CN113543882A - 捕获流测定装置和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种装置，其至少包括区段1、区段2、区段3和区段4，其中区段2联结到区段1，区段3联结到区段2并且包括用分析物或其等同物官能化的表面，区段4联结到区段3，并且区段1、区段2、区段3和区段4沿水平轴布置并处于流体连通，允许从区段1贯穿所有部分横向流动到区段4。还公开了用于确定样品中分析物的存在并对其定量的试剂盒和方法。

Description

捕获流测定装置和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年12月31日提交的名称为“捕获流测定装置和方法”的美国临时专利申请号62/786,611的优先权权益，其内容通过引用以其整体全部并入本文。
技术领域
本发明属于用于测试生物样品的结合测定方法和设备领域。
背景技术
在过去的几年里，需要更贴近患者提供护理，因此需要开发可以在传统实验室之外进行的测试方法。
可以使用护理点测试(POCT)装置进行的测试已大大扩展。仍然需要改进以使装置更易于使用、更不容易出错、更紧凑或更小。此外，有些领域需要新技术以便提供所需的分析性能。传染病是现有技术不够灵敏的这类领域之一。此外，POCT领域还缺少定量技术。
发明内容
在一些实施方式中，本发明涉及横向流装置。在一些实施方式中，该装置是护理点测试装置。
根据本发明的一个方面，提供了一种装置，其包括区段1、区段2、区段3和区段4，其中区段2联结到区段1；区段3联结到区段2并且联结到区段4，区段3包括用分析物或其等同物官能化的表面；区段1至4沿水平轴布置并处于流体连通，允许流体从区段1通过区段2和区段3横向流动到区段4。
在一个实施方式中，区段1包括样品收集表面；区段2包括含有对分析物具有特异性亲和力的识别分子的表面，其中识别分子与报告分子连接，并且其中报告分子产生触发物(trigger)；并且区段4包括与底物分子接触的表面，其响应于触发物而产生信号。
在一个实施方式中，装置进一步包括设置在区段2和区段3之间的校准区域，其中校准区域包括与底物分子接触的表面。
在一个实施方式中，该装置进一步包括联结到区段4并与区段4流体连通的区段5。
在一个实施方式中，联结是接触或部分重叠的。
在一个实施方式中，触发物包括以下中的至少一种：反应性化合物、电磁辐射和带电颗粒或其组合。
在一个实施方式中，区段3没有识别分子和报告分子。
在一个实施方式中，区段2中的识别分子和区段3中的分析物的浓度在0.01μg/mL至100mg/mL的范围内。
在一个实施方式中，报告分子选自酶、发光化合物、荧光化合物、磁性颗粒、电化学活性化合物。
在一个实施方式中，至少三个区段沿着一个或多个平面设置。
在一个实施方式中，两个连续的区段沿着一个或多个平面设置。
在一个实施方式中，所有区段都沿相同平面设置。
在一个实施方式中，重叠在区段总表面的0.01％至99％的范围内。
在一个实施方式中，装置进一步包括与装置可操作连通(通信，communication)的检测单元，并且其中该检测单元配置为检测信号。
在一个实施方式中，检测单元包括选自以下的元件：有源像素传感器(APS)、电极、具有有源像素传感器的激发源或其任意组合。
在一个实施方式中，分析物或其等同物选自病毒、蛋白质、生物细胞、毒素和病原体、药品和药物。
在一个实施方式中，样品选自水、血液、尿液、汗液、唾液和血清。
根据本发明的另一方面，提供了用于确定样品中分析物存在的方法，其包括：将样品与本发明的装置接触；并且检测信号的存在，从而确定样品中分析物的存在。
在一个实施方式中，区段1包括样品收集表面；区段2包括沉积有识别分子的表面，该识别分子对与报告分子连接的分析物具有特异性亲和力，其中报告分子产生化学和/或电学和/或物理可检测反应；区段4包括沉积有底物的表面；并且区段5包括可用于容纳过量样品的表面。
在一个实施方式中，装置进一步包括放置在区段2和区段3之间的包含底物的校准区域。
在一个实施方式中，样品从区段1扩散到区段5。
在一个实施方式中，提供了用于对样品中分析物的量进行定量的方法，其进一步包括对校准区域中的信号量进行定量；并将校准区域的信号强度数据与区段4的信号强度数据相关联。
在一个实施方式中，提供了用于诊断传染病的方法。
根据本发明的另一方面，提供了一种试剂盒，其包括：区段1、区段2、区段3和区段4；分析物或其等同物；对与报告分子连接的分析物具有特异性亲和力的识别分子，其中报告分子产生化学和/或电学和/或物理可检测反应；并且底物在报告分子的存在下反应。
在一个实施方式中，试剂盒进一步包括用于用报告分子沉积区段2、用分析物沉积区段3以及用底物沉积区段4的说明。
根据本发明的一个方面，提供了一种试剂盒，其包括：包括样品收集表面的区段1，包括沉积有识别分子的表面的区段2，该识别分子对与报告分子连接的分析物具有特异性亲和力，其中报告分子产生化学和/或电学和/或物理可检测反应；用分析物官能化的区段3；包括沉积有底物的表面的区段4；以及包括可用于容纳过量样品的表面的区段5。
在一个实施方式中，试剂盒进一步包括校准区域。
在一个实施方式中，试剂盒进一步包括用于将区段1、区段2、校准区域、区段3、区段4和区段5沿水平轴布置并处于流体连通，允许从区段1贯穿所有区段横向流动到区段5的说明。
在一个实施方式中，试剂盒进一步包括样品收集仪器。
在一个实施方式中，试剂盒包括至少两个区段4，每个区段包括不同的底物。
在一个实施方式中，底物中的至少一种包括有源像素传感器(APS)、电极或具有有源像素传感器(APS)的激发装置。
在一个实施方式中，提供了用于诊断传染病的试剂盒。
除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实施方式的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料，但下文描述了示例性方法和/或材料。在冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不旨在是必须限制性的。
根据下文给出的详细描述，本发明的进一步实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应当理解，详细说明和具体实例虽然表明了本发明的优选实施方式，但仅以说明的方式给出，因为本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将由该详细描述而变得显而易见。
附图说明
图1是根据本发明的一些实施方式的捕获流装置的透视图简化图解。
图2A-B是根据本发明的一些实施方式的在测定测量期间捕获流装置如何工作的透视图简化图解；样品中存在分析物(图2A)，样品中不存在分析物(图2B)；
图3是根据本发明的一些实施方式的包括校准区域的装置的透视图简化图解。
图4A-B是在其中分析物存在于样品中(图4A)和其中分析物不存在于样品中(图4B)的根据本发明的一些实施方式的测定测量期间包括校准区域的装置如何工作的透视图简化图解；
图5是根据本发明的一些实施方式的包括区段5的装置的透视图简化图解。
图6A-B是基于荧光信号(图6A)和基于电化学或磁信号(图6B)的装置的透视图简化图解；当样品通过设置迁移时，它会与沿流路的区段中的试剂相互作用。在分析物存在于样品中的情况下(阳性)，它将附接至识别分子，并作为分析物-识别-报告复合物穿过捕获层，到达第二个测量区段，在该第二个测量区段激发装置将激发报告颗粒，并且光电检测器将在迁移穿过该区段到达用作用于样品吸收的储器的最后区段期间测量受激颗粒的存在(图6A)，或者电极将在迁移穿过该区段到达用作用于样品吸收的储器的最后区段期间测量电活性或磁性报告分子的存在(图6B)。在样品中不存在分析物的情况下(阴性)，识别-报告分子将被捕获层中的预固定化分析物样分子捕获，从而防止第二含底物区段中出现假信号。在这两种情况下，从第二区段释放的所有识别-报告分子将在区段2和区段3之间的校准线中、在含有激发和光电检测装置(图6A)或包括电极(图6B)的第一测量区段中记录其活性。计算两个测量区段之间的比率以确定产生并到达最后区段的分析物-识别-报告复合物的量。当设置中的流速恒定时，信号区段之间的比率将在0和1之间；
图7是固定化NS1浓度对阻滞剂(blocker)捕获潜能的影响的条形图。从左到右，阻滞剂与增加的NS1浓度(分别为0、100、500、1000、1500、2000ng mL-1)进行O.N.孵育，n＝4；
图8A-B呈现了抗体浓度对信号分辨率的影响；使用CCD相机拍摄的照片(图8A)和使用imageJ生成的信号的数值表示，n＝3(图8B)；
图9A-B是条形图，其显示了设置对加标NS1的样品的响应(图9A)，以及使用ELISA对不同NS1浓度的化学发光测试(图9B)；和
图10A-B呈现了对加标60ng mL-1的NS1的血清样品的设置响应；使用CCD相机拍摄的图片图像(图10A)，和使用InageJ软件的数值分析(图10B)。
图11显示了表示装置对阳性样本和阴性样本的响应的条形图。左两列表示在吸收垫处测量的绝对响应值，右两列显示归一化值，其计算为在吸收垫处测量的绝对响应值与在校准线处测量的响应绝对响应值的比率。
具体实施方式
在一些实施方式中，本发明涉及横向流装置。在一些实施方式中，装置是护理点测试装置。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种装置，其至少包括区段1、区段2、区段3和区段4，其中区段2联结到区段1，区段3联结到区段2并且包括用分析物或其等同物官能化的表面，区段4联结到区段3，并且区段1、区段2、区段3和区段4沿着水平轴布置并且流体连通，允许从区段1贯穿所有区段横向流动到达区段4。在一些实施方式中，区段1、区段2、区段3和区段4沿水平轴布置，其中后续区段处于流体连通或被并联结以允许从区段1贯穿所有区段横向流动到区段4。
在一些实施方式中，本文使用的术语“联结(couple)”包括接触或流体连通。在一些实施方式中，区段1包括样品收集表面。在一些实施方式中，区段2包括含有识别分子的表面，该识别分子对与报告分子连接的分析物具有特异性亲和力，其中信号分子产生化学和/或物理可检测反应。在一些实施方式中，区段4包括包含底物分子的表面。
在一些实施方式中，区段2包括与对分析物具有特异性亲和力的识别分子接触的表面，其中识别分子与报告分子连接或结合，并且其中报告分子产生触发物。在一些实施方式中，区段4包括与底物分子接触的表面，其中底物分子响应于报告分子产生的触发物而产生信号。
在一些实施方式中，根据本发明的装置进一步包括校准区域。在一些实施方式中，根据本发明的装置进一步包括设置在区段2和区段3之间的校准区域，并且其中校准区域与底物分子接触。在一些实施方式中，区段4的底物分子和校准区域的底物分子是相同的。
在一些实施方式中，根据本发明的装置进一步包括联结到区段4和/或与区段4流体连通的区段5。
在一些实施方式中，区段1、区段2、区段3、区段4和区段5部分重叠。在一些实施方式中，区段1、区段2、区段3、区段4和区段5部分重叠，其中重叠占区段总表面的0.01％至99％、0.01％至95％、0.01％至90％、1％至90％、0.01％至1％、1％至80％、1％至70％、1％至60％、1％至50％、1％至40％、1％至30％、1％至20％、1％至10％、1％至5％、5％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％。
在一些实施方式中，术语“流体连通”、“接触”和“联结”在本文中可互换使用。根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种装置，其包括(i)包含样品收集表面的区段1，(ii)包含含有对与报告分子连接的分析物或其等同物具有特异性亲和力的识别分子的表面的区段2，其中信号分子产生化学和/或物理可检测反应，(iii)包含用分析物或其等同物官能化的表面的区段3，(iv)包含具有在其上沉积底物分子的表面的区段4，和(v)包括可用于容纳过量样品的表面的区段5，其中区段1、2、3、4和5沿水平轴布置并处于流体连通，允许从区段1贯穿整个区段横向流动到区段5。
在一些实施方式中，提供了用于确定样品中分析物的量的装置。在一些实施方式中，提供了用于对样品中分析物的量进行定量的装置。在一些实施方式中，提供了用于对样品中分析物的量进行确定和定量的装置。在一些实施方式中，定量是相对的或绝对的。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了横向流装置。在一些实施方式中，根据本发明的装置是护理点测试装置。
如本文所用，术语“护理点测试”是指可以在快速时间框架内完成使得所得的测试比不采用该系统的可比较测试更快执行的实时诊断测试。它可以在医生办公室、床边、统计实验室、急诊室、救护车或家中和其他类似场所进行，特别是在需要快速和准确结果的地方进行。患者可以在场，但这种在场不是必需的。护理点包括但不限于：急诊室、手术室、医院实验室和其他临床实验室、医生办公室、现场或任何需要快速且准确结果的情况。
如本文所用，术语“横向流装置”是指包括能够将分析物和试剂输送到预选位点的吸水或非吸水基质的装置。许多这种装置是已知的，其中条带由吸水材料制成，比如硝化纤维、纸、纤维素和其他吸水材料。横向流动中使用的测试条是如此条，其中怀疑含有分析物的测试样品流过该条到达其中分析物(如果存在)与检测试剂相互作用的检测区以指示分析物的存在、不存在和/或量。
如本文所用，术语“分析物”是指可能存在于测试样品中的待检测物质。分析物可以是任何物质，对于其存在天然存在的特异性结合成员(比如抗体或适体、DNA等)，或者可以为其制备特异性结合成员。因此，分析物是可以在测定中与一个或多个特异性结合成员结合的物质。“分析物”还包括任何抗原物质、半抗原、抗体及其组合。作为特异性结合对的成员，分析物可以通过天然存在的特异性结合配偶体(对)的方式进行检测。应当理解，本发明可以配置用于检测广泛的分析物，其包括治疗药物、滥用的药物、激素、维生素、蛋白质(包括所有类别的抗体)、肽、氨基酸、类固醇、细菌、酵母、霉菌、病毒、寄生虫、细菌的成分或产物、真菌、所有类型的过敏原、所有类型的抗原、正常或恶性细胞的产物或成分等。
在一些实施方式中，分析物包括病毒。在一些实施方式中，分析物包括蛋白质。在一些实施方式中，分析物包括生物细胞。在一些实施方式中，分析物包括毒素和病原体。在一些实施方式中，分析物包括药品和药物。
如本文所用，术语“样品”以其最广泛的含义使用。如本文所用，“生物样品”包括，但不限于，来自活体或先前活体的任何量的物质(分析物分子)，其可溶解在任选地含有表面活性剂或去污剂的第一提取缓冲液中。这种活体包括，但不限于，哺乳动物、人类、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其他动物；植物；单细胞生物，比如酵母、细菌和病毒。这种物质包括，但不限于，例如，来自切除的组织或活检样品的生理液体、血液(例如全血)、血浆、血清、尿液、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾脏；和例如，通过离心从任何体液收集的细胞；以及原代和永生化细胞和细胞系。样品可以包括新鲜样品和历史样品。然而，术语“样本”还包括环境样品，比如水样或各种项目的涂片测试。如本文所用，“基于细胞的样品”被理解为这样的样品，其中基本上所有(例如，至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)的存在于用于检测的样品中的分析物分子存在于样品的细胞内(即，不在血清、细胞外液、细胞培养基中)。在优选实施方式中，样品是液体样品。
在一些实施方式中，样品选自水、血液、尿液、汗液、唾液和血清。在一些实施方式中，生物样品从动物(包括哺乳动物)获得。在另一个实施方式中，生物样品从人类获得。在另一个实施方式中，在本领域技术人员的能力范围内获得生物样品。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了利用特异性结合成员(识别元件)的装置。如本文所用，术语“特异性结合成员”是指特异性结合对的成员。即，两个不同的分子，其中一个分子通过化学或物理方式与第二个分子特异性地结合。因此，除了常见免疫测定的抗原和抗体特异性结合对之外，其他特异性结合对可以包括生物素和抗生物素蛋白、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、效应子和受体分子、辅因子和酶、酶抑制剂和酶、适体等。此外，特异性结合对可以包括为原始特异性结合成员的类似物的成员，例如，分析物-类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、抗原片段、抗体和抗体片段——单克隆和多克隆的、蛋白质亚基及其复合物，其包括由重组DNA分子形成的那些。
如本文所用，术语“底物分子”是指与报告分子特异性相互作用的分子。“特异性相互作用”是指底物分子基本上表现出结构或物理变化，导致产生可测量的物理信号。
如本文所用，术语“特异性”是指结合部分相对于不同抗原优先结合一种分析物分子的能力，并不一定意味着高亲和力(如本文所进一步限定)。可以与特定分析物分子特异性结合和/或对特定分析物分子具有亲和力的结合部分被称为“针对(against或directedagainst)”抗原或抗原决定簇。如果根据本发明的识别分子对这两种不同的分析物分子都具有特异性，则称其对两种不同的分析物分子是“交叉反应性的”。
如本文所用，术语“亲和力”是指识别分子与分析物分子结合从而将游离分析物分子的平衡向存在通过其结合形成的复合物的方向移动的程度。因此，例如，当分析物分子和识别分子以相对相等的浓度结合时，高亲和力的识别分子将与可用的分析物分子结合，从而使平衡向所得复合物的高浓度移动。解离常数(Kd)通常用于描述识别分子与其靶标之间的亲和力。在一些实施方式中，解离常数低于10-3M。在一些实施方式中，解离常数低于10- 2M。在一些实施方式中，解离常数低于10-4M。在一些实施方式中，解离常数低于10-5M。在一些实施方式中，解离常数低于10-6M。在一些实施方式中，解离常数低于10-7M。在一些实施方式中，解离常数低于10-8M。在一些实施方式中，解离常数低于10-9M。
如本文所用，术语“特异性地结合”和“特异性结合”是指结合结构域优先结合存在于不同分子的均质混合物中的特定分析物分子的能力。在一些实施方式中，特异性结合相互作用将区分样品中期望的分子和不期望的分子，在一些实施方式中，超过约2至100倍或更多(例如，超过约1000倍或10,000倍)。
如本文和权利要求中所用，术语“官能化表面”是指制品的表面，该表面已被修饰使得一个或多个分子或官能团存在于其上。在一些实施方式中，多个分子或官能团结合到官能化表面。处理方式取决于，例如，待合成的化合物的性质以及表面的性质和组成。
如本文所用，术语“表面”是指制成区段的材料。在一些实施方式中，表面是指外表面。根据本发明，多种材料可用作表面。材料包括可以作为目标分子附接的载体的任何材料。这种材料是本领域技术人员已知的。这些材料包括，但不限于，有机或无机聚合物、天然和合成聚合物，其包括，但不限于琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、其他纤维素衍生物、葡聚糖、葡聚糖衍生物和葡聚糖共聚物、其他多糖、玻璃、硅胶、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、人造丝、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺、乙烯基聚合物、聚乙烯醇、聚苯乙烯和聚苯乙烯共聚物、与二乙烯基苯或类似物交联的聚苯乙烯、丙烯酸树脂、丙烯酸酯和丙烯酸、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺共混物、乙烯基和丙烯酰胺的共聚物、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯衍生物和共聚物、具有各种官能团的其他聚合物和共聚物、乳胶、丁基橡胶和其他合成橡胶、硅、玻璃、纸、天然海绵、不溶性蛋白质、表面活性剂、红细胞、金属、非金属,磁性材料或其他商业上可获得的介质。在一些实施方式中，表面包含吸水材料，如上文所述。
装置和测定
参考图1，图1是根据本发明的一些实施方式的装置100的一些部件的简化图解。
根据本发明的一些实施方式，区段1 110、区段2 120、区段3 130和区段4 150沿水平轴布置并且流体连通，允许从区段1贯穿所有区段横向流动到区段4。
在一些实施方式中，区段1 110、区段2 120、区段3 130和区段4 150彼此接触，以允许从区段1贯穿所区段到横向流动区段4。
在一些实施方式中，区段1 110、区段2 120、区段3 130和区段4 150部分重叠。在一些实施方式中，重叠在区段总表面的0.01％至99％的范围内。在一些实施方式中，重叠在区段总表面的0.05％至99％、0.1％至99％、0.1％至90％、0.1％至80％、0.1％至70％、0.1％至60％、0.1％至50％、0.1％至40％、0.1％至30％、0.1％至29％、0.1％至10％或0.1％至5％的范围内，包括其间的任何范围。在一些实施方式中，区段1在区段2上方部分重叠。在一些实施方式中，区段1与区段2下方部分重叠。在一些实施方式中，区段2与区段3下方部分重叠。在一些实施方式中，区段2在区段3上方部分重叠。在一些实施方式中，区段3在区段4上方部分重叠。在一些实施方式中，区段3与区段4下方部分重叠。
在一些实施方式中，根据本发明的装置的至少三个区段沿着一个以上的平面设置。在一些实施方式中，两个连续的区段沿着一个或多个平面设置。在一些实施方式中，区段1 110、区段2 120、区段3 130和区段4 150共享至少一个平面。在一些实施方式中，所有区段沿相同平面设置。
根据本发明的一些实施方式，区段1 110、区段2 120、区段3 130和区段4 150用作不同组分被吸附或固定(比如，结合)到其上的固体载体。在一些实施方式中，区段2 120、区段3 130和区段4 150包括与组分(比如，底物分子、识别分子或分析物)接触或结合的表面，其中表面如上文所述。在一些实施方式中，区段2 120上的组分包括吸附、接触或结合到该区段的识别分子(比如，免疫试剂)。在一些实施方式中，区段2 120上的组分包括吸附到该区段的识别分子。区段3 130上的组分包括免疫试剂并且被吸附或共价固定(例如，共价结合)到该区段。在一些实施方式中，不同的组分在区段组装之前被固定。在一些实施方式中，不同的组分在区段组装之后被固定。
在一些实施方式中，区段1 110包括样品收集表面112，区段2 120包括含有识别-报告分子复合物124的表面，区段3包括用分析物132官能化的表面，和区段4 150包括其上沉积有底物分子142的表面。在一些实施方式中，区段3 130包括校准区域140。在一些实施方式中，区段3 130进一步包括校准区域140，该校准区域140包括邻近区段2 120放置的底物分子。
在一些实施方式中，区段1 110、区段2 120、区段3 130和区段4 150包括膜。在一些实施方式中，膜包含聚酯。在一些实施方式中，膜包含纤维素。
如本文所用，术语“膜”是指边界、层、屏障或材料，其可以是可渗透的或可以是不可渗透的。术语“膜”可以进一步指界面。在一些实施方式中，术语“膜”和“表面”在本文中可互换使用。除非另有说明，否则膜可以采用固体、液体或凝胶的形式，并且可以具有或不具有独特的晶格、非交联结构或交联结构。在一些实施方式中，膜是纤维膜。
在一些实施方式中，区段1 110、区段2 120、区段3 130和区段4 150包括基质。该基质限定了横向流动路径。在一些实施方式中，该路径是微流体路径。在一些实施方式中，流动路径是轴向的，并且流动是单向导向的。在一些实施方式中，流动方向在区段1的下游。如本文所用，术语“下游”是指施加到样品收集表面的流体将流向的位置，该位置与区段1的方向相反。在一些实施方式中，液体样品的溶解或分散的组分以基本相等的速率被携带并且相对未受损地横向流动通过基质。在一些实施方式中，本文所用的横向流动是指毛细管流动。在一些实施方式中，横向流动由毛细作用产生。在一些实施方式中，液体样品的溶解或分散的组分由添加的PVA膜和其他表面活性材料或离子缓冲力调节。
可用于根据本发明的装置的典型基质材料包括高密度聚乙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙酸乙烯酯和氯乙烯的共聚物、聚酰胺、聚碳酸酯、尼龙、玻璃纤维、奥龙、聚酯、聚苯乙烯、棉、纤维素等，或共混物。用于本发明的膜的最佳孔径为约20μm至约140μm。根据本发明也可以使用其他材料，比如未处理的纸、硝化纤维素、衍生尼龙、纤维素等。
在一些实施方式中，基质或膜包括亲水材料。在一些实施方式中，亲水材料是亲水聚合物。在一些实施方式中，基质或膜包含可被水溶液润湿的聚合物。
现在参考图2，其是根据本发明的一些实施方式的在测定测量期间装置100如何工作的简化图解。在一些实施方式中，装置包括具有样品收集表面112的区段1 110、包含具有与报告分子连接的识别分子124的表面的区段2 120、包含用分析物132官能化的表面的区段3和包括具有沉积的底物分子142的表面的区段4 150。
在测量期间可能发生两种主要的可能性。第一种可能性如图2A所示。在一些实施方式中，具有目标分析物132的液体样品被放置在区段1 110中。样品通过横向流动迁移到区段2 120，在那里其遇到识别分子124。基于分子识别(比如，识别分子与分析物之间的基于亲和力的相互作用或结合)形成复合物214，其中复合物214包括与识别分子124结合或接触的分析物132，并且其中识别分子124与报告分子结合，产生触发物。形成的分析物-识别-报告分子复合物214通过横向流动继续迁移到包含分析物132的区段3 130。由于分析物-识别分子复合物214已经形成，复合物214不能固定在区段3 130中，并且将继续并迁移到区段4 150，该区段4 150包括具有沉积的底物分子142的表面。在此，复合物214或由报告分子产生的触发物将与底物分子142相互作用。形成的相互作用218将导致反应，从而产生信号220，并以绝对方式确认样品中分析物的存在。信号生成的类型将取决于与报告分子缀合的所使用的报告分子和沉积在区段4 150中的底物分子。
现在参考图2B。在一些实施方式中，在没有目标分析物132的样品的情况下，样品通过横向流动从区段2 120迁移，在区段2 120它遇到识别分子124。然后，报告分子将与样品未结合地迁移到区段3 130，在那里它们将与分析物132连接，形成复合物214并停止进一步迁移到下一个区段4 150，因此在区段4 150将观察不到可见信号(如图2B中的叉号222所示例)。
在一些实施方式中，区段1 110、区段2 120、区段3 130和区段4 150以如此方式布置，使得区段3 130能够接收分析物-识别-报告分子复合物214和过量的游离报告分子124二者，并且区段4 150部分仅能够接收分析物-识别-报告分子复合物214。在一些实施方式中，位于区段2 120和区段4 150之间的包括分析物132的区段3 130确保仅分析物-识别-报告分子复合物214迁移到区段4 150。
在一些实施方式中，区段1 110、区段2 120、区段3 130和区段4 150处于流体连通，允许从区段1到区段2、从区段2到区段3以及从区段3到区段4的横向流动。
校准区域
在一些实施方式中，根据本发明的装置进一步包括校准区域。
在一些实施方式中，根据本发明的装置进一步包括位于区段2和区段3之间并且包括底物的校准区域。在一些实施方式中，校准区域与区段2和区段3流体连通或联结。
现在参考图3，它是根据本发明的一些实施方式的包括校准区域300的根据本发明的装置100的简化图解。
在一些实施方式中，包括底物分子142的校准区域300与区段2 120邻近放置。在一些实施方式中，校准区域300与区段2 120流体连通或联结。
根据本发明的一些实施方式，在包括校准区域300的装置100中的测量期间可能发生两种主要可能性。
第一种可能性如图4A所示。在一些实施方式中，具有目标分析物132的液体样品被放置在区段1 110中。样品通过横向流动迁移到区段2 120，在区段2 120处其遇到识别分子124。基于分子识别形成复合物214。形成的分析物-识别-报告分子复合物214通过横向流动继续迁移到包含底物分子142的校准区域300。当被分析物-识别-报告分子复合物214中的报告分子和如果存在的话，识别-报道分子复合物124中的报告分子氧化时，底物分子142能够产生第一信号400，从而表明进入区段3 130的报告分子124和报告的分子214的适当功能和总量。产生的信号400也可用于信号校准。信号校准可以通过测量(使用光电检测器、手机、恒电位仪(电化学信号、荧光测量装置、相机))并将信号强度与进入区段3 130的识别-报告的分子复合物的浓度相关联来完成。
形成的分析物-识别-报告分子复合物214在横向流动中继续，不能结合至固定在区段3130中的分析物132，因此将继续并迁移到区段4 150，该区段4 150包括具有沉积的底物分子的表面142。含有报告分子的复合物氧化底物分子，从而触发反应并产生第二信号220。信号产生的类型取决于所使用的信号分子(报告分子和底物分子)。
现在参考图4B。在一些实施方式中，在没有目标分析物132的样品的情况下，样品经由横向流动从区段2 120迁移，在区段2 120它遇到识别-报告分子124。然后，识别-报告分子将与样品未结合地迁移到本文所述的校准区域300。同样在这种情况下，会产生信号400，从而表明识别-报告分子124的正确功能和数量。识别-报告分子将继续迁移到区段3130，在那里它们将与分析物132连接并停止进一步迁移到下一个区段4 150，因此在区段4150将观察不到可见信号(如在图4B由信号222上的叉号示例的)。
在一些实施方式中，校准区域300被设计为接收分析物-识别-报告分子复合物214和过量的游离识别-报告分子124二者。在一些实施方式中，校准区域300被设计为接收由报告分子产生的触发物，以形成可检测信号。在一些实施方式中，区段4 150被设计为仅接收分析物-识别-报告分子复合物214。在一些实施方式中，区段4 150被设计为仅接收由报告分子产生的触发物。在一些实施方式中，区段4 150被设计为仅接收识别-报告分子复合物124。
在一些实施方式中，区段1 110、区段2 120、区段3 130和区段4 150以如此方式布置，使得区段3 130能够接收分析物-识别-报告分子复合物214或触发物和过量的游离识别-报告分子124，并且区段4 150仅能够接收分析物-识别-报告分子复合物214或触发物。在一些实施方式中，位于区段2 120和区段4 150之间的包含分析物132的区段3 130确保仅分析物-识别-报告分子复合物214或触发物迁移到区段4 150。
在一些实施方式中，区段1 110、区段2 120、区段3 130和区段4 150流体连通。
在一些实施方式中，如本文所述的装置包括包含底物分子的校准区域，其中该校准区域邻近区段2放置。在一些实施方式中，本文所述的装置包括放置在区段2和区段3之间的包含底物分子的校准区域。在一些实施方式中，校准区域包括膜，其中膜如上文所述。
在一些实施方式中，校准区域放置在用分析物官能化的表面之前。在一些实施方式中，校准区域没有分析物。在一些实施方式中，校准区域没有识别分子。在一些实施方式中，校准区域没有报告分子。在一些实施方式中，当校准区域的底物分子遇到报告分子时，报告分子产生触发物，其在与底物分子相互作用时产生信号，给出报告分子的功能性和数量的指示以及总信号强度的参考。在一些实施方式中，信号强度用于信号校准。
在一些实施方式中，底物分子与校准区域的表面接触。如本文所用，“接触”可指经由共价键或非共价键结合。在一些实施方式中，底物分子是产生颜色的信号底物分子，比如5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、对硝基苯基磷酸酯、二钠盐(PNPP)、2,2'-连氮-双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐(ABTS)、邻苯二胺二盐酸盐(OPD)。在一些实施方式中，底物分子是产生光的信号底物分子，比如1,2-二氧杂环丁烷(CDP-星型和CSPD)。
区段1
在一些实施方式中，如本文所述的装置包括区段1，其包括样品收集表面。
在一些实施方式中，收集表面是过滤器。在一些实施方式中，收集表面是可容纳样品的固体载体。在一些实施方式中，收集表面包括膜或基质，其中膜或基质如上文所述。
在一些实施方式中，收集表面包括能够吸收或吸附液体样品的材料。
在一些实施方式中，区段1的尺寸和形状不是关键的并且它可以变化。
在一些实施方式中，样品收集表面由用于全细胞和大物体过滤的过滤器组成。
在一些实施方式中，样品收集表面包含用于控制pH和离子强度的缓冲液。
如本文所用，术语“样品收集表面”是指其中施加样品的表面。施加的样品从区段1的样品收集表面到区段2、区段3和区段4按此具体顺序连续迁移。
区段2
在一些实施方式中，如本文所述的装置包含区段2，其包括含有与报告(信号)分子连接或结合的识别分子的表面。在一些实施方式中，区段2包括含有与报告(信号)分子连接的沉积的识别分子的表面。在一些实施方式中，识别分子对分析物具有特异性亲和力。在一些实施方式中，报告分子产生化学和/或电学和/或荧光和/或物理可检测反应。在一些实施方式中，报告分子产生触发物。在一些实施方式中，识别分子在区段2的表面上干燥。在一些实施方式中，识别分子未结合到区段2的表面。在一些实施方式中，触发物在接触底物分子时诱导信号形成。在一些实施方式中，触发物能够化学相互作用(例如，通过反应和/或非共价结合)、物理相互作用(例如，通过光子诱导激发、通过与电离辐射的相互作用或通过诱导基于电磁场的相互作用)。在一些实施方式中，触发物包括以下至少一种：反应性化合物(比如，过氧化物，或能够与底物分子反应以产生信号的任何化合物)、电磁辐射、电离辐射和带电颗粒或其组合。在一些实施方式中，触发物是具有足以引起底物分子的荧光、发光、磷光或比色反应的波长的光子。
如本文所用，术语“识别分子”是指对生物学相关系统(例如，体外、离体或体内)中具有高亲和力(即，Kd≤10-9M的平衡解离常数值)的分子。在一些实施方式中，“识别分子”包括“报告分子”。在一些实施方式中，“识别分子”包括能够产生和产生通过外部手段可检测的可测量信号的“报告分子”。
如本文所用，术语“报告分子”是指对分子试剂或生物分子具有中等至高亲和力的化学基团或分子基序，其诱导或介导产生可被仪器监测的产物的反应。在一些实施方式中，“报告分子”包括色原、催化剂(比如酶)、发光化合物(比如荧光素和罗丹明)、化学发光化合物(比如，二氧杂环丁烷、吖啶
Figure BDA0003235986970000121
菲啶
Figure BDA0003235986970000122
(phenanthridinium)和鲁米诺)、放射性元素、电活性化合物、TEMPO、1,4,5,8-萘四羧酸二酰亚胺(NTCDI)和直接视觉标签。具体报告分子的选择并不关键，但它自身或与一种或多种另外的物质相互作用都能够产生信号。
可用于实践本发明的报告酶的实例包括水解酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶、异构酶和连接酶。一些优选的实例是葡萄糖氧化酶、磷酸酶、酯酶、糖苷酶和过氧化物酶。在一些实施方式中，报告分子选自蛋白质、酶、辣根过氧化物酶、核苷酸、染料、量子点、荧光团、金、银和铂。在一些实施方式中，报告分子产生化学活性触发物，比如过氧化氢，其氧化底物分子。
在一些实施方式中，报告分子选自酶、发光底物化合物、荧光、电化学活性化合物、荧光团(有机、量子点、荧光蛋白)、有机染料、磁性颗粒、金颗粒。
在一些实施方式中，识别分子选自DNA、蛋白质、抗原、生物受体、适体、噬菌体展示表位、仿生物、肽、核酸或抗体——其与一些报告分子连接。
在一些实施方式中，允许区段120处的识别元件与样品一起流动。底物分子(在区段400和150二者上)和捕获元件在测定时间期间保持在原位。
区段3
在一些实施方式中，如本文所述的装置包括区段3，该区段3包括用分析物或其等同物官能化的表面，其中该表面如上文所述。在一些实施方式中，分析物或其等同物结合到区段3的表面。
在一些实施方式中，如果使用不含分析物的样品，则在样品的迁移期间，过量的游离识别-报告分子将缀合到用分析物或其等同物官能化的区段3中，并且不会进一步迁移到区段4。
在一些实施方式中，如果使用具有分析物的样品，则由于分析物-识别-报告分子复合物在区段3之前形成，样品将继续并迁移到区段4，该区段4包括具有沉积的底物分子的表面，从而产生信号。信号产生的类型将取决于所使用的与识别分子缀合的报告分子和/或沉积的底物分子。
在一些实施方式中，使用分析物的等同物。在一些实施方式中，分析物的等同物是指类似的分子。分析物的等同物是与识别分子上的相同活性位点相互作用的分子。在一些实施方式中，分析物类似物可以是合成肽或肽置换的噬菌体或蛋白质的亚基。
区段4
在一些实施方式中，根据本发明的装置包括区段4，该区段4包括与底物分子接触或结合的表面，其中该表面如上文所述。在一些实施方式中，区段4包含与本文其他地方所述的校准区域中存在的相同的底物分子。
在一些实施方式中，区段4包括包含电极的表面。在一些实施方式中，区段4包括与选自荧光团、发光团、光致发光团、辐射发光材料和光反应性材料或其组合的底物分子接触或结合的表面。在一些实施方式中，底物分子包括能够与过氧化物反应以便形成可检测信号的分子。
在一些实施方式中，当区段4的底物分子遇到报告分子时，它能够发射具有一定强度的信号。在一些实施方式中，将该信号强度与从校准区域获得并用于信号校准的信号进行比较。在一些实施方式中，所获得的信号与样品中的分析物浓度成比例。在一些实施方式中，所获得的信号与样品中的分析物浓度和从样品到达区段4至测量时的时间成比例。在一些实施方式中，从校准区域和区段4获得的信号之间的比率用作内标。
在一些实施方式中，校准区域和区段4之间的信号比可以与预定值进行比较并且可以指示样品中存在的分析物的量。在报告分子与第一底物分子区第一次相遇时，获得与通过的报告分子数量成比例的信号。此后，当那些报告分子-分析物复合物不与捕获层结合时，它们到达在远端具有底物分子的第二区域，并且报告标记物将再次重新氧化那些底物分子。如果存在非常少的分析物，则第一个信号比下游信号高得多。如果报告分子对分析物饱和(或接近饱和)，则上游和下游信号接近单位一(unit)。
参考图4，在一些实施方式中，当样品中不存在分析物时，区段4和校准区域值之间的信号比为0。在一些实施方式中，当样品中存在分析物时，区段4和校准区域值之间的信号比与分析物浓度和距样品到达区段4时的时间相关联地增加。
在一些实施方式中，当样品中不存在分析物时，区段4和校准区域值之间的信号比为0。在一些实施方式中，当样品中存在分析物时，区段4和校准区域值之间的信号比在0和1之间，其与样品中的分析物浓度相关联，产生相对信号。
在一些实施方式中，底物分子是比色剂。在一些实施方式中，底物分子能够与触发物(比如，过氧化物)反应以导致颜色变化。在一些实施方式中，底物分子是产生颜色的底物分子，比如5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、4-CNDAB，显色物(chromogenic)。
在一些实施方式中，信号的类型取决于所选择的报告分子和/或底物分子。
在一些实施方式中，使用读取器或检测单元进行信号检测、定量或二者。在一些实施方式中，本发明的装置进一步包括检测单元。在一些实施方式中，检测单元与装置可操作地连通。在一些实施方式中，检测单元与区段4可操作地连通。在一些实施方式中，检测单元配置为检测由底物分子产生的信号。在一些实施方式中，检测单元包括电路。
如本文所用，术语“检测单元”是指能够比如在本文所述的区段上检测和/或定量数据的仪器。数据可能是肉眼可见的，但不必须是可见的。在一些实施方式中，检测单元与处理器可操作地连通。处理器是用于生产机器的通用计算机、专用计算机或其他可编程数据处理设备，使得通过计算机或其他可编程数据处理设备的处理器执行的指令创建用于实现装置功能的手段(means)。这些计算机可读程序指令还可以存储在计算机可读存储介质中，其可以指导计算机、可编程数据处理设备和/或其他装置以便以特定方式发挥功能，使得其中存储有指令的计算机可读存储介质包括制造的物品，其包含实施该装置的各方面的说明。在一些实施方式中，从装置接收的信号由软件处理以便生成输出，比如阳性报告或阴性报告。
在一些实施方式中，程序代码可由硬件处理器执行。
在一些实施方式中，硬件处理器是控制单元的一部分。
在一些实施方式中，进一步提供了可以使用本领域已知的任何合适的检测或测量手段来检测或测量在装置中进行的测定的读出。检测手段可根据测定读出的性质而变化。在一些实施方式中，所公开的装置还涉及包括在其任何实施方式中的装置和如本文所述的检测单元的设备。
在一些实施方式中，检测单元提供阳性报告。在一些实施方式中，检测单元提供阴性报告。如本文所用，“阳性报告”是指检测信号随着分析物浓度的增加而增加。如本文所用，术语“阴性报告”是指没有检测信号。
在一些实施方式中，读取器是电化学检测单元。在一些实施方式中，读取器是比色检测单元。在一些实施方式中，检测单元包括光电检测器，比如光电倍增管(PMTS)、CCD相机或互补MOS(CMOS)。在一些实施方式中，检测单元是手机。在一些实施方式中，检测单元将包括用于激发荧光报告分子的光源和光检测器。在一些实施方式中，检测单元是人。
在一些实施方式中，信号是颜色变化。在一些实施方式中，信号是光产生。在一些实施方式中，信号是电子流。在一些实施方式中，信号是激发光源。
如本文所用，术语“颜色”是指可见光谱内电磁辐射的相对能量分布。颜色可以通过视觉或使用仪器(例如光敏检测器)来评估。
如本文所用，术语“颜色变化”是指颜色的强度或色调的变化，或者可以是没有颜色存在的情况下颜色的出现或颜色的消失。
在一些实施方式中，区段4进一步包括有源像素传感器(APS)或电极。
区段5
现在参考图5。根据本发明的一些实施方式，该装置进一步包括区段5。在一些实施方式中，区段5联结到区段4并与区段4流体连通。在一些实施方式中，提供了一种装置，该装置包括区段1 110、区段2 120、区段3 130、区段4 150和区段5 510，这些区段沿水平轴布置并且流体连通，允许从区段1贯穿所有区段横向流动到区段5。
在一些实施方式中，区段5 510没有试剂并且能够容纳整个样品体积。
参考图5，当样品到达区段4 150时，报告分子将与底物分子相互作用以给出可测量的信号，然后继续迁移到区段5 510以被吸收。
在一些实施方式中，在装置的区段之间存在扩散膜，其在测量步骤期间调节样品流速和试剂之间的相互作用时间。
在一些实施方式中，扩散膜由聚乙烯醇、石蜡制成。
在一些实施方式中，装置将被引入频率范围在0.1kHz和1000kHz之间的振动，振动将促进试剂之间的相互作用并提高效率。在一些实施方式中，振动源自内部区段。在一些实施方式中，振动源自外部装置。
在一些实施方式中，可以使用磁场来调节流动。
在一些实施方式中，与典型的酶联免疫吸附测定(ELISA)相比，根据本发明的装置能够检测样品中较低量的分析物。
在一些实施方式中，根据本发明的装置检测溶液中浓度低于25ng mL-1的分析物的存在。在一些实施方式中，根据本发明的装置检测溶液中浓度低于25ng mL-1、低于24ng mL-1、低于20ng mL-1、低于15ng mL-1、低于10ng mL-1、低于8ng mL-1、低于7ng mL-1或低于5ngmL-1——包括其间的任何值——的分析物的存在。
在一些实施方式中，区段2中的报告分子与区段3中的分析物的比率在1:1至1:20的范围内。在一些实施方式中，区段2中的报告分子与区段3中的分析物的比率在1:2至1:20、1:3至1:20、1:4至1:20、1:8至1:20、1:10至1:20、1:12至1:20或1:15至1:20的范围内——包括其间的任何范围。
在一些实施方式中，区段2中的报告分子与校准区域中的底物分子的比率在1000:1至1:1000的范围内。在一些实施方式中，区段2中的报告分子与校准区域中的底物分子的比率在900:1至1:1000、500:1至1:1000、300:1至1:1000、100:1至1:1000、50:1至1:1000、25:1至1:1000、1000:1至1:900、1000:1至1:500、1000:1至1:300、1000:1至1:100、1000:1至1:50或1000:1至1:25的范围内——包括其间的任何范围。
在一些实施方式中，区段2中的报告分子与区段4中的底物分子的比率在1:1至1:1000的范围内。在一些实施方式中，区段2中的报告分子与区段4中的底物分子的比率在1:1至1:900、1:1至1:700、1:1至1:500、1:1至1:200、1:1至1:100、1:1至1:50、1:1至1:25或1:1至1:10的范围内——包括其间的任何范围。
在一些实施方式中，校准区域中的底物分子与区段4中的底物分子的比率在1:1000至1000:1的范围内。在一些实施方式中，校准区域中的底物分子与区段4中的底物分子的比率在900:1至1:1000、500:1至1:1000、300:1至1:1000、100:1至1:1000、50:1至1:1000,、25:1至1:1000、1000:1至1:900、1000:1至1:500、1000:1至1:300、1000:1至1:100、1000:1至1:50或1000:1至1:25的范围内——包括其间的任何范围。
方法
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种用于确定样品中分析物的存在的方法。在一些实施方式中，提供了一种用于确定样品中分析物的存在的方法，该方法包括使样品与装置接触，该装置至少包括以轴向和连续顺序布置且部分重叠的区段1、区段2、区段3和区段4，其中区段3用分析物官能化；和检测信号的存在，从而确定样品中分析物的存在。
如本文所用，术语“接触”通常是指提供一种组分、试剂、分析物或样品到另一种组分、试剂、分析物或样品的通路。例如，接触可以包括将本发明的装置与包括分析物分子的样品混合。
在一些实施方式中，区段1包括样品收集表面，区段2包括用识别分子官能化的表面，该识别分子对与报告分子连接的分析物具有特异性亲和力，其中报告分子产生化学和/或电学和/或物理可检测反应；并且区段4包括沉积有底物分子的表面。在一些实施方式中，区段3进一步包括校准区域，该校准区域包括邻近区段2放置的底物分子。在一些实施方式中，区段5包括空的表面。
在一些实施方式中，样品被放置在区段1，并从区段1流动到区段2，从区段2流动到区段3，和从区段3流动到区段4。在一些实施方式中，样品被放置在区段1，并从区段1流动到区段2、从区段2流动到区段3、从区段3流动到区段4和从区段4流动到区段5。
在一些实施方式中，检测信号的存在是在区段3的校准区域中。在一些实施方式中，检测信号的存在是在区段3和区段4的校准区域中。在一些实施方式中，如果样品中存在分析物，则将在区段3和区段4的校准区域中检测到信号。在一些实施方式中，如果样品中不存在分析物，则将仅在区段3的校准区域中检测到信号。
区段1、区段2、区段3、区段4和区段5以及信号的检测的说明在本文其他地方描述。
在一些实施方式中，样品从区段1扩散到区段5。在一些实施方式中，样品的所有溶解或分散的组分以基本相等的速率扩散，并且从区段1相对未受损地横向流动到区段5。
在一些实施方式中，提供了用于对样品中分析物的量进行定量的方法，其进一步包括对校准区域中的信号量进行定量并将来自校准区域的信号强度数据与来自区段4的信号强度数据相关联。
在一些实施方式中，提供了用于诊断传染病的方法。
在一些实施方式中，提供了用于诊断病原体或其子组分的方法，其存在已知生物标志物以及现有的特定亲和生物受体，比如抗体。
在一些实施方式中，可以在区段1中施加样品1min至40min后检测信号的存在。在一些实施方式中，可以在区段1中施加样品的1min至30min、1min至20min、1min至15min、1min至10min、2min至30min、5min至30min、5min至20min、5min至15min或5min至10min——包括其间的任何范围——后检测信号的存在。
根据本发明的一些实施方式，提供了利用特异性结合成员的方法。
试剂盒
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了一种试剂盒，其包括：包含样品收集表面的区段1；包含沉积有识别分子的表面的区段2，该识别分子对与报告分子连接的分析物具有特异性亲和力，其中报告分子产生化学和/或电学和/或物理可检测反应；用分析物官能化并且包括包含底物分子的校准区域的区段3；和包括沉积有底物分子的表面的区段4；包括用于容纳过量材料的表面的区段5。
在一些实施方式中，根据本发明的试剂盒包括用于以轴向和连续顺序并且部分重叠地连接区段1、区段2、区段3、区段4和区段5的说明。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包括样品收集仪器。在一些实施方式中，样本收集仪器是刻度测量仪器。在一些实施方式中，样品收集仪器用于通过在样品收集表面中施加样品来收集样品。可根据本发明使用的收集仪器的非限制性实例包括拭子、木刮刀、移液管或其他形式的样品收集设备。
在一些实施方式中，试剂盒包括至少两个区段4，其每个包含不同的底物分子。在一些实施方式中，底物中的至少一种包括有源像素传感器(APS)或电极。
根据本发明的一些实施方式，提供了用于确定样品中分析物的存在的试剂盒。
在一些实施方式中，提供了用于诊断传染病的试剂盒。
一般概念
如本文所用，术语“约”是指±10％。
术语“包括(comprise、comprising)”、“包含(include、including)”、“具有(having)”及其同根词是指“包括但不限于”。
术语“由……组成”是指“包括并限于”。
术语“基本上由……组成”是指组成、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是另外的成分、步骤和/或部分不会实质上改变要求保护的组合物、方法或结构基本上且新颖的特性。
词语“示例性的”在本文中用于指“作为实例、例子或说明”。描述为“示例性的”的任何实施方式不一定被解释为相比于其他实施方式更优选或有利和/或排除了并入来自其他实施方式的特征。
词语“任选地”在本文中用于指“在一些实施方式中提供而在其他实施方式中不提供”。本发明的任何特定实施方式可以包括多个“任选的”特征，除非这些特征冲突。
如本文所用，单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
遍及本申请，可以以范围格式呈现本发明的各种实施方式。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应理解为对本发明范围的不灵活限制。因此，应该认为对范围的描述已经具体公开了该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。例如，对比如从1至6的范围的描述应被认为已经具体公开了子范围，比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
无论何时在本文中指示数字范围时，都意味着包括在指示范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字和第二指示数字之间的范围”和“从第一指示数字到第二指示数字的范围”在本文中可互换使用并且意在包括第一和第二指示数字以及其间的所有分数和整数。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，其包括但不限于化学、药理学、生物、生物化学和医学领域的从业者已知的那些方式、手段、技术和程序或者从已知的方式、手段、技术和程序容易发展来的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状或基本上防止病症的临床或美学症状的出现。
应当理解，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为了简洁起见在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合或在本发明的任何其他描述的实施方式中合适地提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方式的基本特征，除非实施方式在没有那些要素的情况下是不可操作的。
本发明的各种实施方式的描述出于说明的目的而呈现，但并不旨在是穷举的或限于所公开的实施方式。在不脱离所描述实施方式的范围和精神的情况下，许多修改和变化对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。选择本文使用的术语以最好地解释实施方式的原理、实际应用或对市场中发现的技术的技术改进，或者使本领域普通技术人员能够理解本文公开的实施方式。
上面描述的和所附权利要求部分中要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，这些实施例与以上描述一起以非限制性方式说明了本发明的一些实施方式。
材料和方法
试剂
磷酸盐缓冲盐水(PBS)片剂(目录号P4417)、3-(缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷(GPTMS)(440167，98％(v/v))和间高碘酸钠(S1878)购自Sigma-Aldrich。PBS-0.05％(v/v)Tween(PBST)通过将0.5mL的Tween-20溶液(目录号P7949)添加到1L的PBS缓冲液中制备。5％(w/v)脱脂奶(SM)溶液通过将5g的SM粉末(70166)添加到100mL的PBST溶液中制备。Milli-Q超滤(UF)H2O(在25℃下电阻率为18.2MΩcm)用于制备所有溶液，鲁米诺-H2O2底物溶液(比率1:1)(目录号1705040，BioRad)、甲醇(136805)购自Bio-Lab(以色列)、乙酸(45731，99.8％(v/v))购自Fluka，盐酸(7647010，37％(v/v))和过氧化氢溶液(7722841，35％(v/v))购自Acros Organic(USA)。
免疫试剂
登革热NS1蛋白(His标签)(Fitzgerald，目录号80-1348)购自Tarom(以色列)，小鼠单克隆抗登革热病毒，NS1抗体(IgG)，其缀合有HRP酶(USBiological，目录号143056-HRP)，购自Biotest(以色列)。
装置制造
膜。缀合物释放基质(目录号PT-R5)和吸收剂(目录号AP-080)垫购自AdvancedMicrodevices Pvt.Ltd.(印度)。
测定试剂固定步骤
通过从吸收垫上切下40×5毫米的垫，用300μL的鲁米诺-H2O2底物溶液(比率1:1)(目录号1705040，BioRad)润湿，并在37℃下避光干燥2小时来制造底物垫。通过用35μL的抗登革热NS1抗体——HRP缀合的(用PBS(0.203g L-1 NaH2PO4、1.149g L-1 Na2HPO4、8.5g L- 1NaCl)(pH 7.2)稀释)——润湿垫来制备缀合垫(10×3mm)，并在37℃下干燥20min。切割10×5毫米的空缀合垫来制造样品垫。缀合物垫在室温下存储在100％湿度下直至使用。阻滞层(blocking layer)的制备类似于Liebes等人和Algaar等人描述的参考方案。简而言之，缀合物释放基质(目录号PT-R5)暴露于甲醇/97％HCl溶液20分钟，通过在DDW中超声清洁20min并用7:3[v/v]97％HCl/H2O2溶液在90℃下处理10min以产生表面羟基，用纳米纯水冲洗并用氮气干燥。然后将膜表面用(3-缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷在60℃下硅烷化60min。然后，在50℃下用11.6mM盐酸处理60min(形成邻二醇)并在不暴露于光的情况下在室温下用100mM溶解在10％(v/v)乙酸中的高碘酸钠处理60min(氧化成醛)。然后用去离子水冲洗膜，并在4℃下与10mL的200ng mL-1NS1孵育过夜。第二天，使用PBST将膜洗涤3次，每次5分钟，并在RT下干燥40min。
测量步骤
将360μL含水样品施加在样品垫之上。样品穿过膜并发挥特定的相互作用。目标分析物首先在带有标记的抗NS1抗体的膜内扩散，然后通过阻滞层移动到含有干燥底物分子的吸收垫，以便到达的酶反应以产生信号。在含有目标蛋白的样品中，产生的光信号用CCD相机(Retiga-SRV FAST 1394，InterFocus，英国)捕获。CCD相机放置在条带上方30cm处，并使用QCapture pro软件拍摄1.5min曝光时间的系列照片。在条带暴露于液体样品后5min进行测量。
优化步骤
随着固定化NS1浓度的增加确定阻滞潜力
使用更高的蛋白质浓度来评估潜在的阻滞能力，以防止检测中的假阳性反应。5×15mm缀合物垫根据先前描述的方案进行处理，并与浓度越来越高的NS1(0、100、500、1000、1500、2000ng mL-1)一起孵育过夜。之后，垫在PBST中洗涤3次，与在PBS中以1/15,000稀释的HRP附接的抗NS1抗体一起在RT中孵育1小时，然后在PBST中再次洗涤3次。将100μL鲁米诺:H2O2添加到每个条带(尺寸0.5×1.5cm)中，然后使用CCD相机拍摄光图像。
确定抗体-HRP浓度
抗体-HRP浓度与平台的可信度直接相关。如果浓度太高，阻滞剂层可能会溢出并出现假阳性。当浓度太低时，信号会减弱，检测灵敏度会损失。如测定试剂固定步骤部分所述的，准备设置，仅在PBST 0.05％v/v中使用不同稀释度的抗NS1-HRP(1/5k、1/7.5k、1/10k、1.25k)。
优化膜设置中的灵敏度测试
优化后，测试了基于膜的设置对登革热NS1的灵敏度，并与通过ELISA实现的灵敏度进行了比较。两种工艺都针对加标了不同浓度登革热NS1(1、5、25、125、600、3000ng mL-1)的PBS样品进行了测试。所有固定步骤和垫制备都之前在测定试剂固定步骤部分中进行了描述。该设置设计在基于膜的免疫测定设置的组装部分中进行了解释。将360μL样品缓慢施加在样品垫上方，并在5min后使用CCD相机进行测量。所有不同NS1浓度的每次重复都在不同的一天重新进行(n＝3)。对样品中信号强度和NS1浓度之间的线性响应的拟合计算为5到600ng mL-1之间。
加标血清样品
加标猪血清样品以达到500ng mL-1的浓度，并使用捕获流测定法测试登革热NS1的存在。将40μL的每种样品用360μL PBS稀释，然后施加到设置上。使用CCD相机记录光反应并在ImageJ中进行分析。
数据分析
对于使用CCD相机接收到的每次测量，创建TIF格式文件并使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)进行分析。为像素亮度设定阈值，并测量总光强度的发光面积。
实施例1 用于检测和定量登革热NS1的基于膜的免疫测定设置的组装
建议的设置由先前用于诊断目的的材料制成的层组成。在条带开始处，样品垫将收集测试样品，接着是具有等待抗-NS1-HRP抗体报告因子的缀合物释放基质。然后，具有共价结合的登革热NS1蛋白的官能化缀合物基质的捕获层。在第二端，吸收垫与底物分子产生信号。设计方案如此工作使得，一旦施加推定的样品，它就会遇到第一层以均匀流速，样品中的NS1传递到下一个功能膜，在该功能膜处相应的抗NS1-HRP缀合物形成NS l-抗-NS l-HRP的复合物，然后该免疫复合物穿过包含预先附接的NS1的官能化过滤器，如捕获层，所形成的免疫复合物将惰性传递至当前层并到达底物分子等待与报告分子反应并产生可读光信号的最终层。在无NS1样品的情况下，抗NS1-HRP将保持可用以连接到过滤器如捕获层中预先附接的NS1，因此在最终层不会产生信号。
独特的新型捕获层给出了将横向流动测定技术从二维平台转化为三维基质的机会，允许不同的形状、在简单的一步程序中进行多路复用(multiplex)和定量的能力。
通过类似于传统横向流动免疫分析放置所有制备好的垫来组装免疫分析。样品、缀合物、捕获物和吸收剂(底物分子)垫一个接一个地放置在支撑卡之上，其按此顺序重叠大约1mm。
实施例2 优化和表征步骤
捕获层对该技术至关重要，捕获未结合的抗体-HRP以免到达吸收垫，防止了不必要的假响应。该层捕获抗体的能力取决于NS1与基质的结合强度、其在基质中的可用性和数量。如测定试剂固定步骤部分中所述，NS1蛋白与层表面共价结合，其中硅烷交联剂加倍作为间隔物，强共价键极大地有助于防止NS1浸出。处理的缀合物垫的多孔形状允许大量活性基质容纳许多NS1潜在捕获分子。
在图7中显示，固定在阻滞层上的捕获剂(在这种情况下为登革热NS1)的量影响捕获层过滤未结合抗体的潜力。理想情况下，更高量的捕获剂将确保抗体的假阳性最小和捕获能力最大，然而，为了降低生产成本，优选的是固定防止假阳性响应所需的有效最小值。在进一步的实验中，使用了200ng mL-1的浓度。
等待样品的抗体量决定了该设置的潜在灵敏度，最佳抗体-HRP浓度允许样品中NS1与抗体之间的大量缀合，从而产生强的光信号，同时未结合的抗体不会溢出阻滞层并泄漏产生假阳性响应。
最佳抗体稀释度在1/7.5k处确定(图8A-B)，直到稀释度为1/7.5k时，与阴性样品的光信号没有显著差异，然而在1/5k浓度下，存在阴性信号的显著增加，这意味着未结合的抗体溢出阻滞剂并到达吸收垫——而没有来自样品的NS1蛋白。1/7.5k产生最强的真阳性响应而不产生强的假阳性，这个浓度可以在系统中给出最高的灵敏度。
实施例3 优化膜设置中的灵敏度测试
与作为基准的ELISA比较，进行我们当前设置的评估。ELISA通常用于蛋白质定量的比较。
使用本发明人的设置检测到的最低NS1浓度为5ng mL-1(图9A)，它比使用ELISA达到的灵敏度极限(25ng mL-1)(图9B)低5倍。建立5到600ng mL-1之间的响应的线性拟合，其中R2＝0.9921(数据未显示)。
实施例4 加标血清测试
从患者采集的当前临床样品是血清，因此必须证明设置能够检测血清样品中的目标分析物。
图10A-B显示了在应用阳性样品的情况下更高的光强度。这证明了该设置检测血清样品中的NS1分析物的能力。
实施例5 校准线对结果确定性的影响
将10×70mm聚酯捕获膜用浓度为2000ng/mL的hTg固定O.N.。通过将在PBST0.05％中稀释的35uL抗hTg与2％海藻糖施加到12×4mm天然聚酯膜上并在30℃干燥60min来制备缀合物释放垫。吸收垫施加有300uL TMB底物，并在40℃下避光干燥2.5小时。将12×4mm天然聚酯膜的校准线浸泡在TMB中并在40℃下干燥30min。4×12mm天然聚酯膜用作样品垫。
样品含有300uL的1:50稀释的猪血清。阳性对照含有1000ng/ml的hTg。阴性对照不含hTg。
在施加样品后，使用智能手机相机拍摄图像。使用imageJ软件进行图片分析。
如图11所示，平台的阳性响应高于阴性响应。然而，绝对值的概率值(p值)为0.019，而计算的相对值的p值显著较低(p值＝0.0054)。该结果表明，通过应用校准概念，测量的确定性增加。
尽管已经结合其特定实施方式描述了本发明，但很明显，对于本领域技术人员而言，许多替代、修改和变化将是显而易见的。因此，其旨在包括落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这种替代、修改和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本说明书中，其程度就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示为通过引用并入本文中一样。此外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认这种参考文献可作为本发明的现有技术。就使用章节标题而言，它们不应被解释为必然限制性的。

Claims (29)

1.一种装置，其包括区段1、区段2、区段3和区段4，其中：
a.所述区段2联结到所述区段1；
b.所述区段3联结到所述区段2和所述区段4，所述区段3包括用分析物或其等同物官能化的表面；和
c.区段1至4沿水平轴布置并且流体连通，允许流体从所述区段1通过所述区段2和所述区段3横向流动到区段4。
2.根据权利要求1所述的装置，其中
(i)所述区段1包括样品收集表面；
(ii)所述区段2包括含有对所述分析物具有特异性亲和力的识别分子的表面，其中所述识别分子与报告分子连接，并且其中所述报告分子产生触发物；和
(iii)所述区段4包括与响应于所述触发物而产生信号的底物分子接触的表面。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的装置，其进一步包括设置在区段2和区段3之间的校准区域，其中所述校准区域包括与所述底物分子接触的表面。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的装置，其进一步包括联结到所述区段4并与所述区段4流体连通的区段5。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的装置，其中所述联结是接触或部分重叠。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的装置，其中所述触发物包括以下中的至少一种：反应性化合物、电磁辐射和带电颗粒或其组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的装置，其中所述区段3没有所述识别分子和所述报告分子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的装置，其中区段2中的所述识别分子和区段3中的所述分析物的浓度在0.01mg/mL至100mg/mL的范围内。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的装置，其中所述报告分子选自酶、发光化合物、荧光化合物、磁性颗粒、电化学活性化合物。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的装置，其中至少三个区段沿着一个或多个平面设置。
11.根据权利要求10所述的装置，其中两个连续的区段沿着一个或多个平面设置。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的装置，其中所有所述区段均沿相同平面设置。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的装置，其中所述重叠在所述区段的总表面的0.01％至99％的范围内。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的装置，其进一步包括与所述装置可操作连通的检测单元，并且其中所述检测单元配置为检测所述信号。
15.根据权利要求14所述的装置，其中所述检测单元包括选自以下的元件：有源像素传感器(APS)、电极、具有有源像素传感器的激发源或其任意组合。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的装置，其中所述分析物或其等同物选自病毒、蛋白质、生物细胞、毒素和病原体、药品和药物。
17.根据权利要求1至14中任一项所述的装置，其中所述样品选自水、血液、尿液、汗液、唾液和血清。
18.一种确定样品中分析物的存在的方法，其包括：
a.使样品与权利要求1至17中任一项的装置接触；和
b.检测信号的存在，
从而确定样品中所述分析物的存在。
19.根据权利要求18所述的方法，用于定量样品中分析物的量，其进一步包括：
(i)定量校准区域中所述信号的量；和
(ii)将来自校准区域的信号强度数据与来自区段4的信号强度数据相关联。
20.根据权利要求18和19中任一项所述的方法，用于诊断传染病。
21.一个试剂盒，其包括：
(i)区段1、区段2、区段3和区段4；
(ii)分析物或其等同物；
(iii)对与报告分子连接的所述分析物具有特异性亲和力的识别分子，其中所述报告分子产生化学和/或电学和/或物理可检测反应；和
(iv)在所述报道分子的存在下反应的底物分子。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其进一步包括使用所述报告分子沉积所述区段2、使用所述分析物沉积所述区段3以及使用所述底物分子沉积所述区段4的说明。
23.一种试剂盒，包括：
(i)包括样品收集表面的区段1，
(ii)区段2，其包括沉积有识别分子的表面，所述识别分子对与报告分子连接的所述分析物具有特异性亲和力，其中所述报告分子产生化学和/或电学和/或物理可检测反应；
(iii)用所述分析物官能化的区段3；和
(iv)包括沉积有底物分子的表面的区段4；
(v)包括可用于容纳过量样品的表面的区段5。
24.根据权利要求22至23中任一项所述的试剂盒，其进一步包括校准区域。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其进一步包括用于将区段1、区段2、校准区域、区段3、区段4和区段5沿水平轴布置并且处于流体连通以允许从区段1贯穿所有区段横向流动到区段5的说明。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的试剂盒，其进一步包括样品收集仪器。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的试剂盒，其包括至少两个区段4，其中每个区段4包含不同的底物分子。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述底物分子中的至少一种包括有源像素传感器(APS)、电极或具有有源像素传感器(APS)的激发装置。
29.根据权利要求22至28中任一项所述的试剂盒，其用于诊断传染病。
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