rpm离心min，尽可能小心吸弃上清，用含0.5％BSA和0.2％PEG20000的磷酸盐缓冲液悬浮收集沉淀物，至最后体积为1ml，4℃冰箱保存备用。

②喷金：将胶体金标记的抗体喷到玻璃纤维上，制成胶体金垫；

③喷膜：将试纸条中T线和C线喷到硝酸纤维素膜上；

④将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸按常规方法进行组装，然后切条。

(10)灵敏度实验

将AMOZ用超纯水溶解、稀释，与等体积的单抗同时加入ELISA板中。

1.将包被抗原以稀释液稀释成一定浓度，100μl/孔，4℃过夜；

2.磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤1遍；

3.以5％脱脂奶粉满孔封闭，并尽量排除孔中可能产生的贴壁气泡，37℃水浴作用1h或4℃过夜。

4.PBST洗涤3遍，每次3～5分钟，洗后于吸水纸上拍干；

5.将AMOZ标准品与单抗等体积混合后加入板中，37℃水浴作用1h；

6.PBST洗涤3遍，每次3～5分钟，洗后于吸水纸上拍干；

7.加入HRP标记羊抗鼠IgG(1∶5000，in PBS)，100μl/孔，37℃水浴作用1h；

8.PBST洗涤4遍，每次3～5分钟，洗后于吸水纸上拍干；

9.加入新鲜配置的邻苯二胺(OPD)底物溶液，100μl/孔，37℃水浴作用30min；

10.加入2M浓硫酸终止显色反应；

11.用酶联免疫阅读仪测定OD_490nm值。

实验结果表明：本试剂盒灵敏度10μg/kg以下，且较稳定。

(11)临床样品检测

①检测样品的处理

采集肝、肾、肌肉、蛋黄、牛脂肪等组织，按一定比例加水进行研磨、离心处理。

②测定方法

A、呋喃它酮残留快速检测试剂盒的操作方法及结果分析：

使用前取B瓶液(浓缩洗涤液)按1∶10用蒸馏水稀释至工作浓度为洗涤液；C管液100μL用A液1∶100稀释待用；D管液100μL用A液1∶100稀释待用；N管液用A液作系列梯度稀释待用。按下表格式，先将样品与单抗在板外37℃水浴作用1hr，再整体移到ELISA板上，37℃水浴45min(A1、A2孔只加入稀释液100μL，不加单抗)。弃去孔内液体，每孔加入洗涤液至满孔，弃去洗涤液，于吸水纸上拍干，重复洗涤5遍。洗涤后立即在每孔中加入稀释好的D液100μL，置37℃水浴1hr。弃去孔内液体，每孔加入洗涤液至满孔，放置2min，弃去洗涤液，于吸水纸上拍干，重复洗涤5遍。将F管中片剂(2片)溶于10mL底物缓冲液(E液)，完全溶解后，加入30ul G液混匀后每孔加入100μL，37℃避光显色30min。显色结束，每孔加50μL的H液；以A1孔为调零孔，用酶标仪测定样品的OD490值。

结果判定标准：

加入H液后各孔颜色由黄色变为橙红色，用酶标仪测定在490nm波长处每孔的光吸收值(OD值)，分别计算出每份被检样品孔、标准品的平均OD值，利用下列公式求出OD比值。

若OD比值小于15％，判定为“-”；OD比值在16-20％，判定为“±”；OD比值介于21-40％，判定为“+”；OD比值介于41-60％，判定为“++”；OD比值大于60％，判定为“+++”。

若需要，可以各标准品孔的浓度为横坐标，以各自的吸光值为纵坐标，作标准曲线。求出回归方程，将各样品的吸光值带入方程即可求出残留量。

B、呋喃它酮残留胶体金快速诊断试纸条应用与判定：

将样品处理液与试纸条样品垫充分浸透，样品液向膜的方向进行扩散，如果T线和C线同时出现，则待检样品判为阴性，如果仅出现T线，则待检样品判为阳性。

Claims (6)

1、单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法，其特征在于以抗呋喃它酮单克隆抗体为介导建立呋喃它酮残留ELISA快速检测方法。

2、根据权利要求1所述单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将还原好的呋喃它酮与卵清蛋白重氮化法偶联合成抗原AMOZ-OVA；

2)将合成抗原AMOZ-OVA包被到酶标板；

3)以5％脱脂奶粉满孔封闭；

4)磷酸盐缓冲液洗涤，拍干；

5)将抗呋喃它酮单克隆抗体与AMOZ标准液在板外作用后加入到洗涤好的包被板上；

6)磷酸盐缓冲液洗涤，拍干；

7)加入酶标抗体，进行孵育；

8)磷酸盐缓冲液洗涤，拍干；

9)加入底物溶液；

10)加入终止液，终止反应；

11)测定OD_490nm值。

3、如权利要求1所述单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法的应用，其特征在于用于制作呋喃它酮残留ELISA快速检测试剂盒。

4、根据权利要求3所述单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法的应用，其特征在于呋喃它酮残留ELISA快速检测试剂盒包括：

1)包被有合成抗原AMOZ-OVA的聚苯乙烯酶标板；

2)浓缩稀释液；

3)浓缩洗液；

4)抗呋喃它酮单克隆抗体；

5)酶标抗体；

6)底物缓冲液；

7)底物；

8)终止液。

5、如权利要求1所述单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法的应用，其特征在于用于制作呋喃它酮残留ELISA快速检测试纸条。

6、根据权利要求5所述单克隆抗体介导的呋喃它酮残留检测方法的应用，其特征在于呋喃它酮残留ELISA快速检测试纸条的制作方法是：

1)胶体金标记抗体：胶体金上标记纯化后的单克隆抗体；

2)喷金：将胶体金标记的抗体喷到玻璃纤维上，制成胶体金垫；

3)制作硝酸纤维素膜：将试纸条中T线和C线喷到硝酸纤维素膜上；

4)将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组装，然后切条。