JPS62285780A - 動物細胞増殖用組成物および増殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 産業上の利用分野 本発明は、動物細胞を増殖するための組成物。

動物細胞の増殖方法および生理活性物質の製造法に関す
る。

従来の技術 動物細胞を大量に効率よく培養する技術は、新しい有用
な生理活性物質の探索や生産に、さらに遺伝子操作技術
を施した細胞を用いる生理活性物質生産に必須の技術と
して、種々の方向からの研究か進められている。従来動
物細胞の培３％には、血清を約１０％程度添加した培地
が主として用いられ、とりわけ牛胎児血清（Ｆｅ２）含
有培地が賞用されて来た。

発明か解決しようとする問題点 しかしながら、血清は非常に高価であり、かつ原因不明
のロブト差があるため、細胞を大量に培養するには問題
が多い。さらに血清には多種類の異種蛋白質が含まれる
ため、生産される有用物質を培養液から回収精製する際
にも不都合が生ずる。

これらの不都合を解消しようとして、血清を含まない培
地（無血清培地）も種々開発されて来たが、一般に汎用
性が低く、増殖性および生理活性物質生産性の面でら血
清含有培地に比べろと必ずしも十分なものとはいえない
。またＩｔｔ　ｔｒｕ　ｔｉ？培地では、血清の代替と
して、各種細胞増殖因子、ホルモン類などが添加される
が、これらの因子類には高価°なものも多く、血清含有
培地より、むしろ高価な場合らしばしば認められる。

いずれにしても従来知られている培地は、細胞培養によ
って灯用物質を大量に効率よく得ろためには必ずしも十
分満足できるしのではなかった。

このように、安価で大量供給か可能で、しから血清等に
由来する性質不明の蛋白質を出来るだけ含まない動物細
胞増殖用培地を開発することが望まれる。該培地として
は、無血ｌＩ￥で汎用性があり、しかも細胞増殖能が高
い培地が理想的であるか、血清含有培地でしその血清の
使用量を大巾に減らすことが出来れば、培地の経済性お
よび培養液中の不純物含量の面での問題点を大巾に改善
することが可能である。

問題点を解決するための手段 上記した事情に鑑み、本発明者らは、細胞増殖を促進す
る物質の探索を進めたところ、ポリエチレングリコール
を含有した動物細胞増殖用組成物による培地で動物細胞
または生理活性物質を生産する動物細胞を培養すると、
動物細胞が著しく増殖され、またこれにより、産生され
る生理活性物質の爪か増大されることを見い出し、これ
に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、（１）、ポリエチレングリコールを含有して
なる動物細胞増殖用組成物。

（２）、ポリエチレングリコールを含有する動物細胞増
殖用培地で動物細胞を培養することを特徴とする動物細
胞の増殖方法および （３）、ポリエチレングリコールを含有する動物細胞増
殖用培地で、生理活性物質を生産する動物細胞を培養し
、培養物中にこれを生成蓄積仕しめ、採取することを特
徴とする生理活性物質の製造法である。

本明細書においては、ポリエチレングリコールをＰＥＧ
と略Ｊ己することもある。

本発明の組成物は、基礎培地およびポリエチレングリコ
ールからなる。

該基礎培地としては、動物細胞の培養に用いることので
きろしのであればいずれのらのでらよい。

本発明に用いられる基礎培地としては、ｒ二とえば゛市
販されている＠種基礎培地［ｒ二とえば、イーグルの最
小必須培地（Ｍ　ＩＥ　Ｎ１）（サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ）　ｌ　３０巻　・１３２頁　１９５９年）、イ
ーグルの基礎培地（［３Ｍ　Ｅ　）（プロシーディンゲ
ス・才ブ・ザ・ソサイエティ・フォア・エキスペリメン
タル・バイオロジー・アンド・メディスン（Ｐｒｏｃｅ
ｅ−ｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｒｏ
ｒ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｉｏｉｏｇｙ　ａｎｄ
　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）８９０　３６２頁　１９６５年）
、ダルベツコ改変イーグル培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ）（バイｏ
ロジー（Ｖ　ｉ　ｒｏ　ｌｏｇｙ　）　８巻　３９６頁
　１９５９年）、イスコツ改変ダルベツコ培地（ＩＭＤ
Ｍ）（ザ・ジャ−ナル・オブ・エキスペリメンタル・メ
ディスン（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＥｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　１４７巻　９２３
頁　１９７８年）、Ｌ−１５培地（アメリカン・ジャー
ナルΦ才ブ・ハイノーン（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｒＨｙｇｉｅｎｅ）７８巻　１７３頁　１９６
３年）。

マツコイ５ａ培地（プロシーディンゲス・オブ・ザ・ソ
サイエティ・フォア・エキスペリメンタル・バイオロジ
ー・アンド・メディスン１００巻＋１５頁　１９５９年
）、ハムＦ１２培地（ブロン−ディンゲス・才ブ・ナノ
ヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンス°ニー・ニス−
ｘ　−（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏ［Ｎａｔｉｏｎａｌ
　　Ａｃａｄｅｍｙ　　ｏｆ　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　
ＵＳＡ）５　３　９２８８頁　１９６５年）、ＲＰＭＩ
１６４０培地（ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソノＬ−ソー３ン（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏＣ
ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　１ｌｌｅｄｉ−ｃａｌ　Ａ
ｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）　ｌ　９９巻　５１９頁　１９
６７年）などコあるいはこれらを混合した培地が挙げら
れる。該基礎培地にそれぞれの細胞の増殖に必須な因子
（補助増殖因子）たとえばホルモン類（たとえばインス
リン、トランスフェリン、ステロイドホルモンなど）、
蛋白性増殖因子［たとえば上皮細胞増殖因子（ＥＧＧ；
’）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）。

繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）など００重金属類（たと
えば亜セレン酸ナトリウムなど）やリン脂質（たとえば
エタノールアミン、ホスファチノルエタノールアミンな
ど）を必要により添加した無血清培地が挙げられる。さ
らに、これらに通常の使用量またはそれ以下の血清代替
物質［たとえばＧＦＳＣ第２回第２伏 クノロジー　予講集１６＋頁．　１９８４年）、ＮＵ−
ノーラム（フラボレーテイブリザーチ社製）、ノーラム
プラス（ＫＣバイオロジカルズ社製）など］か添加され
た培地や、通常の使用量以下の血清［たとえば牛胎児血
清（Ｆ　Ｃ　Ｓ　）、新生子牛血清，仔牛血清。

ブタ血清，ヤギ血清，ニワトリ血清など］を添加した培
地などが挙げられる。また市販の無血清培地［たとえば
ハイブリティーＩ（日本薬品開発製）、ＨＢ−　１　０
　２（ハナ・メディア社製）、ＨＬ−１（ベントレッド
社製）などコら本発明の基礎培地として用いることが可
能であり、市販の基礎培地に準じてアミノ酸なとの濃度
を最適化した培地を作成して用いることら可能である。

本発明で用いられるポリエチレングリコールとしては、
重合分子量が約１０００以上のものが好ましく、なかで
も約２．０００ないし２０，０００のらのが好ましく、
さらに約４，０００．約６，０００、約２　０，０　０
　０の乙のが好ましい。

本発明で用いられるポリエチレングリコールの量は、使
用時の儂度が約１０％（Ｗ／Ｖ）以下となる量か好まし
い。なおここにおいて、「以下」は「０」を含まないこ
とを示す。また、ポリエチレングリコールの量としては
、使用時の濃度が、より好ましくは、約０　００１ない
しｌＯ％Ｕ／Ｖ）、さらに好ましくは約０．０１ないし
２％（Ｗ／Ｖ）となる量である。

ポリエチレングリコールは、あらかじめ組成物中に混合
されていても良いし、培地として使用する際に混入して
も良い。

本発明の動物細胞増殖用組成物は、固体状態のらのおよ
び水溶液であるもののいずれでもよい。

固体状態のらのは、それをたとえば水に溶解あるいは懸
濁して用いられる。

また、該組成物を動物細胞増殖用の培地として用いるこ
とかできるが、培地として用いる場合には、血清を含ま
ない培地としてら良く、さらに、通常の使用量以下の血
１ｉｌＦを含む培地として乙良い。

ここで、通常の使用量としては、ノことえば約ＩＯ％（
Ｖ／’／）が挙げられる。

本発明の組成物を培地として用いろ場合には、通常の使
用量またはそれ以下の＋ｍ清代替物を含む培地として乙
よい。ここで、通常の使用量としては、たとえば、ＧＦ
Ｓの場合は約３〜４ｇ／Ｃ（蛋白質として）であり、Ｎ
Ｏ−ノーラムの場合は約ｌＯ％Ｖ／Ｖであり、ノーラム
プラスの場合は約１０％Ｖ／Ｖである。

本発明方法によって培養される動物細胞としては、特に
限定されない。その例としては、たとえばヒト、マウス
、ラット、ウシ、ハムスターなどの哺乳動物由来のリン
パ系細胞（例、正常リンパ球，ミエローマ細胞、Ｂ−リ
ンパ芽球様細胞，Ｔリンパ性白部病細胞など）、６種ハ
イブリドーマ（例、マウスハイブリドーマ、マウス・ヒ
トヘテロハイブリドーマ、ヒトハイブリドーマなど）、
正常２倍体細胞（例、繊維芽細胞など）、その他の種々
の接着依存性細胞などを挙げることが出来る。

より具体的には、ヒトリンパ系細胞としては、Ｎａｍａ
ｌｖａ（Ａ’ｒ’ＣＣＣＲＬ　ｌ　４３２Ｘインターナ
シヨナル・ツヤ−ナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔ　１ｏｎａｌ　　　〕ｏｕｒｎａｌ　　ｏｒ　ｃ
ａｎｃｅｒ）ｌ　　２　　巻３９６頁　１９１３年）、
Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ８６）（ランセント（Ｌａｎ
ｃｅｔ）　１巻　２３８頁　１９６４年）。

ＥＩ３−３（Ａ’ｒＣＣＣＣＬ８５）（ランセント１括
　２５２頁　１９６　、を年）、Ｗ［−Ｌ２（キヤツチ
−（Ｃａｎｃｅｒ）２２　Ｑ　　５１７頁　１９６８年
）、　Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ２１３Ｘキャンザー
・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　２８
巻　１３００頁　１９６８年）、ＲＰＭＩ　　８２２６
（ＡＴＣＣＣＣＬ１２０）（プロン−ディンゲス・オブ
・ザ・ソサイエティ・フォア・エキスペリメンタル・バ
イオロジー・アンド・メディスン　１２５巻　１２４６
頁　１９６７年）、ＣＣＲＦ−ＣＥ！ｖｉ（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ１１９にキャンサー　１８巻　５２２頁　１９６５
年）、ｒｔＰＭ（１７８８（ＡＴＣＣＣＣＬ　ｌ　５６
［（ジャーナル・才ブ・ザ・ナショナル・キャンサー・
インスティチュート（ユナイテイド・ステーブ）（Ｊｏ
ｕｒｎａｌｏｒ　　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔ
ｅｓ））＝１３巻　１１１９頁　１９６９年）ｌ、ＣＲ
ＣＦ−ＳＢ（ＡＴＣＣＣＣＬ１２０）（キャンサー・リ
サーチ　２７巻　２４７９頁　１９６７年）などか、マ
ウスリンパ系ｗＵＩＩｍとしては、たとえば、Ｍ　Ｐ　
Ｃ−１１（ＡＴＣＣＣＣＬ　ｌ　６７）（ジャーナル・
オブ・エキスペリメンタル・メデイスン１３１＠５１５
頁　１９７０年）、５ｓ−１（ＡＴＣＣＴｌＢ１８）（
ユーロビアン・ツヤ−ナル・才ブ・イムノロジー（Ｅｕ
ｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　１ｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ）６Ｑ　　５１１頁　１９７６年）、　　Ｐ　３
　Ｘ　６３　Ａｇ８　Ｕ・１（ｒ’３ＵＩＸＡＴｃｃ　
　ＣＲＬＩ５９７Ｘカレント・トピックス・才ブ・マイ
クロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｏｆｌｌｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
　ａｎｄ　１ｍｍｕｎｏｌｏＢｙ）８１巻　１頁１９７
８年）なとか、ハイブリドーマとしては、たとえばマウ
スハイブリドーマＣＥＡ（第２回次世代産業基盤技術〉
ンボノウムーバイオテクノロジー予稿果　１７５頁　昭
和５９年）、ＨＳ−ｆｆ（同上）、ｅ２３５１６３（ハ
イブリドーマ　４巻４７頁１９８５年）、　７ウス・ヒ
ト・ヒトヘテロハイブリドーマＮ１２−１６・６３（第
２回次世代産業届盤技術ノノボノウムーバイオテクノロ
ノー予ｍ集　１７５頁　昭和５９年）、１１２−２２−
２５（バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーンヨン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ｌ１ｅｓｅａｒｃｈ
　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）１２９巻　２Ｑ頁１９
８５年）、　ＨＢＩＩ［−４３・ｌ（同上）などが、接
着依存性細胞としては、たとえばＦＬ（ＡＴＣＣＣＣＬ
６２）（プロシーディンゲス・オブ・ザ・ソサイエティ
・フォア・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド
・メチイス２９４巻　５３２頁　１９５７年）、　Ｈｅ
１ａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２Ｘキャンサー・リサーチ　１２
巻２６４頁　１９５２年）、Ｗｉｓｈ（ＡＴＣＣＣＣＬ
２５）（エキスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）２
３巻　１７１頁１９６１年）、Ｃｌｌ０−Ｋｌ（ＡＴＣ
ＣＣＣＬ６１）（ジャーナル・才ブ・エキスペリメンタ
ル・メデイスン１０８巻　９４５頁　１９５８年）、Ｌ
細胞（ＡＴＣＣＣＣＬＩ）（ジャーナル・オブ・ナショ
ナル・キャンサー・インスチチュート・ニー・ニス・ニ
ー　９巻　２２９頁　１９４８年）なとかそれぞイー挙
げられる。

本発明の生理活性物質の製造法において用いられる生理
活性物質を生産する動物細胞としては、たとえば、マウ
スモノクローナル抗体を産生するＣＥＡ、ＨＳ−１１，
Ｃ２３５１６３なと、ヒトモノクローナル抗体を産生ず
るＮ１２−１６・６３゜１１２−２２−２５．１（Ｂｉ
ｌｌ−、ｉ３．１などが、白匣球インターフェロンを産
生するＮ　ａｍａｌｖａ細胞。

インターロイキン−２を産生ずる遺伝子組換え細胞マウ
スＬ−ＩＬ２＋３−３細胞、ヒトＰＬ−ＩＬ３８５−細
胞、ハムスターＣＩＬ４８５−１４細胞（特開昭６１−
６３２８２号公報参照）などが挙げられる。

本発明方法の培養には通常培養に用いられる容器または
装置が用いられる。たとえば浮遊細胞の場合には、マル
チウェルプレート、培養フラスコ。

スピナーフラスコ、ツヤ−ファーメンタ−、ファーメン
タ−などが用いられ、さらにホローファイバー培養装置
、セラミックマトリックスを用いた培養装置さらにマイ
クロカプセル培養法などが適宜採用される。接着依存性
細胞の場合には、マルチウェルプレート、培養フラスコ
、ローラーボトル。

マイクロキャリアー培養法、ホローファイバー培笑法、
セラミックマトリックス培昆法などが用いられる。

本発明の培養は、用いられる動物細胞の培養に適しｆこ
条件か採用されろ。一般的には、培養温度約３７°Ｃ前
後で、ｐ［（約６．５〜７．５で、数日〜３か月培養さ
れる。たとえば、本発明の培地に通常Ｏｌ〜５Ｘ１０５
個／ｍｌの細胞を播種し、マルチウェルプレートやフラ
スコの場合には約３７℃。

５％炭酸ガス培養器（炭酸ガス濃度５％の培養器）中で
ｐ［（約６．５〜７５で約１〜２０日間培養される。ツ
ヤ−ファーメンタ−やファーメンタ−などでは通気攪拌
培養か行われる。またこれらの培養槽やホローファイバ
ー、セラミックマトリックス、マイクロカプセルなどを
用いた培養においては培地を回分的、または連続的に交
換することにより生理活性物質の生産性を向上させるこ
とかできる。連続層流培養の場合には１ないし数ケル（
約３か月）も続けろ場合かある。また、必要により通気
される。

培箆液から細胞を採取するには、たとえば、浮遊細胞の
場合は、培養液を直接遠心分離機やろ過機にかけて集め
る。接着依存性細胞の場合にはたとえば、Ｏ、ｌ　ｍｇ
／ｍｌＥ　Ｄ　Ｔ　Ａおよび１．２５ｍｇ／ｍｌのトリ
プシンを添加して、３７°Ｃ１〜２分反応させて細胞を
分散させたのち、遠心分離またはろ過によって集める。

細胞培養によって生産される生理活性物質は、その物質
が培養液中に蓄積される場合、ろ過または遠心分離によ
って上澄液を得、これから採取される。また細胞内に蓄
積される物質の場合には、ろ過または遠心分離によって
得た細胞を物理的方法（例、超音波、フレンチプレス、
ダイノミルなど）または化学的方法（例、塩酸グアニジ
ン等）にて処理し、生産物を抽出したのち、上澄液を得
る。

上記上澄液から生理活性物質を分離、精製するに：よ自
体公知の分離、精製法を適宜組み合わせて行うことかで
きろ。たとえば生理活性物質が蛋白質またはペプチドの
場合には、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方
法、透析法、限外ろ適法。

ケルろ適法、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交
換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、
アフィニティクロマトグラフイーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法２等電点電気泳動などの等電
点の差を利用する方法などが適用される。

本発明の方法に従って増殖させた動物細胞は、たとえば
これにウィルスを感染させてワクチンの製造に利用した
り、各種リンフォツＪイン類（例、インターフェロン類
、インターロイキン−２）５各種増殖因子順（例、上皮
細胞増殖因子、繊維芽細胞増殖因子など）、各種ホルモ
ン類（例、ヒト成長ホルモン、インスリンなど）、各種
酵素類（例、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性
化因子など）や各種モノクローナル抗体なとの土竜に利
用される。

また遺伝子操作によって特定の遺伝子を導入した細胞を
用いることにより該物質を効率よく生産させることかて
きる。まｆこ本発明の方法に従って増殖し、集めた細胞
を直接に、人工皮腎や人工器官（例、膵臓ヘータ島細胞
や、旺冊胞など）として＋１１用することらできる。

本発明方法により、動物細胞を効率良く増殖させること
ができるので、動物細胞を工業的に大量に増殖させる方
法として何利に用いることができる。

本発明方法において、生理活性物質を生産する動物細胞
を培養した場合には、該細胞か効率良く増殖されるので
、生理活性物質を効率良く生産することができ、工業的
生産上有利である。

実施例 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

ＰＥＧの添加％は、Ｗ／Ｖ％を表わす。ＧＦＳ以外の直
情代替物および血清の添加％はＶ／Ｖ％を表わす。

実施例Ｉ Ｉ　Ｍ　Ｄ　Ｍ　、ハムＦ’＋２およびＬ−夏５培地を
Ｉ：１２の比率で混合した培地に、２　ｍｇ／σインス
リン、　２　ｍｇ／（！　トランスフェリン、２ＸｌＯ
−″８Ｍエタノールアミン、２ＸＩＯ−１１Ｍ亜セレン
酸ナトリウム（４つを合せてＩＴＥＳと称する。）を添
加し、これに各種重合度のＰ　Ｅ　Ｇ　（Ｐ　Ｅ　Ｇ　
４００．　Ｐ　Ｅ　Ｇ　１０００゜ＰＥＧ１５＝ｌＯ，
ＰＥＧ２０００．　ＰＥＧ４０００．　ＰＥＧ６０００
、　Ｐ　Ｅ　Ｇ　２００００）を各種濃度に添加した培
地を調製し、これを２４穴マルチウエルプレートへ１ｍ
ｌ宛分注した。これにマウス・ヒト・ヒトヘテロハイブ
リドーマＮｌ２−１６・６３株の細胞を１×１０５ｇ／
ｍｌになるように播種し、５％炭酸ガス培養器中で３７
°Ｃ５日間培養後、コールタ−カウンターにて細胞数を
測定した。

結果を第１図に示す。第１図において、−〇−はＰＥ　
Ｇ　２０，０００．−〇−はＰ　Ｅ　Ｇ　６，０００．
−ム−はＰＥＧ４，０００．−△−はＰ　Ｅ　Ｇ　２，
０００．−閣一はＰＥＧ　１，５４０．−口−はＰ　Ｅ
　Ｇ　１，０００．−・−はＰＥＧ４００を第１図に示
した濃度になる様に添加した場合の細胞数をそれぞれ示
す。

第１図から明らかな如く、Ｉ）　Ｅ　ｃ　＋添加しない
培地での細胞数は２．５　×Ｉ　Ｏ５ｇ／ｍｌてあっｆ
このに対し、ＰＥＧを添加した場合にはＰ　Ｅ　Ｇ　４
００を除いて濃度の増加に供なって細胞数が増加した。

至適濃度は０．２５％付近に存在したか、０００１％の
添加においても明らかに効果か認められｆ二。

また重合分子量の大きいものほど効果が良い傾向が認め
られ、Ｐ　Ｅ　Ｇ　２０，０００の場合、至適濃度条件
下では、無添加の場合の３．３倍にら達した。

実施例２ 実施例１と同じ基礎培地にＩＴＥＳを添加した培地（１
）、更にこれに０，２５％Ｐ　Ｅ　Ｇ　２０，０００を
添加した培地（２）、および０．２５％Ｐ　Ｅ　Ｇ、２
．０００を添加した培地（３）を用意し、これらを２４
穴マルヂウエルプレートへ１ｍｌ宛分注した。これに下
表に示す各種リンパ系細胞を１　ｘ　Ｉ　Ｏ’ｇ／ｍｌ
の割合で播種し、３７°Ｃ，５％炭酸ガス培養器中で５
日間培養したのちコールタ−カウンターで細胞数を計数
し表１の結果を得た。この表にみられろ様に各種リンパ
系細胞および各種ハイブリドーマの培養に１３広く効果
が認められた。

表１　無血清培地における各種リンパ系細胞の増殖に及
ぼすＩ’ＥＧの効果 細胞株　　　山　来　　　無添加　　添加　　　添加Ｅ
Ｂ　−３ヒトバーキット　５．ｇｘｌＯ’　３．０Ｘ１
＋）５２．９Ｘ１０５リンパ腫 、、　　Ｎａｍａｌｖａ　ヒトバーキット　　４．９ｘ
ｌＯ’　１．５ｘｌＯ８１５ｘｌＯ”リンパ腫 ＣＲＣＦ−ｔニド急性リンパ　５．８Ｘ１０’　４．９
ｘｌＯ５４，７Ｘ１０５ＳＢ　　芽球性白血病 Ｄａｕｄｉヒトバーキット　　６．７ｘｌＯ’　５．３
ＸＩＯ’　５．５ｘｌＯ’リンパ腫 Ｗｌ−Ｌ２　　ヒトリンパ芽球　８．５ｘｌＯ５２，６
ｘｌＯ’　２．５ｘｌＯ’ＲＰＭＩ　　　ヒト’）　：
／ハ芽球　３．１Ｘ１０５１．３Ｘ１０８１．１ＸＩＯ
’Ｅ２３５マウスバイブ’）　　　６．３Ｘ１０５１．
０Ｘｌｏｅ９．５ｘｌＯ’１６３　　　　ドーマ ＋１２−２２　　マウス・ヒト・　２．３ｘ１０５７．
４ｘｌＯ５７，５ｘｌＯ５実施例３ 実施例１と同じ基礎培地にＩＴＥＳおよび血清代替物質
ＧＦＳ（成牛血清の５５〜７０％（飽和度）硫酸アンモ
ニウム沈澱画分）を蛋白濃度として０　３ｍｇ／ｍｌ（
通常使用される濃度の１／１０量）添加し、これにＰ　
Ｅ　Ｇ　２０．０００を無添加の培地（１）および０１
％添加した培地（２）を用意し、これらにマウス・ヒト
・ヒトヘテロハイブリドーマ＼１２−１６・６３または
Ｈ［３ＩＩＩ　−４３−１を１ｘｌｏ５細胞／ｍ細胞種
種し、３７°Ｃ，５％炭酸ガス培谷器中で５日間培養し
、表２の結果を得た。

表２　低濃度の血清代替物質を添加した培地における１
／　ｌ０ＧＦｓ　　ｌ／　ｌ０ＧＦｓ　十ＰＥＧ　　Ｇ
ＦＳ添加Ｎ１２−１６・６３　　３．６Ｘ　１０５ｇ、
２Ｘ　１０５９．８Ｘ　１０５実施例４ 実施例１と同じＭｌｉ！ｆ！培地に１％牛脂児血ｉｉ’
ｆ　（ＦＣＳ）を添加し、更に０１％ＰＥＧを添加した
培地と無添加培地を用意し、実施例３と同じ細胞を培養
し、表３の結果を得た。

表３　低血清培地におけるＰＥＧの添加効果ＰＥＧ２０
，０００対照 Ｎ１２−１６・６３　５．９Ｘ　１０５９．６Ｘ　１０
５１．ｌＸ　１０’実施例５ 市販の各種無商清培地（ハイプリティー１．８Ｂ−１０
２およびＨＬ−１）および実施２例１と同じ組成の基礎
培地にそれぞれ市販の血清代替物質（ＮＵ−ノーラム、
ノーラムプラス）を１０％になるように添加した培地を
用きし、これに０．１％ＰＥＧ　２０，０００を添加し
た場合と添加しない場合でのマウス・ヒト・ヒトハイブ
リドーマＮ１２−１６・６３の増殖を実施例１と同じ方
法で調べ、表・ｔの結果を得た。

表４　各種市販培地でのｐ　Ｅ　Ｇ　ｉｆ＜加効果Ｐ　
Ｅ　Ｇ　　ＰＥＧ２０，０００ ハイブリテイー１　　　　　１００　　　１６９１１Ｂ
　＋　０２　　　　　　　　１００　　　１４３！−Ｉ
Ｌ−１ｔｏｏ　　　　１５３ 実施例１と同様の基礎　　１００　　　　ｉｓ。

培地＋ＮＵＮシーラム ′″１それぞれの培地での無添加の増殖度を１００とし
た場合の相対値で示した。

実施例６ 実施例１と同じ基礎培地にビＩ″ＥＳと０．１％Ｐ　Ｅ
　Ｇ　２０．０００とを添加した培地を用意し、これに
Ｗｌ−Ｌ２またはＮａｍａｌｖａ細胞をそれぞれ１×１
０５細胞／ｍｌになる様に播種し、５％炭酸ガス培養器
中で３７°Ｃで培養し、５日目毎に新しい培地へ同じ細
胞数になる様に移し変えて培養を続けた。結果を第２図
に示す。第２図において、〇−〇はＷ［−Ｌ２細胞を培
養した場合を、Ｏ−・はＮ　ａｍａｌｖａ細胞を培養し
た場合をそれぞれ示す。第２図に示す様に、Ｗ　［−Ｌ
　２　、Ｎａｍａｌｖａ共に、５代部代後も全く正常に
増殖し、細胞の継代推持にら使用できることがわかった
。

実施例７ 接着依存性ヒトＦ’Ｌ細胞（、ＡＴＣＣＣＣＬ６２）を
Ｉ　ＮＩＤ　ＭとハムＦＩ２培地の１１混合物を基礎培
地とし、これに実施例１と同じ濃度のｌＴ　Ｅ　Ｓおよ
び表５に示ず濃度のＦＣＳおよびＰＥＧ　２０．０００
を添加しｆコ培地にｌＸＩＯ３細胞／ｍｌになる様に播
種し、５％炭酸ガス培養器中で３７°Ｃ５日間培養した
。培養終了後トリプシンで細胞を遊離させた後、コール
タ−カウンターで計数した。

表５に示す様に血清無添加でもＰＥＧの著しい促進効果
か認められ、血清１％、ＰＥＧ２０，０００の０．２％
の培地では血清１０％の培地以上の生育が認められた。

表５　ヒｂＦ’Ｌ細胞に対するＰＥＧの効果０　　　　
０　　　　　　１　　Ｘｌ０５ｏ　　　　　ｏ、ｏｔ％
　　　　４．６Ｘ　１０’００．２％　　　　４．７Ｘ
１０５ １％　　　０　　　　　　４．９Ｘ１０５１％　　　０
０１％　　　　９．ＯＸ　１０５１％　　　０２％　　
　　１．２Ｘ　１０’ｌＯ％　　　０　　　　　　９．
４Ｘ　１０５実施例８ 接右依存性ハムスターＣＩＩＣＩ−Ｋ　ｌ　（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ６１）についてはＩ　Ｍ　Ｄ　Ｍ・ハムｒ”１２
：Ｌ　ｌ　５（１：ｌ：２）に３５ｍｇ／ＱＬ−プロリ
ンを添加した培地を基礎培地とし、マウスＬ８１１Ｉ胞
についてはＭＥＭを基礎培地とし、これらに実施例１と
同じ濃度のＩＴＥＳおよび表６に示ず濃度のＦＣＳとＰ
　Ｅ　Ｇ　２０．０００を添加した培地１．＝　ｌ　ｘ
　ｌ　Ｏ’細。

胞／ｍｌになる様に播種し、５％炭酸ガス培養器中で３
７°Ｃ５日間培養した。培養終了後トリプシンで細胞を
遊離させたのち、コールタ−カウンターにて細胞数を測
定した。

表６　′！！歯類歯末由来細胞するＰＥＧの効果Ｃｌｌ
０−Ｋｌ　　　１％　　　　０　　　　２．１ＸｌＯ’
１％　　　０．１％　　　６．４ＸｌＯ’１％　　　０
．２％　　　６．７ｘ　１０５５％　　　　０　　　　
７．５Ｘ　１０’Ｌ　　　２％　　　　Ｏ１，４ＸｌＯ
’２％　　　０．１％　　　２．３ｘ　ｔｏ’２％　　
　０．２％　　　３．２ｘ　１０５１０％　　　　０　
　　　２．Ｏｘ　ｔｏ’表６から明らかな様にＣＨＯ−
Ｋｌ細胞では血清１％にＰ　Ｅ　Ｇ　２０，００００　
、１％を添加すると血清５％にほぼ等しい増殖が認めら
れ、Ｌ細胞では血清２％に０．２％のＰ　Ｅ　Ｇ　２０
．０００を添加すると血清１０％の培地以上の増殖が認
められた。

実施例９ マウスハイブリドーマＥ２３５１６３株をＩＭＤＭ：Ｆ
　ｌ　２（１：ｌ）に実施例１と同じ濃度のＩＴＥＳお
よび表７に示す濃度のＰ　Ｅ　Ｇ　２０，０００を添加
した培地にｌ　Ｘ　Ｉ　０５細胞／ｍｌになる様に接種
したのち、５％炭酸ガス培養器中３７°Ｃ４日間培養し
、細胞数および抗体産生上をｉ＋＋定して表７の結果を
得た。

表７　マウスハイブリドーマによる抗体生産に及ぼす０
　　　　　４．８ｘ　１ｏ５１００ Ｑ、１％　　　　１．ｏｘ　ｔｏ”　　　　２５３″　
Ｐ　Ｅ　Ｇ　２０．０００無添加の場合の生産量を１０
０とした相対値で示した。

実施例１０ マウス・ヒト・ヒトヘテロハイプリドーマ■！２−２２
・２５株を実施例１と同し基礎培地に同じ濃度のＩＴＥ
Ｓおよび表８に示す濃度のＰＥＧ２０．０００を添加シ
タ培地＋、：ｌＸＩＯ３細胞／ｎｉｌ：なる様に接種し
たのち、５％炭酸ガス培羨器中３７’Ｃ６日間培養し、
細胞数および抗体産生量を測定して表８の結果を得た。

表８　マウス・ヒト・ヒトヘテロハイプリドーマｊこよ
るヒトモノクローナル抗体生産に及ぼすＰｏ　　　　　
　　２ＸｌＯ’　　　　１０００．１％　　　　６Ｘ１
０’　　　　２８０″Ｐ　Ｅ　Ｇ　２０．０００無添加
の場合の生産量を１００として相対値で示しｆこ。

ｐ　Ｅ　Ｇ　２ｏ、ｕＢｉ添加およびｔｌ、ｔ％添加培
地で培養した細胞培養上／ｎ各１ｆ２に硫酸アンモニウ
ムを加えて３７％〜５０％（飽和度）で沈澱する両分を
集め、透析後、０．０７ＭＮａＣ１を添加した０、０２
Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐｒｎ、９）にて平衡化したワ
ットマンＤＥ５２カラムにかけ、素通り画分を集めた。

透析後凍結乾燥して３５ｆｆｉｌの０．００５ＭＮａＣ
１を含む０．０５ＭＭＥＳ緩所液（叶緩衝液、　０）に
溶かし、１ｖｌｏｎｏｓ　　ＨＲ５１５カラム（ファー
マンア）を用いたＦＰＬＣにかけ、同じ緩衝液にて洗滌
後Ｉ　Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＩを含む０　、０５　ＭＭＥ　５
ｔｌｌ街液（ｐＨ６，（１）で直線濃度勾配をかけて溶
出し、ＩｇＧ画分を集めたところ、ＰＥＧ無添加培地か
らは１０１８μｇ、ＰＥＧ添加培地からは３１３５μｇ
のヒトモノクローナル抗体がそれぞれ得られた。

発明の効果 本発明の動物細胞増殖用組成物による培地を用いると動
物細胞を人里に効率良く増殖させることができろ。また
、生理活性物質を生産する動物細胞を培養すると、該細
胞か大量に効率良く増殖されるので、生理活性物質を効
率良く生産させることができろ。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例！で得られたポリエチレングリコール
の添加効果を示す。 第２図は、実施例６で得られた細胞の継代培養の結果を
示す。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）、ポリエチレングリコールを含有してなる動物細
   胞増殖用組成物。
2. （２）、固体状態にある特許請求の範囲第１項記載の組
   成物。
3. （３）、水溶液である特許請求の範囲第１項記載の組成
   物。
4. （４）、ポリエチレングリコールの濃度が約１０％以下
   である特許請求の範囲第３項記載の組成物。
5. （５）、血清を含まない特許請求の範囲第３項または第
   ４項記載の組成物。
6. （６）、通常の使用量以下の血清を含む特許請求の範囲
   第３項または第４項記載の組成物。
7. （７）、ポリエチレングリコールを含有する動物細胞増
   殖用培地で動物細胞を培養することを特徴とする動物細
   胞の増殖方法。
8. （８）、動物細胞増殖用培地がポリエチレングリコール
   を１０％以下含有する培地である特許請求の範囲第７項
   記載の増殖方法。
9. （９）、動物細胞増殖用培地が血清を含まない培地であ
   る特許請求の範囲第７項または第８項記載の増殖方法。
10. （１０）、動物細胞増殖用培地が通常の使用量以下の血
    清を含む特許請求の範囲第７項または第８項記載の増殖
    方法。
11. （１１）、ポリエチレングリコールを含有する動物細胞
    増殖用培地で、生理活性物質を生産する動物細胞を培養
    し、培養物中にこれを生成蓄積せしめ、採取することを
    特徴とする生理活性物質の製造法。
12. （１２）、動物細胞増殖用培地がポリエチレングリコー
    ルを１０％以下含有する培地である特許請求の範囲第１
    １項記載の製造法。
13. （１３）、動物細胞増殖用培地が血清を含まない培地で
    ある特許請求の範囲第１１項または第１２項記載の製造
    法。
14. （１４）、動物細胞増殖用培地が通常の使用量以下の血
    清を含む培地である特許請求の範囲第１１項または第１
    ２項記載の製造法。