JPS63209582A - 付着性動物細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ａ、産業上の利用分野 本発明は付着性動物細胞の培養り法に閏７［るものであ
る。更に詳しくは付着性動物細胞をゲル粒子にて固定し
て培ｎｉｌるＩ）法に関σるものである。 ｂ、従来技術 細胞培養技術は、例えばウィルス、ワクチン。 、インターフ１ロンの如き抗ウィルス創成いはホルモン
の如き生物薬品の製品にとって重要である。史に近年特
定タンパク質ζ〈どを標的と４−る七ツク［ｌ−ナル抗
体の生産は抗体産生細胞とミニ［１−マによるハイブリ
ドーマの培養によるものであり、その技術の解決は］−
業的に重要なテーマひある。 従来、細胞培養は一般にシト−レ試験管、培香びんｌＺ
とを用いて実験室的規模で行なわれでいる。 一方近年細胞の天吊培養を「１的としてその培薩法及び
イのための装置として、いくつかの提案がなされている
。これらの提案は、大きく分けＣ４−どして付着性細胞
のための付打性培杏（ａｎｃｈｏｒａｇｅ　　ｄｅｐｅ
ｎｄｅｎｔ　　ｃｕｌｔｕｒｅ　）とＬとしＣ浮遊性ａ
ｌ胞のための浮逅培た、つまりリスベンジ１ン培ａ　（
ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　　ｃｕｌｔｕｒｅ　）との２つ
の方式に分類されるが、これらの方式は培養される細胞
の特性によっＣいずれかに決められる。 後者の浮遊培養に関しては近時人ｆδ培薔乃至高密度培
養の研究がさかんに行なわれ、種々の技ｉ（ｊが提案さ
れている。 しかし前者の付右性■ｌ胞のためのＵ石培符に関しＣは
、人１通培養を中心どする工業的技術の研究は比較的が
れでいる。ぞれは付着性細胞１よ、その培養が付ｎする
担体の人血清に人さ″く依存しているために、高密瓜乃
↑人単培薔の−ｒ段が自ら制限を受けていたためと思わ
れる。また付着性Ｉｌｌ胞を天吊に培＾するためには、
当然のことながら培養面積を人さくする必要があり、（
のため装置が複雑になったり、また培養液ど細胞の接融
を効率的に１−るために煩雑４ｒ構造を要１にとはさけ
難かった。 てこで本発明者は、付着性動物細胞を人ＥδにＨつ高密
度で培養する］−集的Ｉノ法について研究を進めた結果
、付層性動物細胞をアルギン酸カルシウムゲル粒子中に
成る状態ｅ包封４“るどそのゲル粒子中で極めて高密度
で培養さぜることができしかしそのゲル粒子（よ培養液
中にで自由に、高いゲル粒子濃度でも培養することが可
能であることを見出し本発明に到達した。 Ｃ１発明の構成 本発明は前記知見に基いて到達されたものであっ−Ｃ１
付石性初物細胞をアルギン酸カルシウムゲル粒子中に包
封せしめ、該粒子を培た液中にｆｆ　（ｉせしめ、該粒
子中にて該細胞を固定化培養１！、シめることを特徴と
でるｆ−１石性手Ｊｌ物細胞の培養方法である。 またもう１つの本発明はｆ＝Ｊ石性動性動物細胞ルギン
酸カルシウムゲル粒子中に、固体微粒子１１１体と共に
包封ぜしぬ、該粒子をＪ８養液中に存在せしめ、該粒子
中にて該細胞を固定化１８１けしめることを１１徴とす
る付着性動物細胞の培養す法て・ある。 かかる本発明り法によれば、ｉ４　？ｆｆｉ性動物ｍ胞
をアルギン酸カルシウムゲル粒子中で高密度で培養する
ことが可能となり、てのゲル粒子を培養液中番こ高い密
度ぐ例えば浮遊状態（”培たりることができるので、小
さな装置または簡単な装置で付着性動物細胞を人ωにｎ
つ高密度に３８たりることがひきる。 しかも本発明によれば生育した細胞は、ゲル粒子に存在
するので、培落後の培養液からの■１胞の取り出しまた
は分離や細胞の培養’！’４　ｉＦｉからの分離が極め
て簡単であって、この王栗的酉（１ｒ１は甚大である。 以下発明ｔｊ法について更に詳細に説明づ“る。 本発明の培養方法において、培養４る動物細胞は付着性
のものぐあれば、種々のものが対象となり、殊に培養条
イ１Ｃ増殖可能なしのぐあればＪ、く、天然の動物細胞
のみならず、人為的或いは眉仏子組み換え操作などによ
って変性された細胞であってもよい。また行用く家蛋白
を産生するか、それを目的としで改変されＩこΦＩＪ物
細胞であることもできる。その例としでは、例えば、Ｃ
ＨＯ，Ｆ３ＨＫ、　　１−ｉｅｐＧ２．　　Ｃｈａｒ＋
ｇ　　　Ｌｉｖｅｒ。 ＮＣＴＣｃｌｏｎｅ１４６０　、　ｃｌｏｎｅ　９．　
Ｖｅｒｏ、Ｌｌｃｌａ　　、Ｒ２Ｏ−１、ＬＭＴＫ−、
２９３゜Ｃ１２７ｉ、　　Ｃａｋｉ　　２゜ＣＶｌ、Ｃ
４２７，ＣＯ８゜１、−、ＦＩｖ１３Ａ、ＡＰ　、−８
の如き遺伝了導入用宿に　細　Ｉｔｓ：ＭＯ−６３，Ｃ
−１０，Ｈｕｍａｒｉ　　　　ｄｉｐｌｏｉｄｆ　ｉ　
Ｉ］ｒＯｂ　１ａｓｔの如きインターフ［１］ン産牛細
］抱；訓えばＢ　ＯＷ　Ｅ　Ｓ　−ＩＩｌｅｌａｎｏｍ
ａ、血管内皮細胞。 ＰＣ３，ＰＣ１０，ＰＣ６の如きｔｌ〕Ａ産生細胞：例
えばト１ｎ＋　Ｌｕ　、ＭＰＫ、ＣＰＦＫ。 ＣＫＴＣ６−１，ＥＳＫ、　　　ＣＫ、　　　Ｗｌ−３
８，ＭＲＣ５の如きワクチン装造用細胞を挙げることが
できる。 ４発明ｔノ法におけるφカ物細１抱が包」・１されたア
ル−１゛ン酸力ルシウムゲル粒子は、その平１勺粒１￥
が０，５へ−５間好ましくは０．８〜４間の範囲て・あ
るのが望ましい。この平均ｉ￥とは、粒子の体積と同じ
体積の球体とした時の、イの球体の直径を平均して表わ
した値である。 粒子の大きさが、前記範囲より小さいと、粒子へ゛製造
づることが困難であるばかりＣ：　＜’；：　＜培蓄操
作、殊に粒子と培香液との分離操作が困難どなる。一方
粒子があまりに大きいと培り液の拡散や酸素の供給が充
分に達成しにくくなり、また粒子自体も形態保持が出来
ないことがあるのぐ、その粒子の大きざ及び形状は、粒
子の組成、培養条件、装置の形式などによりその最適条
件は左右され、適当に決められるが、その人ささは前記
範囲から選択される。 本発明方法におい−Ｃゲルを形成しているアルギン酸カ
ルシウムの濃１食は、０．５〜２０（重最）％、特に０
．７〜１５（Φ量）％の範囲であるのが好ましい。前記
範囲よりもアルギン酸カルシウム濃度が低いと、ゲルの
物即的強度が弱くなり、ゲル粒子としての形態保持が困
難どなる。−ｆｊアルギン酸カルシウムのｏｑが高過ぎ
ると充分な強庶のゲル粒子を維持４るが、１名養液の流
入と流出、酸素の移動が充分に行なわれ１．Ｎ　り’＝
’にり細胞の生育に支障を来すことがあるのでての上限
は前記の直に設定されるべきぐある。 本発明方法の実施に当って、ゲル粒子中における細胞の
密度は、特に制約を受けないが、一般には少くとｂ１０
４藺／ｄ、好ましくは少くとｂ　１０５個／ｄの密度ひ
あるのが（ｉ刊である。 本発明者の研究によれば、前記付着性動物細胞を包封し
たアルギン酸カルシウムゲル拉子は、付着性動物細胞を
含イ１さぜたアルギン酸ナトリウム水懸濁液を、７０〜
２００ｍ　Ｍの範囲、好ましくは８０へ・１５０７１７
．Ｍの範囲の塩化カルシウムの比較的高い濃度の水溶液
中へ滴下することにより、ｆＩｌｌ胞が増殖するのに適
したゲル粒子が形成されることがわか−）だ。上記濃度
範囲のｊｎ化カルシウム水溶液に前記細胞含ｔ］アルギ
ン酸ｆ−１−リウム水懸濁液を滴下り−ることによ−）
で、ゲル粒子が形成されるが、この場合ゲル中１こアル
ギン酸カルシウムで満されない空隙部分が形成され、ぞ
の空隙部分が細胞の増殖に寄与し、結甲とし−Ｃグル中
で高密度の培養がＩｉｌ能になったしのと本発明者は１
１＃察している。 上記塩化カルシウム水溶液の澗庶におい−Ｃ１゛″ｍ　
Ｍ　”とは水溶′ａｉ　ｕ中に含まれる１忌化カルシウ
ムのミリモル数を意味するものとする。 さらに本発明者のｒｄ究によれば、前記ゲル粒子を形成
させる場合に、付着性ａノ物細胞と共に固体微粒子担体
をゲル粒子中に包封させると一層高い密度で増殖するこ
とができることが判明した。ゲル粒子中に前記両者を包
封りるには、付着性動物細胞と固体微粒子担体のそれぞ
れをアルギン酸す１〜リウム水溶液に懸濁さけ、懸濁液
を前記塩化カルシウム水溶液中に滴下させる方法或いは
付着性動物細胞を予め固体微粒子担体の表面に付谷させ
、次いぐこれをアル４゛ン酸ツートリウム水溶液に懸濁
ｊ′５ｊ！てこの懸濁液を前記塩化カルシウム水溶液中
に滴下さぜるプ）法のいずれによっても行うことができ
る。後者の１ノ法が前者方法よりも高い密度で培養する
ことができる。 前記した如き固体′ｆｌｔ１／子担体をゲル粒子に包封
させると、それによって一層ゲル粒子中にアルギン酸カ
ルシウム’Ｃ：ｂＳされむい空隙部分が容易に且つ数多
く形成され易くなり、より好】Ｌしい。この固体微粒担
体としては、動物細胞が付６し易いものであるのが好ま
しく、■つト」着した細胞に生育、増殖を防げイ（いも
のｅあるのが好ましい。殊に固体微粒子担体としては、
平均１￥が２０μへ〜　２００μ、好ましくは４０〜１
００７１の範囲の５のが好適であり、その形状は概して
円形のものが望よ１）い。この固体微粒子担体の例とし
Ｃは、一般的にト１盾性細胞の培養のためのマｒクロキ
１Ｆリアーとして使用し１５１ろｂのが有利に用いられ
、殊に多糖類系のものが使用される。 その具体例としＣは、例えばファルマシア社装Ｕ’）Ｌ
ｊイｔ−）”ｙ　’）’Ｊ）、　（ＣＶｔＯｄｅＸ＠）
　１．２または３）が挙げられる。 本発明り法にａ；　Ｉ−ｊる前記ゲル粒子を形成させろ
ことに当り、細胞を分散状態で含ｉｔするアルギン酸す
１〜リウム懸濁液にお

【」る、アルギン酸ツートリウム
の製電は、一般に０．５〜１５８１′ｊ早％、好ましく
は１〜１０？Ｉｉｍ％の範囲がよい。またゲル粒子の形
成は細胞を取扱う観点から１）Ｈを６−７．５のは範囲
に維持するのが望ましい。 本発明の１８ｍ方法は、前記した細胞を包封したゲル粒
子を培養液中に存在せしめることよって行なわれる。こ
の際使用される培養液は、好ましくは実質的に水よりな
る水性媒体に、種々の無機塩、ビタミン類、補酵素、ブ
ドウ等、アミノ酸、抗生物質、生長促進因子などの通常
細胞鳩首に使用される添加成分が加えられでいる。 また培養液には血清を加えることもできるし、血清を用
いない所謂無血清培地を培養液どして使用することも出
来る。 本発明方法において、細胞はゲル粒子中に包１・１され
τ、モの粒子中生台される。その粒子は、細胞がその中
に封入されて外部へ漏出せず、培養液が流入及び流出が
スムースに行なわれ１つその粒子内におい−Ｕ　ＩＩ胞
の生白が容易′Ｃあ・）で、しかし培養液中に浮遊でさ
、イの形状が容易に変形、破壊されないものであること
が望ましい。 本発明の培養は、例えば培養槽中で所謂流？）Ｊ僧形式
で行なうことが′Ｃきる。この際鳩首槽とは、桁長の塔
形式のｂのであっＣｂよく、また横長のタンク形式であ
ってもよいが、いずれにしても、ＩＪ本的には新しい培
ｎ液が下部Ｊ、り供給され、粒子と接触した古い培養液
が１部より１１１出される形式のｂのであればよい。 すなわら、基本的む培養形式について説明すると、培養
槽中に細胞が包封された多数のゲル粒子が充填された浮
遊し得る領域が形成され、ぞのＫｉ域の下部から培養液
が供給され、その領域から、古い培養液を取り出（方式
であって、下部７）ｒ　＋らの培養液の供給は、粒子が
）マ遊した状態を維持し、培蓑槽の１部からオーバーフ
Ｌｌ　−しないように制御される範囲で行なわれる。 さらに培養槽から排出された培た液はぞのよ４Ｌ、或い
【、Ｌ耐糸を供給して、生育のために再び循環使用する
こともできる。 以上本発明によれば、細胞から培１へ液を極めＣ容易に
分離することができ、しかも細胞を効果的に生育するこ
とか可能となる。殊に本５ト明によれば、有用物？ｉを
産生する細胞からイｎ　ｆｌｌ物質の産生、及び分離を
Ｔ業的に４１刊に実施り−ることができるのでその価値
は甚大である。 本発明方法は、付省性を高密庶且つ人「こに培養するこ
とができしかも細胞自体及びそれが包封されたゲル粒子
自体がより安定に維持され、［１つ培養液とのＩＢ触を
一層効率的に行（（うことか可能となる。 以下実施例を掲げて本発明Ｉｊ法をル１述りる。 実施Ｍ　１ 細胞の固定化 ［３ＨＫ（［３ａｂｙ　　　　ｌ（ａｍｓｔｅｒ　　　
Ｋｉｄｎｅｙ）ＩＩＩＥ！を第１人に示す培地に、細胞
密度が６　ｘ　ＩＱ″ｃＯｌｌｓ／ｒＩｔ１．になるよ
うに投入したのら、等［１：の２％）？ルギン酸ブトリ
ウム水溶液を混合した。この）Ｉ″１１１１合物の１０
０ｍ　Ｍ　　Ｃａ　Ｃ１２水溶液中に滴下し−Ｃグル化
し、上記細胞を包１４固定化したゲルを青た。 このゲルの平均径は２　ｍｔａ　Ｔ：あった。 １８首 直径３　、５　ｃｍのシャーレに第１表に示した培地２
ｄ＠投入したのら、［３１−Ｉ　Ｋ　ＩＩ胞を固定化し
たｌ−記のゲル１５０１＋１９を加え、３７℃　ＣＯ２
含♀５％に保ったＣＯ２インキ］７ベーター中で培養を
開始した。 １■に１回培養液を新培地と全９置換して培養を継続し
この間の培養時間と単位ゲル学当りのグルＥ】−ス消費
速厖の関係を第１図に示す一０培養間始１９５０目「１
および８５日目にゲルの一部庖とりだしゲルを溶解して
細胞密１αを測定したところぞれぞれ３　Ｘ　１０Ｇｃ
ｅｌｌｓ　／ｄおよび（３Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ　７
’ｍ　’Ｃ：あ・）た。 比較例１ ゲル化するに際しで　ｉｏｏｍ　Ｍ　　Ｃａ　Ｃ１ノ水
溶液（７）代りに５０　ｍ、　Ｍ　　Ｃａ　ＣＪ　２水
溶液を用いる以外は実施例１ど全く同様にしで［３１−
Ｉ　Ｋ細胞の培た庖行った。 １８養開始後７］−］間、毎日ゲルコールの培地中の濃
度を測定したが、全く減少しなかったので培養を打切っ
た。 実施（Ｉ７１２ 細胞の固定化 Ｂ　Ｉ−Ｉ　Ｋ　’ＩＡ胞を第１表に示す培地に２　Ｘ
　１０’ｃｅｎｔｓ　／ｄになるように投入したのちＷ
ｆｆｌの２％アルギン酸す１−リウム水溶液を況合した
。さらにこの混合液の１５％に当る準のファルマシア召
製マイクロキ１１リヤーＣｙｔｏｄｅＸ３を投入した。 この混合物を均一になるようによくかきまぜながら水冷
下（７）　１００ｍＭ　　Ｃａ　Ｃ９２水溶液中に滴下
しＣゲル化し、上記細胞をマイクロキャリ■−とともに
同月固定化したゲルを得ｌζ。このゲルの平均径は１０
顧であった。 培養 直径１２ＣＩＩＩのシャーレに第１表に示した培地２０
ｄを投入したのら上記ゲル１．４７を加えＣＯ２インキ
ュベーター中で培養を開始した。１Ｆ］に１回培養液を
新培地と全旦置換して培俗を継続した。この間の培養時
間と単位ゲル場当りのグルコース消費速度の関係を第２
図に示ずく黒丸）。 実施例３ ファルマシア社製マイクロキせリヤー１Ｕ当り２　Ｘ　
１０７個のＢＨＫ細胞をあらかじめ付着せしめたのち第
１表に示す培地に上記のＢ　ｌ−Ｉ　Ｋ−１１１胞を付
着したマイクロキャリヤーを１０％投入したのら、等間
の２％アルギン酸ナトリウム水溶液を況合した。 々゛ル化以降の操作は実施例２と全く同様にして培養を
行った。この間の培養時間と単位ゲル雀当りのグルコー
ス消費速度の関係を第２図に示す（白丸）。 第１表　培地組成

【図面の簡単な説明】 第１図は本発明の実施例１における培養時間とその結果
の関係を示したものであり、また第２図は本発明の実施
例２および３に３３　ＬＪる培養時間とその結果を示し
たしのである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、付着性動物細胞をアルギン酸カルシウムゲル粒子中
   に包封せしめ、該粒子を培養液中に存在せしめ、該粒子
   中にて該細胞を固定化培養せしめることを特徴とする付
   着性動物細胞の培養方法。 ２、付着性動物細胞をアルギン酸カルシウムゲル粒子中
   固体微粒子担体と共に包封せしめ、該粒子を培養液中に
   存在せしめ、該粒子中にて該細胞を固定化培養せしめる
   ことを特徴とする付着性動物細胞の培養方法。 ３、該粒子は、その平均径が０．５〜５ｍｍである第１
   項もしくは第２項記載の方法。 ４、該粒子は、０．５〜２０重量％のアルギン酸カルシ
   ウムを含有する第１項もしくは第２項記載の方法。 ５、該粒子は、付着性動物細胞を含有するアルギン酸ナ
   トリウム水懸濁液を７０〜２００ｍＭの塩化カルシウム
   水溶液中へ滴下して形成されたものである第１項もしく
   は第２項記載の方法。 ６、該粒子は、付着性動物細胞および固体微粒子担体を
   含有するアルギン酸ナトリウム水懸濁液を７０〜２００
   ｍＭの塩化カルシウム水溶液中へ滴下して形成されたも
   のである第２項記載の方法。 ７、該粒子は、付着性動物細胞がその表面上に付着され
   た固体微粒子担体を含有するアルギン酸ナトリウム水懸
   濁液を７０〜２００ｍＭの塩化カルシウム水溶液中へ滴
   下して形成されたものである第２項記載の方法。