ES2237200T3 - Produccion de proteinas. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la producción de una proteína por cultivo celular que comprende las etapas de: cultivar células NS0 transformadas por recombinación que producen de forma constitutiva dicha proteína en un medio de cultivo, el cual comprende ácido butírico o una sal metálica del mismo a una concentración mantenida de aproximadamente 0, 075 mM.

Description

Producción de proteínas.

La presente invención se refiere a la producción de proteínas por técnicas de cultivo celular y, en particular, se refiere a procedimientos nuevos y mejorados para la producción de proteínas útiles en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas.

La producción comercial de proteínas por cultivo celular, en concreto para su uso en aplicaciones médicas, requiere de un costoso esfuerzo principalmente debido a los niveles relativamente bajos de proteínas (en concreto denominadas "proteínas extrañas") producidas por varios tipos de células. Una aproximación para abordar este problema es el uso de agentes para inducir que las células produzcan cantidades más elevadas de lo normal de la proteína deseada. Un ejemplo de tal agente es el ácido butírico o, más típicamente, una sal del mismo como por ejemplo el butirato de sodio, el cual se cree modifica la expresión de genes a un nivel molecular a través de su efecto en el estado de metilación del ADN, el cual afecta a su vez a la activación transcripcional de genes. El agente inductor sirve de complemento a los medios de cultivos durante el procedimiento de cultivo, y va típicamente seguido de un período de cultivo celular. Durante el procedimiento, los medios de cultivo que incluyen el agente inductor se pueden cambiar por un procedimiento continuo en el que se añaden continuamente medios frescos a la vez que se elimina el medio antiguo, o bien, en un procedimiento de tipo lote, en el que de alguno de los medios se eliminan las células y se reemplaza.

En el documento EP 0 239 292 B1, se incubaron células NB1/19 con una serie de concentraciones de butirato de sodio que variaban de 0,1 mM a 1,0 mM durante un período de sólo aproximadamente 8 días. En el documento WO 89/06686 se sugiere un procedimiento para aumentar la producción de proteínas por medio de un cultivo de células eucarióticas a través de la adición de ácido butírico o de una de sus sales en concentraciones de 0,1 mM a 10,0 mM. En esta revelación, se favorece primero el crecimiento de las células hasta que confluyan antes de la adición del ácido o de la sal. Generalmente, esto está en línea con el pensamiento aceptado de que el ácido butírico, mientras que resulta efectivo en promover la producción de proteínas, tiene un efecto potencialmente perjudicial sobre la viabilidad de las células, haciendo que resulte prudente llevar a las células a una confluencia o a una población celular relativamente elevada, antes de exponerlas al ácido butírico.

En el documento US 5.705.364 se describe acerca del uso de un ácido alcanoico o de una de sus sales a unas concentraciones de entre 0,1 mM y 20 mM, junto con, opcionalmente, un control osmótico para incrementar de forma específica el contenido en ácido silac de las glicoproteínas. En el nº 21 de Nucleic Acid Res., 1983, 11, se investigan los efectos del butirato de sodio sobre la transferencia de genes mediadas por el ADN en concentraciones que varían de 2 a 10 mM. En Can. Res., Vol 46, Feb 1986, 713-716, se describe una investigación acerca de los efectos del butirato de sodio sobre la síntesis y mutilación el ADN en células normales y en sus equivalentes transformadas. En esta investigación se usan concentraciones que varían de 5 a 100 mM. En el documento US 5.378.612, se describe un medio de cultivo para cultivar las células transformadas. Los medios de cultivo pueden contener ácido butírico en una concentración de por ejemplo 1 mM.

Los autores de la presente invención han descubierto, contrariamente a las expectativas esperadas, que el uso y mantenimiento de concentraciones inusualmente bajas de un ácido alcanoico en medios de cultivo que comprenden cultivos celulares, conduce a una producción aumentada de proteínas, durante un largo período de tiempo, influyendo de manera significativa en la viabilidad celular. Además, la baja concentración de ácido alcanoico permite la presencia de ácido alcanoico en los medios de cultivo en una etapa más temprana en el procedimiento de cultivo que la descrita hasta la fecha.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para la producción de una proteína por cultivo celular que comprende las etapas de:

poner en cultivo células NS0 transformada por recombinación que producen de forma constitutiva dicha proteína en un medio de cultivo, el cual comprende ácido butírico o una de sus sales metálicas a una concentración mantenida de aproximadamente 0,075 mM.

Los expertos en la técnica entenderán que los términos "concentración mantenida" y "mantener la concentración" no implican necesariamente que la concentración en el medio de cultivo deba permanecer constante ya que se permite un cierto grado de variación en la concentración siempre que se alcancen los mismos resultados o similares. Por supuesto, 0 mM queda excluido del término "menos de 0,1 mM".

Las proteínas que se pueden producir por la presente invención incluyen proteínas eucarióticas terapéutica y/o diagnósticamente útiles que pueden producirse de forma natural o artificial (por ejemplo, proteínas de fusión). Son ejemplos de proteínas de la presente invención cuya producción puede resultar beneficiosa las hormonas, por ejemplo la hormona de crecimiento humana como ejemplo de hormona de crecimiento, enzimas, inhibidores de enzima o linfoquinas. El procedimiento de la presente invención resulta particularmente útil en la producción de inmunoglobulinas, por ejemplo anticuerpos o análogos o fragmentos de los mismos que se producen de forma natural o artificiales (quiméricos y humanizados).

Fragmentos adecuados de los mismos incluyen fragmentos Fab y Fv y anticuerpos de una sola cadena. Los anticuerpos pueden ser policlonales o más preferiblemente monoclonales de cualquier clase o subclase adecuada. Se prefiere que el anticuerpo sea una IgG, particularmente anticuerpo del tipo IgG_{1} o un fragmento derivado del mismo. Tales proteínas son preferiblemente adecuadas para su uso en el tratamiento terapéutico (incluyendo profiláctico) o diagnóstico de enfermedades humanas, como por ejemplo trastornos pro-inflamatorios como por ejemplo la artritis reumatoide, osteoartritis u otros trastornos. De esta forma, en el caso de anticuerpos, el anticuerpo se puede producir bajo una forma humanizada.

El ácido y/o sal del mismo está presente en los medios de cultivo celular en una concentración de aproximadamente 0,075 mM. Estas concentraciones proporcionan una producción de proteína útil con, durante un período prolongado, efectos adversos mínimos sobre la viabilidad celular. Además, la producción de proteínas por células expuestas a estas concentraciones parece menos variable en el tiempo que a concentraciones más elevadas, por ejemplo 0,1 mM. Esto resulta beneficioso a la hora de proporcionar una mayor consistencia durante cualquier recuperación de proteína que puede tener lugar durante el procedimiento de cultivo. Además se proporciona un grado de control sobre el procedimiento, el cual, se apreciará, se desea durante los procedimientos comerciales de fabricación.

Quedará claro para los expertos en la técnica que se puede emplear experimentación rutinaria, por ejemplo experimentos simples de valoración, para determinar empíricamente la concentración o intervalo de concentraciones de ácido y/o sal del mismo en la que, para un tipo de células dado, resulta evidente la producción aumentada de proteína con efectos adversos mínimos sobre la viabilidad celular, particularmente durante un período de tiempo prolongado tal y como se mide, por ejemplo, por medio de un conteo de viabilidad simple.

Se prefiere que la concentración del ácido y/o sal presente en los medios de cultivo se mantenga a aproximadamente la misma concentración durante el procedimiento de cultivo (la concentración especificada), preferiblemente durante una mayor proporción del procedimiento de cultivo, más preferiblemente, el tiempo completo en el que el ácido y/o sal está presente en los medios de cultivo. Cuando se de una variación en la concentración, tal variación resultará adecuada dentro de \pm20 mM, apropiadamente \pm10 mM, de la concentración especificada.

Los medios de cultivo celular de la presente invención pueden comprender suero (por ejemplo suero animal, como por ejemplo suero fetal de ternera) o ser suero libre, y puede además comprender los componentes normales encontrados en medios de cultivo celular convencionales. Los expertos en la técnica apreciarán que en circunstancias en las que por ejemplo se emplee una prueba de dependencia de glutamina, los medios de cultivo deberían comprender poca glutamina, preferiblemente nada. El ácido y/o sal se añade y se mezcla con los medios de cultivo antes de, al comienzo o brevemente después del procedimiento de cultivo.

Se prefiere particularmente que el ácido y/o sal del mismo sirva de complemento a los medios después de un breve período de tiempo desde el comienzo en el que las células se ponen en el cultivo en ausencia del ácido y/o sal del mismo para facilitar el establecimiento de una población de células productoras de proteína (esto es, estable). Se prefiere que las células se pongan en cultivo durante un período mínimo de tiempo necesario para establecer la población productora de proteína antes de la adición del ácido y/o sal. El breve período se puede determinar empíricamente para una línea celular dada, por ejemplo, para la línea celular NS0-GS, el breve período es de aproximadamente 4 días.

El mantenimiento de la concentración del ácido y/o sal del mismo se puede alcanzar por adición a los medios de ácido y/o sal del mismo como complemento por medio de un procedimiento de tipo lote alimentado (en el que inicialmente se proporcionan las células y el medio de cultivo a un recipiente de cultivo y se administran continuamente nutrientes de cultivo adicionales, o en incrementos discretos, al cultivo durante el procedimiento de cultivo) o, de forma alternativa, a través de un procedimiento continuo (esto es, perfusión) en el que se añaden continuamente medios frescos a la vez que se eliminan los medios viejos.

En formas preferidas, una parte del cultivo se convierte en un subcultivo por ejemplo mediante un procedimiento de vaciado-llenado, en el que una parte del cultivo se elimina durante el procedimiento de cultivo, se ajustan los medios de cultivo y se continúa con el cultivo de las células que quedan. El subcultivo se complementa con ácido y/o sal adicional para ajustar y, por lo tanto, mantener la concentración de este/esta a menos de 0,1 mM. El procedimiento completo de cultivo tiene lugar preferiblemente durante un período prolongado de tiempo, esto es, mayor de 10 días, preferiblemente mayor de 40 días.

Preferiblemente, el ácido y/o sal está presente continuamente en los medios de cultivo durante al menos una parte de procedimiento de cultivo. En particular, se prefiere que el ácido y/o sal del mismo esté continuamente presente en los medios de cultivo durante una mayor proporción del procedimiento de cultivo, de la forma más preferida, el procedimiento completo.

Los ejemplos de sistemas de cultivo que se pueden emplear en la presente invención incluyen biorreactores de lecho fluidizado, biorreactores de fibra hueca, cultivo en frascos de tipo rodillo o biorreactores de tanque agitado. Generalmente, el cultivo de células comprende sumergir las células (a una densidad de por ejemplo 0,2 x 10^{5} células/ml) en los medios de cultivo contenidos en un recipiente adecuado. Los medios que comprenden las células y el ácido y/o sal se expone entonces a temperatura (por ejemplo 36ºC), presión, pH, humedad y otras condiciones adecuadas durante un período de tiempo.

El procedimiento de la presente invención se puede usar junto con otras técnicas para incrementar la producción de proteína en células en cultivo, por ejemplo provocando un estrés osmótico de las células en cultivo.

La proteína deseada se puede aislar o recuperar del cultivo celular por técnicas convencionales de separación. Esto puede tener lugar durante o después de la terminación del procedimiento de cultivo. Tales técnicas convencionales incluyen la centrifugación para eliminar partículas de desechos celulares tratando el sobrenadante recuperado después de la etapa de centrifugación con, por ejemplo, columnas de ultrafiltración, fraccionamiento o inmunoafinidad o intercambio iónico u otras técnicas cromatográficas, y sometiendo a técnicas adicionales de purificación para purificar, si se desea, hasta homogeneidad.

Las proteínas producidas por la presente invención se pueden usar en la fabricación de composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de la proteína junto con otros constituyentes como por ejemplo un vehículo farmacéuticamente aceptable tal y como se conoce y se requiere por la práctica farmacéutica aceptada. Otros constituyentes tales pueden incluir otros agentes terapéuticos. La determinación de la cantidad eficaz se puede averiguar por experimentación y observación rutinarias tal y como es sabido por los expertos en la técnica.

De forma adecuada, se hace que las composiciones farmacéuticas queden disponibles en forma de dosificación unitaria. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en cualquier forma adecuada para la ruta de administración la cual, se apreciará, se dicta en parte por las circunstancias prevalecientes, por ejemplo por la afección a tratar. De esta forma, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de cápsulas, pastillas, comprimidos, polvos o gránulos, suspensiones en un líquido estéril acuoso o no acuoso, ungüento, pasta o pintura. Las composiciones farmacéuticas se pueden usar, por ejemplo como parte de un régimen de tratamiento, junto con otros agentes terapéuticos y/o de diagnóstico. Particularmente se prevé que las proteínas de la presente invención se usan en el tratamiento terapéutico y/o diagnóstico de mamíferos, incluyendo seres humanos.

La presente invención quedará ahora ilustrada, solamente a modo de ejemplo, y en referencia a las siguientes figuras, en las que:

La Figura 1 ilustra la comparación de la producción de anticuerpos en un cultivo de células NS0 cuando se cultivan en medios complementados con cinco concentraciones de butirato de sodio (0 - 0,1mM) durante un período de 56 días. Las siguientes referencias numéricas indican la concentración usada:

(1): butirato de sodio 0 mM;

(2): butirato de sodio 0,025 mM;

(3): butirato de sodio 0,05 mM;

(4): butirato de sodio 0,075 mM;

(5): butirato de sodio 0,1 mM.

La Figura 2 ilustra el aumento de la producción de anticuerpos por células NS0 puestas en cultivo en butirato de sodio 0,075 mM en un cultivo de lotes repetidos. Las siguientes referencias numéricas indican:

(10): viabilidad de células sin complemento de butirato (control);

(11): viabilidad de células complementadas de butirato de sodio (0,075 mM);

(12): título de anticuerpos de células control (10);

(13): título de anticuerpos de células (11).

Ejemplo 1

Se inocularon cinco matraces Erlenmeyer con células NS0 recombinantes de ratón transfectadas con un anticuerpo humanizado anti-CD23 de tipo IgG_{1}(producido según el procedimiento de Bebbington et al, tal y como se dijo anteriormente) en un medio libre de proteína/glutamina que contenía colesterol a razón de 0,2 x 10^{6} células/ml. Reañadió butirato de sodio (0,5 M) en PBS a los matraces en las siguientes concentraciones: 0 mM; 0,025 mM; 0,05 mM; 0,075 mM y 0,1 mM, y se incubaron a 36ºC y con agitación durante 4 días en una incubadora de agitación. Posteriormente, se elaboraron subcultivos a partir de los matraces cada cuatro días para un valor de partida de 0,2 x 10^{5} células/ml, manteniendo las concentraciones de butirato de sodio como anteriormente en cada matraz. Los matraces fueron sometidos a muestreo y ensayo antes de cada subcultivo. Se continuó con el cultivo en este modo sacar/llenar en lotes repetidos durante 56 días, manteniendo las concentraciones de butirato de sodio en las concentraciones indicadas de principio a fin. Se contaron las célula viables para cada muestra tomadas tal y como se resume posteriormente.

Recuento de células viables

El cultivo se diluyó de la forma en que fue necesaria en los medios de cultivo. Se examinó microscópicamente en un hemocitómetro (cámara de recuento Neubauer) usando Eritrosina B (Sigma) al 0,04% peso/volumen en PBS, pH 7 como tinte de exclusión. Se calcularon el número de células viables y no viables por milímetro y el porcentaje de viabilidad del cultivo.

Título de anticuerpos

Se determinó la cantidad de IgG humana por un método nefelométrico (Tanford, C. (1961) Light Scattering. Physical Chemistry o Macromolecules. New Cork: Wiley, 275-316; Whicher J. T. et al (1978), "An evaluation of Hyland laser nephelometer PDQ system for the measurement of immunoglobulins"; Ann. Clin. Biochem. 15, p 77-85), por lo cual se midió la formación de inmuno-precipitina insoluble de IgG humana con anticuerpo altamente específico para IgG humana. El nefelómetro midió la intensidad de la luz dispersada por la inmuno-precipitina insoluble en la solución de reacción. El cambio en intensidad de la señal de luz dispersada es proporcional a la concentración de IgG humana en la muestra sometida a ensayo. La cantidad de IgG humana en la muestra se midió a partir de una curva patrón construida a partir de la concentración de IgG humana purificada frente a la tasa de señal de luz dispersada.

Resultados

La Figura 1 ilustra una gráfica de títulos de anticuerpo frente al tiempo a varias concentraciones de butirato. Las concentraciones de butirato de 0,1 mM y 0,075 mM demostraron un marcado aumento en el título de anticuerpos con respecto al control después de 56 días de cultivo. Las concentraciones de butirato de 0,1 mM demostraron una producción de proteína variable durante el procedimiento de cultivo mientras que a 0,075 mM se observaba una producción más constante.

La Figura 2 ilustra una gráfica de producción de anticuerpos por recuento de células viables durante 56 días de cultivo. Las células cultivadas en presencia de butirato 0,075 mM mostraron una ligera disminución en el recuento de células viables durante las primeras etapas del procedimiento de cultivo, reduciéndose considerablemente dicha disminución hacia el día 56 cuando se comparó con el control. Esto puede indicar que las células NS0 cultivadas en butirato (0,075 mM) desarrollan un grado de adaptación o tolerancia a la presencia de butirato en torno a esta concentración. El título de anticuerpos a 0,075 mM mostró un marcado aumento respecto al control.

Claims (5)

1. Un procedimiento para la producción de una proteína por cultivo celular que comprende las etapas de:

cultivar células NS0 transformadas por recombinación que producen de forma constitutiva dicha proteína en un medio de cultivo, el cual comprende ácido butírico o una sal metálica del mismo a una concentración mantenida de aproximadamente 0,075
mM.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 comprendiendo además las etapas de;

(a)

elaborar subcultivos a partir del cultivo celular de la reivindicación 1;

(b)

complementar los medios de subcultivo con ácido butírico adicional o con una de sus sales metálicas para mantener la concentración en los mismos en aproximadamente 0,075 mM durante el procedimiento de cultivo.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que la sal es butirato de sodio.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína se selecciona de un grupo constituido por;

hormonas, enzimas, inhibidores de enzima, linfoquinas, inmunoglobulinas.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la proteína es una inmunoglobulina.