CN101451151A - 一种利用肿瘤细胞生产生物活性产物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域的生物活性蛋白表达体系的建立，该技术可应用于制备重组蛋白，如某些细胞因子、酶及抗原性蛋白(疫苗)，本发明的技术方案是应用功能基因的DNA编码序列及含有核心启动/增强子序列的表达载体组成的基因构件，制备转基因小(大)鼠，从转基因小(大)鼠中获得转基因组织细胞，应用细胞融合的方法将转基因细胞与肿瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，杂交瘤细胞接种小鼠腹腔大量生产重组蛋白。应用本发明可大规模、高效率生产重组蛋白。利用杂交瘤细胞及小鼠个体作为生产媒介不仅成本低、产量高，而且较其它动物安全、卫生，易控制质量。因此，本发明在生物产业中有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及一种利用肿瘤细胞生产生物活性产物的方法。
背景技术
重组蛋白的规模化生产一直是重要的技术问题。应用传统原核生物发酵的方法虽然产量高，但产品的脱毒比较麻烦，而且应用安全性存在隐患；而应用真核细胞培养的方法使产品的安全性得到了提高，但成本较高、产量低。随着基因工程和基因测序工作的不断完善和发展，对已经获得的基因进行表达检验及生产重组蛋白的大量生产越来越多，因此建立高效的生物反应器具有很高的实用价值。
传统的真核细胞表达需要复杂的设备和很高的培养条件，其培养成本高，技术要求高，投资大，一般要达到上千万元或几千万元。生产过程要消耗大量昂贵的培养液，生产成本也很高。而肿瘤细胞培养简单而快速，增繁能力强，细胞株可接种腹腔，产生有表达产物的腹水，从而降低了成本。另一种传统的重组蛋白生产方式是应用原核生物发酵的方法，此法虽然成本低，但产物中含有细菌毒素，给后期加工提出了更高的要求和复杂的处理，由此也会降低产品的安全性。肿瘤细胞是一种低分化细胞，可无限扩增，但由于低分化的特性，一般外源基因不能在肿瘤细胞中表达。本发明将肿瘤细胞与转基因细胞融合，使其有组织细胞表达目的基因的功能，而且保留无限扩增的特性，实现了转基因杂交瘤细胞的表达，并达到可生产水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用肿瘤细胞生产生物活性产物的方法，该方法可应用于制备生物药品、生物试剂、疫苗、营养保健品及其它蛋白质类生物材料，应用本发明方法可以缩短产品研究开发周期，降低成本和实现规模化生产。
本发明采用外源基因可在低分化的肿瘤细胞和杂交瘤细胞中表达，建立了应用肿瘤细胞高效表达重组蛋白的方法。具体的技术方案是：
一种利用肿瘤细胞生产生物活性产物的方法，包括以下步骤：
(1)构建含有5′核心序列-功能基因-3′核心序列-NEOr基因构件的表达载体，该载体可在杂交瘤细胞中高效表达，所说的5′核心序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其中SEQ ID NO.2位于SEQ ID NO.1上游，3′核心序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)分离上述(1)构建的表达载体中的基因构件，制备转基因小鼠，从转基因小鼠后代(F1代或其后裔)成体中分离得到转基因淋巴细胞、成纤维细胞或乳腺上皮细胞；
(3)将(2)得到的转基因细胞与小(大)鼠肿瘤细胞(SP2/0)融合，制备转基因杂交瘤细胞；杂交瘤细胞用催乳素诱导杂交瘤细胞表达，筛选出表达特性优良的细胞株；
(4)用筛选出的高表达转基因杂交瘤细胞接种泌乳期BALB/C小鼠或大鼠腹腔，收集小鼠腹腔液获得重组蛋白。
上述所说的步骤(4)还可以是，筛选出的高表达转基因杂交瘤细胞再转染带有NEOr基因构件，G418筛选后，接种泌乳期BALB/C小鼠腹腔，收集小(大)鼠腹腔液获得重组蛋白。
上述所说的基因构件，其特征在于，5′和3′核心序列侧翼增加山羊BLG调控序列。
根据上述公开的基因构件的结构，本领域的技术人员可选用已知的载体和克隆技术获得相应的基因构件。
本发明应用杂交瘤细胞可无限扩增及接种鼠腹腔产生含相应分泌产物的腹水的原理，用于大规模制备有应用价值的重组蛋白。
本发明的一个具体的方案是用上述方法制备人乳铁蛋白，其具体的步骤是：
(1)构建含有5′核心序列-功能基因-3′核心序列-NEOr基因构件的表达载体pBnLC2G(如图1)，所说的5′核心序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其中SEQID NO.2位于SEQ ID NO.1上游，3′核心序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)分离上述(1)构建的表达载体中的基因构件，制备转基因小鼠，从转基因小鼠后代(F1代或其后裔)成体中分离得到转基因淋巴细胞、成纤维细胞或乳腺上皮细胞；
(3)将(2)得到的转基因细胞与小(大)鼠肿瘤细胞(SP2/0)融合，制备转基因杂交瘤细胞；杂交瘤细胞用催乳素诱导杂交瘤细胞表达，筛选出表达特性优良的细胞株；
(4)用筛选出的高表达转基因杂交瘤细胞接种BALB/C小鼠或相应品种的大鼠腹腔，收集小鼠腹腔液获得重组蛋白。
整个技术中基因表达载体的构建；应用转基因小鼠的转基因体细胞制备转基因杂交瘤细胞是关键。
本发明的有益效果是：应用该方法可提高真核细胞基因表达效率，该方法可直接应用于生产，并可以缩短研究开发周期。由于应用的小(大)鼠可以达到清洁级或SPF级，其产物(产品)适合于医药或高级实验。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是pBnLG2G结构
图2是细胞培养液和腹水中表达产物ELISA检测
A1~12：待测细胞液；
B1、C9、D5、D9：为接种10天后的腹水；B2-6接种5天后的腹水；C1-8、D1-4、E1-12接种3天后的腹水
F1-2：阳性对照；
F3~8：非转基因肿瘤细胞接种腹水；F9空白对照(PBS)。
图3基因构建流程
图4是本发明方法流程图
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1：
本专利技术实施需先获得适合于杂交瘤细胞表达的基因构件，其中所含的核心启动子序列可来自不同组织的表达调控序列；表达细胞可以通过转基因小鼠获得，并能筛选出重组蛋白产量高的细胞株；用这种细胞株可大规模生产重组蛋白，其浓度可达到2-50mg/ml，平均每只小鼠收集腹水10ml计算，可获20-500mg/只。
以人乳铁蛋白(hLF)为例实施过程如下，流程参见图4：
(1)按图3的流程构建含基因构件的表达载体pBnLC2G如图1，其中BLG5、BLG3、SV40pA、pCMV、β-globin组成核心调控序列，hLF为人乳铁蛋白cDNA；hLF cDNA由RT-PCR扩增而来，序列见Genebank登录号为：NM_002343；BLG5、BLG3分别为5′和3′核心序列和山羊BLG调控序列(Genebank登录号：Z33881)；NEOr来自质粒pCDNA3.1质粒(Invitrogen公司Catalog nos.K4900-01，K4900-40)；β-globin为鸡β球蛋白，来自质粒pBC1；质粒pBC1、pcDNA3.0、pcDNA3.1、pCEP-4和人乳腺cDNA文库均来自Invitrogen公司(Invitrogen Life Technologies，Catalog no.K270-01，V044-50，8903026；1600 Faraday Avenue Carlsbad，Califoria 92008，USA)；Easy/vectorTA克隆载体来自基因公司(Gene Company，Shanghai)，PGEM载体购自Promega公司。分子克隆技术扩增基因构件，经纯化后用于转基因小鼠制备。
(2)ICR小鼠受精卵→原核期微显注射→胚胎移植→出生小鼠→整合检测→原代hLF转基因小鼠→繁殖F1、F2、F3……。
(3)后代hLF转基因小鼠→取淋巴细胞(或乳腺上皮细胞)→与SP2/0骨髓瘤细胞融合→HAT筛选→获得转hLF基因杂交瘤细胞。细胞融合条件为：45％的PEG6540；37℃；90S。
(4)高表达转基因杂交瘤细胞转染带NEOr基因构件，经G418筛选，获得转双基因的转基因杂交瘤细胞。
(5)细胞株中添加催乳素5μg/ml，ELISA检测表达(抗原+乳铁蛋白多抗+CAB检测显示剂)，筛选出高表达转基因杂交瘤细胞。
(6)8-12周龄泌乳期母鼠，接种转基因杂交瘤细胞106-107/只小鼠，3-10天后采集腹水，ELISA检测腹水中rhLF含量，如图2所示。其中，10天后腹水中rhLF含量较高(8-16mg/ml).
SEQUENCE LISTING
<110>扬州大学
<120>一种利用肿瘤细胞生产生物活性产物的方法
<160>3
<210>1
<211>173
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
<210>2
<211>130
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>142
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
Claims (3)
1、一种利用肿瘤细胞生产生物活性产物的方法，包括以下步骤：
(1)构建含有5′核心序列-功能基因-3′核心序列-NEOr基因构件的表达载体，该载体可在杂交瘤细胞中高效表达，所说的5′核心序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其中SEQ ID NO.2位于SEQ ID NO.1上游，3′核心序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)分离上述(1)构建的表达载体中的基因构件，制备转基因小鼠或大鼠，从转基因鼠后代成体中分离得到转基因淋巴细胞、成纤维细胞或乳腺上皮细胞；
(3)将(2)得到的转基因细胞与小鼠或大鼠肿瘤细胞融合，制备转基因杂交瘤细胞；杂交瘤细胞用催乳素诱导杂交瘤细胞表达，筛选出表达特性优良的细胞株；
(4)用筛选出的高表达转基因杂交瘤细胞接种泌乳期BALB/C小鼠或大鼠腹腔，收集小鼠或大鼠腹腔液获得重组蛋白。
2、权利要求1的方法在制备人乳铁蛋白中的应用，其特征在于，其具体的步骤是：
(1)构建含有5′核心序列-功能基因-3′核心序列-NEOr基因构件的表达载体pBnLC2G，所说的5′核心序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其中SEQ ID NO.2位于SEQ ID NO.1上游，3′核心序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)分离上述(1)构建的表达载体中的基因构件，制备转基因小鼠或大鼠，从转基因鼠后代成体中分离得到转基因淋巴细胞、成纤维细胞或乳腺上皮细胞；
(3)将(2)得到的转基因细胞与小鼠或大鼠肿瘤细胞融合，制备转基因杂交瘤细胞；杂交瘤细胞用催乳素诱导杂交瘤细胞表达，筛选出表达特性优良的细胞株；
(4)用筛选出的高表达转基因杂交瘤细胞接种泌乳期BALB/C小鼠或大鼠腹腔，收集小腹腔液获得重组蛋白。
3、根据权利要求2所说的应用，其特征在于，其中步骤(3)中所说的肿瘤细胞是SP2/O。
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2008
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