JP2500384B2

JP2500384B2 - 生理活性物質の製造法

Info

Publication number: JP2500384B2
Application number: JP6271895A
Authority: JP
Inventors: 一昭北野; 靖新谷
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1994-09-30
Publication date: 1996-05-29
Anticipated expiration: 2011-05-29
Also published as: JPH0851993A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、動物細胞を培養する生
理活性物質の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】動物細胞を大量に効率よく培養する技術
は、新しい有用な生理活性物質の探索や生産に、さらに
遺伝子操作技術を施した細胞を用いる生理活性物質生産
に必須の技術として、種々の方向からの研究が進められ
ている。従来動物細胞の培養には、血清を約１０％程度
添加した培地が主として用いられ、とりわけ牛胎児血清
（ＦＣＳ）含有培地が賞用されて来た。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、血清は
非常に高価であり、かつ原因不明のロット差があるた
め、細胞を大量に培養するには問題が多い。さらに血清
には多種類の異種蛋白質が含まれるため、生産される有
用物質を培養液から回収精製する際にも不都合が生ず
る。これらの不都合を解消しようとして、血清を含まな
い培地（無血清培地）が種々開発されて来たが、一般に
汎用性が低く、増殖性および生理活性物質生産性の面で
も血清含有培地に比べると必ずしも十分なものとはいえ
ない。

【０００４】いずれにしても従来知られている培地は、
細胞培養によって有用物質を大量に効率よく得るために
は必ずしも十分満足できるものではなかった。そこ
で、本発明者らは、ポリエチレングリコールを添加した
動物細胞増殖用組成物により動物細胞を培養すると、動
物細胞が著しく増殖され、またこれにより、産生される
生理活性物質の量が増大される旨の発明を行なった（特
願昭６１−１２８１１２号）。また、ポリビニールアル
コールまたはこれとポリエチレングリコールとを添加し
た動物細胞増殖用組成物により動物細胞を培養すると、
動物細胞が著しく増殖され、またこれにより、産生され
る生理活性物質の量が増大される旨の発明を行なった
（特願昭６１−２２７１９０号）。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、さらに種
々研究を重ねたところ、ポリエチレングリコールまたは
／およびポリビニールアルコールにさらに低密度リポ蛋
白質を添加すると、血清無添加の状態でも動物細胞の増
殖が著しく促進され、またこれにより、産生される生理
活性物質の量が増大され、しかも動物細胞に対する汎用
性が高まることを見い出し、これに基づいてさらに研究
した結果、本発明を完成した。本発明は、（１）ポリエ
チレングリコールまたは／およびポリビニールアルコー
ルと低密度リポ蛋白質とを含有する動物細胞増殖用培地
で、生理活性物質を産生する動物細胞を培養し、培養物
中にこれを生成蓄積せしめ、採取することを特徴とする
生理活性物質の製造法、および、（２）動物細胞増殖用
培地が血清を含まない培地である上記（１）１記載の製
造法に関するものである。

【０００６】本明細書においては、ポリエチレングリコ
ール，ポリビニールアルコールおよび低密度リポ蛋白質
をそれぞれＰＥＧ，ＰＶＡおよびＬＤＬと略記すること
もある。

【０００７】本発明の組成物は、基礎培地，ポリエチレ
ングリコールまたは／およびポリビニールアルコールと
低密度リポ蛋白質とからなる。該基礎培地としては、動
物細胞の培養に用いることのできるものであればいずれ
のものでもよい。本発明に用いられる基礎培地として
は、たとえば市販されている各種基礎培地〔たとえば、
イーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）（サイエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）１３０巻４３２頁１９５９年），イー
グルの基礎培地（ＢＭＥ）（プロシーデイングス・オブ
・ザ・ソサイエティ・フォア・エキスペリメンタル・バ
イオロジー・アンド・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓｏｆｔｈｅＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＥｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｄ
ｉｃｉｎｅ）８９巻３６２頁１９６５年），ダルベ
ッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ）（バイロロジー（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ）８巻３９６頁１９５９年），イスコ
フ改変ダルベツコ培地（ＩＭＤＭ）（ザ・ジャーナル・
オブ・エキスペリメンタル・メディスン（ＴｈｅＪｏ
ｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉ
ｃｉｎｅ）１４７巻９２３頁１９７８年），Ｌ−１
５培地（アメリカン・ジャーナル・オブ・ハイジーン
（ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｙｇｉ
ｅｎｅ）７８巻１７３頁１９６３年），マッコイ５
ａ培地（プロシーデイングス・オブ・ザ・ソサイエティ
・フォア・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド
・メディスン１００巻１１５頁１９５９年），ハム
Ｆ１２培地（プロシーデイングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＮａｔｉｏｎａｌＡｃａ
ｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）５３巻
２８８頁１９６５年），ＲＰＭＩ１６４０培地（ジ
ャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシ
エーシヨン（ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒ
ｉｃａｎＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）
１９９巻５１９頁１９６７年）など〕あるいはこれら
を混合した培地が挙げられる。さらに該基礎培地にそれ
ぞれの細胞の増殖に必須な因子（補助増殖因子）たとえ
ばホルモン類（たとえばインスリン，トランスフェリ
ン，ステロイドホルモンなど），蛋白性増殖因子〔たと
えば上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ），血小板由来増殖因子
（ＰＤＧＦ），繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）など〕，
重金属類（たとえば亜セレン酸ナトリウムなど）やリン
脂質（たとえばエタノールアミン，ホスファチジルエタ
ノールアミンなど）を必要により添加した無血清培地が
挙げられる。

【０００８】さらに、これらに通常の使用量またはそれ
以下の血清代替物質〔たとえばＧＦＳ（第２回次世代産
業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー予講集１
６１頁，１９８４年），ＮＵ−シーラム（コラボレーテ
イブリサーチ社製），シーラムプラス（ＫＣバイオロジ
カルズ社製）など〕が添加された培地や、通常の使用量
以下の血清〔たとえば牛胎児血清（ＦＣＳ），新生子牛
血清，仔牛血清，ブタ血清，ヤギ血清，ニワトリ血清な
ど〕を添加した培地でもよい。また市販の無血清培地
〔たとえばハイブリティー１（日本薬品開発製），ＨＢ
−１０２（ハナ・メディア社製），ＨＬ−１（ベントレ
ット社製）など〕を基礎培地として用いてもよく、市販
の基礎培地に準じてアミノ酸などの濃度を最適化した培
地を作成して用いてもよい。

【０００９】本発明で用いられるポリエチレングリコー
ルは、〔−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−〕ｎ（ｎは重合度を表
す。）の構造を持つ高重合体であり、重合分子量が約１
０００以上のものが好ましく、なかでも約２，０００な
いし２０，０００のものが好ましく、さらに約４，００
０，約６，０００，約２０，０００のものが好ましい。
本発明で用いられるポリエチレングリコールの量は、使
用時の濃度が約１０％Ｗ／Ｖ）以下となる量が好まし
い。なおここにおいて、「以下」は「０」を含まないこ
とを示す。また、ポリエチレングリコールの量として
は、使用時の濃度が、より好ましくは約０．００１ない
し１０％（Ｗ／Ｖ）、さらに好ましくは約０．０１ない
し２％（Ｗ／Ｖ）となる量である。また、本発明で用い
られるポリビニールアルコールは、〔−ＣＨ_２ＣＨ（Ｏ
Ｈ）−〕ｎ’は（ｎ’は重合度を表す。）の構造を持つ
高重合体であり、平均重合度が約５００ないし２，００
０のものが好ましく、なかでも約５００のもの，１，５
００〜１，８００のものが好ましい。本発明で用いられ
るポリビニールアルコールの量は、使用時において約
０．００１ないし１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく，なかで
も約０．０１ないし３％（Ｗ／Ｖ）となる量がより好ま
しい。ポリエチレングリコールとポリビニールアルコー
ルは単独で使用しても良いし、両者を同時に使用しても
良い。両者を同時に使用する場合、その混合比はＥＧを
１とした場合、ＰＶＡは約０．０１〜１００（重量比）
となるのが好ましく、なかでも約０．１〜１０（重量
比）となるように混合するのがより好ましい。

【００１０】本発明で用いられる低密度リポ蛋白質は、
動物の血しょうから分離される比重１．０１９ないし
１．０６３、分子量（２．２ないし２．３）×１０^６、
直径１９〜２５ｎｍの粒子を形成するリポ蛋白質で、脂
質，糖および蛋白質からなり、生体内では細胞へコレス
テロールを供給する役割を荷っている。本発明におい
ては、市販のＬＤＬ（例、ヒトＬＤＬ，ウシＬＤＬ等）
を用いてもよいし、例えばセル・カルチュアー・メソッ
ド・フォー・モルキュラー・アンド・セル・バイオロジ
ー（ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓｆｏ
ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌ
ｏｇｙ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）１巻６９頁１９８４年に記載の方法，以下の
参考例に示す方法などにより、動物（例、ウシ，ブタ
等）の血清から調整したＬＤＬを用いてもよいが、参考
例に示す方法により調整したＬＤＬがとりわけ好都合に
用いられる。本発明で用いられるＬＤＬの量としては、
使用時の濃度が、約０．０１ないし１０００μｇ／ｍｌ
となるのが好ましく、なかでも約０．０５ないし５００
μｇ／ｍｌとなるのがより好ましく、さらに好ましくは
約０．５ないし１００μｇ／ｍｌとなる量である。なお
本明細書において、ＬＤＬの量はＬＤＬが含有する蛋白
質量として表す。ＰＥＧまたは／およびＰＶＡとＬＤＬ
とは、あらかじめ組成物中に混合されていても良いし、
培地として使用する際に混入しても良い。

【００１１】本発明の動物細胞増殖用組成物は、固体状
態のものおよび水溶液であるもののいずれでもよい。固
体状態のものは、それをたとえば水に溶解あるいは懸濁
して用いられる。また、該組成物を動物細胞増殖用の培
地として用いることができるが、培地として用いる場合
には、血清を含まない培地としても良く、さらに、通常
の使用量以下の血清を含む培地としても良い。ここで、
通常の使用量としては、たとえば約１０％（Ｖ／Ｖ）が
挙げられる。本発明の組成物を培地として用いる場合に
は、通常の使用量またはそれ以下の血清代替物を含む培
地としてもよい。ここで、通常の使用量としては、たと
えば、ＧＦＳの場合は約３〜４ｇ／Ｌ（蛋白質として）
であり、ＮＵ−シーラムの場合は約１０％（Ｖ／Ｖ）
であり、シーラムプラスの場合は約１０％（Ｖ／Ｖ）で
ある。

【００１２】本発明方法によって培養される動物細胞と
しては、特に限定されない。その例としては、たとえば
ヒト，マウス，ラット，ウシ，ハムスターなどの哺乳動
物由来のリンパ系細胞（例、正常リンパ球，ミエローマ
細胞，Ｂ−リンパ芽球様細胞，Ｔリンパ性白血病細胞な
ど），各種ハイブリドーマ（例、マウスハイブリドー
マ，マウス・ヒトヘテロハイブリドーマ，ヒトハイブリ
ドーマなど），正常２倍体細胞（例、繊維芽細胞な
ど），その他の種々の接着依存性細胞などを挙げること
が出来る。

【００１３】より具体的には、ヒトリンパ系細胞として
は、Ｎａｍａｌｖａ（ＡＴＣＣＣＲＬ１４３２）（イ
ンターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆｃ
ａｎｃｅｒ）１２巻３９６頁１９７３年），Ｒａｊ
ｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ８６）（ランセット（Ｌａｎｃｅ
ｔ）１巻２３８頁１９６４年），ＥＢ−３（ＡＴＣ
ＣＣＣＬ８５）（ランセット１巻２５２頁１９６
４年），ＷＩ−Ｌ２（キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）２２
巻５１７頁１９６８年），Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２１３）（キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２８巻１３００頁１９６８
年），ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣＣＣＬ１５５）
（プロシーデイングス・オブ・ザ・ソサイエティ・フォ
ア・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデ
ィスン１２５巻１２４６頁１９６７年），ＣＣＲＦ
−ＣＥＭ（ＡＴＣＣＣＣＬ１１９）（キャンサー１
８巻５２２頁１９６５年），ＲＰＭＩ１７８８
（ＡＴＣＣＣＣＬ１５６）（ジャーナル・オブ・ザ・
ナショナル・キャンサー・インスティチュート（ユナイ
ティド・ステーツ）（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅ
ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ
（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ））４３巻１１１９頁
１９６９年），ＣＲＣＦ−ＳＢ（ＡＴＣＣＣＣＬ１
２０）（キャンサー・リサーチ２７巻２４７９頁１
９６７年），Ｊｕｒｋａｔ（イムノジェネティクス（Ｉ
ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）１０巻２４７頁１９
８０年）などが、マウスリンパ系細胞としては、たとえ
ば、ＭＰＣ−１１（ＡＴＣＣＣＣＬ１６７）（ザ・ジ
ャーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディスン１３
１巻５１５頁１９７０年），ＮＳ−１（ＡＴＣＣ
ＴＩＢ１８（ユーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＩ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）６巻５１１頁１９７６年），
Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ・１（Ｐ３Ｕ１）（ＡＴＣＣＣＲ
Ｌ１５９７）（カレント・トピックス・オブ・マイクロ
バイオロジー・アンド・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ
ＴｏｐｉｃｓｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａ
ｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）８１巻１頁１９７８
年）などが、ハイブリドーマとしては、たとえばマウス
ハイブリドーマＣＥＡ（第２回次世代産業基盤技術シン
ポジウム−バイオテクノロジー予稿集１７５頁昭
和５９年），ＨＳ−ＩＩ（同上），Ｅ２３５Ｉ６３（ハ
イブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）４巻４７頁１
９８５年），マウス・ヒト・ヒトヘテロハイブリドーマ
Ｎ１２−１６・６３（第２回次世代産業基盤技術シンポ
ジウム−バイオテクノロジー予稿集１７５頁昭和
５９年），およびＮ１２−１６・６３から誘導された高
産生株（Ｎ１２−１６・６３・４９・１９，Ｎ１２−１
６・６３・４９・１９・６９など）（第３回次世代産業
基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー予稿集
１５５頁昭和６０年），Ｉ１２−２２・２５（バイオ
ケミカル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ・コミ
ュニケーション（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕ
ｎｉｃａｔｉｏｎ）１２９巻２６頁１９８５年），
ＨＢＩＩＩ−４３・１（同上）ヒトＢハイブリドーマＷ
４７１−７．２４（ＩＦＯ５００９４）などが、接着
依存性細胞としては、たとえばＦＬ（ＡＴＣＣＣＣＬ
６２）（プロシーデイングス・オブ・ザ・ソサイエティ
・フォア・エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド
・メディスン９４巻５３２頁１９５７年），ＨｅＬ
ａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）（キャンサー・リサーチ１
２巻２６４頁１９５２年），Ｗｉｓｈ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２５）（エキスペリメンタル・セル・リサーチ
（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｒ
ｃｈ）２３巻１４頁１９６１年），ＣＨＯ−Ｋ１
（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）（ザ・ジャーナル・オブ・エ
キスペリメンタル・メディスン１０８巻９４５頁
１９５８年），Ｌ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１）（ジャー
ナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスチチュー
ト・ユー・エス・エー９巻２２９頁１９４８年）
などがそれぞれ挙げられる。上記ヒトＢハイブリドーマ
Ｗ４７１−７．２４は日本特願昭６１−２２７１９１号
に記載の方法で得られ、昭和６１年８月２０日から財団
法人発酵研究所（ＩＦＣ）にＩＦＯ５００９４として
寄託されている。

【００１４】本発明の生理活性物質の製造法において用
いられる生理活性物質を生産する動物細胞としては、た
とえば、マウスモノクローナル抗体を産生するＣＥＡ，
ＨＳ−ＩＩ，Ｅ２３５１６３など、ヒトモノクローナル
抗体を産生するＮ１２−１６・６３およびその変異株，
Ｉ１２−２２・２５，ＨＢＩＩＩ−４３・１Ｗ４７１−
７．２４などが、白血球インターフェロンを産生するＮ
ａｍａｌｖａ細胞、インターロイキン−２を産生するＪ
ｕｒｋａｔ細胞，遺伝子組換え細胞（マウスＬ−ＩＬ−
２１３−３細胞，ヒトＦＬ−ＩＬ３８５−６細胞，ハム
スターＣ−ＩＬ４８５−１４細胞（特開昭６１−６３２
８２号公報参照）など）などが挙げられる。本発明方法
の培養には通常培養に用いられる容器または装置が用い
られる。たとえば浮遊細胞の場合には、マルチウエルプ
レート，培養フラスコ，スピナーフラスコ，ジャーファ
ーメンター，ファーメンターなどが用いられ、さらにホ
ローファイバー培養装置，セラミックマトリックスを用
いた培養装置さらにマイクロカプセル培養法などが適宜
採用される。接着依存性細胞の場合には、マルチウエル
プレート，培養フラスコ，ローラーボトル，マイクロキ
ャリアー培養法，ホローファイバー培養法，セラミック
マトリックス培養法などが用いられる。

【００１５】本発明の培養は、用いられる動物細胞の培
養に適した条件が採用される。一般的には、培養温度約
３７℃前後で、ｐＨ約６．５ないし７．５で、数日ない
し３か月培養される。たとえば、本発明の培地に通常
０．１ないし５×１０^５個／ｍｌの細胞を播種し、マル
チウエルプレートやフラスコの場合には約３７℃，５％
炭酸ガス培養器（炭酸ガス濃度５％の培養器）中でｐＨ
約６．５ないし７．５で約１ないし２０日間培養され
る。ジャーファーメンターやファーメンターなどでは通
気攪拌培養が行われる。またこれらの培養槽やホローフ
ァイバー，セラミックマトリックス，マイクロカプセル
などを用いた培養においては培地を回分的，または連続
的に交換することにより生理活性物質の生産性を向上さ
せることができる。連続潅流培養の場合には１ないし数
ケ月（約３か月）も続ける場合がある。また、必要によ
り通気される。培養液から細胞を採取するには、たとえ
ば、浮遊細胞の場合は、培養液を直遠心分離機やろ過機
にかけて集める。接着依存性細胞の場合にはたとえば、
０．１ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡおよび１．２５ｍｇ／ｍｌ
のトリプシンを添加して、３７℃，１ないし２分反応さ
せて細胞を分散させたのち、遠心分離またはろ過によっ
て集める。

【００１６】細胞培養によって生産される生理活性物質
は、その物質が培養液中に蓄積される場合、ろ過または
遠心分離によって上澄液を得、これから採取される。ま
た細胞内に蓄積される物質の場合には、ろ過または遠心
分離によって得た細胞を物理的方法（例、超音波，フレ
ンチプレス，ダイノミルなど）または化学的方法（例、
塩酸グアニジン等）にて処理し、生産物を抽出したの
ち、上澄液を得る。上記上澄液から生理活性物質を分
離，精製するには自体公知の分離，精製法を適宜組み合
わせて行うことができる。たとえば生理活性物質が蛋白
質またはペプチドの場合には、塩析や溶媒沈澱法などの
溶解度を利用する方法，透析法，限外ろ過法，ゲルろ過
法，ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの
主として分子量の差を利用する方法，イオン交換クロマ
トグラフィーなどの荷電の差を利用する方法，アフィニ
ティクロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する
方法，逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の
差を利用する方法，等電点電気泳動などの等電点の差を
利用する方法などが適用される。本発明の方法に従って
増殖させた動物細胞は、たとえばこれにウイルスを感染
させてワクチンの製造に利用したり、各種リンフォカイ
ン類（例、インターフェロン，インターロイキン−２な
ど），各種増殖因子類（例、上皮細胞増殖因子，繊維芽
細胞増殖因子など），各種ホルモン類（例，ヒト成長
ホルモン，インスリンなど），各種酵素類（例、ウロキ
ナーゼ，組織プラスミノーゲン活性化因子など）や各種
モノクローナル抗体（例、マウスモノクローナル抗体，
ヒトモノクローナル抗体など）などの生理活性物質の生
産に利用される。また遺伝子操作によって特定の遺伝子
を導入した細胞を用いることにより該物質を効率よく生
産させることができる。また本発明の方法に従って増殖
し、集めた細胞を直接に、人工皮膚や人工器官（例、膵
臓ベータ島細胞や、肝細胞など）として利用することも
できる。本発明方法により、動物細胞を効率良く増殖さ
せることができるので、動物細胞を工業的に大量に増殖
させる方法として有利に用いることができる。本発明方
法において、生理活性物質を生産する動物細胞を培養し
た場合には、該細胞が効率良く増殖されるので、生理活
性物質を効率良く生産することができ、工業生産上有利
である。

【００１７】

【実施例】以下に参考例および実施例を挙げて本発明を
更に具体的に説明する。ＰＥＧおよびＰＶＡの添加％は
Ｗ／Ｖ％を表す。また、ＬＤＬの添加量はＬＤＬが含有
する蛋白質量として表している。なお、実施例で用いた
ヒトＬＤＬは、シグマ社製の市販のＬＤＬであり、ブタ
ＬＤＬは参考例１に示す方法で製造されたものである。

【００１８】参考例１ブタ血清１Ｌを５ｍＭＥＤＴＡと１ＭＮａＣｌを添加し
た１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して
透析したのち、同じ緩衝液で平衡化したシバクロン・ブ
ルーＦ３Ｇ−Ａ（バイオラッド社製）カラム（２．５ｃ
ｍφ×１８ｃｍ）へ通液した。同じ緩衝液で十分洗滌し
たのち、この緩衝液に０．５ＭＮａＳＣＮを添加した溶
出液３００ｍｌで溶出した。活性画分を集め、低比重液
（０．１５ＭＮａＣｌ，ｄ＝１．００６）を添加して比
重をｄ＝１．０１９に調整したのち、３５０００ｒｐｍ
で３０時間遠心分離した。底部層約１００ｍｌを集め
て、これに高比重液（ｄ＝１．３４６，ＮａＣｌ１５
３．０ｇとＫＢｒ３５４．０ｇとを水に溶かして１Ｌと
したもの）を添加して比重をｄ＝１．０６９に調整した
のち、超遠心分離機（３５０００ｒｐｍ，３０分，４
℃）にかけて、ＬＤＬ層（最上層）約１０ｍｌ（蛋白質
として約１０．６ｍｇのＬＤＬを含む）を得た。

【００１９】参考例２ＩＭＤＭ，ハムＦ１２およびＬ−１５培地を１：１：２
の比率で混合した培地に、２ｍｇ／Ｌインスリン，２ｍ
ｇ／Ｌトランスフェリン，２×１０^−６Ｍエタノールア
ミン，２．５×１０^−８Ｍ亜セレン酸ナトリウム（４つ
合せてＩＴＥＳと称する。）を添加し、これにＰＥＧ２
０，０００（平均分子量２０，０００）を０．１％添加
した培地と、無添加の培地とを用意し、それぞれ２４穴
マルチウエルプレートへ１ｍｌ宛分注した。この各穴
へ、第１図に示す各種濃度のヒトＬＤＬ（シグマ社製）
を添加したのち、マウス・ヒト−ヒトヘテロハイブリド
ーマＮ１２−１６・６３・４９・１９株の細胞を１×１
０^５個／ｍｌになるように播種し、５％炭酸ガス培養器
中で３７℃，３日間培養後、コールターカウンターにて
細胞数を測定した。結果を第１図に示す。第１図におい
て、−○−はヒトＬＤＬのみを添加した場合、−●−は
ヒトＬＤＬと０．１％ＰＥＧ２０，０００とを同時に添
加した場合の細胞数を示す。

【００２０】第１図から明らかなように、０．１％ＰＥ
Ｇと至適濃度（３．１２ないし２５μｇ／ｍｌ）のヒト
ＬＤＬとを添加すると、０．１％ＰＥＧのみあるいは至
適濃度のヒトＬＤＬのみを添加した場合に比べて、細胞
増殖は著しく促進された。

【００２１】参考例３参考例２におけるヒトＬＤＬの代りに、参考例に従って
調整したブタＬＤＬを各種濃度添加し、実施例１と同一
条件下で実施して細胞数を測定した。結果は第２図に示
す。第２図において、−○−はブタＬＤＬのみを添加し
た場合、−●−はブタＬＤＬと０．１％ＰＥＧ２０，０
００とを同時に添加した場合の細胞数を示す。

【００２２】第２図から明らかなように、０．１％ＰＥ
Ｇと至適濃度（０．３６ないし２００ｇ／ｍｌ）のブタ
ＬＤＬとを添加すると、０．１％ＰＥＧのみあるいは至
適濃度のブタＬＤＬのみを添加した場合に比べて、細胞
増殖は著しく促進された。

【００２３】第１図，第２図を比較すると、参考例１に
示す方法により調整したブタＬＤＬは、市販のヒトＬＤ
Ｌ（シグマ社製）に比べて、ＰＥＧとの相乗効果が大き
く、かつ広い濃度域で安定した増殖を示すことが明らか
である。

【００２４】参考例４参考例２と同じ基礎培地にＩＴＥＳを添加した培地
（１）、更にこれに０．１％ＰＥＧ２０，０００を添加
した培地（２）、培地（１）に０．１％ＰＶＡ（平均重
合度５００）を添加した培地（３）、培地（１）に０．
０５％ＰＥＧ２０，０００と０．０５％ＰＶＡ（平均重
合度５００）とを添加した培地（４）、およびその各々
に参考例に従って調製したブタＬＤＬ１０μｇ／ｍｌを
添加した培地（５）ないし（８）を用意し、これらを２
４穴マルチウエルプレートへ１ｍｌ宛分注した。これに
表１に示す各種細胞を１×１０^５個／ｍｌの割合で播種
し、３７℃，５％炭酸ガス培養器中で３日間培養したの
ち、コールターカウンターで細胞数を計数し、表１の結
果を得た。

【表１】表１の結果から、ＰＥＧまたは／およびＰＶＡとＬＤＬ
とを添加すると、各種細胞に対して幅広く細胞増殖を示
すことが明らかである。

【００２５】参考例５参考例２と同じ基礎培地にＩＴＥＳを添加した培地
（１）、更にこれに０．１％ＰＥＧ２０，０００を添加
した培地（２）、培地（１）に０．１％ＰＶＡ（平均重
合度５００）を添加した培地（３）、培地（１）に０．
０５％ＰＥＧ２０，０００と０．０５％ＰＶＡ（平均重
合度５００）とを添加した培地（４）、およびその各々
に参考例に従って調製したヒトＬＤＬ１０μｇ／ｍｌを
添加した培地（５）ないし（８）を用意し、これらを２
４穴マルチウエルプレートへ１ｍｌ宛分注した。これに
表２に示す各種細胞を１×１０^５個／ｍｌの割合で播種
し、３７℃，５％炭酸ガス培養器中で３日間培養したの
ち、コールターカウンターで細胞数を計数し、表２の結
果を得た。

【表２】表２の結果から、ＰＥＧまたは／およびＰＶＡとＬＤＬ
とを添加すると、各種細胞に対して幅広く細胞増殖を示
すことが明らかである。

【００２６】実施例１参考例２と同じ基礎培地にＩＴＥＳを添加し、更にこれ
に０．１％ＰＥＧ２０，０００を添加した培地（１）、
１０μｇ／ｍｌヒトＬＤＬを添加した培地（２），０．
１％ＰＥＧ２０，０００と１０μｇ／ｍｌヒトＬＤＬと
を添加した培地（３）を用意し、これらをそれぞれ１０
０ｍｌスピナーフラスコへ仕込み、これにマウス・ヒト
−ヒトヘテロハイブリドーマＮ１２−１６・６３・４９
・１９・６９株を１×１０^５個／ｍｌになるように添加
し、回転数２５ｒｐｍ，３７℃にて６日間培養し、細胞
数および抗体産生量を測定した。結果を表３に示す。

【表３】上記培地（３）の培養液上清１Ｌに硫酸アンモニウムを
添加して０〜４５％飽和で沈澱する画分を集め、５ｍＭ
ＥＤＴＡを含む５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に対して透析し、生じる沈澱を集め、５ｍＭＥＤＴ
Ａと０．５ＭＮａＣｌとを添加した５０ｍＭトリス・塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）３．２ｍｌに溶解させたのち、
同じ緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−３００ゲルカ
ラム（約１００ｍｌ）にかけ、活性画分を集めたとこ
ろ、約１３ｍｇの抗破傷風トキソイドヒトＩｇＭが得ら
れた。

【００２７】参考例６参考例２と同じ基礎培地にＩＴＥＳを添加した培地，さ
らにこれに０．２５％ＰＥＧ２０，０００を添加した培
地を用意し、これを２４穴マルチウエルプレートへ１ｍ
ｌ宛それぞれ分注した。これらに、それぞれＷ４７１−
７．２４細胞（ＩＦＯ５００９４）を１×１０^５個／
ｍｌの割合で播種し、３７℃，５％炭酸ガス培養器中で
５日間培養したのちコールターカウンターで細胞数を計
数し、表４の結果を得た。

【表４】

【発明の効果】本発明の動物細胞増殖用組成物で生理活
性物質を生産する動物細胞を培養すると、該細胞が大量
に効率良く増殖されるので、生理活性物質を効率よく生
産させることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた各種濃度ヒトＬＤＬの添加
効果を示す。

【図２】第２図は、実施例２で得られた各種濃度ブタＬ
ＤＬの添加効果を示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリエチレングリコールまたは／およびポ
リビニールアルコールと低密度リポ蛋白質とを含有する
動物細胞増殖用培地で、生理活性物質を産生する動物細
胞を培養し、培養物中にこれを生成蓄積せしめ、採取す
ることを特徴とする生理活性物質の製造法。
【請求項２】動物細胞増殖用培地が血清を含まない培地
である請求項１記載の製造法。