WO1991008486A1 - Procede de diagnostic des cryptococcoses, reactif pour la realisation de ce procede, et pour l'obtention d'antigene cryptococcique et compositions immunogenes contenant lesdits antigenes - Google Patents

Procede de diagnostic des cryptococcoses, reactif pour la realisation de ce procede, et pour l'obtention d'antigene cryptococcique et compositions immunogenes contenant lesdits antigenes Download PDF

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WO1991008486A1
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antigens
cryptococcus neoformans
antigen
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PCT/FR1990/000862
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Bertrand Dupont
Jean-Michel Delga
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Institut Pasteur
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56961—Plant cells or fungi

Definitions

  • the present invention relates to a process for the diagnosis of cryptococcosis by detection of circulating antigens, to the antibodies necessary for the production of the diagnostic reagent for said detection, to the use of said reagent for obtaining said antigens as well as immunogenic compositions containing said antigens.
  • Cryptococcosis is caused by a fungus, Cryptococcus neoformans.
  • Cryptococcus neoformans There are four serotypes of Cryptococcus neoformans, namely serotypes A, B, C and D.
  • Trichosporon beigel ⁇ i type species of the genus Trichosporon, synonymous with Trichosporon cu- taneum (L. do CARMO-SOUSA, 1970, 1309-1352, "The genus Trichosporon BEHREND” in J. LODDER ed., "The yeasts, a taxono ic study ", North Holland Marsh. Co. Amsterdam) belonging to serogroup 2 of the genus Trichosporon, presents partial antigens common with the genus Cryptococcus, as well as with the genus Candida, in particular Candida curvata and Candida humicola (SEELIGER HPR et al, Sabouraudia, 1963, 2_, 248-263).
  • T. TAKEUCHI et al. J. Pathol., 1988, _15 ⁇ , 23-27 recall that the diagnosis of infection with Trichosporon beigelii, which is observed more and more frequently in immunodeprinnate patients, is carried out by cultures (blood cultures ) or by histological observation of the fungus and that this diagnosis is not always easy to interpret because of the possibility of confusion between this fungus and the Candida species.
  • the authors propose two monoclonal antibodies which make it possible to distinguish T. beigelii from other fungi and to detect more specifically T. beigelii on sections of tissue included in paraffin.
  • the antibodies described in this article do not react with Cryptococcus neoformans or with Candida albicans.
  • the present invention relates to anti ⁇ bodies directed against Cryptococcus neoformans, character- its in that it is obtained by immunization of a suitable animal with a fungus which has an antigenic community with Cryptococcus neoformans and which is immunogenic, in that it is immunoglobulins G, and in what they have a great affinity for Cryptococcus neoformans, expressed on the one hand by an agglutination titre of said Cryptococcus neoformans at least equal to l / 100th and on the other hand by a detection threshold for soluble antigens circulating polysaccharide capsular of Cryptococcus neoformans of between 10 and 50 ng / ml, in an appropriate buffer and when the said
  • said antibodies are obtained by immunization of an appropriate animal with a fungus of the genus Trichosporon.
  • Trichosporon is a strain of Trichospo ⁇ ron beigelii.
  • the Trichosporon beigelii strain is preferably an IP strain no * T49 1495-83. This strain was deposited in the National Collection of Culture of Microorganisms (CNCM), held by the Institut Pasteur, on September 22, 1983.
  • CNCM National Collection of Culture of Microorganisms
  • the fungus Trichosporon in particular, makes it possible to obtain antibodies which recognize Cryptococcus neoformans, while it is very difficult to obtain a correct and reproducible immunization, directly from Cryptococcus neoformans.
  • Animals suitable for immunization are in particular mammals, but may also be gallinaceous.
  • the buffer is a glycine buffer.
  • said antibodies are polyclonal antibodies.
  • said antibodies are monoclonal antibodies.
  • Said monoclonal antibodies are obtained by cloning hybridomas resulting from the fusion of appropriate myeloma cells and spleen cells i mutated by an antigen constituted by an appropriate strain of Trichosporon beigelii, in particular strain T49 1495-83 by uses an appropriate cloning technique.
  • the present invention also relates to a diagnostic reagent in the form of particles, for the detection of soluble antigens of Cryptococcus neo ⁇ formans in biological fluids, characterized in that said particles are covered with an antibody in accordance with the invention.
  • said particles are chosen from the group which comprises the latex beads and the magnetic beads, as described in particular in French Patent 7,536,889.
  • the present invention also relates to a process for detecting the soluble circulating polysaccharide antigen of Cryptococcus neoformans, possibly present in a biological sample, characterized in that the said biological sample is brought into contact with the diagnostic reagent according to the invention, after which the The agglutination of the capsular polysaccharide-diagnostic reagent antigen complex is assessed by any appropriate means.
  • the method according to the invention has the advantage of being much more sensitive than the tests proposed in the prior art and in particular does not involve self-agglutination of the c latex beads between them.
  • the present invention further relates to a ready-to-use diagnostic kit for implementing the method of detecting cryptococcosis according to the invention, characterized in that it comprises, in addition to the useful quantities of buffers suitable for carrying out said detection, appropriate doses of diagnostic reagent according to the invention.
  • the present invention also relates to a process for obtaining circulating polysaccharide cryptococcal antigen, characterized in that one proceeds to the fixing of said antigen on an affinity column on which are fixed the antibodies conforming to the invention, then in that one proceeds to an appropriate elution of said antigens.
  • Such a method makes it possible to specifically obtain cryptococcal antigens.
  • the present invention further relates to the antigens obtained using the method according to the invention above.
  • the present invention further relates to an immunogenic composition, characterized in that it comprises an antigen according to the invention, optionally associated with an adjuvant and / or with at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the process which is the subject of the present invention.
  • Example 1 Preparation of polyclonal antibodies in accordance with the invention.
  • Antigen preparation Trichosporon beigelii precultures (so-called T 49 strain, IP 1495-83) are produced by inoculating 500 ml flasks containing 100 ml of Sabouraud chloramphenicol culture medium, liquid. Incubation is 48 hours, at 30 ° C, with shaking
  • the strain T 49 has the morphological and physiological characteristics of the Trichosporon beige ⁇ lii.
  • the antigenic community of this strain with Cryptococcus neoformans has been proven.
  • New Zealand rabbits weighing 2.5 kg were used for immunizations. Blood is collected on a dry tube by bleeding from the central artery of the ear. After 24 hours coagulation, the serum is obtained by centrifugation at 2000 rpm. It is stored at -20 "C. The immunoglobulins G are then extracted by purification.
  • Immunization is carried out by subcutaneous multi-injection (total volume 1ml) of a 20% suspension of killed Trichosporon.
  • the first injection is made with Freund's complete adjuvant, the following with incomplete adjuvant. These injections are repeated until an agglutination titer at least equal to 1/100 is obtained. vs. Immunization control:
  • the immunization control is carried out by ag ⁇ glutination on a plate, by mixing 25 ⁇ l of a suspension of 2 ⁇ 10 7 cells / ml of T 49 [48-hour culture washed three times in glycine buffer (glycine buffe-red saline 0.1 M GBS or GBS) with 25 ⁇ l of serum or its dilutions in GBS buffer]. After 10 minutes of stirring at 200 revolutions per minute, the reading is made either directly under a fluorescent tube or in the microscope, to differentiate the degrees of agglutination.
  • glycine buffer glycine buffe-red saline 0.1 M GBS or GBS
  • Example 2 Preparation of a diagnostic reagent according to the invention.
  • bovine serum albumin (0 to 100 ⁇ g / ml) are fixed on latex beads in glycine buffer (GBS) (Prolabo), in combination or not with bovine serum albumin (0 to 100 ⁇ g / ml). 1 ml of each of these preparations is mixed with 1 ml of latex beads. The mixture is incubated at 37 "C for 45 min, with stirring at 100 revolutions per minute. Then 0.5 ml of a solution, comprising for 300 ml of 30% bovine albumin serum (SAB) (100 ml) and GBS (200 ml) is added to said mixture, then the latter is incubated in the same conditions as above, for 30 minutes.
  • SAB bovine albumin serum
  • Centrifugation for 10 minutes at 20,000 g allows the latex beads to be separated from the reaction medium.
  • 2.5 ml of a stabilizing solution are added to the centrifugation pellet, comprising per 1000 ml: sucrose 54.0 g, NaCl 0.3 g, SAB 30% (Sigma) 67.0 ml, Merthiolate 0.18 g, G.B.S. 933.0 ml).
  • the diagnostic reagent according to the invention is thus obtained, which is then stored at + 4 ° C., until it is used. All the tubes or flasks in which the latex preparation was carried out, were previously washed with glycine buffer.
  • Example 3 Detection method according to the invention in blood. 1) Collection of samples
  • the sample is kept in a hermetically sealed glass or polyethylene bottle, then the samples are inactivated for 30 minutes in a water bath at 56 °.
  • - reagent A reactive latex, i.e. latex sensed by a rabbit anticryptococcal globulin;
  • control latex i.e. latex sensitized by a non-immunized rabbit globulin
  • the positive and negative controls should be treated like the serum to be examined.
  • a positive result corresponds to a frank agglutination of the reactive latex and to the absence of agglutination of the control latex.
  • Quantitative determination prepare a series of dilutions of the sample from 1/2 to 1/256 in the glycine buffer;
  • Example 4 Detection method according to the invention in the cerebrospinal fluid.
  • the protocol is identical to that of Example 3, with the exception of the sample which differs in that the LCR is centrifuged for 10 minutes at 1000 xg or filtered on a 0.2 ⁇ m filter, then it is placed in a glass bottle or hermetically sealed polyethylene.
  • Example 4 Sensitivity of the detection method according to the invention.
  • a reagent A consisting of latex beads sensitized by a rabbit anticryptococcal globulin
  • a reagent B consisting of latex beads coated with a non-immunized rabbit globulin
  • a control positive consisting of polysaccharide antigen of C. neoformans 0.25 ⁇ g / ml per year
  • a negative control consisting of a non-immunized rabbit serum and an approriated buffer stabilized with a preservative, with a test in accordance with the invention.
  • the "detection sensitivity” column indicates the minimum concentration of cryptococcal antigen detected by "CRYPTO LA TEST” (registered trademark) and the test according to the invention.

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Abstract

Procédé de diagnostic des cryptococcoses par détection d'antigènes circulants, anticorps nécessaires à la réalisation du réactif de diagnostic pour ladite détection, utilisation dudit réactif pour l'obtention desdits antigènes ainsi que compositions immunogènes contenant lesdits antigènes. Les anticorps dirigés contre Cryptococcus neoformans sont obtenus par immunisation d'un animal approprié par un champignon qui présente une communauté antigénique avec Cryptococcus neoformans et qui est immunogène, en ce qu'il s'agit d'immunoglobulines G, et en ce qu'ils présentent une grande affinité pour Cryptococcus neoformans, exprimée d'une part par un titre d'agglutination desdits Cryptococcus neoformans au moins égal au 1/100ème et d'autre part par un seuil de détection des antigènes solubles capsulaires polysaccharidiques circulants de Cryptococcus neoformans compris entre 10 et 50 ng/ml, dans un tampon approprié et lorsque lesdits anticorps sont fixés sur des billes de latex appropriées.

Description

PROCEDE DE DIAGNOSTIC DES CRYPTOCOCCOSES, REACTIF POUR LA REALISATION DE CE PROCEDE, ET POUR L'OBTENTION D'ANTIGENE CRYPTOCOCCIQUE ET COMPOSITIONS IMMUNOGENES CONTENANT LESDITS ANTIGENES. La présente invention est relative à un pro¬ cédé de diagnostic des cryptococcoses par détection d'antigènes circulants, aux anticorps nécessaires à la réalisation du réactif de diagnostic pour ladite détec¬ tion, à l'utilisation dudit réactif pour l'obtention des- dits antigènes ainsi qu'aux compositions immunogènes contenant ledits antigènes.
La cryptococcose est due à un champignon, Cryptococcus neoformans . Il existe quatre sérotypes de Cryptococcus neoformans, à savoir les sérotypes A, B, C et D.
L'émergence du SIDA a entraîné une augmenta¬ tion de la fréquence des cryptococcoses. Cette mycose se rencontre dans 6 % des cas de SIDA et se révèle être la première manifestation de ce syndrome dans 30 % des cas. C'est dire l'importance de son diagnostic.
Celui-ci repose à l'heure actuelle, essentiel¬ lement sur les méthodes mycologiques classiques (mise en évidence de la levure à l'examen direct et par culture) ou sur la détection d'un antigène polysaccharidique cir- culant dans le sérum, les urines ou le L.C.R., le glu- curo-xylo-mannane. Cette détection utilise l'agglutination de particules de latex sensibilisées par des immunoglobulines, dont la spécificité est dirigée contre cet antigène. Cependant, l'obtention de telles immunoglobu¬ lines est problématique, notamment à l'échelle indus¬ trielle, car la capsule de Cryptococcus neoformans est un puissant inhibiteur de la réaction immunologique.
Il est connu que Trichosporon beigel±i, espèce type du genre Trichosporon, synonyme de Trichosporon cu- taneum (L. do CARMO-SOUSA, 1970, 1309-1352, "The genus Trichosporon BEHREND" in J. LODDER éd., "The yeasts, a taxono ic study", North Holland Publi. Co. Amsterdam) appartenant au sérogroupe 2 du genre Trichosporon, pré¬ sente des antigènes partiels communs avec le genre Cryptococcus, ainsi qu'avec le genre Candida, notamment Candida curvata et Candida humicola (SEELIGER H.P.R. et al, Sabouraudia, 1963, 2_, 248-263) . Ces Auteurs ont en particulier mis en avant la difficulté à préparer des antiséru s de lapin contre T. beigelii et contre les ex¬ traits cellulaires totaux de Cryptococcus neoformans et T. beigelii et ont montré l'existence de réactions croi¬ sées entre les antigènes de ces deux champignons.
T.C. U et al. ont comparé (J. Clin. Micro- biol., 1983, 3^, 5, 1127-1130) trois kits de détection de l'antigène cryptococcique, comprenant des billes de latex recouvertes d'anticorps anti-cryptococciques ("CRYPTO LA TEST", "MYCO-IM UNE", "IMMY")et montrent une variation de sensibilité importante, tant dans le sérum que dans le liquide céphalorachidien
E.J. McMANUS et al. ont décrit (J. Clin. icrobiol., 1985, 2 _, 5, 681-685) un antigène de Tricho¬ sporon beigelii qui présente une réaction croisée avec le polysaccharide capsulaire de Cryptococcus neoformans, le¬ quel antigène a été isolé à partir du sérum d'un patient présentant une infection disséminée par Trichosporon (souche U ) .
Les Auteurs de cet article montrent que des billes de latex revêtues d'anticorps anti-Cryptococcus neoformans ont été agglutinées par le sérum de ce pa¬ tient. Ceci est dû au fait que Trichosporon beigelii pos- sède un ou plusieurs antigènes qui sont communs avec l'antigène polysaccharidique capsulaire de Cryptococcus neoformans . Cet antigène peut donc entraîner un faux po¬ sitif dans ce test d'agglutination au latex cryptococ¬ cique. II est donc nécessaire, d'après cet article, d'être prudent lors de l'interprétation d'un test d'agglutination au latex cryptococcique positif à partir d'un sérum de patient immunodéprimé dans lequel a été mis en évidence des Trichosporon beigelii en culture.
T. TAKEUCHI et al. (J. Pathol., 1988, _15β, 23- 27) rappellent que le diagnostic de l'infection par Tri- chosporon beigelii, qui est observée de plus en plus fré¬ quemment chez des patients immunodéprinnés, est réalisé par cultures (hémocultures)ou par observation histolo- gique du champignon et que ce diagnostic n'est pas tou- jours facile à interpréter en raison des possibilités de confusion entre ce champignon et l'espèce Candida . Les Auteurs proposent deux anticorps monoclonaux qui permet¬ tent de distinguer T. beigelii d'autres champignons et de détecter de manière plus spécifique T. beigelii sur des coupes de tissus inclus dans de la paraffine. Les anti¬ corps décrits dans cet article, ne réagissent ni avec Cryptococcus neoformans, ni avec Candida albicans . L'un de ces deux anticorps (K-16) permet de détecter spécifi¬ quement T. beigelii, réagit à la fois avec les formes le- vures et les formes hyphes, la réactivité n'étant pas perdue après fixation au formol et inclusion dans de la paraffine. L'autre anticorps (K-30) réagit préférentiel- lement avec les formes levures tuées à l'éthanol et fixées à l'acétone. L'existence de réactions croisées d'une varia¬ tion de sensibilité importante et de la difficulté de préparer les immunoglobulines dirigées contre Cryptococ¬ cus neoformans, ont conduit la Demanderesse à mettre au point un test de diagnostic de la cryptococcose facile à mettre en oeuvre, d'un coût moindre, dans la mesure où 1'agent de diagnostic est préparé plus facilement que les agents proposés dans l'Art antérieur et d'une sensibilité nettement améliorée (de l'ordre de 10 ng/ml) par rapport aux tests proposés dans l'Art antérieur. La présente invention a pour objet des anti¬ corps dirigés contre Cryptococcus neoformans, caractéri- ses en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'un ani¬ mal approprié par un champignon qui présente une commu¬ nauté antigenique avec Cryptococcus neoformans et qui est immunogène, en ce qu'il s'agit d'immunoglobulines G, et en ce qu'ils présentent une grande affinité pour Crypto¬ coccus neoformans, exprimée d'une part par un titre d'ag¬ glutination desdits Cryptococcus neoformans au moins égal au l/100ème et d'autre part par un seuil de détection des antigènes solubles capsulaires polysaccharidiques circu- lants de Cryptococcus neoformans compris entre 10 et 50 ng/ml, dans un tampon approprié et lorsque lesdits anticorps sont fixés sur des billes de latex appropriées.
Selon un mode de réalisation avantageux des¬ dits anticorps, ils sont obtenus par immunisation d'un animal approprié par un champignon du genre Trichosporon .
Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, le Trichosporon est une souche de Trichospo¬ ron beigelii.
La souche de Trichosporon beigelii est de pré- férence une souche IP n* T49 1495-83. Cette souche a été déposée à la Collection Nationale de Culture des Microor¬ ganismes (CNCM) , tenue par l'Institut Pasteur, le 22 sep¬ tembre 1983.
Le champignon Trichosporon, notamment, permet d'obtenir des anticorps qui reconnaissent Cryptococcus neoformans, alors qu'il est très difficile d'obtenir une immunisation correcte et reproductible, directement à partir de Cryptococcus neoformans .
Les animaux appropriés à l'immunisation sont en particulier des mammifères, mais peuvent également être des gallinacés.
Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits anticorps, le tampon est un tampon glycine.
Selon un autre mode dé réalisation avantageux, lesdits anticorps sont des anticorps polyclonaux.
Selon un autre mode de réalisation avantageux. lesdits anticorps sont des anticorps monoclonaux.
Lesdits anticorps monoclonaux sont obtenus par clonage d'hybridomes résultant de la fusion de cellules myélomateuses appropriées et de cellules spléniques i mu- nisées par un antigène constitué par une souche appro¬ priée de Trichosporon beigelii, notamment la souche T49 1495-83 en mettant en oeuvre une technique de clonage appropriée.
La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic sous forme de particules, pour la détection des antigènes solubles de Cryptococcus neo¬ formans dans des fluides biologiques, caractérisé en ce que lesdites particules sont recouvertes d'un anticorps conforme à l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux dudit réactif, lesdites particules sont choisies dans le groupe qui comprend les billes de latex et les billes magné¬ tiques, telles que décrites notamment dans le Brevet français 7 536 889. La présente invention a également pour objet un procédé de détection de l'antigène soluble circulant polysaccharidique capsulaire de Cryptococcus neoformans, éventuellement présent dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en présence ledit échan- tillon biologique avec le réactif de diagnostic conforme à l'invention, après quoi l'agglutination du complexe an¬ tigène polysaccharidique capsulaire-réactif de diagnostic est appréciée par tout moyen approprié.
Le procédé conforme à l'invention a l'avantage d'être nettement plus sensible que les tests proposés dans l'art antérieur et n'entraîne en particulier pas d'autoagglutination des billes c latex entre elles.
La présente invention a, de plus, pour objet une trousse de diagnostic prête à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de détection de cryptococcose conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées de réactif de diagnostic conforme à l'invention.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'antigène cryptococcique polysac¬ charidique circulant, caractérisé en ce que l'on procède à la fixation dudit antigène sur une colonne d'affinité sur laquelle sont fixés les anticorps conformes à l'invention, puis en ce que l'on procède à une élution appropriée desdits antigènes.
Un tel procédé permet d'obtenir spécifiquement les antigènes cryptococciques.
La présente invention a, de plus, pour objet les antigènes obtenus à l'aide du procédé conforme à l'invention ci-dessus.
La présente invention a, en outre, pour objet une composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un antigène conforme à l'invention, éventuelle¬ ment associé à un adjuvant et/ou à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se ré¬ fère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1 : Préparation d'anticorps polyclo- naux conformes à l'invention. a. Préparation des antigènes : Des précultures de Trichosporon beigelii (souche dite T 49, IP 1495-83) sont réalisées par inoculation de fioles de 500 ml contenant 100 ml de mi¬ lieu de culture Sabouraud chloramphénicol, liquide. L'incubation est de 48 heures, à 30°C, avec agitation
(150 tours par min) . 10 ml de ces précultures servent à ensemencer des fioles de deux litres contenant 400 ml du même milieu de culture, qui sont ensuite incubées dans les mêmes conditions que les précultures .
Les cellules sont traitées de différentes ma¬ nières :
1) Cellules vivantes : après trois lavages en eau physiologique, une suspension de 10' est obtenue par comptage au microscope en cellule de Mallassez.
2) Cellules tuées : soit par traitement par le formol à 1 % pendant une nuit, soit par chauffage à 100*C pendant une heure. Le contrôle de la mort des cellules est fait par ensemencement des suspensions traitées. Des suspensions à 2 % ou 20 % sont alors préparées en présence de NaCl à 0,9 %.
La souche T 49 présente les caractéristiques morphologiques et physiologiques des Trichosporon beige¬ lii . La communauté antigenique de cette souche avec Cryp- tococcus neoformans a pu être prouvée. Le surnageant de culture de 48 heures, à 30*C en milieu liquide agité, agglutine au l/2000è les billes de latex recouvertes d'anticorps spécifiques des antigènes solubles de Crypto¬ coccus neoformans. b. Immunisation des lapins :
Des lapins de race New Zealand, pesant 2,5 kg, ont servi aux immunisations. Le sang est recueilli sur tube sec par saignée de l'artère centrale de l'oreille. Après coagulation de 24 heures, le sérum est obtenu par centrifugation à 2000 tours par minute. Il est conservé à -20"C. Les immunoglobulines G sont ensuite extraites par purification.
L'immunisation est réalisée par multiinjection sous cutanée (volume total 1ml) d'une suspension à 20 % de Trichosporon tués.
La première injection est effectuée avec de 1'adjuvant complet de Freund, les suivantes avec de l'adjuvant incomplet. Ces injections sont répétées jusqu'à l'obtention d'un titre d'agglutination au moins égal au l/100è. c. Contrôle de l'immunisation :
1) Agglutination avec Trichosporon beigelii
Le contrôle d'immunisation se réalise par ag¬ glutination sur plaque, par le mélange de 25 μl d'une suspension de 2xl07 cellules/ml de T 49 [culture de 48 heures lavée trois fois en tampon glycine (glycine buffe- red saline GBS 0,1 M ou G.B.S.) avec 25 μl de sérum ou de ses dilutions en tampon G.B.S.]. Après 10 minutes d'agitation à 200 tours par minute, la lecture est faite soit directement sous un tube fluorescent, soit au micro- scope, pour différencier les degrés d'agglutination.
2) Agglutination avec Cryptococcus neoformans Après obtention du titre d'agglutination avec la suspension de Trichosporon beigelii, un contrôle est effectué dans les mêmes conditions avec une suspension de Cryptococcus neoformans NIH 68 (souche IP 1207-79, séro- type A) . d. Isolement des immunoglobulines : Les sérums répondant au 1/400 et 1/800 ont été traités de manière à obtenir, par purification à l'acide caproïque, les immunoglobulines G (M. STEINBUCH et R. AUDRAN, Archives Biochem. Biophys., 1969, 134, 279-284, "The isolation of IgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid") .
Exemple 2 : Préparation d'un réactif de dia- gnostic conforme à l'invention.
Différentes concentrations d'immunoglobulines
(90 à 200 μg/ml) sont fixées sur des billes de latex en tampon glycine (G.B.S.) (Prolabo) , en association ou non avec de la sérum albumine bovine (0 à 100 μg/ml) . 1ml de chacune de ces préparations est mélangée avec 1 ml de billes de latex. Le mélange est incubé à 37"C pendant 45 min, sous agitation à 100 tours par minute. Puis 0,5 ml d'une solution, comprenant pour 300 ml de la sérum albu¬ mine bovine à 30 % (SAB) (100 ml) et du G.B.S. (200 ml) est ajoutée audit mélange, puis celui-ci est incubé dans les mêmes conditions que précédemment, pendant 30 mi¬ nutes.
Une centrifugation de 10 minutes à 20 000 g permet la séparation des billes de latex du milieu de réaction. On ajoute au culot de centrifugation 2,5 ml d'une solution stabilisante comprenant pour 1000 ml : saccharose 54,0 g, NaCl 0,3 g, SAB 30 % (Sigma) 67,0 ml, Merthiolate 0,18 g, G.B.S. 933,0 ml). On obtient ainsi le réactif de diagnostic conforme à l'invention qui est alors conservé à +4°C, jusqu'à son emploi. Tous les tubes ou flacons dans lesquels a été réalisée la préparation du latex, ont été préalablement lavés avec le tampon glycine.
Exemple 3 : Procédé de détection conforme à l'invention dans le sang. 1) Prélèvement des échantillons
- on prélève le sang aseptique ent sur tube sec sans anticoagulant ;
- on conserve le prélèvement dans un flacon en verre ou en polyéthylène hermétiquement fermé, puis on inactive les échantillons 30 minutes au bain marie à 56°.
2) Réactifs
- réactif A : latex réactif, i.e. latex sensi¬ bilisé par une globuline anticryptococcique de lapin ;
- réactif B :latex de contrôle, i.e. latex sensibilisé par une globuline de lapin non immunisé ;
- contrôle positif : antigène polysacchari¬ dique de Cryptococcus neoformans 0,200 μg/ml ;
- contrôle négatif : sérum de lapin non immu¬ nisé. 3) Dosage qualitatif
- sur une plaque de verre propre, déposer sur deux puits, 25 μl de l'échantillon à examiner ;
- ajouter 25 μl de latex réactif dans l'un des puits, 25 μl de latex contrôle dans l'autre puits ;
- mélanger le contenu de chaque puits sur toute la surface du puits, avec un agitateur différent ;
- placer la plaque de verre sur un agitateur rotatif pendant 10 minutes à température ambiante, à 160 tours/mn ;
- observer immédiatement sous une source lumi¬ neuse et sur fond noir, la présence ou l'absence d'agglutination.
Les contrôles positif et négatif doivent être traités comme le sérum à examiner.
Un résultat positif correspond à une aggluti¬ nation franche du latex réactif et à l'absence d'agglutination du latex contrôle.
4) Dosage quantitatif - préparer une série de dilutions de l'échantillon du 1/2 au 1/256 dans le tampon glycine ;
- prendre deux plaques propres et déposer 25 μl de chaque dilution (rang A : latex réactif ; rang B : latex contrôle) ; - ajouter 25 μl de latex réactif dans les puits du rang A et 25 μl de latex contrôle dans ceux du rang B, et mélanger sur toute la surface du puits avec un agitateur à usage unique ;
- placer 10 minutes sur un agitateur rotatif à 160 tours/mn, puis effectuer la lecture sous une source lumineuse et sur fond noir.
Le titre est donné par la plus grande dilution présentant une agglutination. Exemple 4 : Procédé de détection conforme à l'invention dans le liquide céphalo-rachidien.
Le protocole est identique à celui de l'exemple 3, à l'exception du prélèvement qui diffère en ce que le LCR est centrifugé 10 minutes à 1000 x g ou filtré sur filtre 0,2 μm, puis il est placé en flacon de verre ou de polyéthylène hermétiquement fermé.
Exemple 4 : Sensibilité du procédé de détec¬ tion conforme à l'invention. On compare le "CRYPTO LA TEST" qui comprend comme réactifs, un réactif A constitué par des billes de latex sensibilisées par une globuline anticryptococcique de lapin, un réactif B constitué par des billes de latex recouvertes par une globuline de lapin non immunisé, un contrôle positif constitué par an antigène polysacchari¬ dique de C. neoformans 0,25 μg/ml, un contrôle négatif constité par un sérum de lapin non immunisé et un tampon approrpié stabilisé avec un conservateur, avec un test conforme à l'invention. On constate : - une plus grande sensibilité en tampon gly¬ cine : la concentration limite de détection du polysac¬ charide de Cryptococcus neoformans est de 10 ng/ml, soit six fois plus faible que celle obtenue avec le "CRYPTO LA TEST", - une plus grande sensibilité en sérum : les titres trouvés sont en moyenne quatre fois supérieurs à ceux obtenus avec le CRYPTO LA TEST,
- une plus grande sensibilité en L.C.R.: même résultat que pour le sérum, - une absence d'autoagglutination en sérum : particulièrement sensible lors du test d'agglutination,
- une absence d'autoagglutination en L.C.R.: particulièrement sensible lors du test d'agglutination.
Figure imgf000014_0001
* conditions optimales . (1) LCR de patients atteints de cryptococcose méningée.
(2) LCR de patients ne présentant pas de cryptococcose.
(3) sérums de patients atteints de cryptococcose généralisée.
(4) sérums de patients ne présentant pas de cryptococcose.
Dans ce tableau, la colonne "sensibilité de détection" indique la concentration minimum d'antigène cryptococcique décelée par "CRYPTO LA TEST" (marque déposée) et le test conforme à l'invention. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de réalisation qui viennent d'être décrits de façon expli¬ cite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Anticorps dirigés contre Cryptococcus neoformans, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'un animal approprié par un champignon qui présente une communauté antigenique avec Cryptococcus neoformans et qui est immunogène, en ce qu'il s'agit d'immunoglobulines G, et en ce qu'ils présentent une grande affinité pour Cryptococcus neoformans, exprimée d'une part par un titre d'agglutination desdits Crypto¬ coccus neoformans au moins égal au l/100ème et d'autre part par un seuil de détection des antigènes solubles capsulaires polysaccharidiques circulants de Cryptococcus neoformans compris entre 10 et 50 ng/ml, dans un tampon approprié et lorsque lesdits anticorps sont fixés sur des billes de latex appropriées.
2°) Anticorps selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'un animal approprié par un champignon du genre Trichosporon.
3*) Anticorps selon la revendication 2, caractérisés en ce que ledit Trichosporon est une souche de Trichosporon beigelii .
4°) Anticorps selon -l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le tampon est un tampon glycine.
5*) Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que lesdits anticorps sont des anticorps polyclonaux. 6*) Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que lesdits anticorps sont des anticorps monoclonaux.
7*) Réactif de diagnostic sous forme de particules pour la détection d'antigènes solubles de Cryptococcus neoformans dans des fluides biologiques, caractérisé en ce que lesdites particules sont recouvertes d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
8°) Réactif selon la revendication 7, caractérisé en ce que lesdites particules sont choisies dans le groupe qui comprend les billes de latex et les billes magnétiques.
9*) Procédé de détection de l'antigène circulant polysaccharidique capsulaire de Cryptococcus neoformans, éventuellement présent dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que l'on met en présence ledit échantillon biologique avec un réactif de diagnostic selon la revendication 7 ou la revendication 8, après quoi l'agglutination du complexe antigène polysaccharidique capsulaire-réactif de diagnostic est appréciée par tout moyen approprié.
10°) Trousse de diagnostic prête à l'emploi, pour la mise en oeuvre du procédé de détection de crypto¬ coccose selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend, outre des quantités utiles de tampons appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection, des doses appropriées de réactif de diagnostic selon la revendication 7 ou la revendication 8.
11°) Procédé d'obtention d'antigène cryptococcique polysaccharidique circulant, caractérisé en ce que l'on procède à la fixation dudit antigène sur une colonne d'affinité sur laquelle sont fixés les anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, puis en ce que l'on procède à une élution appropriée desdits antigènes. 12°) Antigènes obtenus à l'aide du procédé selon la revendication 11.
13°) Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend un antigène selon la revendication 11, éventuellement associé à un adjuvant et/ou à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
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