JPS6135782A - 細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 仏）産業上の利用分野 本発明は細胞を培養増殖、させるための培養方法に関す
るものである。さらに詳しくは、細胞をサスペンジョン
状態で培養する方法において、その培養系中へ酸素を効
率よく供給し且つ細胞の生育を増大せしめる方法に関す
るものである。

（ｂ）　　従来技術 細胞の培養、殊に大量培養は、例えばウィルスフワクチ
ン、イ／ターフエｐンなどの抗ウィルス剤、あるいはホ
ルモンなどの生物薬品の製造に必須である。殊に近年特
定タンパク質などを標的とするモノクローナル抗体の生
産は抗体産生細胞とミニローマによるハイズリドーマ大
量培養によるものであり、その技術の解決は工業的に重
要なテーマである。

従来、細胞培養は一般にシャーレ、試験管。

培養びんたとを用いて実験室的規模で行なわれている。

一方近年細胞の大量培養法及びそのための装置として、
いくつかの提案がなされている。

これらの提案は、大きく分けて付着培養と浮遊培養との
２つの方式に分類されるが、これらの方式は培養される
細胞の粘性によっていずれかに決められる。

本発明はサスペンジョン状態で付着培養又は浮遊培養を
行う方式における改良方法に関する。そのサスペンジョ
ン状態によって細胞を培養する方法に関し、最近いくつ
かの提案があり、例えばマク゛ネティックスターラーも
しくは機械的に駆動されるシャフト上の羽根車によって
、スピナーフラスコの中に調整された攪拌機能を設けた
培養方法などが提案されている（例えば特開昭５７−６
５１８０号公報参照）。

一方細胞の培養においては、通常酸素（０，）の供給を
必要とし、そのためサスペンジョン族の液面の気相部か
ら酸素含有ガスを溶解させて供給する方法、又はサスペ
ンジョン液中へ酸素含有ガスを吹込んで供給する方法な
どによって、サスペンジョン液中の酸素を一定濃度に維
持している。これらの方法による酸素の供給は、小規模
において細胞を培養する場合には、特に問題を引起さな
い。

しかし、細胞培養を工業的規模、就中高密度で実施しよ
うとする場合には、上記の酸素供給方法は、いずれも不
適当である。１なわちサスペンジョン液面の自由表面か
ら酸素を供給する場合は、サスペンジョン液量が増大−
１−るとそれと共に液表面の面積を増加させることが出
来ず、工業的規模では、酸素の供給不足を避けることは
不可能に近い。

またサスペンジョン液中へ酸素含有ガスを吹込んで供給
する場合には、発泡によって液面が上昇し、時には操作
を継続することさえ困難となる。さらにこの方式は、気
泡と接触することによって死亡乃至増殖活性が弱まる細
胞には利用し難いし、また気泡によって分離現象が起る
細胞（例えば成る種の植物細胞）にも同様に用いること
は出来ない。

前記したいずれの酸素供給方式も、工業的規模で、しか
も高密度による培養を行う場合には、それらの欠点又は
困難性は更に拡大される。＋ そこで本発明者は、上記の如き酸素供給方式の欠点がな
（、種々細胞の生育（も阻害がな（、工業的規模におい
てもまた高密度培警処おいても採用し得、その上酸素供
給操作が簡単で且つ培養操作のトラブルがない方法につ
いて研究を進めた結果本発明に到達した。

（ｃ）　　発明の構成 すなわち１本発明は細胞をサスペンジョン状態で培養槽
中で培養する方法において、（ｉ）酸素を溶解している
フルオロカーホンを該培養槽へ供給する工程、 （ｉ１）該培養槽よりフルオロカーボンを槽外へ取り出
て工程、 ０ｌｉｌ　　前（ｉ１）の工程で取り出されたフルオロ
カーホンに酸素を溶解させる工程、〃び ４Ｖ）　　４ｅられた酸素を溶解しているフルオロカー
ボンを前（ｉ）の工程へ循環する工程よりなることを特
徴とする細胞培養方法である。

かかる本発明方法によれば、酸素を溶解しているフルオ
ロカーホンを培養槽中の細胞が浮遊しているサスペンジ
ョン液中へ直接供給することによって、そのフルオロカ
ーボンの表面からサスペンジョン液中へ酸素の溶解拡散
が起り、該液中への酸素の供給が行なわれ、かくして培
養槽の底部に沈んだフルオロカーボンは、培養槽外へ取
り出され、再び酸素を供給して培養槽へ循環使用される
。

本発明によれば、酸素を溶解しているフルオロカーホン
を細胞が浮遊しているサスペンジョン液へ直接供給して
フルオロカーホンと細胞とが接触しても化学的にもまた
物理的にも細胞は安定であり、生育には何等の悪影響を
受けず増殖すること、殊に細胞を高密度で培養する場合
にはサスペンジョンの容積当り大量の酸素を必要とする
が、そのような場合であっても大量に該フルオロカーホ
ンを供給しても高密度培養が何等の支障な（達成される
。

本発明の細胞培養方法はサスペンジョン状態で細胞を培
養する方法に適用されるが、サスペンジョン状態とは、
水性媒体中で細胞それ自体が浮遊しながら、或いは細胞
が微小担体（マイクロキャリアー）Ｋ担持されて浮遊し
ながら、またマイクロカプセル中で細胞が生育されるよ
うな種々の浮遊培養をいう。殊に本発明は、囮胞自体を
浮遊させながら培養する方式に有利に用いられる。

本発明の細胞培養において培養される細胞は、植物細胞
、動物細胞、微生物細胞などであってもよ（、また人為
的或いは遺伝子操作により変性された細胞であつ【もよ
い。また、例えばマウスＸマウスハイブリドーマ、マウ
スＸヒトハイプリドーマ、ヒトＸヒトハイブリドーマな
どの種々ハイプリドーマ、マｔ、：、Ｂ細胞或いはＴ細
胞由来の細胞であってもよい。

殊に本発明の培養方法は、動物細胞の培養に適している
。

本発明におけるサスペンジョン状態の細胞培養において
は、培養しようとする細胞が培養液中に浮遊した状態で
培養される。培養液は実質的に水よりなる水性媒体に、
種々の無機塩、ビタミン類、補酵素、ブドウ糖、アミノ
酸、抗生物質などの通常細胞培養に使用される添加成分
が加えられている。また培養液には血清を加えることも
できるし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液とし
て使用することも出来る。

本発明方法において用いられるフルオロカーホンはそれ
自体酸素を溶解する能力を有していることは云うまでも
ないが、培養栄件下で水と混和せず水と２液相を形成す
るものであり、細胞の生育を阻害しないものであるのが
一層望ましい。かかるフルオロカーボンとしては、常温
で液体であるのが有利であり、市販されているものが広
く利用できる。例えば各種熱媒体、電気絶級羽料とし【
使用されているフルオロカーホン、人工血液として使用
されている種々のフルオロカーボンが使用できる。その
具体例としては、炭素数８以上のパーフルオロアルカン
類、パーフルオロシクロアルカン類（例えば、パーフル
オロテカリン、パーフルオロメチルデカリン、炭素数３
〜５のアルキル置換基を有するバーフルオルアルキルシ
クロヘキサン）、炭素数５〜７のアルキル置換基を有す
るパーフルオロアルチルテトラヒドロフラン類、炭素数
４〜６のアルキル置換基を有するパーフルオロアルキル
テトラヒドロビラン類、パーフルオロアダマンタン類（
例えばパーフルオロアダマンタン、バーフルオｐメチル
アタマンクン、パーフルオロジメチルアダマンタン、パ
ーフルオμメチルエチルアダマンタン、パーフルオロジ
エチルアダマンタンなど）が挙げられる。

前記フルオロカーホンは、゛種々の基、例えば第３級ア
ミ７基を含有したものであってもよい。これらは一種で
も二種以上の混合物でも使用される。さらに住友スリー
エム■より発売されている種々の７０リナート［Ｆ］（
Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ　）であってもヨイ。

前記したフルオロカーボンは単に例示のために挙げたの
であって本発明方法の実施を防げない限り他のフルオロ
カーボンであっても何等差支えない。

フルオロカーボンはその比重が水に比べて約１．６〜約
２倍と大きく、そのため本発明方法を実施する場合には
、培養・槽中のサスペンジョン液の上部に酸素を溶解し
ているフルオロカーボンを供給しフルオロカーボンがサ
スペンジョン液中に懸濁しながら上部から下方へ落下さ
せる方式を実施するのが有利である。

特にサスペンジョン培養を縦長のタンク又は塔形式の培
養槽を用いて、その培養槽の上部に酸素を溶解したフル
オロカーホンを供給し、その下部から酸素溶解量の低下
したフルオロカーボンを取り出すように設計されたもの
であるのが本発明方法の実施に９に有利である。

培養槽のサスペンジョン液中のフルオロカーボンを供給
するに当っては、その供給口はノズル、スリット、多孔
体、スパージャリングなど種々の形状のものが使用でき
、またフルオロカーボンはサスペンジョン液中で液柱。

液滴、液膜などのいずれの形態で存在していてもよいが
、好ましいのは液滴の状態である。

フルオロカーホンは、サスペンジョン液中へ連続的１間
歇的或いは半連続的に供給することができるが、一般に
は、サスペンジョン液中の酸素濃度を検知して所望する
酸素濃度にＪ応した量のフルオロカーホンを供Ｍｊるこ
とか望ましい。

本発明方法の実施に当っては、サスペンジョン液中にお
いて、細胞に栄養分、酸素、その他生前に必要な成分が
充分に接触するために攪拌することもできる。また培養
に必要な栄養物穿塩類！抗生物質などを含んだ新しい培
養液をサスペンジョン状態で細胞が存在する培養槽に供
給しながら、細胞が産生じた老廃物９代謝産物、その他
生前阻害物質を含んだ古い培養液をサスペンジョン液か
ら抜き出し培養槽の外へ適宜排出するのが、細胞を効率
よ（増殖させるために望ましく、特に細胞を高密度で生
育させるためＫは有利である。

前述したようにフル第２カーボンは、水より比重が重い
ために培養槽の下部へ沈降し、その底部に溜る。この培
養槽の底部に溜ったフルオロカーホンは酸素溶′Ｗ１１
１度が低下しているか殆んど溶解していないものである
から、連続的２間歇的或いは半連続的に培養槽外へ敗り
出し、再び酸素を溶解させる。フルオロカーボンに酸素
を溶解させるには、フルオロカーホン中へ純酸素、空気
の如き酸素含有ガス（このガスにはさらに二酸化炭素な
どを含有していてもよい）を吹込む方法または前記酸素
含有ガスの案囲気中へフルオロカーボンをスプレーする
方法などが有利であるが、これら以外の方法であっても
、酸素を溶解させることができる限り差支えない。

か（して酸素を溶解したフルオロカーホンは、再び培養
槽へ循環され使用される。なお本発明において培養槽か
ら取り出されたフルオロカーボンは、その全量に対して
酸素を溶解させる必要はなく、一部はそのま〜再び培養
槽へ戻すことも可能でさる。

本発明方法を実施マるに光っては、培ｌＩ槽中のサスペ
ンジョン液に供給されるべきフルオロカーホンの量は、
フルオロカーホンの種類、フルオロカーホン中の酸素の
溶解濃度。

サスペンジョン液中の細胞のＳ類と密度など−により左
右されるが、一般忙は培養液ＩＡ＋当り１時間に対し少
くとも０．０１７’　、好ましくは少くとも０．１１で
あるのが有利である。

本発明の方法は、前述したようにサスペンジョン状態で
細胞培養を行っている培養系に酸素をフルオロカーホン
を介して供給するのであるが、他の酸素供給手段を一部
併用しても何等差支えない。例えば、サスペンジョン液
の自由表面忙酸素や空気の如き酸素含有ガスを接触させ
て、該液面から一部の酸素を吸収させてもよく、また、
酸素含有ガスをサスペンジョン液中ＩＣ吹込んで補足さ
せることもできる。

かくして本発明によれば、従来の酸素供給手段において
生じる掬々の欠点を克服し、温和な酸素供給ができ、従
って安定した操作で細胞を効率的に増殖小米、また高密
度による培養を容易に可能にすることができる。

さらに本発明方法においては、フルオーカーボンがサス
ペンジョン液と接触し、その液中な流動することによっ
て局部的な攪拌が起り、そのため全体として攪拌効果が
増大し、強い機械的攪拌な碧することが少（なるという
利点をも有する。この利点は、細胞を高密度で培養する
場合或いは大規模な装置で培養′１−る場合に％に著し
い。

以下実施例を掲げて本発明方法を説明するが、本発明は
これらに何等限定を受けるものではない。

実　　施　　例 実験に用いた装置を第１図に示す。槽径８０ｎφ、高さ
１４０ｖａｇのガラス製の培養槽３の中に高さ３５■、
外径６（ｉｍφの円筒状回転フィルター（細胞は通さな
いが液状成分は通過しうるフィルター二本実験ではＧ−
５グラスフイルター）を内蔵した培養４Ｗ２をオートク
レーブ滅菌する。しかるのち１０％牛脂児血清含有ＲＰ
Ｍ１１６４０培地２２５紅を培１１！傭に仕込み、マウ
ス−マウスハイプリドーマ４Ｃ１０Ｂ６株（親株：Ｐ２
Ｏ３）を１．５　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／ａｔ　　で
播ねする。培養槽２上部には５％ＣＱ、含有空気を流通
せしめ１回転フィルターを１５　Ｏｒ、ｐ、ｍ、で回転
し３７℃でｔ＠参を行う。

３日目に細胞密度を測定したところ生細胞が９、ＯＸ　
１０”　ｃｅ／／ｓ／側であり、死細胞は認められなか
った。３日目から第１図に示すライン１より上記組成の
新培地を４５０１ｊ／　ｄａｙの速度で連続供給を開始
し、同時に培養槽２内の培養容積が２２５廊に一定にな
るようにライン４の先に取付けたポンプで回転フィルタ
ー３経由ライン４を通じ【連続的に細胞と分離したのち
、培養液を系外へ取り出す。４日目に培養槽２内の溶存
酸素濃度が３解以下になったので、５ＸＣＯ。

含有空気の供給を止めライン５からあらかじめ後述の方
法で酸素を溶解せしめであるフルオロカーボン（３Ｍ社
製フロリナートＦＣ−４０）を培養槽２内の溶存酸素数
が３四となるようにライン５より培養液中へ滴下して供
給する。培養槽２の底部にはフルオロカーホン取出しラ
イン６がついており、このラインにはフルオロカーボン
と培養液の界面の位置が自動的に一定の位置にコン）Ｇ
−−ルされるよ５に培養槽との連通ライン７が連結され
ている。培養槽２内の培養液とフルオロカーボンとの界
面の位置はライン６とライン７の連結部の位置を変える
ことによって任意に設定出来る。このようにして培養系
に送入されたフルオロカーボンは、系内の滞留量を一定
に維持しながら、ライン６経由ライン８を経て自動的に
気泡塔９に供給される。気泡塔の下部からライン１０経
由フイルターで除菌された５　Ｘ　Ｃｏ、含有酸素ガス
が連続的に吹込まれている。気泡塔９０内塔で酸素を十
分に溶解したフルオロカーボンは外筒の底部に滞留する
。

このフルオロカーボンは培養系の溶存酸素濃度が３ｗａ
になるようにポンプ１２によりライン５を通して塔養系
に供給される。６日目以降はラインｌより供給する新培
地の供給速度を６７５鯰／　ｄａｙ　Ｋ変更した。

以上のパーヒユージョン方式による高密度連続培養は操
作性良好であった。細胞密度の測定結果を次に示す。

【図面の簡単な説明】

添付図面は、本発明方法を実施するための装置及び工程
の概略図の一例を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞をサスペンジョン状態で培養槽中で培養する方
   法において、 （ｉ）酸素を溶解しているフルオロカーボンを該培養槽
   へ供給する工程、 （ｉｉ）該培養槽よりフルオロカーボンを槽外へ取り出
   す工程、 （ｉｉｉ）前（ｉｉ）の工程で取り出されたフルオロカ
   ーボンに酸素を溶解させる工程、及び （ｉｖ）得られた酸素を溶解しているフルオロカーボン
   を前（ｉ）の工程へ循環する工程 よりなることを特徴とする細胞培養方法。 ２、酸素を溶解しているフルオロカーボンの少くとも一
   部が該培養槽中で液滴状で存在するように供給する第１
   項記載の細胞培養方法。