JP5719301B2 - 血清不含インスリン不含で第ｖｉｉ因子を産生する方法 - Google Patents

Description

（発明の背景）
ＦＶＩＩの主な役割は、組織因子（ＴＦ）と共に凝固プロセスを開始することである。組織因子は、血管の外側に見出され、通常は血流に曝されない。血管傷害により、組織因子は血液および循環する第ＶＩＩ因子に曝される。一旦ＴＦに結合されると、ＦＶＩＩは様々なプロテアーゼ（それらは、トロンビン（第ＩＩａ因子）、活性化第Ｘ因子およびＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体それ自身）によってＦＶＩＩａに活性化される。ＦＶＩＩａ−ＴＦについての最も重要な基質は、第Ｘ因子および第ＩＸ因子である。第ＶＩＩａ因子は、総第ＶＩＩ因子タンパク質量の約１％に相当する量で循環中に存在する。第ＶＩＩ因子は、ＦＸａによって２本鎖の活性化形態である第ＶＩＩａ因子に切断される、単鎖酵素前駆体として主に血漿中に存在する。

組換え型活性化第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）は、前止血剤（ｐｒｏｈａｅｍｏｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ）として開発されてきた。ｒＦＶＩＩａの投与は、抗体の発生により他の凝固因子による処置が制限されている、出血を伴う血友病被験体において迅速かつ高効果の前止血反応をもたらす。また、第ＶＩＩ因子不全を伴う被験体における出血、または正常な凝固系を有しているが過剰の出血状態である被験体も、ｒＦＶＩＩａにより首尾よく処置することができる。

組換え血液凝固因子の調製は、重要性を獲得しつつある。例えば、他の凝血タンパク質のように、第ＶＩＩａ因子は、例えばアスパラギン結合（Ｎ結合）型グリコシル化；Ｏ結合型グルコシル化；およびグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化を含む多様な翻訳時修飾および翻訳後修飾に供される。これらの組換えタンパク質を、適切に組換えタンパク質を修飾することが可能な哺乳動物細胞において産生することが好ましい。

これは、動物血清またはアルブミン、トランスフェリン、インスリン等の動物由来成分の存在下で従来行われてきた組換え細胞（哺乳動物細胞培養）の最適な増殖を考慮することである。しかし、汚染のリスクを低減し、産生された産物における変異性を減少させる必要があることが認識されており、様々な方法および組成物が、組換え血液凝固因子の調製用の血清不含（ｆｒｅｅ）培地の使用のために開発されてきた（例えば、特許文献１および特許文献２または特許文献３を参照）。また、調製法におけるそのような培地の使用は、発現したタンパク質のより単純な精製をも可能にする。ほとんどの場合、組換え細胞は血清含有培地で高い細胞密度まで最初に培養され（例えば、作業用細胞バンク用）、その後それらは産生相中に血清不含培地に再順応させられる。

米国特許第６，１００，０６１号明細書 米国特許出願公開第２００３／０２０３４４８号明細書 米国特許出願公開第２００６／００９４１０４号明細書

血清不含培養方法は結果が変わりやすく、細胞増殖および第ＶＩＩ因子タンパク質の産生のためにインスリンの添加を要した。従って、哺乳動物細胞培養方法に関する技術分野において、多量の凝固タンパク質、具体的には組換えヒト第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドを産生するために、血清または他の動物由来成分およびインスリンの両方から解放されることが必要とされている。

（発明の簡潔な概要）
特定の態様によれば、本発明は、組換えヒトＦＶＩＩを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を得ること；および当該ＣＨＯ細胞をインスリンを欠いている血清不含培地中で培養することを含む、組換えヒト第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）を産生する方法に関する。具体的には、ＣＨＯ細胞におけるこのＦＶＩＩの産生は、インスリン存在下でのＦＶＩＩの産生に匹敵する。

当該産生方法において使用されるＣＨＯ細胞は、血清不含培養における増殖のために改変された組換えヒトＦＶＩＩを発現するＣＨＯ細胞株を、インスリン非存在下で増殖するＦＶＩＩ産生ＣＨＯ細胞株を得るため、当該ＣＨＯ細胞株をインスリン量を減少させながら連続的に培養することによってインスリン非存在下での細胞培養で増殖するように順応させて調製される。

特定の実施形態において、血清不含培養における増殖のために改変された組換えヒトＦＶＩＩを発現するＣＨＯ細胞株は、欧州細胞カルチャーコレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、イギリス、ポートダウン（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）に２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１で寄託された細胞株１Ｅ９細胞株である。

他の実施形態において、インスリン非存在下での増殖のために産生されたＦＶＩＩ産生ＣＨＯ細胞株は、欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２で寄託された１Ｅ９細胞株である。

産生方法において使用される細胞培養培地は、好ましくはビタミンＫ１を含む。より詳しくは、当該培地は、１以上の次の添加物ｉ）グルタミン；最終濃度０．９ｇ／ｌ、ｉｉ）硫酸第二鉄×７Ｈ２Ｏ ０．０００６ｇ／ｌ、ｉｖ）プトレシン、×２ＨＣｌ ０．００３６ｇ／ｌ、ｖｉ）ビタミンＫ１ ０．００２５ｇ／ｌ、ｖｉｉ）シンペロニック（Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ）；最終濃度１ｇ／ｌ、フェノールレッド ０．００８ｇ／ｌ、エタノールアミン ０．００１５３ｇ／ｌ、および炭酸水素Ｎａ ２ｇ／ｌが補充された血清不含ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２に基づく処方物である。

当該細胞は、連続的に培養する方法を用いて調製され、当該連続的に培養する方法は、インスリン濃度を減少させながらＣＨＯ細胞の連続継代をパルスする工程（ｐｕｌｓｅ）を含む。そのようなパルス手法は生存可能な細胞を産生する一方で、パルスを伴なわずに連続的に少なくなるインスリンで前記細胞を増殖させることは生存可能な細胞を産生しないことが見出された。

パルス方法における代表的工程は、インスリンを含有する標準血清不含培地中で１４日目までＣＨＯ細胞株を増殖させ、そして１４日目に当該細胞株を血清不含、インスリン不含培地へ移すことを含む。

特定の態様において、当該細胞をその後血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間、好ましくは１日間増殖させ、その後、０．２ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ再び移し、そしてインスリン含有培地中で１〜３日間、好ましくは３日間増殖させる。その後、インスリン含有培地中での１〜３日間、好ましくは３日間の増殖の後、当該ＣＨＯ細胞株を再び血清不含、インスリン不含培地中へ移す。

代表的な実施形態において、当該細胞を、その後、さらなる期間、好ましくは１日間、血清不含、インスリン不含培地中で増殖させ、その後０．０７０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移し、そしてインスリン含有培地中で３〜８日間、好ましくは８日間増殖させる。インスリン含有培地中での３〜８日間、好ましくは８日間の増殖の後、当該ＣＨＯ細胞株を、血清不含、インスリン不含培地中へ移す。その後、当該方法は、１日間血清不含、インスリン不含培地中で細胞を増殖させ、その後当該細胞を０．０３０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移し、そしてインスリン含有培地中で当該ＣＨＯ細胞株を３〜９日間、好ましくは９日間増殖させることを含む。さらに、インスリン含有培地中での３〜９日間、好ましくは９日間の増殖の後、当該ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す。この細胞株を、その後、血清不含、インスリン不含培地中で１日間増殖させ、その後当該細胞を０．０１６ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移し、そして当該ＣＨＯ細胞株をインスリン含有培地中で３〜９日間、好ましくは９日間増殖させる。この細胞株は、その後、血清不含、インスリン不含培地へ移され、少なくとも３０継代、好ましくは少なくとも４０継代の間インスリン不含培地中で安定である。第０〜８８日目の順応中の実際のインスリン濃度（計算に基づく）は、図１に提示される。

従って、本発明は、インスリン濃度を減少させながらＣＨＯ細胞の連続継代をパルスすること（ここで、パルスは、ａ）当該細胞株をインスリン含有培地中で３〜９日間、より具体的には９日間増殖させることに続き、ｂ）インスリン不含、血清不含培地中で１日間増殖させること、そして工程ａ）およびｂ）を反復することを含み、ここで、各連続工程ａ）における培地は、培地が検出可能なインスリンを含有しなくなるまで前工程ａ）のおよそ半分の濃度のインスリンを含有する）を含む、血清不含培地中で増殖するＦＶＩＩ産生細胞株を血清不含、インスリン不含培地中で増殖する細胞株へと順応させる方法にも関する。

そのような好ましい順応方法において、当該方法は、ａ）インスリンを含有する標準的な血清不含培地中で１４日目までＣＨＯ細胞株を増殖させ、そして１４日目に当該細胞株を血清不含、インスリン不含培地へ移すこと；ｂ）工程ｂ）の細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間、より具体的には１日間増殖させ、その後当該細胞を０．２ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移し、そして当該ＣＨＯ細胞株をインスリン含有培地中で１〜３日間、より具体的には３日間増殖させること；ｃ）工程ｂ）のインスリン含有培地中での１〜３日間、より具体的には３日間の増殖の後、当該ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移すこと；ｄ）工程ｃ）の細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１日間増殖させ、その後当該細胞を０．０７０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移し、そして当該ＣＨＯ細胞株をインスリン含有培地中で３〜８日間、より具体的には８日間増殖させること；ｅ）工程ｄ）のインスリン含有培地中での３〜８日間、より具体的には８日間の増殖の後、当該ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移すこと；ｆ）工程ｅ）の細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１日間増殖させ、その後当該細胞を０．０３０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移し、そして当該ＣＨＯ細胞株をインスリン含有培地中で３〜９日間、より具体的には９日間増殖させること；ｇ）工程ｆ）のインスリン含有培地中での１日間の増殖の後、当該ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移すこと；ｈ）工程ｇ）の細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１日間増殖させ、その後当該細胞を０．０１６ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移し、当該ＣＨＯ細胞株をインスリン含有培地中で３〜９日間、より具体的には９日間増殖させること；ならびにｉ）工程ｈにおけるインスリン含有培地中での３〜９日間、より具体的には９日間の増殖の後、当該ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移すことを含み、ここで工程ｉ）の細胞は血清不含、インスリン不含培地中での長期増殖に順応させられている。また、本発明はこれらの方法に従って産生された細胞に関する。

本発明のさらなる態様は、ヒトＦＶＩＩを発現し、動物由来成分を欠いているインスリン不含培地中での増殖に順応させられた組換えＣＨＯ細胞に関する。好ましくは、組換え細胞は、インスリン濃度を減少させながらＣＨＯ細胞の連続継代をパルスすること（ここで、パルスは、ａ）インスリン含有培地中で９日間細胞株を増殖させることに続き、ｂ）インスリン不含、血清不含培地中で１日間増殖させること、そして工程ａ）およびｂ）を反復することを含み、ここで、各連続工程ａ）における培地は、培地が検出可能なインスリンを含有しなくなるまで前工程ａ）のおよそ半分の濃度のインスリンを含有する）を含む、血清不含培地中で増殖するＦＶＩＩ産生細胞株を血清不含、インスリン不含培地中で増殖する細胞株へと順応させることによって産生される。

好ましいヒトＦＶＩＩを発現する組換えＣＨＯ細胞は、欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１で寄託されているものである。さらに好ましいヒトＦＶＩＩを発現する組換えＣＨＯ細胞は、欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２で寄託されているものである。

また、哺乳動物細胞におけるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドのラージスケール産生の方法が考えられ、当該方法は、（ａ）本発明の順応させられた組換え細胞を血清不含、インスリン不含培地を含有する培養容器中に播種し、そして少なくとも細胞が所定の密度に到達するまで当該哺乳動物細胞培養物を増殖させること；（ｂ）増殖させられた種培養物を血清不含、インスリン不含培地を含有するラージスケール培養容器へ移すこと；（ｃ）少なくとも当該細胞が所定の密度に到達するまで血清不含、インスリン不含培地中でラージスケール培養物を増殖させること；（ｄ）工程（ｃ）で得られた培養物を、ＦＶＩＩ発現またはＦＶＩＩ関連ポリペプチド発現に適当な条件下で血清不含、インスリン不含培地中で維持すること；および（ｅ）当該維持された培養物からＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドを取り出すことを含む。

好ましくは、当該方法は、工程（ｂ）の前に、漸進的に増加するサイズの種培養容器を使用して工程（ａ）を繰り返すことをさらに含む。また、当該方法は、定期的な培養培地の採取および新鮮培地による置換によって血清不含、インスリン不含培地中において工程（ｃ）で得られた培養物を維持することをさらに含み得る。

当該培養方法は、例えば、マイクロキャリア法；マクロ多孔質キャリア法等の任意の方法であってよい。当該方法は、標準マイクロキャリア法またはマイクロキャリア灌流法であってもよい。あるいは、当該方法は、灌流法またはバッチ／ドローフィル（ｄｒａｗ−ｆｉｌｌ）法であってもよい懸濁法である。当該細胞培養法は、単純バッチ法、フェドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）法またはドローフィル法であってもよい。播種工程の前に、当該細胞は、インスリンを欠いている血清不含培地中での増殖に順応させられている。さらに、当該細胞は、播種工程の前に、懸濁培養における増殖が可能であることが好ましい。

記載される方法において、好ましくは、所望のＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドは、ヒトＦＶＩＩまたはヒトＦＶＩＩ関連ポリペプチドである。当該ラージスケール産生方法は、好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルでＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドを産生するものである。より好ましくは、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドは、少なくとも約２．５ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される。他の実施形態において、当該方法の収率は、少なくとも約５ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルでＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドを産生するものである。他の好ましい実施形態において、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドは、少なくとも約８ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される。具体的な代表的実施形態において、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドは、約３〜４ｍｇ／ｌ／日のレベルで産生される。

当該方法は、少なくとも５０００Ｕ／Ｌ／日のＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドを生じる。他の実施形態において、少なくとも７０００Ｕ／Ｌ／日のＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが産生される。産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドの活性単位の好ましい範囲は、約７０００〜１０，０００Ｕ／ｌ／日である。

具体的な実施形態において、当該方法は、工程（ｃ）において得られた培養物を細胞含有キャリアの沈降の後、培養上清の一部を定期的に採取すること、および新鮮培地による置換によって血清不含、インスリン不含培地中に維持することをさらに含む。好ましくは、当該方法は、キャリアの沈降前に培養の設定値未満の所定の温度まで培養物を冷却することをさらに含む。例えば、当該培養物は、キャリア沈降前に培養の温度設定値より５℃〜３０℃低い温度まで冷却される。他の実施形態において、当該培養物は、培養の温度設定値より５℃〜２０℃低い温度まで冷却される。さらに他の実施形態において、当該培養物は、培養の温度設定値より５℃〜１５℃低い温度まで冷却される。より具体的な実施形態は、培養の温度設定値より約１０℃低い温度まで当該培養物を冷却することを含む。

規定された態様において、本明細書で使用される培地は、１以上の以下の添加物、ｉ）グルタミン；最終濃度０．９ｇ／ｌ、ｉｉ）硫酸第二鉄×７Ｈ２Ｏ ０．０００６ｇ／ｌ、ｉｖ）プトレシン、×２ＨＣｌ ０．００３６ｇ／ｌ、ｖｉ）ビタミンＫ１ ０．００２５ｇ／ｌ、ｖｉｉ）シンペロニック；最終濃度１ｇ／ｌ、フェノールレッド０．００８ｇ／ｌ、エタノールアミン０．００１５３ｇ／ｌ、および炭酸水素Ｎａ ２ｇ／ｌが補充された血清不含ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２に基づく処方物である。

具体的な実施形態において、好ましい方法における条件は、ラージスケール培養における細胞の細胞密度が１〜３×１０^６／ｍｌであり、当該培養物が希釈率０．２５〜１．５で、ｐＨ７．１＋−０．３、ｐＯ２ １０〜５０％に維持されるようなものである。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ａ）組換えヒトＦＶＩＩを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を得る工程；および
ｂ）前記ＣＨＯ細胞をインスリンを欠いている血清不含培地中で培養する工程
を含む、組換えヒト第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の産生方法。
（項目２）
前記ＣＨＯ細胞における前記ＦＶＩＩの産生が、インスリン存在下におけるＦＶＩＩの産生に匹敵する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＣＨＯ細胞が、血清不含培養で増殖するように改変された組換えヒトＦＶＩＩを発現するＣＨＯ細胞株を、インスリン非存在下で増殖するＦＶＩＩ産生ＣＨＯ細胞株を得るため、前記ＣＨＯ細胞株をインスリン量を減少させながら連続的に培養する工程により、インスリン非存在下における細胞培養で増殖するように順応させる工程によって調製される、項目１に記載の方法。
（項目４）
血清不含培養における増殖用に改変された組換えヒトＦＶＩＩを発現する前記ＣＨＯ細胞株が、欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１において寄託された細胞株１Ｅ９細胞株である、項目３に記載の方法。
（項目５）
インスリン非存在下で増殖する前記ＦＶＩＩ産生ＣＨＯ細胞株が、欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２において寄託された１Ｅ９細胞株である、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記細胞培養培地がビタミンＫ１を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記連続的な培養が、インスリン濃度を減少させながらＣＨＯ細胞の連続継代をパルスする工程を含む、項目３に記載の方法。
（項目８）
ＣＨＯ細胞株を１４日目までインスリンを含有する標準的な血清不含培地中で増殖させる工程、そして１４日目に血清不含、インスリン不含培地へ前記細胞株を移す工程を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、その後、０．２ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地へ前記細胞を移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で１〜３日間増殖させる工程を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
インスリン含有培地中での１〜３日間の増殖の後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０７０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜８日間増殖させる工程を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
インスリン含有培地中で３〜８日間増殖させた後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０３０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させた後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０１６ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
血清不含培地中で増殖するＦＶＩＩ産生細胞株を血清不含、インスリン不含培地中で増殖する細胞株へと順応させる方法であって、インスリン濃度を減少させながらＣＨＯ細胞の連続継代をパルスする工程を含み、ここで、前記パルスする工程は、ａ）前記細胞株をインスリン含有培地中で１〜９日間増殖させ、続いて、ｂ）インスリン不含、血清不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、ならびに工程ａ）および工程ｂ）を繰り返す工程であって、ここで、各連続工程ａ）における培地は、検出可能なインスリンを含有しなくなるまで、前の工程ａ）のおよそ半分の濃度のインスリンを含有する、工程を含む、方法。
（項目１７）
ａ）ＣＨＯ細胞株を、インスリンを含有する標準血清不含培地中で１４日目まで増殖させる工程、そして１４日目に前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地へ移す工程、
ｂ）工程ｂ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．２ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で１〜３日間増殖させる工程、
ｃ）工程ｂ）のインスリン含有培地中での１〜３日間の増殖の後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程、
ｄ）工程ｃ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０７０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜８日間増殖させる工程、
ｅ）工程ｄ）のインスリン含有培地中での３〜８日間の増殖の後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程、
ｆ）工程ｅ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０３０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程、
ｇ）工程ｆ）のインスリン含有培地中での３〜９日間の増殖の後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程、
ｈ）工程ｇ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０１６ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程、および
ｉ）工程ｈのインスリン含有培地中での３〜９日間の増殖の後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程であって、ここで、工程ｉ）の細胞は、血清不含、インスリン不含培地中での長期増殖に順応させられている、工程
を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
項目１６または１７に記載の方法に従って産生される細胞。
（項目１９）
ヒトＦＶＩＩを発現し、かつ、動物由来成分を欠いているインスリン不含培地中での増殖に順応させられている組換えＣＨＯ細胞。
（項目２０）
前記細胞は、血清不含培地中で増殖するＦＶＩＩ産生細胞株を血清不含、インスリン不含培地中で増殖する細胞株へと順応させる工程によって産生され、前記工程は、インスリン濃度を減少させながらＣＨＯ細胞の連続継代をパルスする工程を含み、ここで、前記パルスする工程は、ａ）前記細胞株をインスリン含有培地中で１〜９日間増殖させる工程に続き、ｂ）インスリン不含、血清不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、ならびに工程ａ）および工程ｂ）を繰り返す工程であって、ここで、各連続工程ａ）における培地は、検出可能なインスリンを含有しなくなるまで、前の工程ａ）のおよそ半分の濃度のインスリンを含有する、工程を含む、項目１９に記載の組換え細胞。
（項目２１）
欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１において寄託された、ヒトＦＶＩＩを発現する組換えＣＨＯ細胞。
（項目２２）
欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２において寄託された、ヒトＦＶＩＩを発現する組換えＣＨＯ細胞。
（項目２３）
哺乳動物細胞におけるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドのラージスケール産生方法であって、
ａ）項目１８に記載の細胞を血清不含、インスリン不含培地を含有する培養容器中に播種する工程、さらに前記哺乳動物細胞培養物を少なくとも前記細胞が所定の密度に到達するまで増殖させる工程、
ｂ）前記増殖させた種培養物を血清不含、インスリン不含培地を含有するラージスケール培養容器へ移す工程、
ｃ）血清不含、インスリン不含培地中の前記ラージスケール培養物を、少なくとも前記細胞が所定の密度に到達するまで増殖させる工程、
ｄ）血清不含、インスリン不含培地中の工程（ｃ）で得られた培養物を、ＦＶＩＩ発現またはＦＶＩＩ関連ポリペプチド発現に適当な条件下で維持する工程、および
ｅ）前記ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドを前記維持された培養物から取り出す工程
を含む、方法。
（項目２４）
工程（ｂ）の前に、漸進的にサイズが大きくなる種培養容器を用いて工程ａ）を繰り返す工程をさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
血清不含、インスリン不含培地中の工程（ｃ）で得られた培養物を、定期的な、前記培養培地の採取および新鮮培地による置換によって、保持する工程をさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記方法がマイクロキャリア法である、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記方法がマクロ多孔質キャリア法である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記方法が標準マイクロキャリア法である、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記方法がマイクロキャリア灌流法である、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記方法が懸濁法である、項目２３に記載の方法。
（項目３１）
前記方法が灌流法である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記方法がバッチ／ドローフィル法である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記方法が単純バッチ法である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記方法がフェドバッチ法である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記方法がドローフィル法である、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記方法がケモスタット培養法である、項目２３に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞が、前記播種工程の前に、インスリンを欠いている血清不含培地中での増殖に順応させられている、項目２３に記載の方法。
（項目３８）
前記細胞は、前記播種工程の前に、懸濁培養における増殖が可能である、項目２３に記載の方法。
（項目３９）
前記所望のＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドがヒトＦＶＩＩまたはヒトＦＶＩＩ関連ポリペプチドである、項目２３に記載の方法。
（項目４０）
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも約１ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、項目２３に記載の方法。
（項目４１）
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも約２．５ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも約５ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも約８ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、約３〜４ｍｇ／ｌ／日のレベルで産生される、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチド単位が、少なくとも５０００Ｕ／ｌ／日である、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチド単位が、少なくとも７０００Ｕ／ｌ／日である、項目４２に記載の方法。
（項目４７）
産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドの活性単位が、約７０００〜１０，０００Ｕ／ｌ／日である、項目４２に記載の方法。
（項目４８）
工程（ｃ）で得られた培養物を、細胞含有キャリアの沈降の後、培養物上清の一部を定期
的に採取し、新鮮な培地で置換する工程によって動物産出物不含、インスリン不含培地中で維持する工程をさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目４９）
キャリアの前記沈降前に、前記培養の設定値より低い所定の温度まで前記培養物を冷却する工程をさらに含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記培養物を、キャリアの前記沈降前に、前記培養の設定値より５℃〜３０℃低い温度まで冷却する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記培養物を、前記培養の温度設定値より５℃〜２０℃低い温度まで冷却する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記培養物を、前記培養の温度設定値より５℃〜１５℃低い温度まで冷却する、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記培養物を、前記培養の温度設定値より約１０℃低い温度まで冷却する、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記培地が、１以上の次の添加物、ｉ）グルタミン；最終濃度０．９ｇ／ｌ、ｉｉ）硫酸第二鉄×７Ｈ２Ｏ ０．０００６ｇ／ｌ、ｉｖ）プトレシン、×２ＨＣｌ ０．００３６ｇ／ｌ、ｖｉ）ビタミンＫ１ ０．００２５ｇ／ｌ、ｖｉｉ）シンペロニック；最終濃度１ｇ／ｌ、フェノールレッド ０．００８ｇ／ｌ、エタノールアミン ０．００１５３ｇ／ｌ、および炭酸水素Ｎａ ２ｇ／ｌが補充された血清不含ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２に基づく処方物である、項目１、項目１６または項目２３に記載の方法。

図１は、血清不含、インスリン不含条件において増殖する１Ｅ９細胞株を選択するための減少ストラテジーのグラフを示す。 図２は、血清不含、インスリン不含培地中で増殖することが可能なＣＨＯ−Ｋ１細胞株を導くためのインスリンを伴う血清不含培地およびインスリンを伴わない血清不含培地によりＣＨＯ−Ｋ１細胞のパルスすることを図示するグラフを示す。 図３は、標準継代希釈と本発明のパルス技術による血清不含、インスリン不含培地への細胞の順応の比較を図示するグラフを示す。

（発明の詳細な説明）
本発明は、血清不含およびインスリン不含条件下で、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において組換えヒト第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）を産生する方法を提供する。当該方法は、ヒトＦＶＩＩを発現する組換えＣＨＯ細胞株を得ること、および当該ＣＨＯ細胞をインスリンを欠いている血清不含培地中で培養することを含む。

本発明は、ＦＶＩＩまたはその誘導体を発現する哺乳動物細胞を、血清不含、インスリン不含培地中で培養することを包含する。本明細書において使用する場合、「血清不含」は、完全な動物において作製されたかまたは完全な動物から抽出された任意の成分（「動物由来」、例えば、血清から単離および精製されたタンパク質）も、完全な動物において産生された成分を用いて産生された成分（例えば、植物供給源材料を加水分解するために動物から単離および精製された酵素を用いて作製されたアミノ酸）も欠いている培地を意味する。

本明細書において使用する場合、「インスリン不含」または「インスリンを欠いている培地」は、いかなる追跡可能な量のインスリンも含有しない培地に関する。インスリンは、動物由来インスリン（例えば、動物血清から精製された）および非動物由来インスリン（例えば、酵母もしくは微生物細胞中に産生された組換えインスリン、または例えばＣＨＯ、ＢＨＫもしくはＨＥＫ細胞等の樹立された哺乳動物細胞株中に産生されたインスリンなど）の両方を包含する。

本発明の条件下での細胞増殖および維持を支持する任意の細胞培養培地が、培地が動物由来成分不含（すなわち欠いている）かつインスリン不含である限り使用され得る。一般的に、培地は水、容量オスモル濃度調整剤、緩衝剤、エネルギー源、アミノ酸、無機または組換え鉄源、１以上の合成または組換え成長因子、ビタミン、および補因子を含有する。動物由来成分および／またはタンパク質を欠いている培地は、たとえば、Ｓｉｇｍａ、ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＧｉｂｃｏおよびＧｅｍｉｎｉ等の商業的な供給業者から入手可能である。

慣用的な成分に加え、第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩ因子関連ペプチドを産生するために好適な培地は、有利にはビタミンＫを含有してもよい。ビタミンＫは、第ＶＩＩ因子のグルタミン酸残基のカルボキシル化に必要とされる補因子である。一般的に、ビタミンＫは、約０．１〜５０ｍｇ／リットルの間、好ましくは約０．５〜２５ｍｇ／リットルの間、より好ましくは約１〜１０ｍｇ／リットルの間、そして最も好ましくは約５ｍｇ／リットルの濃度で培地中に存在してもよい。

下表（表１）は、本発明における使用に好適な代表的な培地の組成を示す。使用される培地は、血清不含培地（ＢＣＳ）である。ＢＣＳ培地は以下に例示されるＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２に基づく培地である。

任意に、列挙された好適な範囲で１以上の追加の成分を培養培地に添加してもよい。例えば、培地は、任意に０．５〜５０ｇ／Ｌの範囲そして好ましくは２．５ｇ／Ｌの大豆ペプトンを含有してもよい。別の任意の材料は、０．０００５〜０．０５ｇ／Ｌの範囲そして好ましくは０．００３５ｇ／Ｌの範囲で存在するアスコルビン酸である。他の培地において任意の材料は、約０．０００１〜０．００１ｇ／Ｌの範囲そして好ましくは０．００８６ｇ／Ｌの亜セレン酸Ｎａである。

本発明の実施において、培養される細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくは、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ＣＯＳ−Ｉ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）およびＨＥＫ２９３（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３，Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９７７）細胞株を包含するが、これらに限定されない樹立された哺乳動物細胞株である。好ましいＣＨＯ細胞株は、アクセッション番号ＣＣＩ６１のもとにＡＴＣＣから入手可能であるＣＨＯ Ｋｌ細胞株である。具体的な実施形態において、本明細書に記載される産生方法に使用される細胞株は、ＣＨＯ ｒＦＶＩＩａ ＢＩ ＷＣＢ０７００２ アクセッション番号０８１００８０１であり、この細胞株は血清不含条件における増殖に順応させられた組換え第ＶＩＩ因子産生細胞株である。

組換えヒトＦＶＩＩまたは誘導体を発現する任意の好適で安定なＣＨＯ Ｋｌ細胞株を、血清不含、インスリン不含条件下での増殖に順応させ、本発明の実施に使用してもよい。好適には、ｒＦＶＩＩを発現する安定なＣＨＯ Ｋｌ細胞株は、プラスミドベクターｐＬＮ１９４（以前に記載されている（その全体として参照により組み込まれる、ＰｅｒｓｓｏｎおよびＮｉｅｌｓｅｎ，１９９６，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８５，２４１−２４３）組換えヒトＦＶＩＩ（ｒＦＶＩＩ）のｃＤＮＡをコードするプラスミドベクター）；ｐＬＮ３２９（以前にＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＤＫ０１／００６３４（その全体として参照により組み込まれる）において記載されているガンマカルボキシル化認識配列をコードするベクター）；またはそれらの組み合わせを用いたトランスフェクションにより創出され得る。簡潔には、ｐＬＮ１７４ベクターは、挿入されたｃＤＮＡの転写用のマウスメタロチオネインプロモーターの制御下のプロペプチドを含むヒトＦＶＩＩをコードするｃＤＮＡヌクレオチド配列、および選択マーカーとして使用されるＳＶ４０初期プロモーターの制御下のマウスジヒドロ葉酸レダクターゼｃＤＮＡを保有する。そのような好適な細胞株の１つは、本明細書にその全体として組み込まれるＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＤＫ０１／００６３４に開示されるＥ１１を包含するがこれに限定されない。

最も好適な実施形態において、例えば、下記実施例に記載される細胞株などの（これは、ＨＨｕｅ０７ＤＭＣＢ♯１０細胞株由来のクローン１Ｅ９を包含するがこれに限定されない）、組換えヒトＦＶＩＩを発現するＣＨＯ Ｋｌ細胞株を、血清不含、インスリン不含培地中で増殖するように順応させる。この細胞株を、ＣＨＯ ｒＦＶＩＩａ ＢＩ ＷＣＢ０７００２と呼び、これは、ブタペスト条約に従って欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１で寄託されている。

本発明の技術は、血清不含およびインスリン不含条件で増殖するようにＦＶＩＩを発現する組換えＣＨＯ Ｋｌ細胞株を順応させる方法を提供する。特定の実施形態において、そのように順応させられた細胞株はｒＦＶＩＩの産生に使用される。上記ＣＨＯ細胞株は、血清不含培養条件において増殖が可能な組換えヒトＦＶＩＩ発現ＣＨＯ細胞株を、インスリン非存在、かつ動物由来成分非存在下で増殖するＦＶＩＩ産生ＣＨＯ細胞株を得るために、インスリン量を減少させながら連続的に培養することにより、インスリンを欠いている血清不含細胞培養において増殖するように順応させることによって調製される。いくつかの実施形態において、血清不含培養培地中で増殖するＣＨＯ細胞株は１Ｅ９である。ヒトＦＶＩＩ発現ＣＨＯ細胞株を連続的に培養する方法の１つの実施形態は、インスリン濃度を減少させながらヒトＦＶＩＩ発現ＣＨＯ細胞株の連続継代をパルスすることを含む。本明細書に記載される順応方法を用いて調製された代表的なＣＨＯ細胞株を、ブタペスト条約に従って欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２で寄託されたＣＨＯ ｒＦＶＩＩａ ＢＩインスリン不含ＷＣＢ０８００１と呼ぶ。

代表的な方法において、ヒトＦＶＩＩ発現ＣＨＯ細胞株（例えば欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１として寄託された細胞株）を、血清不含培地中で増殖可能なＣＨＯ細胞株をインスリンを含有する標準血清不含培地中で１４日目まで増殖させ、そして１４日目に前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地へ移すことによってインスリン不含条件における増殖に順応させる。当該方法におけるこの工程に続いて、前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間、より具体的には１日間増殖させ、その後、前記細胞を０．２ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地に移してＣＨＯ細胞株の細胞を前記インスリン含有培地中で１〜３日間、好ましくは３日間増殖させる。当該方法は、さらに、インスリン含有培地中での１〜３日間、好ましくは３日間の増殖後、血清不含、インスリン不含培地中へ前記ＣＨＯ細胞株の細胞を移すことをさらに含んでもよい。当該方法は、前記ＣＨＯ細胞株の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１日間増殖させ、その後前記ＣＨＯ細胞株の前記細胞を０．０７０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移し、そして前記ＣＨＯ細胞株の前記細胞を前記インスリン含有培地中で３〜８日間、より具体的には８日間増殖させることをさらに含む。当該方法は、そのうえ、インスリン含有培地中での３〜８日間、より具体的には８日間の増殖後、前記ＣＨＯ細胞株の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中へ移すことを包含することができる。当該方法は、前記ＣＨＯ細胞株の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１日間増殖させ、その後前記ＣＨＯ細胞株の前記細胞を０．０３０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移し、そして前記ＣＨＯ細胞株の前記細胞を前記インスリン含有培地中で３〜９日間、より具体的には９日間増殖させることをさらに包含することができる。また、当該方法は、インスリン含有培地中での３〜９日間、より具体的には９日間の増殖後、前記ＣＨＯ細胞株の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中へ移すことをさらに包含することができる。別の態様において、当該方法は、血清不含、インスリン不含培地中で１日間前記細胞を増殖させること、その後前記細胞を０．０１６ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移すこと、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間、より具体的には９日間増殖させることをさらに含むことができる。当該細胞株は、その後、血清不含、インスリン不含培地中へ移される（ここで、当該細胞は血清不含、インスリン不含培地中での長期増殖（培養日数６６）に順応させられている）。この手法の代表的な使用として、（ブタペスト条約に従って欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２として寄託された）細胞株ＣＨＯ ｒＦＶＩＩａ ＢＩインスリン不含ＷＣＢ０８００１が作出された。

さらに、ＦＶＩＩ産生細胞株を血清不含、インスリン不含条件下で増殖するように順応させるために使用される当該方法は、他の細胞株に対して適用され得る。他の好適な細胞株は、ラットＨｅｐＩ（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６００）、ラットＨｅｐＩＩ（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ ＨＢ ８０６５）、ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９．１）；ＤＵＫＸ細胞（ＣＨＯ細胞株）（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０，１９８０）（ＤＵＫＸ細胞はＤＸＢＩｌ細胞とも呼ばれる）、およびＤＧ４４（ＣＨＯ細胞株）（Ｃｅｌｌ，３３：４０５，１９８３，およびＳｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ １０ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２：５５５，１９８６）を包含するがこれらに限定されない。また、３Ｔ３細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ミエローマおよびミエローマと他の細胞との融合物も有用である。いくつかの実施形態において、細胞は、例えばそれらが由来する細胞型とは定性的または定量的に異なるスペクトルの、タンパク質の翻訳後修飾を触媒する酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよび／またはグリコシダーゼなどのグリコシル化酵素、またはプロペプチド等のプロセッシング酵素）を発現する細胞等の変異体または組換え細胞であってもよい。

他の実施形態において、任意の哺乳動物供給源由来の細胞が組換え遺伝子からヒト第ＶＩＩ因子を発現するように操作される。本明細書において使用する場合、「第ＶＩＩ因子」または「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」は、野生型第ＶＩＩ因子（すなわち、米国特許第４，７８４，９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）、ならびに野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に同一かまたは改善された生物活性を呈する第ＶＩＩ因子の改変体を含む。用語「第ＶＩＩ因子」は、非切断（酵素前駆体）型の第ＶＩＩ因子ポリペプチド、ならびにそれぞれの生物活性型（第ＶＩＩａ因子を意味し得る）を生じるようにタンパク質分解性に処理されたものも含むことが意図される。

一般的に、第ＶＩＩ因子は、残基１５２と残基１５３との間で切断されて第ＶＩＩａ因子を生じる。本発明の方法において、産生された第ＶＩＩ因子は、野生型第ＶＩＩ因子であってよく、または、活性を増加させるか又は減少させるかのいずれかのためにポリペプチドの生物活性を修飾する特定のアミノ酸配列の改変が導入された第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子であってもよい。

血液凝固における第ＶＩＩａ因子の生物活性は、その（ｉ）組織因子（ＴＦ）への結合能力、および（ｉｉ）第ＩＸ因子または第Ｘ因子のタンパク質分解性の切断を触媒して活性化第ＩＸ因子または第Ｘ因子（それぞれ、第ＩＸａ因子または第Ｘａ因子）を産生する能力に由来する。本発明の目的のため、第ＶＩＩａ因子の生物活性を、例えば米国特許第５，９９７，８６４号に記載されるように、第ＶＩＩ因子を欠損した血漿およびトロンボプラスチンを用いた、血液凝固を促進するための調製物の能力を計測することによって定量化してもよい。このアッセイにおいて、生物活性はコントロール試料に対する凝固時間における減少として表わされ、そして１単位／ｍｌの第ＶＩＩ因子活性を含有するプールされたヒト血清標準との比較により「第ＶＩＩ因子単位」に転換される。あるいは、第ＶＩＩａ因子生物活性を、（ｉ）脂質膜中に埋め込まれたＴＦおよび第Ｘ因子を含むシステムにおいて第Ｘａ因子を産生する第ＶＩＩａ因子の能力を計測すること（Ｐｅｒｓｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１９９１９−１９９２４，１９９７）；（ｉｉ）水性システムにおける第Ｘ因子の加水分解を計測すること；（ｉｉｉ）表面プラスモン共鳴に基づく計器を用いたＴＦへのその物理的結合を計測すること（Ｐｅｒｓｓｏｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４１３：３５９−３６３，１９９７）、および（ｉｖ）合成基質の加水分解を計測することにより定量化してもよい。

野生型第ＶＩＩａ因子に対して実質的に同一かまたは改善された生物活性を有する第ＶＩＩ因子改変体は、上記の１以上の凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイにおいて試験された場合、同一細胞型において産生された第ＶＩＩａ因子の特異的活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％を呈するものを含む。野生型第ＶＩＩａ因子に対して実質的に低減された生物活性を有する第ＶＩＩ因子改変体は、上記の１以上の凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイにおいて試験された場合、同一細胞型において産生された野生型第ＶＩＩａ因子の特異的活性の約２５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満、そして最も好ましくは約１％未満を呈するものである。野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に改変された生物活性を有する第ＶＩＩ因子改変体は、ＴＦ非依存性第Ｘ因子タンパク質分解活性を呈する第ＶＩＩ因子改変体、およびＴＦに結合するが第Ｘ因子を切断しないものを包含するがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本発明の実施において使用される細胞は、懸濁培養で増殖することが可能である。本明細書において使用する場合、懸濁適格性（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞は、大きな硬い凝集塊を形成することなく懸濁物中で増殖できるもの（すなわち、単分散であるか、または凝集塊あたり数個の細胞のみが緩い凝集塊で増殖する細胞）である。懸濁適格性細胞は、順応または手技を伴わずに懸濁物中で増殖する細胞（例えば造血細胞またはリンパ細胞等）、および懸濁増殖へと付着依存性細胞（例えば上皮又は線維芽細胞等）が漸進的に順応したことにより懸濁適格性となった細胞を包含するがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態において、本発明の実施において使用される細胞は、接着細胞（足場依存性または付着依存性細胞としても知られる）である。本明細書において使用する場合、接着細胞は、増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ）のために好適な表面にそれら自身を付着または固定する必要があるものである。

（培養方法）
本発明は、哺乳動物細胞のラージスケール培養方法を提供し、以下の工程によって実施される：
（ｉ）培養血清不含およびインスリン不含培養培地を含有する種容器中に細胞を播種し、そして細胞が少なくとも最小の所定の密度に到達するまで種培養物を増殖させること；
（ｉｉ）増殖させられた種培養物を、（マクロ多孔質キャリア法の場合）キャリア上に細胞が移動する条件下で、（ａ）血清不含、インスリン不含培養培地を含有するラージスケール培養容器へ移すこと；ならびに
（ｉｉｉ）ラージスケール培養物を、少なくとも前記細胞が有用な密度に到達するまで血清不含、インスリン不含培地中で増殖させること。

いくつかの実施形態において、当該方法は以下の工程によって実施される：
（ｉ）血清不含およびインスリン不含培養培地を含有する種培養容器中に細胞を播種し、そして細胞が少なくとも最小の所定の密度に到達するまで種培養物を増殖させること；
（ｉｉ）増殖させられた種培養物を、キャリア中に細胞が移動する条件下で、（ａ）血清不含、インスリン不含培養培地、および（ｂ）マクロ多孔質キャリアを含有するラージスケール培養容器へ移すこと；ならびに
（ｉｉｉ）ラージスケール培養物を、少なくとも前記細胞が有用な密度に到達するまで血清不含、インスリン不含培地中で増殖させること。

いくつかの実施形態において、当該方法は以下の工程をさらに含む：
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた培養物を、培養培地の定期的な採取および新鮮な血清不含、インスリン不含培地による置換によって血清不含およびインスリン不含培地中で維持すること。

培地交換は、マイクロキャリアを培養容器の底に沈殿させることによって行われ、その後、所定の割合の培地を取り出し、そして相当する割合の血清不含、インスリン不含培地を培養物に添加する。その後、マイクロキャリアを培地中に再懸濁する。この培地取り出しおよび置換のプロセスを、例えば２４時間毎等の所定の間隔で繰り返すことができる。

いくつかの実施形態において、追加の任意工程は、細胞含有マイクロキャリアの沈降前の１０〜２４０分以内、例えば２０〜１８０分以内、または３０〜１２０分以内等の冷却工程を包含する。当該工程は、一般的に以下のように実行される。すなわち、バイオリアクターを冷却し、温度をモニターする。バイオリアクターが設定温度未満の所定の温度、例えば培養の設定値より１０℃低い温度になったとき、バイオリアクターの内容物の攪拌を停止し、細胞含有キャリアを沈降させる。培地交換が行われた場合、温度は培養の設定値に再度調整される。添加された新鮮培地は一般的に培養の設定値近くの温度に予め温められる。

本発明のいくつかの実施形態において、当該プロセスはマイクロキャリア法であり、細胞は足場依存性細胞である。そのような実施形態において、増殖相および産生相の両方がマイクキャリアの使用を包含する。足場依存性細胞は、増殖相中にキャリア上に（そしてマクロ多孔質キャリアが使用される場合キャリア中に）移動すること、そして産生バイオリアクターへ移された場合、新たなキャリアへ移動することが可能であるべきである。足場依存性細胞がそれら自身によって新たなキャリアへ移動することが十分に可能でない場合、タンパク質分解酵素又はＥＤＴＡを細胞含有マイクロキャリアと接触させることによって細胞をキャリアから解放することができる。使用される培地（具体的には、血清不含およびインスリン不含培地）は、足場依存性細胞の増殖の支持に好適な成分をさらに含有するべきであり、そのような足場依存性細胞用の培地は、例えばＳｉｇｍａ等の商業的な供給業者から容易に入手可能である。

懸濁に順応した細胞または懸濁適格性細胞がマイクロキャリア法において使用される場合、細胞の増殖は懸濁物中で行われてもよく、従ってマイクロキャリアは産生相においてのみ必要である。

（播種および初期増殖）
工程（ｉ）は、工程（ｉｉ）のために十分な数の細胞が得られるまで、種培養容器の大きさの漸進的な増加を伴って繰り返されてもよいと理解される。例えば、５リットル、５０リットル、１００リットル、または５００リットルのうちの１以上の種培養容器を連続して使用してもよい。本明細書において使用する場合、培養容器は、約５リットル〜１０００リットルの容積を有するものである。一般的に、細胞は、約０．２〜０．４×１０^６細胞／ｍｌの初期密度で種培養容器中に播種され、そして当該培養物が約１．０×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度に到達するまで増殖させられる。本明細書において使用する場合、最小密度は約０．８〜約１．５×１０^６細胞／ｍｌである。

（マイクロキャリア）
本明細書において使用する場合、マイクロキャリアは、粒子であり、しばしばセルロースまたはデキストランをもととし、一般的に懸濁培養（細胞に顕著な剪断損傷を与えない攪拌速度を伴う）に使用されることが可能なほど十分小さく；固体で、多孔質であるか、または表面が多孔コーティングされた固体の核を有し；そして正電荷の表面（多孔質キャリアの場合外部および内部表面）を有する。一般的に、マイクロキャリアは、約１５０〜３５０ｕｍの全粒径を有し、そして約０．８〜２．０ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。そのようなマイクロキャリアの例には、Ｃｙｔｏｄｅｘ １ＴＭおよびＣｙｔｏｄｅｘ ２ＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ピスカタウェイ ニュージャージー州）が包含されるが、これらに限定されない。

一連の実施形態において、マイクロキャリアは固体キャリアである。固体キャリアは、足場依存性細胞の増殖に特に好適である。別の一連の実施形態において、マイクロキャリアはマクロ多孔質キャリアである。

マクロ多孔質キャリア：本明細書において使用する場合、マクロ多孔質キャリアは、粒子であり、普通セルロースをもととし、以下の特性を有する：（ａ）それらは懸濁培養（細胞に顕著な剪断損傷を与えない攪拌速度を伴う）に使用されることが可能なほど十分小さく；（ｂ）それらは粒子の内部空間に細胞が移動可能な十分な大きさの孔および内部空間を有し、そして（ｃ）それらの表面（外部および内部）は、正電荷を有する。一連の実施形態において、キャリアは約１５０〜３５０μｍの全粒径を有し；約１５〜４０μｍの平均孔開口径を有する孔を有し；そして約０．８〜２．０ｍｅｑ／ｇの正電荷密度を有する。いくつかの実施形態において、正電荷はＤＥＡＥ（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル）基によって提供される。有用なマクロ多孔質キャリアは、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ １ＴＭおよびＣｙｔｏｐｏｒｅ ２ＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ピスカタウェイ ニュージャージー州）を包含するが、これらに限定されない。特に好ましいものはＣｙｔｏｐｏｒｅ １ＴＭキャリアであり、これは平均粒子径２３０ｕｍ、平均孔サイズ３０μｍ、および正電荷密度１．１ｍｅｑ／ｇを有する。

（ラージスケール培養条件）
本明細書において使用する場合、ラージスケール培養容器は、少なくとも約１００リットル、好ましくは少なくとも約５００リットル、より好ましくは少なくとも約１０００リットル、そして最も好ましくは少なくとも約５０００リットルの容積を有する。一般的に、工程（ｉｉ）は約５０リットルの増殖させられた種培養物（約１．０×１０^６細胞／ｍｌを有する）を１５０リットルの培養培地を含有する５００リットル培養容器中へ移すことを含む。ラージスケール培養物を、適当な条件下（例えば、温度、ｐＨ、溶解酸素圧（ＤＯＴ）、Ｏ_２およびＣＯ_２圧、ならびに攪拌速度）で維持し、そして培養容器に培地を添加することによって容積を徐々に増加する。

マイクロキャリア法の場合、培養容器は、約７５０ｇのマイクロキャリアも含む。移した後、細胞は、一般的に最初の２４時間以内にキャリアの表面上に移動する。マクロ多孔質キャリア法の場合、培養容器は約７５０ｇのマクロ多孔質キャリアも含む。移した後、細胞は、一般的に最初の２４時間以内にキャリアの内部へと移動する。

用語「ラージスケール法」は、用語「産業スケール法」と互換的に用いられ得る。さらに、用語「培養容器」は「タンク」、「リアクター」および「バイオリアクター」と互換的に用いられ得る。

（高レベルタンパク質発現）
高レベルの第ＶＩＩ因子タンパク質を産生するように細胞を増殖させる場合、細胞密度が所定の細胞密度（例えば、少なくとも約１×１０^６細胞／ｍｌ）に到達するまでの期間を「増殖相」と呼ぶ。増殖相は、通常、工程（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む。細胞密度が所定の数値（例えば、少なくとも約１×１０^６細胞／ｍｌ、好ましくは少なくとも２×１０^６細胞／ｍｌ、より好ましくは５×１０^６細胞／ｍｌ）に到達すると、当該相を「産生相」と呼ぶ。産生相は、通常、工程（ｉｖ）を含む。任意の好適な関連するパラメーターの変動は、この段階で導入される。

（培養容器）
培養容器は、例えば、従来型のインペラー型によって攪拌を得る従来型攪拌タンクリアクター（ＣＳＴＲ）、または容器の底から空気を導入することによって攪拌を得るエアリフトリアクターであってよい。パラメーターの中で特定の制限内で制御されるのは、ｐＨ、溶解酸素圧（ＤＯＴ）、および温度である。ｐＨは例えばヘッドスペースガス中のＣＯ_２濃度を変化させること、および必要に応じて培地液体に塩基を添加することによって制御され得る。溶解酸素圧は、例えば空気もしくは純酸素またはこれらの混合物を供給（ｓｐａｒｇｅ）することによって維持され得る。温度制御培地は、必要に応じて水で加熱または冷却される。水を、容器を囲むジャケットに通してもよく、または培養物中に浸漬されたパイピングコイルに通してもよい。

培地がいったん培養容器から取り出されたら、所望のタンパク質を得るため、キャリア中に固定化されなかった細胞を除去するための遠心分離もしくは濾過；アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動法（例えば調製用等電点電気泳動（ＩＥＦ）、溶解度差（例えば硫酸アンモニウム沈殿）または抽出等を包含するがこれらに限定されない１以上の処理工程に供されてもよい（一般にＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２；およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照）。

第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの精製は、例えば抗第ＶＩＩ因子抗体カラム上のアフィニティークロマトグラフィー（例えばＷａｋａｂａｙａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１０９７，１９８６；およびＴｈｉｍら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：７７８５，１９８８を参照）、および、第ＸＩＩａ因子または例えば第ＩＸａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子およびトロンビン等のトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼを用いたタンパク質分解性切断による活性化を含み得る（例えばＯｓｔｅｒｕｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２８５３（１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ，米国特許第４，４５６，５９１号；およびＨｅｄｎｅｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７１：１８３６（１９８３）を参照）。あるいは、第ＶＩＩ因子を、ＭｏｎｏＱ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等のイオン交換クロマトグラフィーカラムを通過させることによって活性化できる。

本発明は、さらに血清不含およびインスリン不含条件下でそのような細胞により発現される工業量の第ＶＩＩ因子ポリペプチドを産生するための哺乳動物細胞のラージスケール培養方法を提供する。当該方法は以下の工程により実行される：
（ｉ）血清不含、インスリン不含培地を含有する培養容器中に細胞を播種し、前記哺乳動物細胞培養物を少なくとも細胞が最小の所定の密度に到達するまで増殖させること；
（ｉｉ）前記増殖させた細胞培養物を血清不含、インスリン不含培養培地を含有するラージスケール培養容器へ移すこと；および
（ｉｉｉ）ラージスケール培養物を血清不含、インスリン不含培地中で少なくとも前記細胞が有用な密度に到達するまで増殖させること。

いくつかの実施形態において、当該方法はさらに以下の工程を含む：
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた培養物を、定期的な培養培地の採取および新鮮な血清不含、インスリン不含培地による置換により血清不含、インスリン不含培地中に維持すること。

プロセスの以下の記載は、血清不含、インスリン不含培地の任意の処方物中の任意の細胞型についても適用可能である。記載される最初の２つのプロセスは、マクロ多孔質キャリアに接着および／または固定化される細胞に関する。

（マイクロキャリア法）
２つのタイプのマイクロキャリア法（標準マイクロキャリア法およびマイクロキャリア灌流法）が使用され得る。標準マイクロキャリア法において、当該プロセスは２つの別個の相（増殖相および産生相）において操作される。

（増殖相）
標準マイクロキャリア法において、細胞は血清不含、インスリン不含培養培地を含有する種培養容器中に播種され、そして細胞が最小密度に到達するまで増殖させられる。その後、増殖した種培養物を、キャリアに細胞が（例えばマクロ多孔質キャリアを使用するプロセスの場合、キャリア中に移動することによって）完全に移入（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）する条件下で、（ａ）血清不含、インスリン不含培養培地、および（ｂ）マイクロキャリアを含有するラージスケール培養容器に移す。

この増殖相において、キャリアに完全に移入するまで、細胞はマイクロキャリア上で増殖させられる。培地交換は、培養容器の底にマイクロキャリアを沈殿させることによって行われ、その後、所定の割合のタンク容積が取り出され、そしてそれに相当する割合のタンク容積の新鮮な血清不含、インスリン不含培地が容器に添加される。マイクロキャリアは、その後、培地中に再懸濁され、そしてこの培地取り出しおよび置換のプロセスは所定の間隔（例えば２４時間毎）で繰り返される。置換される培地の量は、細胞密度に依存し、下表２に示されるように、一般的に１０〜９５％、好ましくは２５〜８０％タンク容積であってもよい。

細胞密度がタンパク質発現に好適な数値に到達すると、タンク中の培地の約６０〜９５％、好ましくは約８０％が２４時間毎に交換される。８０％培地交換はまた、産生相において好ましく使用される。

当該プロセスのこの態様の概要を以下の表２に示す。

ＦＶＩＩの産生に好適ないくつかの設定値は、必ずしも種培養における細胞またはマイクロキャリア上の細胞の初期増殖に好適ではない。例えば、温度、ＤＯＴ、および／またはｐＨは２つの相で異なり得る。

この段階での培地交換は、産生相中と同レベルであっても、細胞を生きた状態に維持しかつ増殖させ続けるために行われる。

（産生相）
増殖相において、培養物は、細胞が１ｍｌあたり１〜１２×１０^６細胞の密度に到達するまで増殖させられる。この密度に到達すると、培養物は産生相に入る。また、設定値をこの時点で変更してもよく、ＦＶＩＩの産生に好適な数値に設定してもよい。培地交換は、マイクロキャリアをタンクの底に沈殿させることよって行われ、その後、選択された％タンク容積が取り出され、そしてそれに相当する％タンク容積の新鮮培地が容器に添加される。２５〜９０％のタンク容積が交換されてもよく、好ましくは８０％のタンク容積が交換される。マイクロキャリアは、その後、培地中に再懸濁され、この培地取り出しおよび置換のプロセスは１０〜４８時間毎、好ましくは２４時間毎に繰り返される。

当該プロセスのこの態様の概要を表３に示す。

任意に、培養の温度設定値における低下を、産生相へ入るときおよび産生相中に用いてもよい。特に、ＣＨＯ細胞株を使用する場合、温度における低下は好ましい。増殖相および産生相における温度範囲および好ましい数値は、それぞれ、表２および３を見ればわかるだろう。約３２℃の温度が産生相中のＣＨＯ細胞株に関して好ましい。

あるいは、各キャリア沈降の直前に冷却工程を任意に適用してもよい。培養物は、培養の温度設定値未満の所定の温度に冷却される（例えば、設定値よりも５℃〜３０℃、または５℃〜２０℃、または５℃〜１５℃、または約１０℃低い）。冷却工程は、細胞含有マイクロキャリアの沈降前、１０〜２４０分以内、例えば２０〜１８０分以内、または３０〜１２０分以内等に行われる。当該工程は、一般的に以下のように実行される。すなわち、バイオリアクターを冷却し、温度をモニターする。バイオリアクターが設定温度未満の所定の温度（例えば培養の設定値より１０℃低い温度）に到達したとき、バイオリアクター内容物の攪拌を停止し、細胞含有キャリアを沈降させる。培地交換が行われると、温度を培養の設定値まで再度調整する。添加された新鮮培地は、一般的に、培養の設定値近くの温度まで予め温められる。

（マイクロキャリア灌流法）
このプロセスは、標準マイクロキャリア法に類似し、やはり２つの別個の相、増殖相および産生相において操作される。これと上述された標準法との間の主な相違は、培養培地の交換のために使用される方法である。前述の標準マイクロキャリア法において、規定された割合のタンク容積（例えば全タンク容積の８０％）が、全て同時に交換される。灌流法においては、培地は継続的に添加され、同容積の採取物もまた継続的に取り出される。本質的に、培地（規定された％タンク容積）が所定の期間（例えば２４時間）に亘って徐々に交換される。

マイクロキャリアは、培地が容器を去ることを可能にするが、マイクロキャリアをタンク内に保持することを可能にする分離装置（または灌流装置）を用いることによって、容器中に維持される。

（増殖相）
漸進的な培地交換以外、標準マイクロキャリア法について記載された通りである。培地の交換は、１日（すなわち２４時間）当たりの％タンク容積として提示される。当該プロセスのこの態様の概要を表４に示す。

やはり、培養物を初期段階で高い培地交換（例えば８０％タンク容積）で灌流するとしても、これは産生相とは見なされない。これは、ＦＶＩＩの産生に好適な設定値のいくつかはマイクロキャリア上の細胞の初期増殖に好適ではない可能性があるからである。この段階での新鮮培地による灌流は、細胞を生きた状態に維持しかつ増殖させ続けるために行われる。「標準マイクロキャリア法」との比較の目的のため、流量は１日（２４時間）あたりのパーセントタンク容積の培地として表わされる。

（産生相）
上述のプロセスのように、増殖相において、培養物は細胞が１ｍｌあたり１〜１２×１０^６細胞の密度に到達するまで増殖させられる。この密度に達すると、培養物は産生相に入る。

培地灌流は継続的に行われる。「標準マイクロキャリア法」との比較の目的のため、培地の流量は所定の期間あたりのパーセントタンク容積の培地として表わされる。培地灌流は１０〜４８時間あたり２５〜９０％タンク容積であり得、好ましくは培地灌流は１０〜４８時間あたり８０％、より好ましくは２４時間毎に８０％タンク容積である。当該プロセスのこの態様の概要を表５に示す。

キャリアの保持を達成するための好ましい手段は、容器内部の沈殿装置（例えばディップチューブ（ｄｉｐ ｔｕｂｅ））である。

産生相に入るときおよび産生相中に温度の降下を用いてもよい。特に、ＣＨＯ細胞株を使用する場合、温度の降下が好ましい。増殖相および産生相における温度範囲および好ましい数値は、それぞれ、表２および３を見ればわかるだろう。温度約３２℃が産生相中のＣＨＯ細胞株に関して好ましい。

（懸濁細胞法）
懸濁細胞法に関する２つの主な選択肢、すなわち１）灌流法；および２）バッチ／ドローフィル法がある。

（灌流法）
このプロセスはマイクロキャリア灌流に関して要約されたプロセスに類似する。主な相違は、１）細胞がキャリア中に固定化されることなく自由に懸濁して増殖させられること、および２）培養容器中に細胞を保持するために使用される灌流装置の特徴である。さらに、当該プロセスは２つの別個の相、すなわち増殖相および産生相において操作される。

（増殖相）
懸濁細胞灌流法においては、細胞を血清不含、インスリン不含培養培地を含有する種培養容器中に播種し、細胞が最小の所定の密度に到達するまで増殖させる。その後、増殖させた種培養物を、血清不含、インスリン不含培養培地を含有するラージスケール培養容器へ移し、そして少なくとも所定の細胞密度に達するまで増殖させる。この相において、細胞は、培養容器内の細胞数が所定の値または臨界値まで増加するように懸濁物中で増殖させられる。培地交換は、新鮮培地で培養容器を連続的に灌流することによって行われる。灌流させられる培地の量は細胞密度に依存し、下記表６に示されるように、一般的に１日（２４時間）あたりタンク容積で１０〜９５％、好ましくは２５％〜８０％であり得る。細胞密度が産生相の開始に好適な数値に達すると、タンク中の６０〜９５％、好ましくは８０％のタンク培地を２４時間毎に交換する。また、８０％の培地交換は、好ましくは産生相においても使用される。

やはり、培養物が初期段階で灌流されるとしても、これは産生相とは見なされない。これは、ＦＶＩＩの産生に好適な設定値のいくつかは、マクロ多孔性キャリア上の細胞の初期増殖に好適ではないからである。細胞を生きた状態に維持しかつ増殖させ続けるために、この段階で新鮮培地での灌流が行われる。

当該プロセスのこの態様の概要を表６に示す。

（産生相）
増殖相において、培養物は、細胞が１ｍｌあたり１〜１２×１０^６細胞の密度に到達するまで増殖させられる。この密度に達すると、培養物は産生相に入る。また、設定値はこの時点において変更されてもよく、ＦＶＩＩの産生に好適な数値に設定され得る。培地灌流は継続して行われる。比較の目的のため、培地の流量は規定された期間あたりの培地のパーセントタンク容積として表わされる（より標準的な単位は１日あたりのリットルである）。培地灌流は、１０〜４８時間あたり１０〜２００％タンク容積であり得、好ましくは、培地灌流は１０〜４８時間あたり８０％、より好ましくは２４時間毎に８０％タンク容積である。

当該プロセスのこの態様の概要は表７に示される。

（灌流装置）
培養容器内での細胞保持は、数々の細胞保持装置を用いて達成され得る。以下の器具一式（外部沈殿ヘッド（ｓｅｔｔｌｉｎｇ ｈｅａｄ）、内部沈殿ヘッド、連続式遠心分離機、内部または外部スピンフィルター、外部フィルターまたは中空糸カートリッジ、超音波細胞分離装置、および培養容器内部の長パイプを包含するがこれらに限定されない）は全て、このプロセスに使用され得る。

任意に、産生相に入るときおよび／または産生相中に温度の降下を用いてもよい。特に、ＣＨＯ細胞株を使用する場合、温度の降下が好ましい。増殖相および産生相における温度範囲および好ましい数値は、それぞれ、表４および５を見ればわかるだろう。約３２℃の温度が産生相中のＣＨＯ細胞株にとって好ましい。

（バッチ／ドローフィル法）
これらは、おそらく操作が最も単純な発酵タイプであり、この方式を使用する懸濁細胞法について３つの主な選択肢が存在する。すなわち、１．単純バッチ法；２．フェドバッチ法；または３．ドローフィル法である。

（単純バッチ法）
単純バッチ法において、細胞を血清不含、インスリン不含培養培地を含有する種培養容器中に播種し、細胞が最小密度に到達するまで増殖させる。その後、増殖させられた種培養物を血清不含、インスリン不含培養培地を含有するラージスケール培養容器へ移す。その後、当該培養容器を培地中の栄養素が使い果たされるまで操作する。当該プロセスのこの態様の概要を表８に示す。

当該プロセスの任意の態様は、低下された操作温度の使用である。そのようなバッチ法は、使用された細胞株の増殖に好適な特定の温度における初期増殖相、続いて、所定の細胞密度（例えば１〜１２×１０^６細胞 ｍｌ）での操作温度の降下からなる。これは、特に、ＣＨＯ細胞株にとって適切である。ＣＨＯ用の好ましいバッチ法は、３７℃での初期増殖相、続いて、１〜１２×１０^６細胞／ｍｌ、好ましくは２〜１０×１０^６細胞／ｍｌでの操作温度の降下からなる。好ましくは、ＣＨＯ細胞の場合、温度の降下は３７〜３２℃である。採取時間を決定しなければならない。従来のバッチは、全ての栄養素が使い果たされるまで操作される。しかしながら、これは一般的に細胞溶解を引き起こし、このことは産物を損傷し得、または精製に対する問題を生じ得る。

（フェドバッチ法）
前述のように、単純バッチ法は細胞を培養容器に播種し、培地中の栄養素が使い果たされるまでタンクを操作することで構成される。このようなバッチ法は、タンクに濃縮された栄養溶液を補給することによって延長され得る。これは、プロセス時間を延長し、最終的に培養容器内でのＦＶＩＩ産生の増加を導く。

培養容器中のグルコース濃度をモニターすることは重要である。補給の制御および開始は、この栄養素のレベルに関連する。グルコース濃度が臨界値未満まで低下すると、補給が開始され、そして添加された補給量はこの臨界値までグルコース濃度を引き戻すために十分である。フェドバッチ態様のプロセスに関する概要を表９に示す。

やはり、特にＣＨＯ細胞株を増殖させる場合、低下した操作温度を使用することは有用となる可能性がある。そのようなフェドバッチ法は、使用される細胞株の増殖に好適な特定の温度での初期増殖相、続いて、所定の細胞密度（例えば１〜１２×１０^６細胞／ｍｌ）での操作温度の降下からなる。ＣＨＯ用の好ましいフェドバッチ法は、３７℃での初期増殖相、続いて、１〜１２×１０^６細胞／ｍｌ、好ましくは２〜１０×１０^６細胞／ｍｌでの操作温度の降下からなる。好ましくは、ＣＨＯ細胞の場合、温度降下は３７〜３２℃である。

単純バッチ法のように、採取の時間は、タンクの最長の可能な操作と細胞溶解のリスクとの間のバランスとして決定されなければならない。

（補給組成物および追加のストラテジー）
使用に好適な最も単純な補給物は、グルコースの濃縮溶液である。しかしながら、グルコースの補給物単独では短時間バッチ相を延長するのみである。これは、アミノ酸または脂質またはビタミン等の別の栄養素が、その後使い果たされるからである。この理由で、濃縮補給物が好ましいであろう。使用に好適な最も単純な濃縮補給物は、×１０〜５０濃度の細胞培地である。

この態様の概要を表１０に示す。

残念ながら、いくつかの培地成分は細胞に有害である可能性があり、または単に高濃度で溶解しない。この理由のため、補給物はこれらの問題の成分を低レベルに保つために改良が必要であるかもしれない。また、補給物の添加方法は変化可能である。補給物は、単一パルス（１日に１回、２回、３回等）として添加されてもよく、２４時間の期間を通して徐々に補給されてもよい。高度な補給の選択肢は、容器中において一定のグルコース濃度を維持するために補給速度を制御する培養容器内のグルコースセンサーグルコースセンサーのある形態を有する。採取の時間を決定しなければならない。従来の、または単純なバッチは、全ての栄養素が使い果たされるまで操作される。これは概してフェドバッチシステムにおいて問題ではない。しかしながら、有毒な代謝産物の蓄積により、当該プロセスを無期限に持続することができない。これは、細胞の生存率を低下させ、最終的に細胞溶解を導く。これは、産物の損傷またはその後の精製に対する問題を引き起こし得る。

（ドローフィル法）
二つの型のドローフィルがここに記載される。これらは単純ドローフィルおよびフェドバッチドローフィルである。

（単純ドローフィル）
このプロセスは、反復バッチ発酵に密接に類似する。バッチ発酵においては、細胞を培養容器中で増殖させ、その操作（ｒｕｎ）の終わりに培地が採取される。ドローフィル法においては、培養容器は任意の栄養素が使い果たされる前に採取される。容器から全ての内容物を取り出す代わりに、タンク容積の一部のみが取り出される（一般的にタンク容積の８０％）。採取後、同容積の新鮮培地が容器に戻される。その後、細胞をもう一度容器中で増殖させ、そして別の８０％の採取が設定された日数後に行われる。反復（ｅｐｅａｔｅｄ）バッチ法において、採取後に容器中に残された細胞を、次のバッチの種菌に使用してもよい。

ドローフィル法の概要を表１１に示す。このプロセスは二つの相において操作される。プロセスの第一相は、単純バッチ法と同一に操作される。最初の採取の後、培養容器は単純バッチ法として再度操作されるが、高い初期細胞密度のためバッチの長さは最初のバッチよりも短い。これらの短い「反復バッチ相」が無期限に継続される。

用いられるドローフィルの単純な概要は以下の通りである。

（初期バッチ相）
ｉ．容器に播種し増殖に好適な温度で細胞を増殖させる。
ｉｉ．所定の細胞密度で発現に好適な温度まで温度を降下させる。
ｉｉｉ．播種から７日後に所定の、例えば８０％のタンク容積を取り出し、同容積の新鮮培地で置換する。

（反復バッチ相）
ｉｖ．増殖に好適な温度まで温度を上昇させ、細胞を増殖させる。
ｖ．所定の細胞密度で発現に好適な温度まで温度を降下させる。
ｖｉ．この相を始めて５日後に所定の、例えば８０％のタンク容積を取り出し、同容積の新鮮培地で置換する。
ｖｉｉ．工程ｉｖ．に行く。

好ましい実施形態において、細胞株はＣＨＯ細胞株である。発明者らがＣＨＯ細胞株について用い得るドローフィルの単純な概要は以下の通りである。

（初期バッチ相）
ｖｉｉｉ．容器に播種し、３７℃で細胞を増殖させる。
ｖｉｘ．２〜１０×１０^６細胞／ｍｌで温度を３２℃に降下させる。
ｖｘ．播種から７日後にタンク容積の８０％を取り出し、同容積の新鮮血清不含、インスリン不含培地で置換する。

（反復バッチ相）
ｘｉ．温度を３７℃まで上昇させ、細胞を増殖させる。
ｘｉｉ．２〜１０×１０^６細胞／ｍｌで温度を３２℃に降下させる。
ｘｉｉ．この相を始めてから５日後にタンク容積の８０％を取り出し、同容積の新鮮血清不含、インスリン不含培地で置換する。
ｘｉｉｉ．工程ｘｉ．に行く。

培養容器は、広範囲のサイクル時間、および広範囲のドローフィル容積において操作され得る。範囲および好ましい数値は、表１１を見ればわかるだろう。

（フェドバッチドローフィル）
このプロセスは、フェドバッチ法において提案されるタイプに類似する濃縮補給物を伴うドローフィル発酵である。単純ドローフィル法での懸念は、添加される新鮮培地が、反復するバッチ発酵にわたって細胞を保持するのに十分でない可能性があることである。補給物を包含することは、この懸念を解消する。補給物はまた、ドローフィル法において長期のバッチ時間の間、培養容器を操作することを可能にする。

補給物の組成および添加のストラテジーは、フェドバッチ法と同一である。これについてのプロセス概要を表１２に示す。

（実施例）
（実施例１：血清不含、インスリン不含条件における第ＶＩＩ因子を発現するＣＨＯ Ｋｌ細胞株の単離）
細胞増殖のためにヒト組換えインスリン（ｒＩｎｓｕｌｉｎ）依存性であったチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株１Ｅ９を以下のように連続的に培養し、インスリン不含、血清不含条件においてＦＶＩＩの産生が可能な細胞株を作出した。ヒト組換えインスリン増殖依存性細胞株は、欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１で寄託されたＣＨＯ ｒＦＶＩＩａ ＢＩ ＷＣＢ０７００２であった。使用した培地は、ビタミンＫ１（２．５ｍｇ／ｍｌ）［Ｍｅｒｃｋ］および連続希釈された量のｒＩｎｓｕｌｉｎ［インスリン組換え型、ＮＯＶＯＬＩＮ、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ］が補充されたＢＣＳ培地であった。

「インスリン不含」培地は、２．５ｍｇ／ｍｌビタミンＫ１を含有する血清不含ＢＣＳ培地であった。連続希釈については、連続的に希釈されたｒＩｎｓｕｌｉｎを含有するＢＣＳ培地（１．２５ｍｇ／ｌ、０．６２５ｍｇ／ｌ、０．２０８ｍｇ／ｌ、０．０６９ｍｇ／ｌ、０．２５０ｍｇ／ｌ、０．０６３ｍｇ／ｌ、０．０３１ｍｇ／ｌおよび０．０１５ｍｇ／ｌを含む）を表１３に記載されるように作製した。

１Ｅ９−ＣＨＯｒＦＶＩＩａ細胞（ｒＩｎｓｕｌｉｎヒト５ｍｇ／ｌ−ＤＭＣＢ♯１０（ＨＨｕｅ０７０８２））の血清不含、インスリン不含条件への効果的な順応のためのプロトコルは、表１４に記載される細胞の連続継代によって行われた。連続継代は、培地中のインスリン濃度の制御された「勾配減少（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」を、血清不含条件が達成されるまで行うことによって、行われた。インスリン不含培地中での細胞の１日間の培養の間に徐々に減少するインスリンを含有する培地を用いて細胞を「パルス」した。細胞増殖および生存能のモニターを並行して行った。図１は、細胞のインスリン依存性の減少を図示する。

図２は、血清不含条件に順応させるための細胞のパルス中のインスリンレベルを示すグラフを図示する。

驚くべきことに、含有するインスリン量が徐々に減少するインスリン含有血清不含培地を用いたこのパルス方法は、血清不含、インスリン不含条件下で増殖する細胞株の産生を生じる一方、インスリンの連続希釈を伴う培地中での標準継代は生存能力のある細胞株を産生しない。図３に示されるように、ｒＩｎｓｕｌｉｎの標準連続希釈の技術で継代された細胞は、３継代を超えて生存しなかった（１７日目、０．１５６ｍｇ／ｌインスリン）。

（実施例２：代表的な産生条件）
ｒＦＶＩＩは、懸濁培養において発酵プロセスで組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞クローンにより作りだされる。増殖培地は、ヒトまたは動物由来の物質を含有せず、インスリンを含有しない、化学的に定義された培地である。上記のように産生された細胞株は、商業的に入手可能な組織培養フラスコおよびガラスボトル（攪拌培養）中で、３７℃の温度で培養される。培養物のｐＨは、ＣＯ_２（７．５％）の導入および液体培地に由来するＮａＨＣＯ_３により維持される。

血清不含培地（ＢＣＳ）を、細胞の培養に使用する。ＢＣＳ培地は、次の添加物ｉ）グルタミン；最終濃度０．９ｇ／ｌ、ｉｉ）硫酸第二鉄×７Ｈ２Ｏ ０．０００６ｇ／ｌ、ｉｖ）プトレシン、×２ＨＣｌ ０．００３６ｇ／ｌ、ｖｉ）ビタミンＫ１ ０．００２５ｇ／ｌおよびｖｉｉ）シンペロニック；最終濃度１ｇ／ｌ、フェノールレッド ０．００８ｇ／ｌ、エタノールアミン ０．００１５３ｇ／ｌ、炭酸水素Ｎａ ２ｇ／ｌが補充されたＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２に基づく処方物である。比較目的のため、血清不含、インスリン含有培地中で増殖させられた細胞株を、インスリン０．００５ｍｇ／ｌが補充された同一の培地中で増殖させる。ここで留意すべきは、この培地はビタミンＫ１またはＫ３を使用できることである。

発酵に使用されるプロセスパラメーターの設定値は、下表１５に要約される。

より具体的には、ラージスケール培養における細胞の細胞濃度は、１〜３×１０^６／ｍｌであり、培養物は、希釈率０．２５〜１．５で、ｐＨ７．１＋−０．３、ｐＯ２ １０〜５０％に維持される。

組換え第ＶＩＩａ因子のラージスケール産生のため、１００リットルのバイオリアクターシステムを、前臨床材料の開発用に使用する。堅調かつ安定なプロセスが、インスリン存在下で増殖する細胞株（１Ｅ９；欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１で寄託された）を用いたラージスケール産生レベルで確認されている。前臨床産生キャンペーンのデータの要約が以下に提示される：細胞の具体的な増殖率は、１日当たりおよそ０．５０である。細胞密度の設定値は、１ｍｌあたり２×１０^６細胞程度である。第ＶＩＩ因子抗体力価は、１０μｇ／程度である。ＦＶＩＩ活性（色素形成アッセイ）は２０Ｕ／ｍｌ程度である。抗原に基づくＦＶＩＩ生産性は、３〜４ｍｇ／Ｌ／日であり、活性に基づく生産性は７０００〜１００００Ｕ／Ｌ／日である。産生ロットを通して、安定性は４０日の期間に亘って一貫していた。本発明者らは、インスリン不含条件において産生された細胞株（欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２で寄託された細胞株）が、本来の１Ｅ９（インスリンと共に培養された）産生細胞バンクと同一の特徴を示すことを示している。具体的な増殖率、ｒＦＶＩＩ発現および細胞の安定性の観点で、何らの相違も観察されなかった。

血清不含、インスリン不含培地中での好ましい細胞培養方法は、ケモスタット法である。この方法は、当業者に周知であり、例えばＷｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９２，２２ ｐｐ５１−６８に記載されている。例えば、攪拌バイオリアクターまたはエアリフトリアクターを使用してもよい。

Ｏ２濃度、灌流速度、または培地交換、ｐＨ、温度および培養技術等の細胞培養のパラメーターは、使用される個々の細胞タイプに依存し、それらは当業者によって決定され得る。例えば、具体的な例において、好ましい方法における条件は、ラージスケール培養における細胞の細胞密度が１〜３×１０^６／ｍｌであり、培養物は、希釈率０．２５〜１．５で、ｐＨ７．１＋−０．３、ｐＯ２ １０〜５０％に維持されるようなものである。

本明細書中の全ての参考文献は、その全体において参照によって本明細書に組み込まれる。

本技術は、それが属する技術分野の当業者がこれを実施できるように、完全、明確かつ簡潔な用語で現に記載される。上記は本技術の好ましい実施形態を記載し、添付の特許請求の範囲に記載の本技術の精神または範囲から逸脱することなく改良が行われ得ることが理解される。さらに、実施例は、網羅的ではないが、特許請求の範囲内にあるいくつかの実施形態の例証として提供される。

Claims (46)

1. 組換えヒト第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の産生方法であって、
   ａ）組換えヒトＦＶＩＩを発現する哺乳動物細胞株を得る工程；および
   ｂ）前記哺乳動物細胞をインスリンを欠いている血清不含培地中で培養する工程
   を含み、
   前記細胞が、血清不含培養で増殖するように改変された組換えヒトＦＶＩＩを発現する細胞株を、インスリン非存在下で増殖するＦＶＩＩ産生細胞株を得るため、前記細胞株をインスリン量を減少させながら連続的に培養することにより、インスリン非存在下における細胞培養で増殖するように順応させる工程によって調製され、
   前記連続的な培養が、インスリンを濃度を減少させながら細胞の連続継代にパルスする工程を含む、上記方法。
2. 前記哺乳動物細胞株がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＢＨＫ細胞株またはＨＥＫ２９３細胞株である、請求項１に記載の方法。
3. 前記哺乳動物細胞株がＣＨＯ細胞株である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記細胞における前記ＦＶＩＩの産生が、インスリン存在下におけるＦＶＩＩの産生に匹敵する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 血清不含培養における増殖用に改変された組換えヒトＦＶＩＩを発現する前記細胞株が、欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１において寄託されたＣＨＯ １Ｅ９細胞株である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
6. インスリン非存在下で増殖する前記ＦＶＩＩ産生細胞株が、欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２において寄託されたＣＨＯ １Ｅ９細胞株である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
7. 細胞培養培地がビタミンＫ１を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
8. 細胞株を１４日目までインスリンを含有する標準的な血清不含培地中で増殖させる工程、そして１４日目に血清不含、インスリン不含培地へ前記細胞株を移す工程を含む、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
9. 前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、その後、０．２ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地へ前記細胞を移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で１〜３日間増殖させる工程を含む、請求項８に記載の方法。
10. インスリン含有培地中での１〜３日間の増殖の後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０７０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜８日間増殖させる工程を含む、請求項１０に記載の方法。
12. インスリン含有培地中で３〜８日間増殖させた後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０３０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程を含む、請求項１２に記載の方法。
14. インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させた後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０１６ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 血清不含培地中で増殖するＦＶＩＩ産生細胞株を血清不含、インスリン不含培地中で増殖する細胞株へと順応させる方法であって、インスリンを濃度を減少させながら哺乳動物細胞の連続継代にパルスする工程を含み、ここで、前記パルスする工程は、ａ）前記細胞株をインスリン含有培地中で１〜９日間増殖させ、続いて、ｂ）インスリン不含、血清不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、ならびに工程ａ）および工程ｂ）を繰り返す工程を含み、ここで、各連続工程ａ）における培地は、検出可能なインスリンを含有しなくなるまで、前の工程ａ）のおよそ半分の濃度のインスリンを含有するものである、方法。
17. 前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞株である、請求項１６または１７に記載の方法。
19. ａ）哺乳動物細胞株を、インスリンを含有する標準血清不含培地中で１４日目まで増殖させる工程、そして１４日目に前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地へ移す工程、
    ｂ）工程ｂ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．２ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で１〜３日間増殖させる工程、
    ｃ）工程ｂ）のインスリン含有培地中での１〜３日間の増殖の後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程、
    ｄ）工程ｃ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０７０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜８日間増殖させる工程、
    ｅ）工程ｄ）のインスリン含有培地中での３〜８日間の増殖の後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程、
    ｆ）工程ｅ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０３０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程、
    ｇ）工程ｆ）のインスリン含有培地中での３〜９日間の増殖の後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程、
    ｈ）工程ｇ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０１６ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程、および
    ｉ）工程ｈ）のインスリン含有培地中での３〜９日間の増殖の後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程であって、ここで、工程ｉ）の細胞は、血清不含、インスリン不含培地中での長期増殖に順応させられている、工程
    を含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法に従って産生される細胞。
21. ヒトＦＶＩＩを発現し、かつ、動物由来成分を欠いているインスリン不含培地中での増殖に順応させられている哺乳動物組換え細胞であって、血清不含培地中で増殖するＦＶＩＩ産生細胞株を血清不含、インスリン不含培地中で増殖する細胞株へと順応させる工程によって産生されるものであり、前記工程は、インスリンを濃度を減少させながら哺乳動物細胞の連続継代にパルスする工程を含み、ここで、前記パルスする工程は、ａ）前記細胞株をインスリン含有培地中で１〜９日間増殖させる工程に続き、ｂ）インスリン不含、血清不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、ならびに工程ａ）および工程ｂ）を繰り返す工程を含み、ここで、各連続工程ａ）における培地は、検出可能なインスリンを含有しなくなるまで、前の工程ａ）のおよそ半分の濃度のインスリンを含有するものである、上記細胞。
22. 前記細胞がＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項２１に記載の組換え細胞。
23. 前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２１または２２に記載の組換え細胞。
24. 欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２において寄託された、ヒトＦＶＩＩを発現する組換えＣＨＯ細胞。
25. 哺乳動物細胞におけるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドのラージスケール産生方法であって、
    （ａ）請求項２０に記載の細胞を血清不含、インスリン不含培地を含有する培養容器中に播種する工程、さらに前記哺乳動物細胞の培養物を少なくとも前記細胞が所定の密度に到達するまで増殖させる工程、
    （ｂ）前記増殖させた種培養物を血清不含、インスリン不含培地を含有するラージスケール培養容器へ移す工程、
    （ｃ）血清不含、インスリン不含培地中の前記ラージスケール培養物を、少なくとも前記細胞が所定の密度に到達するまで増殖させる工程、
    （ｄ）血清不含、インスリン不含培地中の工程（ｃ）で得られた培養物を、ＦＶＩＩ発現またはＦＶＩＩ関連ポリペプチド発現に適当な条件下で維持する工程、および
    （ｅ）前記ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドを前記維持された培養物から取り出す工程
    を含む、方法。
26. 工程（ｂ）の前に、漸進的にサイズが大きくなる種培養容器を用いて工程ａ）を繰り返す工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
27. 血清不含、インスリン不含培地中の工程（ｃ）で得られた培養物を、定期的な、前記培養培地の採取および新鮮培地による置換によって、保持する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
28. 前記方法がマイクロキャリア法である、請求項２５に記載の方法。
29. 前記方法がマクロ多孔質キャリア法、標準マイクロキャリア法またはマイクロキャリア灌流法である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記方法が懸濁法である、請求項２５に記載の方法。
31. 前記方法が灌流法である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記方法がバッチ／ドローフィル法である、請求項３０に記載の方法。
33. 前記方法が単純バッチ法、フェドバッチ法またはドローフィル法である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記方法がケモスタット培養法である、請求項２５に記載の方法。
35. 前記細胞が、前記播種工程の前に、インスリンを欠いている血清不含培地中での増殖に順応させられている、請求項２５に記載の方法。
36. 前記細胞は、前記播種工程の前に、懸濁培養における増殖が可能である、請求項２５に記載の方法。
37. 前記所望のＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドがヒトＦＶＩＩまたはヒトＦＶＩＩ関連ポリペプチドである、請求項２５に記載の方法。
38. ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも１ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生され、又はＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも２．５ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、請求項２５に記載の方法。
39. ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも５ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、請求項３８に記載の方法。
40. ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも８ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、請求項３９に記載の方法。
41. ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、３〜４ｍｇ／ｌ／日のレベルで産生される、請求項３９に記載の方法。
42. 産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチド単位が、少なくとも５０００Ｕ／ｌ／日であり、又は産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチド単位が、少なくとも７０００Ｕ／ｌ／日であり、又は産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドの活性単位が、７０００〜１０，０００Ｕ／ｌ／日である、請求項３９に記載の方法。
43. 工程（ｃ）で得られた培養物を、細胞含有キャリアの沈降の後、培養物上清の一部を定期的に採取し、新鮮な培地で置換する工程によって動物産生物不含、インスリン不含培地中で維持する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
44. キャリアの前記沈降前に、前記培養の設定値より低い所定の温度まで前記培養物を冷却する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
45. 前記培養物を、キャリアの前記沈降前に、前記培養の温度設定値より５℃〜３０℃低い温度まで冷却する、又は前記培養物を、前記培養の温度設定値より５℃〜２０℃低い温度まで冷却する、又は前記培養物を、前記培養の温度設定値より５℃〜１５℃低い温度まで冷却する、又は前記培養物を、前記培養の温度設定値より１０℃低い温度まで冷却する、請求項４４に記載の方法。
46. 前記培地が、次の添加物、ｉ）グルタミン；最終濃度０．９ｇ／ｌ、ｉｉ）硫酸第二鉄×７Ｈ２Ｏ ０．０００６ｇ／ｌ、ｉｖ）プトレシン、×２ＨＣｌ ０．００３６ｇ／ｌ、ｖｉ）ビタミンＫ１ ０．００２５ｇ／ｌ、ｖｉｉ）シンペロニック；最終濃度１ｇ／ｌ、フェノールレッド ０．００８ｇ／ｌ、エタノールアミン ０．００１５３ｇ／ｌ、および炭酸水素Ｎａ ２ｇ／ｌのうちの１以上が補充された血清不含ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２に基づく処方物である、請求項１、請求項２、請求項３、請求項１６、請求項１７、請求項１８または請求項２５に記載の方法。

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