JP2746898B2 - 動物細胞の培養方法 - Google Patents
動物細胞の培養方法Info
- Publication number
- JP2746898B2 JP2746898B2 JP63050333A JP5033388A JP2746898B2 JP 2746898 B2 JP2746898 B2 JP 2746898B2 JP 63050333 A JP63050333 A JP 63050333A JP 5033388 A JP5033388 A JP 5033388A JP 2746898 B2 JP2746898 B2 JP 2746898B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- culture
- cells
- immobilized
- gel
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は動物細胞の培養方法に関する。更に詳しく
は、アルギン酸塩ゲルにより固定化された動物細胞を長
期間安定に、かつ収率よく培養する方法に関する。
は、アルギン酸塩ゲルにより固定化された動物細胞を長
期間安定に、かつ収率よく培養する方法に関する。
細胞培養技術は、例えばウイルス、ワクチン、インタ
ーフェロンの如き抗ウイルス剤或いはホルモンの如き生
物薬品の製品にとって重要である。更に近年、特定タン
パク質などを標的とするモノクローナル抗体の生産は抗
体産生細胞とミエローマによるハイブリドーマの培養に
よるものであり、その技術の解決は工業的に重要なテー
マである。
ーフェロンの如き抗ウイルス剤或いはホルモンの如き生
物薬品の製品にとって重要である。更に近年、特定タン
パク質などを標的とするモノクローナル抗体の生産は抗
体産生細胞とミエローマによるハイブリドーマの培養に
よるものであり、その技術の解決は工業的に重要なテー
マである。
従来、細胞培養は一般にシャーレ試験管、培養びんな
どを用いて実験室的規模で行われている。
どを用いて実験室的規模で行われている。
一方、近年、細胞の大量培養を目的としてその培養法
及びそのための装置として、いくつかの提案がなされて
いる。これらの提案は、大きく分けて付着培養（anchor
age dependent culture）と、浮遊培養、つまりサスペ
ンジョン培養（suspension culture）との２つの方式に
分類されるが、これらの方式は培養される細胞の特性に
よっていずれかに決められる。後者のサスペンジョン培
養によって細胞を培養する方法に関し、最近いくつかの
提案があり、例えばマグネティックスターラーもしくは
機械的に駆動されるシャフト上の羽根車によって、スピ
ナーフラスコの中に調整された撹拌機能を設けた培養方
法などが提案されている（例えば特開昭57−65180号公
報参照）。
及びそのための装置として、いくつかの提案がなされて
いる。これらの提案は、大きく分けて付着培養（anchor
age dependent culture）と、浮遊培養、つまりサスペ
ンジョン培養（suspension culture）との２つの方式に
分類されるが、これらの方式は培養される細胞の特性に
よっていずれかに決められる。後者のサスペンジョン培
養によって細胞を培養する方法に関し、最近いくつかの
提案があり、例えばマグネティックスターラーもしくは
機械的に駆動されるシャフト上の羽根車によって、スピ
ナーフラスコの中に調整された撹拌機能を設けた培養方
法などが提案されている（例えば特開昭57−65180号公
報参照）。
しかし、上記の如きサスペンジョン培養方法において
は、一定量の栄養分の中で培養されるため、細胞の成長
増殖は比較的低い密度で停止する。
は、一定量の栄養分の中で培養されるため、細胞の成長
増殖は比較的低い密度で停止する。
そこで、本発明者らは動物細胞の高密度培養法につい
て検討を行い、アルギン酸カルシウム等のアルギン酸塩
ゲルによる動物細胞の固定化が有効であることを見出し
既に報告した〔Appl.Microb.Biotech.,26,495（198
7）、化工協会第20回秋季大会講演要旨集347、姫路（19
87）〕。
て検討を行い、アルギン酸カルシウム等のアルギン酸塩
ゲルによる動物細胞の固定化が有効であることを見出し
既に報告した〔Appl.Microb.Biotech.,26,495（198
7）、化工協会第20回秋季大会講演要旨集347、姫路（19
87）〕。
しかしながら、上記の固定化ゲルの強度が培養時間の
経過とともに低下し、培養中に破壊したり、溶解したり
して、長期間の培養に耐えられないという新たな問題が
生じた。
経過とともに低下し、培養中に破壊したり、溶解したり
して、長期間の培養に耐えられないという新たな問題が
生じた。
そこで、本発明者らは固定化ゲルの強度低下を抑える
べく鋭意研究を行った結果、ゲル中のカルシウムイオン
が培地中のリン酸イオンと容易に結合するという事実に
着目し、培養液中のリン源として無機リン酸塩に代えて
グルコース−１−リン酸を用いることにより、ゲル強度
の低下が抑えられるとともに、細胞の増殖が飛躍的に増
大し、目的物も収率よく生産されることを見出し、本発
明を完成した。
べく鋭意研究を行った結果、ゲル中のカルシウムイオン
が培地中のリン酸イオンと容易に結合するという事実に
着目し、培養液中のリン源として無機リン酸塩に代えて
グルコース−１−リン酸を用いることにより、ゲル強度
の低下が抑えられるとともに、細胞の増殖が飛躍的に増
大し、目的物も収率よく生産されることを見出し、本発
明を完成した。
即ち本発明は、アルギン酸塩ゲルによる固定化動物細
胞の培養において、培養液のリン源としてグルコース−
１−リン酸又はその塩を用いることを特徴とする動物細
胞の培養方法を提供するものである。
胞の培養において、培養液のリン源としてグルコース−
１−リン酸又はその塩を用いることを特徴とする動物細
胞の培養方法を提供するものである。
本発明に用いられるアルギン酸塩はアルギン酸の多価
金属塩であって、特にカルシウム塩、ストロンチウム塩
が好ましい。アルギン酸塩ゲルによる固定化動物細胞
は、アルギン酸アルカリ金属塩溶液に動物細胞を懸濁さ
せた溶液を多価金属イオンを含む溶液中に滴下する方
法、或いは多価金属イオンを存在させた動物細胞懸濁液
をアルギン酸アルカリ金属塩溶液に滴下する方法により
容易に得られる。アルカリ金属塩としてはナトリウム
塩、カリウム塩が使用できる。
金属塩であって、特にカルシウム塩、ストロンチウム塩
が好ましい。アルギン酸塩ゲルによる固定化動物細胞
は、アルギン酸アルカリ金属塩溶液に動物細胞を懸濁さ
せた溶液を多価金属イオンを含む溶液中に滴下する方
法、或いは多価金属イオンを存在させた動物細胞懸濁液
をアルギン酸アルカリ金属塩溶液に滴下する方法により
容易に得られる。アルカリ金属塩としてはナトリウム
塩、カリウム塩が使用できる。
上記の多価金属イオンを含む溶液、例えばカルシウム
イオン又はストロンチウムイオンを含む溶液としては、
塩化カルシウム又は塩化ストロンチウム水溶液が好まし
く用いられるが、濃度はアルギン酸多価金属塩のゲルが
形成する濃度であればよく、通常0.5〜１％程度のもの
が用いられる。
イオン又はストロンチウムイオンを含む溶液としては、
塩化カルシウム又は塩化ストロンチウム水溶液が好まし
く用いられるが、濃度はアルギン酸多価金属塩のゲルが
形成する濃度であればよく、通常0.5〜１％程度のもの
が用いられる。
アルギン酸アルカリ金属塩溶液の濃度も特に限定され
ないが、通常アルギン酸ナトリウム又はカリウムの0.5
〜５％程度の水溶液が好ましい。
ないが、通常アルギン酸ナトリウム又はカリウムの0.5
〜５％程度の水溶液が好ましい。
本発明の培養方法において、培養する動物細胞として
は、本発明方法の培養条件下にて増殖可能なものであれ
ばよく、天然の動物細胞のみならず、人為的或いは遺伝
子操作により変性された細胞、例えばハイブリドーマで
あってもよい。
は、本発明方法の培養条件下にて増殖可能なものであれ
ばよく、天然の動物細胞のみならず、人為的或いは遺伝
子操作により変性された細胞、例えばハイブリドーマで
あってもよい。
また細胞として、1L−２の如きリンホカインを産生す
るリンパ球由来の細胞であってもよく、インターフェロ
ン（INF）の如き有用な生理活性物質を産生する２倍体
細胞であってもよい。さらに種々のモノクローナル抗体
を産生する細胞であってもよく、本発明はかかるモノク
ローナル抗体を産生する細胞の培養に於いてモノクロー
ナル抗体を高い濃度で得る目的のために特に適してい
る。
るリンパ球由来の細胞であってもよく、インターフェロ
ン（INF）の如き有用な生理活性物質を産生する２倍体
細胞であってもよい。さらに種々のモノクローナル抗体
を産生する細胞であってもよく、本発明はかかるモノク
ローナル抗体を産生する細胞の培養に於いてモノクロー
ナル抗体を高い濃度で得る目的のために特に適してい
る。
固定化動物細胞の濃度は増殖を考慮すれば格別高濃度
とする必要はなく、約103〜106個/cm3ゲル程度の濃度で
よい。
とする必要はなく、約103〜106個/cm3ゲル程度の濃度で
よい。
動物細胞を固定化したアルギン酸塩ゲル粒子は、その
平均径が0.5〜5mm、好ましくは0.8〜4mmの範囲である。
平均径が0.5〜5mm、好ましくは0.8〜4mmの範囲である。
本発明は、アルギン酸塩ゲルにより固定化した動物細
胞を、リン源としてグルコース−１−リン酸又はその塩
を含有る培養液中で培養することを特徴とするものであ
って、培養液中でのグルコース−１−リン酸又はその塩
の配合量は、従来使用されてきた無機リン酸塩と同量
（モル数）であればよく、動物細胞の種類等により異な
るが、通常0.1〜10ミリモル／である。
胞を、リン源としてグルコース−１−リン酸又はその塩
を含有る培養液中で培養することを特徴とするものであ
って、培養液中でのグルコース−１−リン酸又はその塩
の配合量は、従来使用されてきた無機リン酸塩と同量
（モル数）であればよく、動物細胞の種類等により異な
るが、通常0.1〜10ミリモル／である。
培養液は好ましくは実質的に水よりなる水性媒体に、
種々の無機塩、ビタミン塩、補酵素、ブドウ糖、アミノ
酸、抗生物質、成長促進因子などの通常細胞培養に使用
される添加成分が加えられている。また培養液には血清
を加えることもできるし、血清を用いない所謂無血清培
地を培養液として使用することもできる。
種々の無機塩、ビタミン塩、補酵素、ブドウ糖、アミノ
酸、抗生物質、成長促進因子などの通常細胞培養に使用
される添加成分が加えられている。また培養液には血清
を加えることもできるし、血清を用いない所謂無血清培
地を培養液として使用することもできる。
本発明に用いられる培養方法は特に限定されないが、
通常固定化細胞培養に用いられる方法、例えば特開昭62
−163688号公報に記載する流動層形成による培養方法或
いは撹拌槽型培養法や気泡塔培養法が挙げられる。
通常固定化細胞培養に用いられる方法、例えば特開昭62
−163688号公報に記載する流動層形成による培養方法或
いは撹拌槽型培養法や気泡塔培養法が挙げられる。
本発明の方法を用いることにより、動物細胞を固定化
したアルギン酸塩ゲル粒子を長期間にわたって安定に保
持し培養することが出来るとともに、動物細胞の増殖が
著しく増大し、高収率で目的物を生産することが出来る
ようになり、動物細胞の工業的規模での培養が可能とな
った。
したアルギン酸塩ゲル粒子を長期間にわたって安定に保
持し培養することが出来るとともに、動物細胞の増殖が
著しく増大し、高収率で目的物を生産することが出来る
ようになり、動物細胞の工業的規模での培養が可能とな
った。
また、本発明の実施にあたって、培養液中にカルシウ
ムイオン又はストロンチウムイオンを添加しておけば、
さらにゲル強度を強化することができる。このことは、
培養液のリン源として無機リン酸塩の代わりにグルコー
ス−１−リン酸を用いることにより初めて可能となるの
であって、無機リン酸塩の場合にはカルシウムイオン又
はストロンチウムイオンを添加するとリン酸カルシウム
又はリン酸ストロンチウムとなって沈澱してしまう。よ
って、これも本発明の顕著な効果といえるものである。
ムイオン又はストロンチウムイオンを添加しておけば、
さらにゲル強度を強化することができる。このことは、
培養液のリン源として無機リン酸塩の代わりにグルコー
ス−１−リン酸を用いることにより初めて可能となるの
であって、無機リン酸塩の場合にはカルシウムイオン又
はストロンチウムイオンを添加するとリン酸カルシウム
又はリン酸ストロンチウムとなって沈澱してしまう。よ
って、これも本発明の顕著な効果といえるものである。
更に、驚くべくことは、リン源としてグルコース−１
−リン酸又はその塩を用いたことにより、動物細胞の阻
害物質である乳酸の生成が抑制されることが見出され
た。即ち、動物細胞の培養に無機リン酸塩に代えグルコ
ース−１−リン酸を用いれば細胞の増殖はもとより目的
物の生産も増大することが明らかである。この現象は細
胞を固定化する、しないにかかわらず発現する。従って
本発明は、広く培養液のリン源としてグルコース−１−
リン酸又はその塩を用いる動物細胞の培養方法を提供す
るものである。
−リン酸又はその塩を用いたことにより、動物細胞の阻
害物質である乳酸の生成が抑制されることが見出され
た。即ち、動物細胞の培養に無機リン酸塩に代えグルコ
ース−１−リン酸を用いれば細胞の増殖はもとより目的
物の生産も増大することが明らかである。この現象は細
胞を固定化する、しないにかかわらず発現する。従って
本発明は、広く培養液のリン源としてグルコース−１−
リン酸又はその塩を用いる動物細胞の培養方法を提供す
るものである。
以下本発明を実施例について説明するが、本発明はこ
れらの実施例により限定されるものではない。
れらの実施例により限定されるものではない。
実施例 １ （１） 実験方法 細胞の固定化と培養 マウスミエローマP3U1株とヒトＢセルを融合して得ら
れたヒト型モノクローナル抗体（IgA）生産株マウスヒ
トハイブリドーマ、4H11株を下記の培地に懸濁した後、
当量の２％アルギン酸ナトリウム水溶液を混合した。こ
の混合物を１％CaCl2水溶液及び１％SrCl2水溶液中に夫
々滴下してゲル化し、上記細胞を包括固定化したゲルを
得た。これらのゲルの平均径は2mmであった。
れたヒト型モノクローナル抗体（IgA）生産株マウスヒ
トハイブリドーマ、4H11株を下記の培地に懸濁した後、
当量の２％アルギン酸ナトリウム水溶液を混合した。こ
の混合物を１％CaCl2水溶液及び１％SrCl2水溶液中に夫
々滴下してゲル化し、上記細胞を包括固定化したゲルを
得た。これらのゲルの平均径は2mmであった。
使用培地にはRDF培地（Appl.Microb.Biotech.,26,495
（1987））を使用し、培地中にストロンチウムイオンSr
2+を添加する際には、RDF培地よりリン酸を除き、リン
源として等量のグルコース−１−リン酸（以下G1Pと略
す）を加えた。なおこの際、G1Pは糖源としても利用で
きるので、RDF培地より添加したG1Pと等モルのグルコー
スを抜き取ったものを使用した。
（1987））を使用し、培地中にストロンチウムイオンSr
2+を添加する際には、RDF培地よりリン酸を除き、リン
源として等量のグルコース−１−リン酸（以下G1Pと略
す）を加えた。なおこの際、G1Pは糖源としても利用で
きるので、RDF培地より添加したG1Pと等モルのグルコー
スを抜き取ったものを使用した。
固定化細胞の培養は以下の手順に従った。
1. 固定化細胞1gを直径6cmのペトリディッシュに入
れ、培地8mlを加えCO2インキュベータ内で培養する。
れ、培地8mlを加えCO2インキュベータ内で培養する。
2. 栄養分の供給と老廃物の除去のため毎日培地を交換
する。
する。
回収培地中のIgA濃度を測定すれば、ゲルあたりのIgA
生産性がわかる。
生産性がわかる。
固定化細胞ゲル強度の測定 ゲル強度の測定は、ゲルに荷重を掛け、ゲルを破壊す
る荷重を測定することにより評価した。
る荷重を測定することにより評価した。
（２） 実験結果 アルギン酸ストロンチウム固定化4H11の培養におい
て、通常のRDF培地とSr2+添加G1P含有培地を使用した際
のIgA生産性を図１に示した。図から本発明による培地
の方が高いIgA生産性を示すことがわかる。
て、通常のRDF培地とSr2+添加G1P含有培地を使用した際
のIgA生産性を図１に示した。図から本発明による培地
の方が高いIgA生産性を示すことがわかる。
表１には培養２週間目の固定化ゲル１個を破壊するの
に必要な荷重を示した。本発明培地により培養したゲル
はG1Pを添加しないRDF培地で培養したゲルに比べ、４倍
から30倍も強固であることがわかる。
に必要な荷重を示した。本発明培地により培養したゲル
はG1Pを添加しないRDF培地で培養したゲルに比べ、４倍
から30倍も強固であることがわかる。
実施例 ２ 固定化しない培養におけるG1Pの効果 次に固定化培養において、本発明の培地の方が通常の
RDF培地より高いIgA生産性を示す原因を明らかにするた
めに、固定化しない条件で細胞を培養した。その結果を
表２に示す。表より細胞密度、IgA生産性とも、本発明
の培地を用いる方が高い値で得られている。一方、生育
阻害物質である乳酸の生産量は本発明の培地を用いた方
が低く、これが本発明による培地を用いた方がIgA生産
性が高くなる主原因であると考えられる。
RDF培地より高いIgA生産性を示す原因を明らかにするた
めに、固定化しない条件で細胞を培養した。その結果を
表２に示す。表より細胞密度、IgA生産性とも、本発明
の培地を用いる方が高い値で得られている。一方、生育
阻害物質である乳酸の生産量は本発明の培地を用いた方
が低く、これが本発明による培地を用いた方がIgA生産
性が高くなる主原因であると考えられる。
図１は固定化4H11のIgA生産性に及ぼすG1PとSr2+の影響
を示す図である。
を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】アルギン酸塩ゲルによる固定化動物細胞の
培養において、培養液のリン源としてグルコース−１−
リン酸又はその塩を用いることを特徴とする動物細胞の
培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63050333A JP2746898B2 (ja) | 1988-03-03 | 1988-03-03 | 動物細胞の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63050333A JP2746898B2 (ja) | 1988-03-03 | 1988-03-03 | 動物細胞の培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01222772A JPH01222772A (ja) | 1989-09-06 |
| JP2746898B2 true JP2746898B2 (ja) | 1998-05-06 |
Family
ID=12855989
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63050333A Expired - Lifetime JP2746898B2 (ja) | 1988-03-03 | 1988-03-03 | 動物細胞の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2746898B2 (ja) |
-
1988
- 1988-03-03 JP JP63050333A patent/JP2746898B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ．２４８，Ｎｏ．３（１９８７）ｐ．９２７−９３２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01222772A (ja) | 1989-09-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ley et al. | REGULATION OF INITIATION OF DNA SYNTHESIS IN CHINESE HAMSTER CELLS: II. Induction of DNA Synthesis and Cell Division by Isoleucine and Glutamine in G1-Arrested Cells in Suspension Culture | |
| JP2004532642A5 (ja) | ||
| JP2525436B2 (ja) | 細胞培養による蛋白質の製造 | |
| Birch et al. | Selecting and designing cell lines for improved physiological characteristics | |
| US20070148753A1 (en) | Preparation of cells for production of biologicals | |
| JP2746898B2 (ja) | 動物細胞の培養方法 | |
| Kong et al. | Long-term stable production of monocyte-colony inhibition factor (M-CIF) from CHO microcarrier perfusion cultures | |
| JP2017508448A (ja) | かん流培地 | |
| JPH0416153B2 (ja) | ||
| US3959074A (en) | Vaccine production | |
| JPH02219568A (ja) | 動物細胞の培養方法 | |
| JPH01296981A (ja) | 動物細胞の培養方法 | |
| JP2757400B2 (ja) | 細胞培養法 | |
| ES2237200T3 (es) | Produccion de proteinas. | |
| RU2201958C2 (ru) | Сухая стерильная малосывороточная питательная среда для культивирования клеток млекопитающих | |
| JPS63237782A (ja) | 付着性動物細胞の培養方法 | |
| Kim et al. | Crystallization and preliminary X‐ray crystallographic analysis of arylesterase from Pseudomonas fluorescens | |
| JPS624117B2 (ja) | ||
| US11254964B1 (en) | Cell culture methods for increased cell viability | |
| JPH04506448A (ja) | Ｆ８活性を有する蛋白質および／またはｆ８誘導体の製造法 | |
| JPS62163688A (ja) | 動物細胞の培養方法 | |
| Okeson et al. | Glutamine replenishment and ammonia removal in hybridoma cell cultures via immobilized glutamine synthetase | |
| JPS63209582A (ja) | 付着性動物細胞の培養方法 | |
| JP2002527057A (ja) | タンパク質を製造するためのチャイニーズハムスター卵巣細胞 | |
| JPS6163283A (ja) | ハイブリ−ド−マの培養方法 |