MXPA05011486A

MXPA05011486A - Inductores de expresion de proteina recombinante.

Info

Publication number: MXPA05011486A
Application number: MXPA05011486A
Authority: MX
Inventors: Jeffrey N Fitzner
Original assignee: Immunex Corp
Priority date: 2003-04-25
Filing date: 2004-04-23
Publication date: 2006-04-18
Also published as: WO2004096833A3; AU2004234377A1; JP2007525176A; WO2004096833A2; CA2522779A1; EP1620457A2; US20040265964A1

Abstract

La invencion proporciona metodos para incrementar la produccion de polipeptidos, opcionalmente polipeptidos recombinantes, de celulas de mamifero utilizando un acido carboxilico aromatico, una acetamida y/o un compuesto de acido hidroxamico, y cultivos conteniendo los mismos.

Description

INDUCTORES DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNA RECOM BINANTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se encuentra en el campo de producción de polipéptidos, particularmente producción de polipéptidos recombinantes en cultivo celular.

ANTECEDENTES Los polipéptidos son útiles en una variedad de aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas, agrícolas, nutricionales y de investigación. Aunque los polipéptidos pueden aislarse de fuentes naturales, el aislamiento de grandes cantidades de un polipéptido específico de fuentes naturales puede ser costoso. También, el polipéptido puede no ser de calidad uniforme debido a la variación en el material de fuente. La tecnología de ADN recombinante permite producción a gran escala efectiva en costo y más uniforme de polipéptidos específicos. Un objetivo de la producción de polipéptidos recombinantes es la optimización de las condiciones de cultivo para obtener la mayor productividad posible. Los incrementos crecientes en productividad pueden ser económicamente significativos. Algunos de los métodos para incrementar la productividad en cultivo celular incluyen utilizar medio enriquecido, monitorear osmolaridad durante la producción, reducir las temperaturas durante las fases específicas de un cultivo celular, y/o la adición de butirato de sodio (ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 5,705,364). Sin embargo, a medida que los medicamentos a base de polipéptidos demuestran efectividad clínica y se necesitan cantidades comerciales incrementadas, las instalaciones de cultivo disponibles se limitan. De acuerdo con lo anterior, permanece una necesidad en la materia de mejorar continuamente las producciones de polipéptidos recombinantes de cada corrida de cultivo celular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Como se muestra por los datos experimentales reportados en la presente, los ácidos carboxílicos aromáticos, acetamidas y/o ácidos hidroxámicos son compuestos que pueden inducir dramáticamente la producción de polipéptidos, especialmente polipéptidos recombinantes, de estirpes de célula de mamífero. Además, estos compuestos pueden utilizarse en combinación , entre sí y/o con otros métodos de inducción, para incrementar además la expresión de polipéptido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA La figura 1 es una gráfica del Efecto de Combinaciones de Compuestos de Inducción del Gen Reportador. Los grupos de células que expresan una proteína marcadora fluorescente, DsRed, bajo el control de un promotor EASE/CMV se cultivan en placas de 96 cavidades a 35°C por 6 días en la presencia de la cantidad de compuesto indicada. La cantidad de fluorescencia se diagrama como una función de la concentración de compuesto. Los compuestos utilizados para inducción son ácido hexanohidroxámico (HHA) (diamantes), Hexametilenobisacetamida (HMBA) (cuadrados) y ambos HHA+HMBA (triángulos).

DESCRIPCIÓ DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un "anticuerpo" es un polipéptido o complejo de polipéptidos, cada uno de los cuales comprende al menos un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable y al menos un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de cadena única, anticuerpos diméricos, o algún complejo de orden más alto de polipéptidos incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos heterodiméricos. Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo codificado por ácidos nucleicos que son por último humanos en origen. Tal anticuerpo puede expresarse en una célula no humana u organismo. Por ejemplo, ADN que codifica un anticuerpo humano puede introducirse en células de cultivo celular y expresarse en estirpes de célula transformadas. Alternativamente, los anticuerpos humanos pueden expresarse en animales transgénicos tales como, por ejemplo, los ratones transgénicos descritos en Méndez et al., ((1997), Nature Genetics 16(4): 146-56). Tales ratones transgénicos se utilizan para hacer los anticuerpos completamente humanos en la Patente de EE.UU. No. 6,235,883 B1 . Los anticuerpos humanos también pueden expresarse en células hibridomas. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo quimérico que comprende regiones de determinación complementarias (CDR1 , CDR2 y CDR3) de una fuente no humana y otras regiones que se conforman con las secuencias en anticuerpos humanos (y puede ser de origen humano) como se explica en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nos. 5,558,864 y 5,693,761 y Solicitud de Patente Internacional WO 92/1 1018. Un "dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante" es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico a o substancialmente similar a un CL, CH1 , CH2, CH3 o CH4, dominio de origen animal o humano. Ver, por ejemplo, Hasemann and Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, en William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, Segunda Edición, 209, 210-218 (1989); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. of Health and Human Services (1991 ). Una "porción Fc de un anticuerpo" incluye dominios de inmunoglobulinas humanos o animales CH2 y CH3 o dominios de inmunoglobulinas substancialmente similares a estos. Para discusión, ver Hasemann and Capra, supra, en 212-213 y Kabat ef al., supra. Las células se han "realizado genéticamente" para expresar un polipéptido específico cuando las secuencias de ácidos nucleicos recombinantes que permiten la expresión del polipéptido se han introducido en las células utilizando métodos de "ingeniería genética", tal como infección viral con un virus recombinante, transfección, transformación, o electroporación. Ver, por ejemplo, Kaufman et al., (1990), Meth. Enzymol. 185:487-51 1 ; Current Protocols in Molecular Bioloqy. Ausubel ef al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, y actualizaciones trimestrales). La infección con un virus que ocurre de manera natural, sin alterar, tal como, por ejemplo, virus de hepatitis B, virus de inmunodeficiencia de humano, adenovirus, etc., no constituye ingeniería genética como se propone en la presente. El término "ingeniería genética" se refiere a un método de ARN o ADN recombinante utilizado para crear una célula huésped que expresa un gen a niveles elevados o a niveles inferiores, o expresa un muíante del gen. En otras palabras, la célula se ha transfectado, transformado o transducido con una molécula de polinucleótido recombinante, y alterado así para causar que la célula altere la expresión de un polipéptido deseado. Para los propósitos de la invención, los anticuerpos producidos por una estirpe de célula hibridoma resultante de una fusión celular no son "polipéptidos recombinantes". Además, los polipéptidos virales producidos por una célula como un resultado de infección viral también no son "polipéptidos recombinantes" como se entiende en la presente al menos que el ácido nucleico viral se haya alterado por ingeniería genética antes de infectar la célula. Los métodos de "ingeniería genética" también comprenden numerosos métodos incluyendo, pero sin limitarse a, amplificar ácidos nucleicos utilizando reacción en cadena de polimerasa, ensamble de moléculas de ADN recombinante al clonarlos en Escherichia coli, restricción de digestión de enzima de ácidos nucleicos, ligación de ácidos nucleicos, y transferencia de bases a los extremos de ácidos nucleicos, entre otros numerosos métodos que se conocen bien en la materia. Ver, por ejemplo, Sambrook eí al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. Los métodos y vectores para realizar genéticamente células y/o estirpes de célula para expresar un polipéptido de interés se conocen bien por aquellos expertos en la materia. Las técnicas de ingeniería genética incluyen pero no se limitan a vectores de expresión, recombinación homologa objetivo y activación genética (ver, por ejemplo, Patente de EE. UU. No. 5,272,071 para Chappel) y trans activación por factores de transcripción realizados (ver, por ejemplo, Segal et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96(6):2758-63). Opcionalmente, los polipéptidos se expresan bajo el control de un elemento de control heterólogo tal como, por ejemplo, un promotor que no realiza en naturaleza directa, la producción de ese polipéptido. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor viral fuerte (por ejemplo, CMV, SV40) que dirige la expresión de un polipéptido mamífero. La célula huésped puede o no producir normalmente el polipéptido. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula CHO que se ha realizado genéticamente para producir un polipéptido humano, significando que el ácido nucleico que codifica el polipéptido humano se ha introducido en la célula CHO. Alternativamente, la célula huésped puede ser una célula humana que se ha realizado genéticamente para producir niveles incrementados de un polipéptido humano normalmente presente solamente a niveles muy bajos (por ejemplo, al reemplazar el promotor endógeno con un promotor viral fuerte).

"Fase de crecimiento" significa un periodo durante el cual las células cultivadas se dividen e incrementan rápidamente en número. Durante la fase de crecimiento, las células se cultivan generalmente en un medio y bajo condiciones diseñadas para maximizar la proliferación celular. Un "compuesto polar híbrido" es un compuesto teniendo dos grupos polares separados por una cadena de carbono apolar. Esto incluye bisacetamida de hexametileno (HMBA) y las otras moléculas tratadas en la solicitud copendiente no. 10/400,334 y las siguientes referencias: Richon et al. (1998), Proc. Nati. Acad. Sci. 95: 3003-07; Marks et al. (1994), Proc. Nati. Acad. Sci. 91 : 10251-54; y las Patentes de EE.UU. Nos. 5,055, 608 y 6,087,367. La producción de un polipéptido se "incrementa'' por la adición de un agente inductor, tal como ácido carboxílico aromático, acetamida, y compuestos de ácido hidroxámico, si la cantidad de polipéptido producido en un cultivo conteniendo el agente inductor es más que la cantidad del polipéptido producido en un cultivo de otra manera idéntico que no contiene el agente inductor. De manera similar, la producción de un polipéptido se "incrementa" por crecimiento a una temperatura diferente a 37°C si la cantidad de polipéptido producida en un cultivo incubado a una temperatura diferente a 37°C es más que la cantidad del polipéptido producido en un cultivo de otra manera idéntico incubado a 37°C. Típicamente, la(s) célula(s) expuesta(s) al compuesto o agente inductor se mantendrán en cultivo por al menos aproximadamente 2 horas, y más típicamente aproximadamente 5 a 10 días, y algunas veces más tiempo, antes de que las células y el medio se recolecten y la producción del polipéptido se valore. Un "dominio de multimerización" es un dominio dentro de una molécula de polipéptido que le confiere una propensión a asociarse con otras moléculas de polipéptido a través de interacciones covalentes o no covalentes. Un "polipéptido que ocurre de manera natural" es un polipéptido que ocurre en la naturaleza, es decir, un polipéptido que puede producirse por las células que no se han realizado genéticamente. Tal polipéptido puede también producirse por células genéticamente formadas para producirlo. "Polipéptido" significa una cadena de al menos 6 aminoácidos enlazados por enlaces de péptido. Opcionalmente, un polipéptido puede comprender al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, o 300 aminoácidos enlazados por enlaces de péptido. "Medio de producción" significa un medio de cultivo celular diseñado para utilizarse para cultivar células durante una fase de producción. "Fase de producción" significa un periodo durante el cual las células se producen cantidades máximas de polipéptido recombinante. Una fase de producción se caracteriza por menos división celular que durante una fase de crecimiento y por el uso de condiciones de cultivo y medio diseñadas para maximizar producción de polipéptido. Un "polipéptido de fusión recombinante" es una fusión de todos o parte de al menos dos polipéptidos, que se hace utilizando los métodos de ingeniería genética. Un "polipéptido recombinante" es un polipéptido resultante del proceso de ingeniería genética. Para los propósitos de la invención, los anticuerpos producidos por una estirpe de célula hibridoma resultantes de una fusión celular no son "polipéptidos recombinantes". Además, las proteínas virales producidas por una célula como un resultado de infección viral con un virus que ocurre de manera natural también no son "polipéptidos recombinantes" como se entiende en la presente al menos que el ácido nucleico viral se haya alterado por ingeniería genética antes de infectar la célula. Polipéptidos "substancialmente similares" son al menos 80%, opcionalmente al menos 90%, idénticos entre sí en secuencia de aminoácidos y mantienen o alteran en una manera deseable la actividad biológica del polipéptido no alterado. Las substituciones de aminoácidos conservadoras, improbablemente para afectar la actividad biológica, incluyen, sin limitación, las siguientes: Ala para Ser, Val para lie, Asp para Glu, Thr para Ser, Ala para Gly, Ala para Thr, Ser para Asn, Ala para Val, Ser para Gly, Tyr para Phe, Ala para Pro, Lys para Arg, Asp para Asn, Leu para lie, Leu para Val, Ala para Glu, Asp para Gly, y estos cambios a la inversa. Ver, por ejemplo, Neurath et al., The Proteins. Academic Press, New York (1979). Además, los intercambios de aminoácidos entre miembros de los siguientes seis grupos de aminoácidos se considerarán substituciones conservadoras para los propósitos de la invención. Los grupos son: 1 ) ) metionina, alanina, valina, leucina, y isoleucina; 2) cisteina, serina, treonina, asparagina, y glutamina; 3) aspartato y glutamato; 4) histidina, lisina, y arginina; 5) glycina y prolina; y 6) triptofan, tirosina, y fenilalanina. El por ciento de identidad de dos secuencias amino puede determinarse por inspección visual y cálculo matemático, o más preferentemente, la comparación se hace al comparar información de la secuencia utilizando un programa computacional tal como Genetics Computer Group (GCG; Madison, Wl) programa del paquete Wisconsin versión 10.0, 'GAP' (Devereux et al. (1984), Nucí. Acids Res. 12: 387) u otros programas computacionales comparables. Los parámetros de falla preferidos para el programa 'GAP' incluye: (1 ) la matriz de comparación de aminoácido pesada de Gribskov and Burgess (1986), Nucí. Acids Res. 14: 6745, como se describe por Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979), u otras matrices de comparación comparables; (2) una penalidad de 30 para cada espacio y una penalidad adicional de 1 para cada símbolo en cada espacio para secuencias de aminoácidos; (3) sin penalidad para espacios finales; y (4) sin penalidad máxima para espacios grandes. Otros programas utilizados por aquellos expertos en la materia de comparación de secuencia también pueden utilizarse. "Fase de transición" significa un periodo de cultivo celular entre una "fase de crecimiento" y una "fase de producción". Durante la fase de transición, el medio y condiciones ambientales se cambian típicamente de aquellas designadas para maximizar la proliferación a aquellas designadas para maximizar la producción de polipéptido. Un "dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable" es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico o substanciaimente similar a un dominio VL o VH de origen animal o humano. La presente invención se dirige a métodos mejorados para cultivar células de mamífero, que pueden haberse realizado genéticamente para producir un polipéptido particular. En particular, la invención se dirige a métodos de cultivo que maximizan la producción de polipéptidos específicos. También se dirige a métodos para producir y obtener tales polipéptidos de células de mamífero cultivadas. Los polipéptidos son útiles en una amplia variedad de aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas, agrícolas, nutricionales y de búsqueda. Como se muestra por los datos experimentales reportados en la presente, se ha descubierto que un ácido carboxílico aromático, una acetamida, y un compuesto ácido hidroxámico utilizados por separado o en varias combinaciones pueden inducir dramáticamente la producción de polipéptido recombinante de estirpes de célula CHO. Estos compuestos se identifican primero como inductores en un análisis a base de proteína fluorescente de 96 cavidades. Utilizando una construcción que expresa DsRed bajo el control de un promotor EASE/CMV, incluyendo una guía tripartita adenoviral, como un indicador para expresión, varios compuestos se analizan. Aquellos compuestos que parecen inducir la expresión DsRed, especialmente a temperaturas inferiores, se investigan además en análisis para inducción de otros polipéptidos recombinantes. Estos experimentales conducen a la identificación de un subconjunto de químicos como inductores fuertes de expresión de proteína recombinante. Generalmente, los compuestos caen en tres amplias clases: ácido carboxílico aromático, acetamida, y compuestos de ácido hidroxámico. Los experimentos adicionales revelaron que las combinaciones de compuestos de más de una de estas clases podrían incrementar además la inducción de expresión de polipéptido, especialmente producción de proteína recombinante. De esta manera, el uso de estos compuestos como inductores puede reducir substancialmente los costos de fabricación y/o reducir las necesidades de capacidad de la planta. Un ácido carboxílico aromático útil en la práctica de la invención es un compuesto de la fórmula X-Y-Z en donde X es un grupo aromático, por ejemplo, un anillo de carbono de 5, 6 o 7 miembros, Y es un conector con un grupo alquilo de desde 1 hasta 20 o más carbonos, preferentemente 2 a 10 carbonos, más preferentemente 2-5 carbonos, y Z es un grupo ácido carboxílico. El grupo aromático puede ser substituido o no substituido, si un grupo fenilo substituido se utiliza, la substitución está preferentemente en la posición para, aunque los substituyentes meta y orto pueden tolerarse. El grupo aromático parece ser particularmente ventajoso; se ha encontrado que si este grupo se substituye con un alquilo de cadena recta o ramificada tales compuestos no trabajan casi bien, y que los grupos de tinte o triácidos son negativos. Por ejemplo, ácido pimélico, ácido metilsuccínico, y citrato de dihidrógeno de sodio fueron ineficaces como inductores. Los ejemplos ilustrativos de estos ácidos carboxílicos aromáticos cuya utilidad como inductores de producción de polipéptido recombinante se describe en la presente, son como sigue: Otros compuestos que pueden utilizarse para incrementar la producción de polipéptido son: ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico; ácido 3-(2-metilfenil)propiónico; ácido 4-(4-metoxifenil)butírico; ácido 4-(4-aminofenil)butírico; ácido 3-(2-hidroxifenil)propiónico; ácido 6-fenilhexanóico; ácido 3,4-difluorohidocinámico; y ácido 2-metilindola-3-acético. Todavía otros compuestos que pueden utilizarse son: ácido 3-(3-metoxifen¡l)propiónico; ácido 6-benziloxicarbonilaminohexanóico; ácido 3-[4-(trifiuorometil)fenil]propiónico; ácido 3-(4-aminofenil)propiónico; ácido 3-(4-fluorofenii)propiónico; ácido 2-tienilacético, y ácido 3-(3,4-dimetoxifenil)propiónico. Además, la invención comprende el uso de acetamidas como inductores de la producción de polipéptido. La solicitud de patente copendiente no. 10/400,334 describe el uso de compuestos polares híbridos, algunos de los cuales son acetamidas, como inductores. Sin embargo, como se describe en la presente, las acetamidas que no son compuestos polares híbridos (es decir, contienen solamente un grupo polar-el grupo acetamida) también pueden inducir producción de polipéptido recombinante. Tales acetamidas polares no híbridas pueden ser acetamidas de alquilo en donde la cadena de alquilo se elige de aproximadamente 32 a aproximadamente 20 carbonos en longitud. Ejemplos de acetamidas que pueden utilizarse solas o en combinación con otros compuestos como inductores incluyen los siguientes: Clase de acetamida: Hexametilenobisacetamida (H BA) (un compuesto polar híbrido) N-butilacetamida Además, otra clase de compuestos que pueden utilizarse como inductores de producción de polipéptido recombinante son ácidos hidroxámicos. La invención comprende el uso como inductores de ácidos hidroxámicos que no son compuestos polares híbridos. Ejemplos de compuestos mostrados en la presente para ser útiles son como sigue: Ácido hexanohidroxámico (HHA) Ácido 3-fenilpropionohidroxamina Ácido benzohidroxámico Acido octano-1 ,8-dihidroxámico En particular, se ha encontrado a través de la selección de un gran número de diferentes compuestos que la adición de cualquiera de los compuestos de ácido carboxílico aromático ejemplificativo, acetamida, y ácido hidroxámico a la fase de producción de un cultivo celular puede aumentar la producción de polipéptido recombinante. Además, tales compuestos elegidos de más de una de las clases anteriores pueden agregarse en combinación para aumentar la producción de polipéptido recombinante. Además, otros métodos para incrementar la producción, tal como, por ejemplo, cultivar las células a temperaturas desde aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C, entre aproximadamente 29°C y 35°C, y/o de aproximadamente 30°C a aproximadamente 33°C también pueden utilizarse en combinación con uno o más de estos inductores químicos. Opcionalmente, el cultivo celular utilizando los métodos de la invención puede tener lugar durante una fase de producción, como se distingue a partir de una fase de crecimiento. Una fase de crecimiento puede distinguirse de una fase de producción por ejemplo, mediante un cambio de temperatura y/o un cambio en medio tal como, por ejemplo, la adición de uno o más inductores. En un aspecto, la invención proporciona un método que comprende desarrollar en cultivo una célula de mamífero que se ha realizado genéticamente para producir un polipéptido; y agregar ai cultivo uno o más de un ácido carboxílico aromático, una acetamida, y un compuesto de ácido hidroxámico. Una célula genéticamente realizada puede ser una célula que se ha transformado con un vector recombinante que codifica el polipéptido. Además, el polipéptido puede expresarse bajo el control de un promotor heterólogo tal como, por ejemplo, un promotor CMV o un promotor SV40. Típicamente, la célula no expresa naturalmente el polipéptido o solamente expresa de manera natural el polipéptido a niveles muy bajos (en la ausencia de ingeniería genética). En otro aspecto, la invención proporciona un cultivo conteniendo una célula realizada genéticamente para producir un polipéptido, un medio de producción, y un ácido carboxílico aromático, una acetamida, y/o un compuesto de ácido hidroxámico. Además, los métodos y composiciones de la invención pueden utilizarse en combinación con cualquier otros métodos conocidos o aún por descubrir para inducir la producción de polipéptidos recombinantes. Tales técnicas incluyen cambio de temperatura fría, adiciones de ácido alcanóico (como se describe en la Patente de EE.UU. No. 5,705,364 para Etcheverry et al. , incorporada en la presente para referencia), compuestos dipoiares híbridos, xantinas, DMF, y DMSO, por nombrar solo unos pocos, así como también cualquier técnica de inducción aún por ser descubierta y/o descubierta (ver, por ejemplo, solicitud de patente copendiente no. 10/400,334, presentada el 27 de Marzo de 2003, incorporada para referencia en la presente). Como se utiliza en la presente, "inducir" la producción de polipéptido o "inducción" se refiere a cultivar células bajo un conjunto de condiciones diseñadas para maximizar la cantidad total de un polipéptido deseado hecho por las células. Un "inductor" es un agente que, cuando se agrega a medio de cultivo, puede incrementar la producción de un polipéptido deseado en al menos algunas estirpes de célula. Combinar la adición de un ácido carboxílico aromático, una acetamida, y/o un compuesto de ácido hidroxámico con otro y/o con otra técnica de inducción de proteína puede tener un efecto sinergístico en inducción de polipéptido, permitiendo adiciones inferiores de estos compuestos y/o adiciones inferiores de otros agentes inductores y/o más cambios de temperatura conservadores.

Los otros métodos de inducción pueden tener lugar en aproximadamente el mismo tiempo en que el compuesto se agrega, y/o antes y/o después de adición. Por ejemplo, uno puede cambiar la temperatura del cultivo en el día 0, y después agrega uno de estos compuestos, y opcionalmente otros inductores químicos, después, por ejemplo, una a varias horas o días después. Tal procedimiento permite algún crecimiento adicional de un cultivo sembrado antes de la inducción completa. Además, múltiples adiciones de un ácido carboxílico aromático, una acetamida, y/o un compuesto de ácido hidroxámico pueden agregarse al cultivo durante la fase de producción, separarse por aproximadamente 12, 24, 48 y/o 72 horas o más, con o sin adiciones de otros agentes inductores o cambios en condiciones de cultivo. Por ejemplo, un inductor puede agregarse el día 0 y de nuevo el día 4. Alternativamente, un inductor puede agregarse por la primera vez una, dos, tres o cuatro días después de un cambio de temperatura. En un aspecto, la invención comprende realizar un cambio a baja temperatura (cambiar la temperatura del medio de la temperatura de crecimiento óptima, usualmente aproximadamente de 37°C, a una temperatura interior, usualmente de aproximadamente 29DC a aproximadamente 36°C, y opcionalmente aproximadamente 30°C a aproximadamente 34°C en el momento de, antes, y/o después de agregar el(los) compuesto o compuestos inductor(es). Existen diferencias individuales entre las estirpes de célula en la efectividad de varios inductores. Por ejemplo, aunque butirato de sodio es un inductor ampliamente utilizado, puede no tener efecto o un afecto adverso en la producción de polipéptido en algunas estirpes de célula. Diferentes inductores o diferentes concentraciones de los mismos inductores pueden ser apropiados para diferentes estirpes de célula. Además, diferentes temperaturas pueden ser apropiadas para diferentes estirpes de célula. A pesar de esta variabilidad, los inductores tales como ácidos carboxílicos aromáticos, acetamidas y ácidos hidroxámicos pueden ser útiles en una amplia variedad de estirpes de célula. La concentración óptima para un compuesto particular variará dependiendo de su actividad y la estirpe de célula en la cual se utiliza y puede determinarse por un experto en la materia utilizando métodos de rutina y la guía proporcionada en la presente. Por ejemplo, los compuestos tales como ácido hidrocinámico (HCA), ácido 3-(4-metilfenil)propiónico, ácido 4-fenilbutírico, ácido 4-(4-aminofenil)butírico, y ácido 5-fenilvalérico pueden agregarse a concentraciones de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 20 milimolares, preferentemente entre aproximadamente 0.1 milimolar y aproximadamente 5 milimolares, y más preferentemente a aproximadamente 0.2 a 2 milimolares. Los compuestos tales como ácido hexanohidroxámico (HHA) y ácido 3-fenilpropionohidroxámico deben utilizarse en concentraciones de alguna manera inferiores y de esta manera pueden agregarse en concentraciones de aproximadamente 0.01 micromolar a aproximadamente 1 milimolar, preferentemente entre aproximadamente 0.1 micromolar y aproximadamente 50 micromolares, y más preferentemente a aproximadamente 1 a 20 micromolares. Los polipéptidos particularmente preferidos para expresión son los medicamentos a base de polipéptido, también conocidos como biológicos. Preferentemente, los polipéptidos se secretan como productos extracelulares. El polipéptido que se produce puede comprender parte de o todo el polipéptido que es idéntico o substancialmente similar a un polipéptido que ocurre de manera natural, y/o puede ser, o no, un polipéptido de fusión recombinante. Opcionalmente, el polipéptido puede ser un polipéptido humano, un fragmento del mismo, o un polipéptido substancialmente similar que es al menos 15 aminoácidos en longitud. Puede comprender un polipéptido sin anticuerpo y/o un anticuerpo. Puede producirse intracelularmente o secretarse en el medio de cultivo del cual puede recuperarse. Puede ser o no un polipéptido soluble. El polipéptido que se produce puede comprender parte de o todo un polipéptido que es idéntico o substancialmente similar a un polipéptido que ocurre de manera natural, y/o puede, o no, ser un polipéptido de fusión recombinante. Puede comprender un polipéptido sin anticuerpo y/o un anticuerpo. Puede producirse intracelularmente o secretarse en el medio de cultivo del cual puede recuperarse. La invención puede utilizarse para inducir la producción de cualquier polipéptido, y es particularmente ventajosa para polipéptidos cuya expresión está bajo el control de un promotor fuerte, tai como por ejemplo, un promotor viral, y/o polipéptidos que se codifican en un mensaje que tiene un elemento guía tripartita adenovirai. Ejemplos de vectores de expresión útiles que pueden utilizarse para producir proteínas se describen en Solicitud Internacional WO 01/27299 y en McMahan et al., (1991 ), EMBO J. 10: 2821 , que describe el vector pDC409, que utiliza un promotor viral, un promotor CMV. Una proteína se entiende generalmente como siendo un polipéptido de al menos aproximadamente 10 aminoácidos, opcionalmente de aproximadamente 25, 75 o 100 aminoácidos. Generalmente, los métodos de la invención son útiles para inducir la producción de polipéptidos recombinantes. Algunos polipéptidos que pueden producirse con los métodos de la invención incluyen polipéptidos que comprende secuencias de aminoácidos idénticas a o substancialmente similares a todos o parte de uno de los siguientes polipéptidos: un ligando flt3 (como se describe en la Solicitud Internacional WO 94/283919, incorporada en la presente para referencia), un ligando CD40 (como se describe en la Patente de EE.UU. No. 6,087,329 incorporada en la presente para referencia), eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, leptina, IL-2, angiopoyetina-2 (como se describe por Maisonpierre et al. (1997), Science 277 (5322): 55-60, incorporada en la presente para referencia), ligando Fas, ligando para el activador receptor de NF-kappa B (RANKL, como se describe en la Solicitud Internacional WO 01/36637, incorporada en la presente para referencia), ligando inductor de apoptósis relacionado con el factor de necrosis de tumor (TNF) (TRAIL, como se describe en la Solicitud Internacional WO 97/01633, incorporada en la presente para referencia), linfopoyetina derivada de estroma tímico, factor de estimulación de colonia de granulocitos, factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF, como se describe en la Patente Australiana No. 588819, incorporada en la presente para referencia), factor de crecimiento de mastocito, factor de crecimiento de célula madre (descrito en, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 6,204, 363, incorporada en la presente para referencia), factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de queratinocito, factor de crecimiento y desarrollo de megacarioto, RANTES, hormona de crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento similares a insulina, hormona paratiroidea, interferones incluyendo interferones a, interferón ?, e interferones de consenso (tales como aquellos descritos en las Patentes de EE.UU. Nos. 4,695,623 y 4, 897471 , ambas incorporadas en la presente para referencia), factor de crecimiento del nervio, factor neurotrófico derivado del cerebro, proteínas similares sinaptotagmina (SLP 1 -5), neurotrofin-3, glucagón, interleuquinas 1 a 18, factores estimuladores de colonia, linfotoxin-ß, factor de necrosis de tumor (TNF), factor inhibidor de leucemia, oncostatin-M, y varios ligandos para moléculas de superficie celular ELK y Hek (tal como los ligandos para quinasas relacionadas con eph o LERKS). Las descripciones de los polipéptidos que pueden producirse de acuerdo con los métodos inventos pueden encontrarse en, por ejemplo, Human Cvtokines:Handbook for Basic and Clinical Research. Vol. I I (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practica! Approach (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); y The Cytokine Handbook (A. W. Thompson, ed., Academic Press, San Diego, CA, 1991 ), todas de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Otros polipéptidos que pueden producirse utilizando los métodos de la invención incluyen polipéptidos que comprenden toda o parte de la secuencia de aminoácidos de un receptor para cualquiera de los polipéptidos arriba mencionados, un antagonista a tal receptor o cualquiera de los polipéptidos arriba mencionados, y/o polipéptidos substancialmente similares a tales receptores o antagonistas. Estos receptores y antagonistas incluyen: ambas formas de receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR, referidos como p55 y p75, como se describe en la Patente de EE.UU. No. 5,395,760 y la Patente de EE.UU. No. 5,610,279, ambos de los cuales se incorporan en la presente para referencia), receptores de lnterleuqina- (IL-1 ) (tipos I y II; descritos en la Patente EP No. 0 460 846, Patente de EE.UU. No. 4,968,607 y la Patente de EE.UU. No. 5,767,064, todas de las cuales se incorporan en la presente para referencia), antagonistas del receptor IL-1 (tales como aquellos descritos en la Patente de EE.UU. No. 6,337,072, incorporada en la presente para referencia), los antagonistas de IL-1 o inhibidores (tales como aquellos descritos en las Patentes de EE.UU. Nos. 5,981 ,713, 6,096,728, y 5,075,222, todas de las cuales se incorporan en la presente parea referencia), receptores IL-2, receptores IL-4 (como se describe en la Patente EP No. 367 566 y la Patente de EE.UU. No. 5,856,296. ambas de las cuales se incorporan para referencia), receptores IL-15, receptores IL-17, receptores IL-1 8, receptor de factor estimulador de colonia de granulocito-macrófago, receptor de factor estimulador de colonia de granulocito, receptores de oncostatin-M y factor inhibidor de leucemia, activador de receptor de NF-kappa B (RANK, descrito en WO 01/36637 y Patente de EE.UU. No. 6,271 ,349, ambas de las cuales se incorporan para referencia), osteoprotegerina (descrita en, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 6,015,938, incorporada para referencia), receptores para TRAIL (incluyendo receptores TRAIL 1 , 2, 3 y 4) y receptores que comprenden dorriinios inactivos, tales como Fas o Receptor Inductor de Apoptósis (AIR). Otros polipéptidos que pueden producirse utilizando el proceso de la invención incluyen polipéptidos que comprende toda o parte de las secuencias de aminoácidos de diferentes antígenos (referidos como polipéptidos CD) o sus ligandos o polipéptidos substancialmente similares a cualquiera de estos. Tales antígenos se describe en Leukocvte Typing VI (Proceedings of the Vlth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al. , eds., Kobe, Japón, 1996, que se incorpora para referencia). Los polipéptidos CD similares se describen en trabajos subsiguientes. Ejemplos de tales antígenos incluyen CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, y ligandos a los mismos (ligando CD27, ligando CD30, etc.). Varios de los antígenos CD son miembros de la familia del receptor TNF, que también incluye 41 BB y OX40. Los ligandos con frecuencia son miembros de la familia TNF, como son el ligando 41 BB y ligando OX40. De acuerdo con lo anterior, los miembros de las familias TNF y TNFR también pueden purificarse utilizando la presente invención. Los polipéptidos enzimáticamente activos o sus ligandos también pueden producirse de acuerdo a los métodos de la invención. Ejemplos incluyen polipéptidos que comprenden todo o parte de uno de los siguientes polipéptidos o sus ligandos o un polipéptido substancialmente similar a uno de estos: miembros de la familia de metaloproteinasa-disintegrina, varias quinasas, glucocerebrosidase, dismutasa de superóxido, activador de plasminogen de tejido, Factor VIII, Factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, un antagonista IL-2, antitripsina alfa-1 , enzima de conversión TNF-alfa, ligandos para cualquiera de las enzimas arriba mencionadas y numerosas otras enzimas y sus ligandos. Los métodos de la invención también pueden utilizarse para producir anticuerpos o porciones de los mismos y anticuerpos quiméricos, es decir, anticuerpos que tienen dominios de inmunoglobulina de anticuerpo constante, humano acoplados a uno o más dominios de inmunoglobulina de anticuerpo variable murino, fragmentos de los mismos, o proteínas substancialmente similares. Los métodos de la invención también pueden utilizarse para producir conjugados que comprenden un anticuerpo y una substancia luminescente o citotóxica. Tales substancias incluyen: derivados de maitansina (tal como DM1 ); enterotoxinas (tal como una enterotoxina Estafilococal), isótopos de yodo (tal como yodo-125); isótopos de tecnio (tal como Tc-99m); fluorocromos de cianina (tal como Cy5.5.18); y polipéptidos de inactivación de ribosoma (tal como bouganina, gelonina, o saporin-S6). La invención también puede utilizarse para producir proteínas quiméricas seleccionadas in vitro para unirse a una proteína objetivo específica y modificar su actividad tales como aquellas descritas en Solicitudes Internacionales WO 01/83525 y WO 00/24782, ambas de las cuales se incorporan para referencia. Ejemplos de anticuerpos, proteínas quiméricas seleccionadas in vitro, o conjugados de anticuerpo/citotoxina o anticuerpo/luminoforo que pueden producirse por los métodos de la invención incluyen aquellos que reconocen cualquiera o una combinación de polipéptidos incluyendo, pero sin limitarse a, las proteínas arriba mencionadas y/o los siguientes antígenos: subunidades de CD2, CD3, CD4, CD8, CD1 1 a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1 ), CD86 (B7.2), CD147, IL-?a, IL-10, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor IL-2, receptor IL-4, receptor IL-6, receptor IL-13, receptor IL-18, PDGF-ß y análogos de las mismas (tales como aquellas descritas en las Patentes de EE.UU. Nos. 5,272,064 y 5,149,792), VEGF, TGF, TGF-p2, TGF-ß? , receptor EGF (incluyendo aquellos descritos en la Patente de EE.UU. No. 6, 235, 883 B1 , incorporadas para referencia), receptor VEGF, factor de crecimiento de hepatocito, ligando de osteoprotegerina, interferón gamma, estimulador del linfocito B (BlyS, también conocido como BAFF, THANK, TALL-1 , y zTNF4 ; ver Do and Chen- Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13 (1 ) : 19-25), complemento C5, IgE, antígeno de tumor CA125, antígeno de tumor MUC1 , antígeno PEM, LCG (que es un producto genético que se expresa en asociación con el cáncer de pulmón), HER-2, una glicoproteína asociada con tumor TAG-72, el antígeno SK-1 , epítopos asociados con tumor que se presentan en niveles elevados en el suero de pacientes con cáncer de colón y/o pancreático, epítopos asociados con cáncer o polipéptidos expresados en células cancerígenas de mama, colón, célula escamosa, próstata, pancreáticas, pulmón y/o riñon y/o en melanoma, glioma, o células de neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, integrina VLA-4, integrinas B2, receptores TRAIL 1 , 2, 3 y 4, RANK, ligando RANK, TNF-a, la molécula de adhesión VAP-1 , molécula de adhesión de célula epitelial (EpCAM), molécula-3 de adhesión intracelular (ICAM-3), adhesina de leucointegrina, la glicoproteína de plaqueta gp llb/llla, cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor Vlla-factor del tejido), MCH I, antígeno carcinoembriónico (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), factor de necrosis de tumor (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno asociado con linfocito T citotóxico), receptor Fc-y- , HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, L-selectina, Virus Sincitial Respiratorio, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de hepatitis B, Streptococcus mutans y Staphlycoccus aureus. La invención también puede utilizarse para producir todo o parte de un cuerpo anti-idiotípico o un polipéptido substancialmente similar, incluyendo anticuerpos anti-idiotípicos contra: un anticuerpo con el objetivo al antígeno de tumor gp72; un anticuerpo contra el gangliósido GD3; un anticuerpo contra el gangliósido GD2; o anticuerpos substancialmente similares a estos. Los métodos de la invención también pueden utilizarse para producir polipéptidos de fusión recombinantes que comprenden cualquiera de los polipéptidos arriba mencionados. Por ejemplo, polipéptidos de fusión recombinantes comprendiendo uno de los polipéptidos arriba mencionados más un dominio de multimerización, tal como un cierre de leucina, una bobina enrollada, una porción Fe de un anticuerpo, o una proteína substancialmente similar, pueden producirse utilizando los métodos de la invención. Ver, por ejemplo, W094/10308 ; Lovejoy et al. (1993), Science 259: 1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262: 1401 -05 ; Harbury et al. (1994), Nature 371 : 80-83; Hákansson et al. (1999), Structure 7: 255-64, todas de las cuales se incorporan para referencia. Se incluyen específicamente entre tales polipéptidos de fusión recombinantes los polipéptidos en los cuales una porción de TNFR o RANK se fusiona a una porción Fe de un anticuerpo (TNFR: Fe o RANK: Fe). TNFR:Fc comprende la porción Fe de un anticuerpo fusionado a un dominio extracelular de TNFR, que incluye secuencias de aminoácidos substancialmente similares a los aminoácidos -163,1 -185, o 1-235 de la figura 2A de la Patente de EE.UU. No. 5,395,760, que se incorpora para referencia. RANK:Fc se describe en la Solicitud Internacional WO 01/36637, que se incorpora para referencia.

Preferentemente, los polipéptidos se expresan bajo el control de un elemento de control heterólogo tal como, por ejemplo, un promotor que no hace en naturaleza directa la producción de ese polipéptido. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor viral fuerte (por ejemplo, CMV, SV40) que dirige la expresión de un polipéptido de mamífero. La célula huésped puede o no producir normalmente el polipéptido. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una célula CHO que se ha realizado genéticamente para producir un polipéptido humano, significando que el ácido nucleico que codifica el polipéptido humano se ha introducido en la célula CHO. Alternativamente, la célula huésped puede ser una célula humana que se ha realizado genéticamente para producir niveles incrementados de un polipéptido humano normalmente presente solamente en niveles muy bajos (por ejemplo, al reemplazar el promotor endógeno con un promotor viral fuerte). Para la producción de polipéptidos recombinantes, un vector de expresión codificando el polipéptido recombinante puede transferirse, por ejemplo, por transfección o infección viral, en un cultivo substancialmente homogéneo de células huésped. El vector de expresión, que puede construirse utilizando los métodos de ingeniería genética, pueden incluir ácidos nucleicos codificando el polipéptido de interés operablemente enlazado a secuencias reguladoras adecuadas. Las secuencias reguladoras se derivan típicamente de genes de mamífero, microbiano, viral, y/o de insecto. Ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores, y aumentadores, un sitio de unión ribosomal (ver, por ejemplo, Kozak (1991 ), J. Biol. Chem. 266: 19867-19870), secuencias apropiadas para controlar el inicio y fin transcripcional y traslacional, señales de poliadenilación (ver, por ejemplo, McLauchlan et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16: 5323-33), y sitios de unión de matriz y prótesis (ver Phi-Van et al. (1988), Mol. Cell. Biol. 10: 2302-07; Stief et al. (1989), Nature 341 : 342-35; Bonifer et al. (1990), EMBO J. 9: 2843-38). Las secuencias de nucleótidos se enlazan operativamente cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de codificación de polipéptidos. De esta manera, una secuencia de nucleótidos promotora se enlaza operativamente a una secuencia de codificación de polipéptido si la secuencia de nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de codificación. Un gen que codifica un marcador seleccionable se incorpora generalmente en el vector de expresión para facilitar la identificación de las células recombinantes. Las secuencias de control transcripcional y traslacional para vectores de expresión de célula huésped de mamífero pueden cortarse de genomas virales. Las secuencias aumentadoras y promotoras comúnmente utilizadas se derivan de virus de polioma, adenovirus 2, virus 40 de simio (SV40), y citomegalovirus humano (CMV). Por ejemplo, el promotor/aumentador de CMV humano del gen temprano inmediato 1 puede utilizarse. Ver, por ejemplo, Patterson et al. (1994), Applied icrobiol. Biotechnol. 40: 691 -98. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, de origen SV40, promotor anticipado o tardío, aumentador, pedazo, y sitios de poliadenilación pueden utilizarse para proporcionar otros elementos genéticos para expresión de una secuencia genética estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores virales, anticipado o tardío, son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento, que también puede contener un origen viral de réplica (Fiers et al. (1978), Nature 273: 1 13; Kaufman . (1990), Meth. in Enzymol. 1 85: 487-51 1 ). Los fragmentos SV40 más pequeños o más grandes también pueden utilizarse, estipulando que se incluye la secuencia de aproximadamente 250 bp que se extiende desde el sitio Hind I I I al sitio Bgl I ubicado en el origen viral SV40 del sitio de replica. Además, una secuencia que codifica un péptido de señal heterólogo (secuencia guía) o nativo, apropiado, puede incorporarse en el vector de expresión, para promover la secreción extracelular del polipéptido recombinante. El péptido de señal se separará del polipéptido recombinante en la secreción de la célula. La elección del péptido de señal o guía depende del tipo de células huésped en las cuales el polipéptido recombinante está por producirse. Ejemplos de péptidos de señal que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen la secuencia de señal para interleuqina 7 (IL-7) descrita en la Patente de EE.U U. No. 4,965, 195, la secuencia de señal para receptor de interleuqina 2 descrito en Cosman et al. (1984), Nature 312: 768; el péptido de señal del receptor de interleuqina 4 descrito en la Patente EP No. 367,566; el péptido de señal del receptor de interleuqina 1 tipo I descrito en la Patente de EE.UU. No. 4,968,607; y el péptido de señal del receptor de interleuqina 1 tipo II descrito en la Patente EP No. 0 460 846. Los métodos establecidos para introducir ADN en células de mamífero se han descrito. Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. Los procedimientos adicionales utilizando reactivos comercialmente disponibles, tales como los reactivos de lípido catiónico LIPOFECTAMINE™, LIPOFECTAMINE™-2000, o LIPOFECTAMINE™-PLUS (que puede comprarse de Invitrogen), pueden utilizarse para transfectar células. Felgner et al. (1987)., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417. Además, la electroporación o bombardeo con microproyectiles revestidos con ácidos nucleicos puede utilizarse para transfectar células de mamífero utilizando procedimientos, tales como aquellos en Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed. Vol. 1 -3, Cold Sprlng Harbor Laboratory Press (1989) y Fitzpatrick-McElIigott (1992), Biotechnology (NY) 10 (9): 1036-40. La selección de transformadores estables puede realizarse utilizando métodos conocidos en la materia, tales como, por ejemplo, resistencia a medicamentos citotóxicos. Generalmente, en células huésped de mamífero los transformantes estables tienen los polinucleótidos introducidos, incorporados en el cromosoma. Kaufman et al. ((1990), Meth. in Enzymology 185: 487-51 1 ), describe varios esquemas de selección, tal como resistencia a reductasa de dihidrofolato (DHFR). Una cepa huésped adecuada para selección de DHFR puede ser la cepa CHO DX-B1 1 , que es deficiente en DHFR. Urlaub and Chasin (1980), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220. Un plásmído que expresa cADN DHFR puede introducirse en la cepa DX-B1 1 , y solamente las células que contienen el plásmido pueden desarrollarse en el medio selectivo apropiado. Otros ejemplos de marcadores seleccionables que pueden incorporarse en un vector de expresión incluyen cADNs que confieren resistencia a antibióticos, tal como G418 e higromicina B. Las células que alojan el vector pueden seleccionarse en la base de resistencia a estos compuestos. Las secuencias de control adicionales mostradas para mejorar la expresión de genes heterólogos de vectores de expresión de mamífero incluyen tales elementos como el elemento de secuencia que aumenta la expresión (EASE) derivado de células CHO (Morris et al., in Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997); Patente de EE.UU. Nos. 6,312, 951 B1 , 6,027, 915, y 6,309, 841 B1 ) y guía tripartita (TPL) y ARNs de gen VA de Adenovirus 2 (Gingeras et al. (1982), J. Biol. Chem. 257 : 13475-13491 ). Las secuencias del sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) de origen viral permite que los mARNs dicistrónicos se trasladen eficientemente (Oh and Sarnow (1993), Current Opinión in Genetics and Development 3: 295-300; Ramesh et al. (1996), Nucleic Acids Research 24 : 2697-2700). La expresión de un cADN heterólogo como parte de un mARN dicistrónico seguido por el gen para un marcador seleccionable (por ejemplo, DHFR) se ha mostrado que mejora la capacidad de transfección del huésped y expresión del cADN heterólogo (Kaufman et al. (1990), Methods in Enzymol. 185: 487-511 ). Los vectores de expresión ejemplificativos que emplean mARNs diclsírónicos son pTR-DC/GFP descritos por Mosser et al., Biotechniques 22: 150-161 (1997), y p2A5l descrito por Morris et al. , in Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997). Un vector de expresión alto, útil, pCAVNOT, se ha descrito por Mosley et al. ((1 989), Cell 59 : 335-348). Otros vectores de expresión para utilizarse en células huésped de mam ífero pueden construirse como se describe por Okayama and Berg ((1983), Mol. Cell. Biol. 3: 280). Un sistema útil para expresión estable de alto nivel de cADNs de mamífero en células epiteliales de mamífero murino C127 pueden construirse substancialmente como se describe por Cosman et al. ((1986), Mol. Immunol. 23:935). Un vector útil de alta expresión, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al. ((1984), Nature 312: 768), se ha depositado como ATCC 39890. Los vectores de expresión de mamífero útiles se describen en Patente EP No.-A-O 367 566 y WO 01/27299 A1 . Los vectores pueden derivarse de retrovirus. En lugar de la secuencia de señal nativa, una secuencia de señal heteróloga puede agregarse, tal como una de las siguientes secuencias: la secuencia de señal para IL-7 descrita en la Patente de EE. UU. No. 4,965, 195; la secuencia de señal para receptor IL-2 descrito en Cosman et al. (Nature 312: 768 (1984); el péptido de señal I L-4 descrito en la Patente EP No. 0 367 566; el péptido de señal de receptor IL-1 tipo 1 descrito en la Patente de EE. UU. No. 4,968,607; y el péptido de señal de receptor IL-1 tipo II descrito en la Patente EP No. 0 460 846. Los polipéptidos pueden producirse recombinantemente en células eucarióticas y se secretan preferentemente por células huésped adaptadas para desarrollarse en cultivo celular. Opcionalmente, las células huésped para utilizarse en la invención son preferentemente células de mamífero. Las células también pueden realizarse genéticamente para expresar un gen de interés, pueden ser células de producción de mamífero adaptadas para desarrollarse en cultivo celular, y/o pueden ser estirpes de célula homogéneas. Ejemplos de tales células comúnmente utilizadas en la industria son VERO, BHK, HeLa, CV1 (incluyendo Cos), MDCK, 293, 3T3, estirpes de célula de mieloma (por ejemplo, NSO, NS1 ), PC12, células W138, y células de ovario de hámster chino (CHO), que se utilizan ampliamente para la producción de varios complejos polipéptidos recombinantes, por ejemplo, citoquinas, factores de coagulación, y anticuerpos (Brasel et al. (1996), Blood 88: 2004-2012; Kaufman et al. (1988), J. Blol Chem 263: 6352-6362; McKinnon et al. (1991 ), J Mol Endocrinol 6: 231 -239; Wood et al. (1990), J. Immunol. 145: 301 1 -3016). Las estirpes de célula mutantes deficientes de reductasa de dihidrofolato (DHFR) (Urlaub et al. (1980), Proc Nati Acad Sci USA 77: 4216-4220, que se incorpora para referencia), DXB1 1 y DG-44, son estirpes de célula huésped CHO deseables debido a que el sistema de expresión genética seleccionable y amplificable DHFR eficiente permite expresión de polipéptido recombinante de alto nivel en estas células (Kaufman R. J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566, que se incorpora para referencia). Además, estas células son fáciles de manipular como cultivos de suspensión o adherentes y muestran estabilidad genética relativamente buena. Las células CHO y polipéptidos recombinantes expresados en ellas se han caracterizado extensivamente y han mejorado para utilizarse en fabricación comercial clínica por agencias reguladoras. Los métodos de la invención también pueden practicarse utilizando estirpe de célula hibridoma que producen un anticuerpo. Los métodos para hacer líneas hibridoma se conocen bien en la materia. Ver, por ejemplo, Berzofsky et al. in Paul, ed., Fundamental (mmunology, Second Edition, pp. 315-356, en 347-350, Raven Press Ltd. , New York (1 989). Las estirpes de célula derivadas de las líneas arriba mencionadas también son adecuadas para practicar la invención. De acuerdo a la presente invención, una célula huésped de mamífero se cultiva bajo condiciones que promueven la producción del polipéptido de interés, que puede ser un anticuerpo o un polipéptido recombinante. Las formulaciones del medio de cultivo celular básico se conocen bien en la materia. A estas formulaciones de medio de cultivo básicas el experto en la materia agregará componentes tales como aminoácidos, sales, azúcares, vitaminas, hormonas, factores de crecimiento, reguladores, antibióticos, lípidos, elementos indicadores y lo similar, dependiendo de los requerimientos de las células huésped a cultivarse. El medio de cultivo puede o no contener suero y/o proteína. Varios medios de cultivo de tejido, incluyendo medio de cultivo definido y/o libre de suero, se encuentran comercialmente disponibles del cultivo celular. El medio de cultivo de tejido se define, para propósitos de la invención, como un medio adecuado para el desarrollo de células de animal, y preferentemente células de mamífero, en cultivo celular in vitro. Típicamente, el medio de cultivo de tejido contiene un regulador, sales, fuente de energía, aminoácidos, vitaminas y elementos esenciales indicadores. Cualquier medio capaz de soportar el crecimiento de la célula eucariótica apropiada en cultivo puede utilizarse; la invención es ampliamente aplicable a células eucarióticas en cultivo, particularmente células de mamífero, y la elección de medios no es crucial para la invención. El medio de cultivo adecuado para utilizarse en la invención están comercialmente disponibles de, por ejemplo, ATCC (Manassas, VA). Por ejemplo, cualquiera o una combinación de los siguientes medios pueden utilizarse: Medio RPMI-1640, Medio RPMI-1641 , Medio de Águila Modificada de Duibecco (DMEM), Águila de Medio Esencial Mínimo, Medio F-12K, Medio F12 de Ham, Medio de Dulbeco Modificado de Iscove, Medio 5A de McCoy, Medio L-15 de Leibovitz, y medio libre de suero tal como EX-CELL™ Series 300 (disponible de JRH Biosciences, Lenexa, Kansas, USA), entre otros, que pueden obtenerse de la Colección de Cultivo Tipo Americano o JRH Biosciences, así como también otros vendedores. Cuando se utiliza medio definido que es libre de suero y/o libre de peptona, el medio se enriquece altamente usualmente para aminoácidos y elementos indicadores. Ver, por ejemplo, Patentes de EE.UU Nos. 5, 122,469 para Mather et al. y 5,633, 162 para Keen et al. En los métodos y composiciones de la invención, las células pueden desarrollarse en medio libre de suero, libre de proteína, libre de factor de crecimiento y/o libre de peptona. El término "libre de suero" como se aplica a los medios incluye cualquier medio de cultivo celular de mamífero que no contiene suero, tal como suero bovino fetal. El término "libre de insulina" como se aplica a los medios incluye cualquier medio al cual no se agrega insulina exógena. Por exógeno se entiende, en este contexto, otros diferentes a aquellos producidos por el cultivo de las células por ellas mismas. El término "libre de IGF-1 " como se aplica a los medios incluye cualquier medio a cual se han agregado factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1 ) o análogo (tal como, por ejemplo, análogos de IGF-1 de LongR3, [Ala31 ], o [Leu24] [Ala31] disponibles de GroPep Ltd. De Thebarton, Australia del Sur). El término "libre de factor de crecimiento" como se aplica a los medios incluye cualquier medio al cual ningún factor de crecimiento exógeno (por ejemplo, insulina, IGF-1 ) se ha agregado. El término "libre de proteína" como se aplica a los medios incluye medie libre de proteína exógenamente agregada, tal como, por ejemplo, transferrina y los factores de crecimiento de proteína IGF-1 e insulina. El medio libre de proteína puede o no tener peptonas. El término "libre de peptona" como se aplica a los medios incluye cualquier medio al cual ningún hidrolisato de proteína se ha agregado tal como, por ejemplo, hidrolisatos de proteína de planta y/o animal. La eliminación de la peptona de medios tiene las ventajas de reducir la variabilidad lote a lote y aumentar el procesamiento tal como filtración. Los medios químicamente definidos son los mediso en los cuales cada componente se define y obtiene de una fuente pura, preferentemente una fuente no animal. El experto en la materia puede elegir utilizar una de las muchas formulaciones de medio individualizadas que se han desarrollado para maximizar el crecimiento celular, viabilidad celular, y/o producción de polipéptido recombinante en una célula huésped cultivada particular. Los métodos de acuerdo a la invención actual pueden utilizarse en combinación con medio de cultivo celular comercialmente disponible o con un medio de cultivo celular que se ha formulado de manera individual para utilizarse con una estirpe de célula particular. Por ejemplo, un medio enriquecido que podría soportar producción de polipéptido incrementada puede comprender una mezcla de dos o más medios comerciales, tales como, por ejemplo, medios DMEM y F12 de Ham combinados en proporciones tales como, por ejemplo, 1 :1 , 1 :2, 1 :3, 1 :4, 1 :5, 1 :6, 1 :7, 1 :8 o aún hasta 1 :15 o más alta. Alternativamente o en adición, un medio puede enriquecerse por la adición de nutrientes, tales como aminoácidos o péptona, y/o un medio (o la mayoría de sus componentes con excepciones notadas abajo) pueden utilizarse más grandes que lo usual, en concentración recomendada, por ejemplo, a 2X, 3X, 4X, SX, 6X, 7X, 8X o concentraciones aún más altas. Como se utiliza en la presente, "IX" significa la concentración estándar, "2X" significa dos veces la concentración estándar, etc. En cualquiera de estas modalidades, los componentes del medio que pueden afectar substancialmente la osmolaridad, tales como sales, no pueden ¡ncrementarse en concentración de manera que la osmolaridad del medio cae fuera de un rango aceptable. De esta manera, un medio puede, por ejemplo, ser 8X con respecto a todos los componentes excepto sales, que pueden presentarse en solamente 1X. Un medio enriquecido puede estar libre de suero y/o libre de proteína. Además, un medio puede complementarse periódicamente durante el tiempo que un cultivo se mantiene para llenar los componentes del medio que pueden reducirse tales como, por ejemplo, vitaminas, aminoácidos, y precursores metabólicos. Como se sabe en la materia, diferentes medios y temperaturas pueden tener efectos de alguna manera diferentes en diferentes estirpes de célula, y el mismo medio y temperatura puede no ser adecuado para estirpes de célula. Las condiciones de cultivo adecuadas para células de mamífero se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed. , Oxford University Press, New York (1992). Las células de mamífero pueden cultivarse en suspensión o aún unirse a un substrato sólido. Además, las células de mamífero pueden cultivarse, por ejemplo, en bioreactores de lecho fluidizado, bioreactores de fibra huecos, botellas de agitación, matraces de agitación, o bioreactores de tanque agitados, con o sin microvehículos, y operarse en un grupo, grupo alimentado, modo continuo, semi-continuo o perfusión. Los métodos de acuerdo a la presente invención pueden utilizarse para mejorar la producción de polipéptidos recombinantes tanto en procesos de cultivo de fase única como múltiple. En un proceso de fase única, las células se inoculan en un ambiente de cultivo y los métodos descritos se emplean durante la fase de producción única. En un proceso de múltiples etapas, las células se cultivan en dos o más fases distintas. Por ejemplo, las células pueden cultivarse primero en una fase de crecimiento, bajo condiciones ambientales que maximizan la proliferación celular y viabilidad, después se transfieren a una fase de producción, bajo condiciones que maximizan la producción de polipéptido. Las fases de producción y crecimiento pueden precederse por , o separarse por, una o más fases de transición. En procesos de múltiples fases los métodos de acuerdo a la presente invención se emplean al menos durante la fase de producción. Una fase de crecimiento puede ocurrir a una temperatura más alta que una fase de producción. Por ejemplo, una fase de crecimiento puede ocurrir a una primer temperatura desde aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C, y una fase de producción puede ocurrir a una segunda temperatura desde aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C, opcionalmente de aproximadamente 30°C a aproximadamente 33°C. Los inductores químicos de producción de polipéptido, tal como, por ejemplo, ácidos carboxílicos aromáticos, acetamidas, y/o ácidos hidroxámicos (así como también, opcionalmente, otros inductores) pueden agregarse al mismo tiempo como, antes y/o después a un cambio de temperatura. Si los inductores se agregan después de un cambio de temperatura, pueden agregarse de una hora a cinco días después del cambio de temperatura, opcionalmente de una dos días después del cambio de temperatura. Después de la inducción utilizando los métodos de la invención, el polipéptido expresado resultante puede entonces recolectarse. Además, el polipéptido puede purificarse, o purificarse parcialmente, de tal cultivo o componente (por ejemplo, de medio de cultivo o extractos celulares o fluido corporal) utilizando procesos conocidos. Por "parcialmente purificado" se entiende que algún procedimiento de fraccionamiento, o procedimientos, se ha llevado a cabo, pero que más especies de polipéptido (al menos 10%) del polipéptido deseado está presente. Por "purificado" se entiende que el polipéptido es esencialmente homogéneo, es decir, menos de 1 % de polipéptidos contaminantes están presentes. Los procedimientos de fraccionamiento pueden incluir pero no limitarse a una o más etapas de filtración, centrifugación, precipitación, separación de fase, purificación de afinidad, filtración de gel, cromatografía de intercambio de ión, cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC; utilizando tales resinas como éter de fenilo, éter de butilo, o éter de propilo), HPLC, o alguna combinación de arriba. Por ejemplo, la purificación del polipéptido puede incluir cualquier columna una columna de afinidad que contiene agentes que se unirán al polipéptido, uno o más etapas de columna sobre tales resinas de afinidad como A-agarosa de concanavalin, heparin-TOYOPEARL® (Toyo Soda Manufacturing Co. , Ltd., Japón) o Cibracom azul 3GA SEPHAROSE® (Pharmacia Fine Chemicals, Inc. , New York); una o más etapas incluyendo elución; y/o cromatografía de ¡nmunoafinidad. El polipéptido puede expresarse como un polipéptido de fusión, tal como aquellos de polipéptido de unión de maltosa (MBP), glutationa-S-transferasa (GST), o tioredoxina (TRX). Los equipos para expresión y purificación de tales polipéptidos de fusión se encuentran comercialmente disponibles de New England BioLab (Beverly, ass), Pharmacia (Piscataway, N.J. ) e InVitrogen, respectivamente. El polipéptido puede marcarse con un epítopo y purificarse subsecuentemente al utilizar un anticuerpo específico dirigido a tal epítopo. Tal epítopo (FLAG®) se encuentra comercialmente de Kodak (New Haven, Conn.). También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende una proteína de unión de polipéptido, tal como un anticuerpo monoclonal al polipéptido recombinante, para purificar por afinidad polipéptidos expresados. Otros tipos de etapas de purificación por afinidad pueden ser una columna de Proteína G o Proteína A, cuyos agentes de afinidad se unen a proteínas que contienen dominios Fe. Los polipéptidos pueden removerse de una columna de afinidad utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, en un regulador de elución rico en sal y después dializarse en un regulador bajo en sal para utilizarse o al cambiar pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada, o puede removerse competitivamente utilizando el substrato que ocurre de manera natural de la porción de afinidad. El grado deseado de pureza final depende del uso propuesto del polipéptido. Un grado relativamente alto de pureza se desea cuando el polipéptido esta por administrarse in vivo, por ejemplo. En tal caso, los polipéptidos se purifican de manera que ninguna banda de polipéptido correspondiente a otros polipéptidos es detectable en el análisis por SDS-electroforesis de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Se reconocerá por un experto en el campo pertinente que múltiples bandas correspondientes al polipéptido pueden visualizarse por SDS-PAGE, debido a glucosilación diferencial, procesamiento postr-traslacional diferencial, y lo similar. Opcionalmente, el polipéptido de la invención se purifica para homogeneicidad substancial, como se indica por una banda de polipéptido única en análisis por SDS-PAGE. La banda de polipéptido puede visualizarse por coloración de plata, coloración azul Coomasie, o (si el polipéptido se radiomarca) por autoradiografía. La invención también comprende especialmente formular además los polipéptidos. Por el término "formulación" se entiende que los polipéptidos pueden intercambiarse por regulador, esterilizarse, empaquetarse en volumen, y/o empaquetarse para un usuario final. Para propósitos de la invención, el término "forma en volumen estéril" significa que una formulación está libre, o esencialmente libre, de contaminación microbiana (a tal grado que sea aceptable para propósitos alimenticios y/o medicamentos) y es de concentración y composición definida. El término "forma de dosis única estéril" significa una forma que es apropiada para el cliente y/o consumo o administración del paciente. Tales composiciones pueden comprender una cantidad efectiva del polipéptido, en combinación con otros componentes tales como un diluyente fisiológicamente aceptable, vehículo o excipiente. El término "fisiológicamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del(los) ingrediente(s) activo(s). Las formulaciones adecuadas para administración incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener anti-oxidantes, reguladores, bacteroestatos, y solutos que vuelven a la formulación isotónica con la sangre del recipiente; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes de espesamiento. Los polipéptidos pueden formularse de acuerdo a métodos conocidos utilizados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Pueden combinarse en mezcla, ya sea como el material activo único o con otros materiales activos conocidos adecuados para una indicación dada, con diluyentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, salina, Tris-HCI, acetato, y soluciones reguladas por fosfato), conservadores (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emulsificadores, solubilizadores, adyuvantes y/o vehículos. Las formulaciones adecuadas para composiciones farmacéuticas incluyen aquellas descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Company, Easto, PA. Además, tales composiciones pueden componerse con polietilenglicol (PEG), iones de metal, o incorporarse en compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poliglucólico, hidrogeles, dextran, etc., o incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, esferoblastos o espíritus de eritrocito.

Los lípidos adecuados para formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfatidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, y lo similar. La preparación de tales formulaciones liposomales se encuentra dentro del nivel de experiencia en la materia, como se trata, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nos. 4,235,871 , 4,501 ,728, 4,837,028 y 4,737,323. Tales composiciones influenciarán el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación ¡n vivo, y velocidad de despejo in vivo, y de esta manera se eligen de acuerdo a la aplicación propuesta, de manera que las características del vehículo dependerán de la vía de administración seleccionada. Las formas de liberación continua adecuadas para utilizarse incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos que se encapsulan en un polímero biocompatible que se disuelve lentamente (tal como las micropartículas de alginato descritas en la Patente de EE.UU. No. 6,036,978), mezcladas con tal polímero (incluyendo hidrogeles tópicamente aplicados) y o incluidos en un implante semi-permeable o biocompatible. La invención habiéndose descrito, los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración, y sin limitación. Ejemplo 1 : Resultados utilizando 0.5 mM de ácido hidrocinámico Las células CHO se transfectan con un vector de expresión que coloca el gen que codifica el gen reportador fluorescente DsRed (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) bajo el control de un sistema promotor EASE/CMV como se describe en la Patente de EE.UU. No. 6,027,915, incorporada para referencia en la presente. Los grupos de células se seleccionan en medio GHT para presencia del vector de expresión, y después se colocan en un formato de 96 cavidades en medio libre de suero. El ácido hidrocinámico se agrega a cavidades de prueba en 0.5 milimolares, la temperatura reducida de 37°C a 31 °C, y el cultivo continúo por 6 días a la temperatura reducida. La fluorescencia DsRED se analiza en un lector de microplaca multietiqueta Wallac Victor2 (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA). De un total de 3 experimentos, hubo un incremento promedio del 60% en expresión DsRed por célula viable relativa al control. La capacidad de inducción de este compuesto se prueba entonces en un formato diferente en una proteína recombinante diferente. En este caso, las células fueron una estirpe de célula CHO que expresa una forma soluble del receptor IL-1 tipo II (ver Patente de EE.UU. No. 6,521 ,740, incorporada para referencia en la presente). Las células se desarrollan en medio libre de suero en matraces de agitación, ácido hidrocinámico se agrega a una concentración de 01.5 milimolar, y la incubación se continúa a 31 °C por 9 a 10 días. De un total de 5 experimentos, el incremento promedio en expresión ILRII relativa al control fue del 22%. Otra estirpe de célula probada fue una célula CHO que expresa una forma soluble de un receptor TNF, TNFR:Fc (Patente de EE.UU. No. 5,605,690, incorporada en la presente para referencia). Después de desarrollar las células a 37°C en medio que contiene suero, las células se cambian a matraces de agitación que contiene medio libre de suero y 0.5 mM de ácido hidrocinámico y se incuban por 7 días más bajo estas condiciones de inducción a una temperatura reducida. Al final del periodo de incubación, las células desarrolladas en medio que contiene ácido hidrocinámico mostró un 20% de incremento en expresión TNFR:Fc relativa a las células de control. Además, los grupos de células CHO transfectadas con un vector de expresión que codifica un anticuerpo contra el receptor IL4 se prueban (ver, Patente de EE.UU. No. 5,717,072, incorporada en la presente para referencia). Los grupos no amplificados se colocan en medio libre de suero en placas de 96 cavidades y se incuban con inductor por 4 días a 37°C. En un total de 3 experimentos diferentes, los grupos expuestos a ácido hidrocinámico mostraron un incremento promedio del 5% en expresión de anticuerpo relativa al control. Ejemplo 2: Resultados utilizando 0.5 mM de ácido 3-(4-metilfeniDpropiónico Los grupos de células CHO se transfectan con un vector de expresión que coloca el gen que codifica el gen reportador fluorescente DsRed descrito arriba en el Ejemplo 1 , también se prueban por inducción por 0.5 mM de ácido 3-(4-metilfenil)propiónico en un formato de 96 cavidades. Los grupos se incuban por 6 días a 31 °C. En al menos 3 experimentos diferentes, los grupos incubados con ácido 3-(4-metilfenil)propiónico promediaron un incremento del 70% en expresión DsRed por célula viable relativa al control. La capacidad de inducción de este compuesto se confirma entonces en un formato de matraz de agitación utilizando la estirpe de célula CHO que expresa una forma soluble del receptor IL1 tipo I I. Las células se desarrollan en medio libre de suero en matraces de agitación, ácido 3-(4-metilfen¡l)propiónico se agrega a una concentración de 0.5 milimolar, y la incubación continuó a 31 °C por 9 a 10 días. En un total de 2 experimentos, el incremento promedio en expresión IL1 RII relativa al control fue del 15%. Ejemplo 3: Resultados utilizando 0.5 mM de ácido 4-fenilbutírico Los grupos de las células CHO se transfectan con un vector de expresión que coloca el gen codificando el gen reportador fluorescente DsRed descrito arriba en el Ejemplo 1 , también se prueban para inducción por 0.5 mM de ácido 4-fenilbutírico en un formato de 96 cavidades. Los grupos se incuban por 6 días a 31 °C. En 3 experimentos diferentes, los grupos incubados con ácido 4-fenilbutírico promediaron un incremento del 60% en expresión de DsRed por célula viable relativa al control. La capacidad de inducción de este compuesto se confirma entonces en un formato de matraz de agitación utilizando la estirpe de célula CHO que expresa una forma soluble del receptor IL-1 tipo II. Las células se desarrollaron en medio libre de suero en matraces de agitación, ácido 4-fenilbutírico se agrega a una concentración de 0.5 milimolares, y la incubación continuó a 31 °C por 9 a 10 días. La estirpe de célula desarrollada en la presencia de ácido 4-fenilbutírico incremento la expresión IL1 RII relativa al control por 21 %. Ejemplo 4: Resultados utilizando 0.5 mM de ácido 4-(4-aminofeniObutírico Los grupos de las células CHO se transfectan con un vector de expresión que coloca el gen codificando el gen reportador fluorescente DsRed descrito arriba en el Ejemplo 1 , también se prueban para inducción por 0.5 mM de ácido 4-(4-aminofenil)butír¡co en un formato de 96 cavidades. Los grupos se incuban por 6 días a 31 °C. En 3 experimentos diferentes, los grupos incubados con ácido 4-(4-aminofenil)butírico promediaron un incremento del 70% en expresión de DsRed por célula viable relativa al control. La capacidad de inducción de este compuesto se confirma entonces en un formato de matraz de agitación utilizando la estirpe de célula CHO que expresa una forma soluble del receptor IL-1 tipo I I. Las células se desarrollaron en medio libre de suero en matraces de agitación, ácido 4-(4-aminofenil)butírico se agrega a una concentración de 0.5 milimolares, y la incubación continuó a 31 °C por 9 a 10 días. En 3 experimentos, la estirpe de célula desarrollada en la presencia de ácido 4-(4-aminofenil)butírico incremento la expresión IL1 RII relativa al control por un promedio del 22%. Ejemplo 5: Resultados utilizando 0.5 mM de ácido 5-fenilvalérico Los grupos de las células CHO se transfectan con un vector de expresión que coloca el gen codificando el gen reportador fluorescente DsRed descrito arriba en el Ejemplo 1 , también se prueban para inducción por 0.5 mM de ácido 5-fenilvalérico en un formato de 96 cavidades. Los grupos se incuban por 6 días a 31 °C. En 3 experimentos diferentes, los grupos incubados con ácido 5-fenilvalérico promediaron un incremento del 40% en expresión de DsRed por célula viable relativa al control. La capacidad de inducción de este compuesto se confirma entonces en un formato de matraz de agitación utilizando la estirpe de célula CHO que expresa una forma soluble del receptor IL-1 tipo II. Las células se desarrollaron en medio libre de suero en matraces de agitación, ácido 5-fenilvalérico se agrega a una concentración de 0.5 milimolares, y la incubación continuó a 31 °C por 9 a 10 días. La estirpe de célula desarrollada en la presencia de ácido 5-fenilvalérico incremento la expresión IL1 RII relativa al control por 44%. Otra estirpe de célula probada fue la célula CHO que expresa TNFR:Fc (etarnecept) descrita arriba en el Ejemplo 1. Después de desarrollar las células a 37°C en medio que contiene suero, las células se cambian a matraces de agitación que contienen medio libre de suero y 0.5 milimolar de ácido 5-fenilvalérico e incuban por un adicional de 7 días bajo estas condiciones de inducción a una temperatura reducida. Al final del periodo de incubación, las células desarrolladas en medio conteniendo ácido 5-fenilvalérico mostraron un incremento del 33% en expresión TNFR:Fc relativa a las células de control. Además, los grupos de células CHO transfectadas con un vector de expresión codificando un anticuerpo contra el receptor IL-4 se prueban. Los grupos no amplificados se colocan en una placa de 96 cavidades y se incuban con inductor por 4 días a 37°C. En un total de 2 experimentos diferentes, los grupos expuestos a ácido 5-fenilvalérico mostraron un promedio de 40% de incremento en la expresión de anticuerpo relativa al control. La mayoría de este incremento ocurrió al final del día de cultivo ya que no hubo incremento en el día 3. Ejemplo 6: 1 .0 Mm de A/-butilacetamida Los grupos de células CHO transfectadas con un vector de expresión que coloca el gen que codifica el gen reportador fluorescente DsRed descritos arriba en el Ejemplo 1 , también se probaron por inducción para 1.0 milimolar de /V-butilacetamida en un formato de 96 cavidades. Los grupos se incuban por 6 días a 31 °C. En 2 experimentos diferentes, los grupos incubados con ácido N-butilacetamida promediaron un 77% de incremento en expresión DsRED por célula viable relativa al control. Ejemplo 7: 10/20 uM de ácido hexanohidroxámico (HHA) Los grupos de células CHO transfectadas con un vector de expresión que coloca el gen codificando el gen reportador fluorescente DsRed descrito arriba en el Ejemplo 1 , también se prueban para inducción por 10 micromolares de ácido hexanohidroxámico (HHA) en un formato de 96 cavidades. Los grupos se incuban por 6 días a 31 °C. Los grupos incubados con HHA mostraron un incremento del 48% en expresión DsRed relativa al control. La capacidad de inducción de este compuesto se confirma entonces en un formato de matraz de agitación utilizando la estirpe de célula CHO que expresa una forma soluble del receptor I L-1 tipo II . Las células se desarrollaron en medio libre de suero en matraces de agitación, HHA se agrega a una concentración de 10 micromoiares, y la incubación continuó a 31 °C por 9 días. La estirpe de célula desarrollada en la presencia de 10 micromoiares de HHA incremento la expresión IL1 RII relativa al control por 19%. Otra estirpe de célula probada fue la célula CHO que expresa TNFR:Fc (etarnecept) descrita arriba en el Ejemplo 1 . Después de desarrollar las células a 37°C en medio que contiene suero, las células se cambian a matraces de agitación que contienen medio libre de suero y HHA se agrega a ya sea 10 micromoiares o 20 micromoiares e incuban por un adicional de 7 días bajo estas condiciones de inducción a una temperatura reducida. Al final del periodo de incubación, las células desarrolladas en medio conteniendo 10 micromoiares de HHA mostraron un incremento del 19% en expresión TNFR:Fc relativa a las células de control, mientras que aquellos desarrollados en 20 micromoiares de HHA mostraron un incremento del 11 % en expresión TNFR:Fc relativa a las células de control. Además, los grupos de células CHO transfectadas con un vector de expresión codificando un anticuerpo contra el receptor IL4 se prueban. Los grupos no amplificados en medio libre de suero se colocan en una placa de 96 cavidades y se incuban con inductor por 4 días a 37°C. En un total de 2 experimentos diferentes, los grupos expuestos a HHA no tuvieron un incremento significativo en la expresión de anticuerpo relativa al control. Ejemplo 8: 10 uM HHA más 1 mM H BA En estos experimentos, una combinación de dos diferentes inductores se utilizan. Como puede observarse a partir de los resultados de abajo, la combinación de inductores de diferentes clases puede resultar en mayores incrementos o inducción que el aditivo. Los grupos de células CHO transfectadas con un vector de expresión que coloca el gen que codifica el gen reportador fluorescente DsRed descrito arriba en el Ejemplo 1 , también se prueban para inducción por 10 micromolares de HHA y 1 milimolar de H BA en un formato de 96 cavidades. Los grupos se incuban por 6 días a 31 °C. Los grupos incubados con solo HMBA mostraron un incremento del 20%, mientras que los grupos incubados con la combinación de HHA y HMBA mostraron un incremento del 98% en expresión DsRed relativa al control. Como se observa en el ejemplo 7, HHA solo resulta únicamente en un incremento del 48%. De esta manera, estos dos compuestos tienen al menos un efecto de aditivo cuando se utilizan en combinación. Los datos de un experimento similar en el cual las células se incuban a varias concentraciones de HHA y HMBA se ilustran en la figura 1. Como puede observarse a partir de esta gráfica, las concentraciones de HHA de aproximadamente 5 micromolares a aproximadamente 100 micromolares, y concentraciones de HMBA de aproximadamente 0.5 milimolares a aproximadamente 10 milimolares cuando se utilizan individualmente podrían incrementar la expresión del marcador fluorescente DsRed. Cuando estos compuestos se combinan, sin embargo, la expresión se incrementó significativamente más. Otra estirpe de célula probada fue la célula CHO que expresa TNFRrFc (etanercept) descrita arriba en el Ejemplo 1 . Después de desarrollar las células a 37°C en medio que contiene suero, las células se cambian a matraces de agitación que contiene medio libre de suero. HHA se agrega a 10 micromolares y H BA se agrega a 1 milimolar, y las células se incuban por un adicional de 7 días bajo estas condiciones de inducción a una temperatura reducida. Al final del periodo de incubación, las células desarrolladas en medio conteniendo 1.0 milimolar HMBA mostraron un incremento del 14% en expresión de TNFRrFc relativa a las células de control, aunque aquellas desarrolladas en la combinación de 10 micromolares de HHA más 1 .0 milimolar de HMBA mostraron un incremento del 26% en expresión de TNFR:Fc relativa a las células de control. Además, los grupos de células CHO .transfectadas con un vector de expresión que codifican un anticuerpo contra el receptor IL4 se prueban. Los grupos sin amplificar se colocan en medio libre de suero en placas de 96 cavidades y se incuban con 10 micromolares de HHA más 1.0 milimolares de HMBA por 4 días a 37°C. En 2 experimentos diferentes, los grupos expuestos a la combinación de 10 micromolar de HHA más 1 .0 milimolar de HMBA mostraron un incremento del 32% en la expresión de anticuerpo relativa al control. Sin embargo, cuando cualquier compuesto se utiliza de manera individual, no existe incremento significativo en expresión del anticuerpo. Este resultado sugiere que estos compuestos pueden actuar sinergísticamente para incrementar la expresión de proteína recombinante. Ejemplo 9: 10 uM de ácido 3-fenilpropionohidroxámico más 1 m de HMBA Los grupos de células CHO transfectados con un vector de expresión que codifica un anticuerpo contra el receptor IL4 se prueban con otra combinación de compuestos, en este caso, 10 micromolares de ácido 3-fenilpropionohidroxámico más 1 milimolar de HMBA. Los grupos no amplificados se colocan en medio libre de suero en placas de 96 cavidades e incuban con esta combinación por 4 días a 37°C. Los grupos expuestos a la combinación de ácido 3-fenilpropionohidroxámico más 1 milimolar de HMBA mostraron un incremento del 40% en expresión de anticuerpo relativa al control. Sin embargo, cuando cualquier compuesto se utiliza individualmente, no existe un incremento significativo en expresión de anticuerpo. Este resultado, especialmente cuando se toma en combinación con el resultado del Ejemplo 8, sugiere que una combinación de una acetamida y un compuesto de ácido hidroxámico puede actuar sinergísticamente para incrementar la expresión de proteína recombinante. La descripción anterior de modalidades específicas revela la naturaleza general de la invención de manera que otros pueden modificar y/o adaptar fácilmente tales modalidades para varias aplicaciones sin apartarse de los conceptos genéricos presentados en la presente. Cualquiera de tales adaptaciones o modificaciones se propone para incluirse dentro del significado y rango de equivalentes de las modalidades descritas. La fraseología y terminología empleadas en la presente son para el propósito de descripción y no de limitación.

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Un método que comprende: cultivar una célula de mamífero en un medio de cultivo que contiene un compuesto de ácido carboxílico aromático, en donde la célula de mamífero secreta un polipéptido de interés y en donde la presencia del compuesto de ácido carboxílico aromático incrementa la producción del polipéptido de interés; y separar el polipéptido de interés de la célula de mamífero.
2. Un método que comprende: cultivar una célula de mamífero en un medio de cultivo que contiene un compuesto de acetamida polar no híbrido, en donde la célula de mamífero secreta un polipéptido de interés y en donde la presencia del compuesto de acetamida incrementa la producción del polipéptido de interés; y separar el polipéptido de interés de la célula de mamífero.
3. Un método que comprende: cultivar una célula de mamífero en un medio de cultivo que contiene un compuesto de ácido hidroxámico, en donde la célula de mamífero secreta un polipéptido de interés y en donde la presencia del compuesto de ácido hidroxámico incrementa la producción del polipéptido de interés; y separar el polipéptido de interés de la célula de mamífero.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo además disminuir la temperatura del medio de cultivo a una temperatura de menos de 37°C.
5. El método según la reivindicación 4, caracterizado porque la temperatura se disminuye a aproximadamente 29°C a aproximadamente 34°C.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la célula de mamífero expresa el polipéptido de interés bajo el control de un promotor CMV.
7. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el compuesto de ácido carboxílico aromático se selecciona del grupo que consiste de ácido hidrocinámico, ácido 3-(4-metilfenil)propiónico, ácido 4-fenilbutírico, ácido 4-(4-aminofenil)butírico, ácido 3-(4-aminofenil)propiónico; ácido 3-(4-fluorofenil)propiónico; ácido 2-tienilacético, y ácido 5-fenilvalérico.
8. El método según la reivindicación 2, caracterizado porque el compuesto de acetamida es N-butilacetamida.
9. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque el compuesto de ácido hidroxámico es ácido hexanohidroxámico (HHA) y/o ácido 3-fenilpropionohidroxámico.
10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido de fusión recombinante.
11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el polipéptido es un anticuerpo humanizado o humano.
12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la concentración del compuesto de ácido carboxílico aromático, el compuesto de acetamida, o el compuesto de ácido hidroxámico en el cultivo es de aproximadamente 0.001 milimolar a aproximadamente 3 milimolares.
13. El método según la reivindicación 1 , comprendiendo además agregar un compuesto de acetamida al cultivo.
14. El método según la reivindicación 13, caracterizado porque el compuesto de acetamida es hexametilenobisacetamida (HMBA) y/o N-butilacetamida.
15. El método según la reivindicación 1 , que comprende además agregar un compuesto de ácido hidroxámico al cultivo.
16. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto de ácido hidroxámico es ácido hexanohidroxámico (HHA), ácido benzohidroxámico, ácido octano-1 ,8-dihidroxámico y/o ácido 3-fenilpropionohtdroxámico.
17. El método según la reivindicación 2, comprendiendo además agregar un compuesto de ácido hidroxámico al cultivo.
18. El método según la reivindicación 17, caracterizado porque el compuesto de ácido hidroxámico es ácido hexanohidroxámico (HHA) y/o ácido 3-fenilpropionohidroxámico.
19. El método según la reivindicación 3, que comprende además un compuesto de acetamida al cultivo.
20. El método según la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto de acetamida es hexametilenobisacetamida (H BA) y/o N-butilacetamida.
21. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula CHO.
22. El método según la reivindicación 21 , caracterizado porque la célula CHO se expone al compuesto de ácido carboxílico aromático, el compuesto de acetamida polar no híbrida, o el compuesto de ácido hidroxámico por al menos aproximadamente 5 días.
23. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio de cultivo está libre de suero.
24. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo además purificar el polipéptido.
25. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la célula de mamífero se cultiva en una fase de crecimiento a una primer temperatura desde aproximadamente 35°C a aproximadamente 38°C antes de que se cambie a una fase de producción a una segunda temperatura de aproximadamente 29°C a aproximadamente 36°C y en donde el compuesto de ácido carboxílico aromático, el compuesto de acetamida polar no híbrida, o el compuesto de ácido hidroxámico se agrega después del cambio a la fase de producción.
26. Un método para producir un polipéptido recombinante que comprende: cultivar una célula CHO que se ha realizado genéticamente para producir el polipéptido recombinante; y agregar al medio de cultivo al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de un ácido carboxílico aromático, una acetamida polar no híbrida, y un ácido hidroxámico, en donde la adición del compuesto incrementa la producción del polipéptido recombinante.
27. El método según la reivindicación 26, caracterizado porque la célula CHO es la progenie de una célula que se ha transformado con un vector recombinante que codifica el polipéptido recombinante y en donde el vector recombinante comprende un promotor CMV.
28. El método según la reivindicación 26, caracterizado porque el compuesto se agrega al medio de cultivo a una concentración de desde aproximadamente 0.001 milimolar a aproximadamente 3 milimolares.
29. El método según la reivindicación 26, comprendiendo además recolectar el polipéptido recombinante del medio.
30. El método según la reivindicación 29, comprendiendo además formular el polipéptido recombinante.
31 . El método según la reivindicación 29, comprendiendo además múltiples adiciones del compuesto.
32. El método según la reivindicación 26, caracterizado porque la célula CHO se cultiva a una temperatura desde aproximadamente 29°C a aproximadamente 35°C.
33. El método según la reivindicación 32, caracterizado porque la célula CHO se cultiva a una primer temperatura desde aproximadamente 36°C a aproximadamente 38°C antes de que se cambie a una segunda temperatura desde aproximadamente 29°C a aproximadamente 35°C y en donde el compuesto se agrega después del cambio de la primer temperatura a la segunda temperatura.
34. Un cultivo que comprende una célula CHO genéticamente realizada para producir un polipéptido, un medio de producción, y al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de un ácido carboxíiico aromático, una acetamida polar no híbrida, y un ácido hidroxámico.
35. El cultivo según la reivindicación 34, caracterizado porque la concentración del compuesto es de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 3 milimolares.
36. El cultivo según la reivindicación 34, caracterizado porque el medio de producción está libre de suero.