DE69032816T2 - Verwendung von oncostatin m zur suppression von mhc antigenen - Google Patents

Verwendung von oncostatin m zur suppression von mhc antigenen

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines kürzlich entdeckten Zytokins, Oncostatin M, zur Hemmung der Immunogenizität endothelialen Gewebes und zur Verbesserung der Wahrscheinlichkeit eines funktionellen Erfolgs von transplantierten Organen. Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet die Verwendung reifer, hybrider, veränderter oder gekürzter, ebenso wie analoger Formen von Oncostatin M. Die Erfindung wird anhand von Beispielen beschrieben, in welchen die Wirksamkeit solcher Zusammensetzungen unter Verwendung verschiedener in vitro-Versuchssysteme beurteilt wird.
    • 2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG EXPRESSION VON HAUPTHISTOKOMPATIBILITÄTS-ANTIGENEN UND DEREN BEZIEHUNG ZUR IMMUNANTWORT
  • Oberflächenexprimierte Proteine des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) sind für die Einleitung und die Effektorfunktionen der Immunantwort unerläßlich. Die Einleitung der Immunfunktionen durch CD4+ T-Zellen (Helfer-Zellen) scheint eine MHC-Antigen-Präsentation der Klasse II zu benötigen, während zytotoxische Effektorfunktionen durch CD8+ T-Zellen (zytotoxische T-Lymphozyten oder CTLs) wohl eine MHC-Antigen-Präsentation der Klasse I erforderlich machen. Es ist bekannt, daß die Zelloberflächenexpression von MHC- Proteinen mit humanen Autoimmun- und Alloimmunkrankheiten in Zusammenhang steht (Übersicht in Felduran et al., in Interferon 9 : 75-90, Academic Press 1987). Gewebezellen bei der Mehrzahl der humanen Autoimmunkrankheiten, einschließlich beispielsweise Thyreoiditis, Diabetes, Multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, Sjörgen-Syndrom, Vasculitis, biliäre Zirrhose und immunologisch bedingte Hauterkrankungen, ebenso wie weisen eine abnormal erhöhte Expression an MHC-Antigenen der Klas se I und II auf. Wenn Zellen, die gewöhnlich keine Klasse II-Antigene exprimieren (z. B. Fibroblasten und Endothelzellen), beginnen, diese Klasse von Antigenen zu exprimieren, werden sie zu Zielzellen einer immunvermittelten Lyse und Destruktion durch CTLs (Pober et al., 1983, Nature 305: 726).
  • Die MHC-Antigen-Expression wird auf vielen Zellarten weitgehend durch verschiedene Zytokine kontrolliert. Zellen, wie beispielsweise Makrophagen, Hautfibroblasten, Keratinozyten, Thyreozyten, Astrozyten, B-Inselzellen, glatte Muskelzellen, T-Lymphozyten, Endothelzellen und viele Krebszellen, benötigen für die MHC Klasse II-Antigen-Expression die Induktion durch Zytokine (Revel and Schattner, in Autoimmunity and Autoimmune Disease 223-233, Wiley 1987). Mitglieder der Interferon-Familie sind in erster Linie an der Hochregulierung der MHC-Expression beteiligt, und alle Arten von Interferonen scheinen die Klasse I-Expression zu erhöhen, obwohl in diesem Zusammenhang IFN-γ das am besten untersuchte und wirksamste Interferon ist. Des weiteren haben die als Tumor-Nekrose-Faktoren bekannten Zytotoxine (TNF-α und TNF-β) gezeigt, daß sie die Klasse I-Expression in Fibroblasten über die Induktion von IFN-β2 erhöhen können (May et al., 1987, Proc. Natl. Acad Sci. USA 83 : 8957). Während die Induktion von Klasse II-Antigenen durch IFN-α und IFN-β gewöhnlich nicht bedeutsam ist, ist IFN-γ ein starker Induktor von Klasse II-Molekülen auf der Gen-Ebene (Collins et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4917). Einige Zytokine scheinen bei der Induktion einer MHC-Antigen-Expression mit IFN-γ zusammenzuwirken; zum Beispiel wirken bei der Expression von Klasse I-Antigenen auf Endothelzellen TNF-α und TNF-β mit IFN-γ synergistisch, ohne die durch IFN-γ vermittelte Induktion von Klasse II- Antigenen zu beeinflussen (Lapierre et al., 1988, J. Exp. Med. 167 : 794).
  • Das Ausmaß der MHC-Antigen-Expression auf einer Zelloberfläche bestimmt das Vermögen zur Antigen-Präsentation (Matis et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6090).
  • Aufgrund dessen können Zusammensetzungen, die eine Überexpression von MHC-Antigenen über die immunologisch tolerierte Schwelle hinaus beeinflussen oder ihr entgegenwirken, einen therapeutischen Nutzen haben, wie beispielsweise zur Verlangsamung oder Hemmung der Progression von Autoimmunkrankheiten. Im Fall von transplantierten Organen bestimmt das Ausmaß der Expression von MHC-Antigenen des Spenders die Schwere der Abstoßungsreaktion (Ferry et al., 1987, Transplantation 44 : 499). Es wurde gezeigt, daß der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) das Ausmaß der durch IFN-γ induzierten Klasse II-Expression bei humanen Melanomzellen und mononukleären Zellen des peripheren Blutes hemmt, ohne die Klasse I-Expression zu beeinträchtigen (Czarniecki et al., 1988, J. Immunol. 140 : 4217).
    • 2.1.2 EXPRESSION VON MHC-ANTIGENEN AUF ENDOTHELZELLEN: ZUSAMMENHANG MIT DER TRANSPLANTATABSTOSSUNG
  • Bei der Transplantatabstoßungsreaktion spielen vaskuläre Endothelzellen eine wichtige Rolle. Immunhistologische Studien zur Gewebeabstoßung haben gezeigt, daß vaskuläre Endothelzellen von MHC-inkompatiblen Herz- oder Hauttransplantaten zu einem frühen Zeitpunkt des Abstoßungsprozesses MHC Klasse II-Antigene in großem Ausmaß exprimieren (De Waal et al., 1983, Nature 303 : 426-429; Milton and Fabre, 1985, J. Exp. Med. 161 : 98-112). Zu Beginn umfaßt die immunologische Abstoßung von Allotransplantaten die Interaktion zwischen Empfänger-T-Zellen und der Gefäße des Spenderorgans; bei Fortschreiten des Prozesses werden weitere Zellen beteiligt. Bei Organtransplantaten stellt das Endothel das Spendergewebe dar, welches das erste Angriffsziel der Empfänger-T-Zellen ist, die auf der Oberfläche der Endothelzellen HLA-Antigene des Spenders erkennen. Die T-Zell- Infiltration durch das vaskuläre Endothel wurde als ein in vier Schritten ablaufender Prozeß beschrieben: Erkennen, Adhärenz, Aktivierung und Penetration der alloaktivierten T-Zellen durch die Gefäßwand (Fung et al., 1986, Human Immunol. 16 : 182). Aktivierte T-Zellen produzieren Interferon-Gamma (IFN-γ), das die Expression von HLA-Antigenen der Klasse II auf der Oberfläche des Spender-Endothels stimuliert, wodurch das Spender-Endothel in einen immunogeneren Zustand verwandelt wird. Eine erhöhte Expression von Klasse I-Antigenen resultiert auch aus einer Induktion durch Gamma-IFN und TNFs, was das Endothel wahrscheinlich verstärkt zum Angriffsziel für zytotoxische T-Lymphozyten macht. In zum frühen Zeitpunkt durchgeführten Biopsien abgestoßener Nierentransplantate überwiegen T-Zellen, die für Klasse I-HLA-Antigene spezifisch sind; nach Fortschreiten der Abstoßung herrschen T-Zellen vor, die für Klasse II- HLA-Antigene spezifisch sind (Zeevi et al., 1986, Transplantation 41 : 620). Bei Herztransplantaten wurden ähnliche Ergebnisse gefunden. Das Ausmaß einer Alloimmunantwort, und letztendlich der Abstoßung, hängt von der Expression von HLA-Molekülen sowohl der Klasse I als auch der Klasse II ab, und sogar geringe Reduktionen des Ausmaßes ihrer Expression führen zu wesentlich verbesserten Ergebnissen.
  • Endothelzellen stellen ein gutes Modell für die Untersuchung der Zytokin-Regulation der MHC-Expression in vitro dar, da diese Zellen einfach aus primärem Gewebe zu gewinnen sind und von ihnen bekannt ist, daß sie nach einer Behandlung mit Zytokinen als Antigen-präsentierende Zellen wirken. Kultivierte humane umbilikale Endothelzellen (HUVECs) exprimieren unter normalen Kulturbedingungen konstitutiv MHC (HLA)-Antigene der Klasse I, jedoch nicht der Klasse II. Alpha- und Beta-Interferone (IFN-ct, IFN-β), ebenso wie Alpha- und Beta-Tumor-Nekrose-Faktoren. (TNF-α, TNF-β) erhöhen das Ausmaß der Klasse I-HLA-Expression auf humanen umbilikalen Endothelzellen, ohne das der Klasse II- HLA zu beeinflussen (Collins et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 38 : 446; Pober et al., 1987, J. Immunol. 138 : 3319). Nur Gamma-Interferon (IFN-γ) ist in der Lage, die HLA-Expression sowohl der Klasse I als auch der Klasse II hochzuregulieren (Geppert and Lipsky, 1985, J. Immunol. 135 : 3750). Die Zytokin-Behandlung von humanen umbilikalen Endothelzellen hat sowohl einen erhöhten Spiegel exprimierter RNA in statischem Zustand als auch eine erhöhte Zell- Oberflächen-Expression der HLA-Antigene zur Folge (Collins et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 38 : 446). TNF-α und TNF-β wirken mit IFN-γ synergistisch bei der Erhöhung der MHC-Expression der Klasse I, ohne dabei die durch IFN-y vermittelte Klasse II-Induktion zu beeinflussen (Lapierre et al., 1988, J. Exp. Med. 167 : 794). Im Gegensatz dazu wirken weder IFN-α noch IFN-β mit IFN-γ synergistisch bei der Erhöhung der Klasse I-Expression, während beide die IFN-γ-vermittelte Induktion der Klasse II-Expression hemmen.
    • 3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es wird die Verwendung von Oncostatin M zur Kontrolle der Immunogenizität von Endothelzellen und zur Verbesserung der Wahrscheinlichkeit eines funktionellen Erfolgs transplantierter Organe beschrieben. Es kann aus natürlichen Quellen stammendes, gereinigtes Oncostatin M, rekombinantes Oncostatin M oder mittels Techniken der synthetischen Chemie hergestelltes Oncostatin M verwendet werden. Die Erfindung wird anhand von Beispielen beschrieben, in welchen die verschiedenen Wirkungen von Oncostatin M auf einzelne Zellarten unter Verwendung von in vitro-Versuchen bestimmt werden.
  • Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Oncostatin M zur Abschwächung der Immunogenizität endothelialen Gewebes, des Hauptelementes, das bei der Abstoßung allotransplantierter Organe und dem Fortschreiten bestimmter Autoimmunkrankheiten beteiligt ist. Dieser Aspekt der Erfindung wird anhand von Beispielen beschrieben, bei welchen das Vermögen von Oncostatin M zur Hemmung der Expression von MHC-Antigenen auf der Oberfläche humaner Endothelzellen in vitro dargestellt wird. Oncostatin M ist in der Lage, der durch IFN-γ und TNF-α stimulierten Expression von HLA- Antigenen der Klasse I und der Klasse II wesentlich entgegenzuwirken und scheint für die Wirkung auf Endothelzellen spezifisch zu sein.
    • 4. BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 Synergistische Wirkung vors Oncostatin M und TGF-β bei der Hemmung der durch IFN-γ induzierten Expression von HLA-Antigenen auf Endothelzellen. Oncostatin M (); TGF-β (); Oncostatin M plus TGF-β (). A: Wirkung auf die Expression von HLA-Antigenen der Klasse I. B: Wirkung auf die Expression von HLA-DR-Antigenen der Klasse II.
  • Fig. 2 Oncostatin M-Rezeptor, Bindung auf humanen umbilikalen Endothelzellen (HUVECs): Sättigungskurve, Scatchard-Diagramm und SDS-PAGE Autoradiograph (Nebenbild). Die Daten wurden entsprechend der Beschreibung in Abschnitt 6.2.4., infra, erhalten und zusammengestellt.
    • 5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Oncostatin M zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Immunogenizität endothelialen Gewebes, wodurch, wie in den Patentansprüchen 1 bis 10 definiert, die Expression von MHC-Antigenen auf Endothelzellen unterdrückt wird. Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren die Verwendung von Oncostatin M zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Wahrscheinlichkeit eines funktionellen Erfolgs von transplantierten Organen, wodurch, wie in den Patentansprüchen 11 bis 24 definiert, die Expression von MHC- Antigenen auf den Gefäßen des Spenderorgans gehemmt wird. Die Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung, daß Oncostatin M verschiedene biologische Wirkungen auf Endothelzellen vermittelt. Die Erfindung wird anhand von Beispielen beschrieben, in welchen die verschiedenen biologischen Wirkungen von Oncostatin M auf Zellen von Säugetieren unter Verwendung von in vitro-Versuchssystemen bestimmt werden. Die klinische Implikation der hier gezeigten und beschriebenen, durch Oncostatin M vermittelten biologischen Wirkungen kann eine Vielzahl therapeutischer Anwendungsmöglich keiten von Oncostatin M in Bezug auf die Human-Immunologie umfassen.
  • Oncostatin M, das ursprünglich wegen seiner hemmenden Wirkung auf humane Tumor-Zell-Linien erkannt wurde, wurde zunächst aus Phorbol 12-Myristat 13-Azetat (PMA)-induzierten humanen histiozytischen Lymphomzellen (Zarling et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 9739-9743) und aus aktivierten T-Lymphozyten (Brown et al., 1987, J. Immunol. 139 : 2977-2983) isoliert. Das Molekül ist ein hitze- und säurebeständiges Protein, das sich aus einer einzigen Polypeptidkette von Mr = 28.000 zusammensetzt. Wie andere, natürlich vorkommende Wachstumsregulatoren weist Oncostatin M eine Vielzahl biologischer Aktivitäten auf. Eine Wachstumshemmung wird bei einigen, jedoch nicht bei allen humanen Tumor-Zell-Linien beobachtet. Im Gegensatz hierzu wird das Wachstum einiger normaler Fibroblasten, wie beispielsweise humaner Vorhaut-Fibroblasten oder WI-38 Zellen unter Einwirkung von Oncostatin M stimuliert (Zarling et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 9739-9743). Das Gen für Oncostatin M wurde geklont und sequentiell geordnet, und eine aktive Form von rekombinantem Oncostatin M wurde kürzlich in Zellen von Säugetieren exprimiert (gleichzeitig anhängige Anmeldung Nr. 144 574, eingereicht am 15. Januar 1988, die durch Literaturhinweis in ihrer Gesamtheit in die vorliegende Patentanmeldung eingefügt ist). Die reife Form, nach Abspaltung des Signalpeptides, ist ein Glykoprotein, das 228 Aminosäuren enthält, von denen fünf Zysteinreste sind. Das Protein besitzt einen extrem hydrophilen carboxyterminalen Bereich. Obwohl Oncostatin M strukturell nicht mit anderen bekannten Zytokinen verwandt ist, enthält seine mRNA eine AG-reiche Region am 3' untranslatierten Ende. Diese Region in der Information von Oncostatin M ist homolog zu der vieler Zytokine, Lymphokine und anderer wachstumsregulatorischer Moleküle, was auf einen gemeinsamen Mechanismus bei der Regulation der Genexpression hindeutet. Auf einer Vielzahl von Zellen von Säugetieren wurde ein Zell-Rezeptor für Oncostatin M gefunden. Das Hauptrezeptormolekül von Oncostatin M ist ein spezifisches Protein von Mr = 150 000-160 000 (Linsley et al., 1989, J. Biol. Chem. 264 : 6528-6532).
  • Erfindungsgemäß kann Oncostatin M mittels vom Stand der Technik her bekannter Techniken aus einer Vielzahl von Zellquellen gewonnen werden, die bioaktives Oncostatin M synthetisch herstellen, einschließlich beispielsweise Zellen, die natürlich Oncostatin M produzieren, und Zellen, die einer Transfektion mit rekombinanten DNA-Molekülen unterzogen werden, die die Synthese und/oder Absonderung von Oncostatin M lenken können. Alternativ kann Oncostatin M mittels Verfahren der synthetischen Chemie, einschließlich, jedoch nicht einschränkend, der Festphasen-Peptid-Synthese, synthetisch hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Oncostatin M werden beschrieben in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung Nr. 144 574, eingereicht am 15. Januar 1988, einer Teilfortführung der Anmeldung Nr. 046 846, eingereicht am 4. Mai 1987, einer Teilfortführung der Anmeldung Nr. 935 283, eingereicht am 26. November 1986, einer Teilfortführung der Anmeldung Nr. 811 235, eingereicht am 20. Dezember 1985, wobei jede dieser Anmeldungen in ihrer Gesamtheit durch Literaturhinweis in die vorliegende Anmeldung eingefügt ist.
  • Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt die Verwendung von Oncostatin M, das mittels einer beliebigen Methode gewonnen wurde, ebenso wie die Verwendung veränderter bzw. verkürzter Oncostatin-Moleküle und analoger Oncostatin M-Verbindungen, die die gewünschte Aktivität erhalten, innerhalb des Bereichs der Erfindung. In diesem Zusammenhang liegen Veränderungen sowohl der Primärstruktur von Oncostatin M als auch Veränderungen auf höherer Ebene der strukturellen Organisation, wie beispielsweise die Art kovalenter Bindungen zwischen den Aminosäureresten und/oder die Zufügung von Gruppen an die terminalen Reste von Oncostatin M, im Rahmen der Erfindung. Zum Beispiel kann das erfindungsgemäß verwendete Molekül von Oncostatin M konservative oder nicht-konservative Veränderungen in der Aminosäuresequenz enthalten, die zu stillen Mutationen, wie beispielsweise Deletionen, Additionen und Substitutionen, führen könnten, welche die Funktionalität des Moleküls aufrechterhalten. Solche veränderten Oncostatin M-Moleküle können wünschenswert sein, wo sie gewisse Vorteile bei ihrer Verwendung bieten. Entsprechend der erfindungsgemäßen Verwendung würden konservative Substitutionen den Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren innerhalb der Sequenz von Oncostatin M mit einer anderen Aminosäure zur Folge haben, die eine ähnliche Polarität und Merkmale der Hydrophobie/Hydrophilie aufweist, was ein funktionell äquivalentes Molekül zur Folge hätte. Solche konservativen Substitutionen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Substitutionen innerhalb der nachfolgenden Gruppe von Aminosäuren: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lycin, Arginin; Phenylalanin, Tyrosin; und Methionin, Norleucin.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann Oncostatin M an Trägermoleküle gekoppelt sein. Oncostatin M könnte beispielsweise kovalent an ein Antikörpermolekül gekoppelt sein, das für Endothelzellen oder für ein anderes Zelloberflächenantigen spezifisch ist, das es Oncostatin M erlaubt, auf Zielzellen gerichtet zu werden, die dieses spezielle Antigen exprimieren. In ähnlicher Weise kann Oncostatin M an andere "auf Zielzellen gerichtete" Moleküle gekoppelt sein, wie beispielsweise Hormone, Wachstumsfaktoren, Zytokine usw. Auf diese Weise könnte das Oncostatin M- Molekül so verändert werden, daß es von Zellen aufgenommen wird, die keinen Rezeptor für das zur Verwendung gewählte spezielle Oncostatin M-Molekül exprimieren. Kopplungstechniken dieser Art sind gemäß dem Stande der Technik bekannt und können beispielsweise die Verwendung von Vernetzungsmitteln, die Bildung einer Schiffschen Base, Amidbindungen, Peptidbindungen, Sulfidbindungen usw. umfassen.
    • 5.1 ONCOSTATIN M ALS IMMUNMODULATOR
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Oncostatin M als Immunmodulator bei der Behandlung humaner Autoimmun- und Alloimmunkrankheiten. In dieser Hinsicht hat die Anmelderin durch eine Serie von Experimenten, wie beispielsweise die in Abschnitt 6 beschriebenen, et seg. entdeckt, daß Oncostatin M in der Lage ist, die Expression von HLA-Antigenen der Klasse I und II auf der Oberfläche von humanen Endothelzellen in vitro zu hemmen. Oncostatin M kann daher bei der Schwächung der Immunogenizität endothelialen Gewebes auf Helfer- und/oder Effektor-T-Lymphozyten eingesetzt werden.
    • 5.1.1 VERWENDUNG VON ONCOSTATIN M BEI DER ORGANTRANSPLANTATION
  • Da Moleküle der Klasse I das Primärziel für zytotoxische T- Lymphozyten zu sein scheinen, würde man von einer Schwächung der Klasse I-Expression erwarten, daß das Einsetzen einer starken Sekundärantwort verhindert bzw. gehemmt wird. Von vielleicht größerer Bedeutung ist die Tatsache, daß die Hemmung einer Klasse II-Expression auf Endothelzellen die Stärkung antigenspezifischer, Gamma-Interferon-ausscheidender T-Helferlymphozyten blockieren und somit der Entwicklung einer Immunantwort entgegenwirken kann. Bei einer speziellen Ausführungsform der Erfindung können Zusammensetzungen, die eine wirksame Dosis an Oncostatin M enthalten, welches in geeigneten pharmakologischen Trägersubstanzen formuliert wurde, Empfängern von Organtransplantaten, wie beispielsweise Nieren-, Herz- und Lungentransplantaten, auf einem beliebigen, geeigneten Verabreichungsweg, einschließlich jedoch nicht einschränkend der lokalen oder System- Injektion, zur Hemmung bzw. Vermeidung der Expression von HLA-Antigenen und der Abstoßung des Transplantates verabreicht werden. Des weiteren kann Oncostatin M vor der in vivo Verabreichung an ein Träger- oder auf die Zielzellen gerichtetes Molekül gekoppelt und/oder in Liposomen, Mikro kapseln und Retardpräparaten eingebaut werden. Durch eine Serie von Experimenten, wie die in Abschnitt 6, infra, beschriebenen, wurde von der Anmelderin bestimmt, daß der Expression von MHC-Antigenen der Klasse I und II auf Endothelzellen, insbesondere der durch Gamma-Interferon und Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha stimulierten Expression, durch Oncostatin M in Konzentrationen im Bereich von 1-50 ng/ml spezifisch entgegengewirkt wird. In einer Konzentration von 5 ng/ml, hemmte Oncostatin M beispielsweise eine durch IFNγ stimulierte Expression von Klasse I-Antigenen um 51% und eine durch TNF-α stimulierte Expression um bemerkenswerte 141%. Die Induktion einer Expression von Klasse II- Antigenen durch IFN-γ wurde um 84% gehemmt. Bei einer Verwendung in Kombination mit einem synergistisch wirkenden Zytokin, wie beispielsweise TGF-β, führten geringe Konzentrationen von Oncostatin M zu einer stark hemmenden Wirkung. Außerdem weisen die Forschungsdaten der Anmelderin darauf hin, daß Oncostatin M nicht in der Lage ist, eine Expression von HLA-Antigenen der Klasse I oder II auf Zellen der Monozyten-Makrophagen-Linie zu hemmen. Die Verwendung von Oncostatin M kann daher eine bessere Alternative zu Cyclosporin A bieten. Die vielfältige Wirkungsweise von Cyclosporin A, dem gegenwärtig bei Allotransplantationen hauptsächlich verwendeten Immunsuppressivum, resultiert aus der Hemmung der Proliferation von T-Lymphozyten. Oncostatin M weist keine ähnliche Wirkung auf die Proliferation von T- Zellen auf.
  • Gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann Oncostation M allein oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Zytokinen, Wachstumsfaktoren oder einem Immunsuppressivum, einschließlich, jedoch nicht einschränkend, TGF-β, Cyclosporin A und Corticosteroiden, verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit einer Akzeptanz des Spenderorgans durch den Empfänger des Transplantats zu erhöhen. Von der Anmelderin wurde hierzu beobachtet, daß TGF-β mit Oncostatin M synergistisch wirkt und die Expression von HLA-Antigenen auf IFN-γ-stimulierten Endothelzellen stark hemmt. Eine geringe Menge von 50 pg/ml Oncostatin M in Verbindung mit 0,5 ng/ml TGF-β ergab eine Reduktion der Klasse I-Antigen-Expression um nahezu 50% (Abschnitt 6.2.2, infra). Des weiteren wurde die durch IFN-y stimulierte Expression von Antigenen der Klasse II durch die Kombination von 0,5 ng/ml Oncostatin M und 1 ng/ml TGF-β um 80% gehemmt.
    • 6. BEISPIEL: MODULATION DER EXPRESSION VON HLA-ANTIGENEN AUF ENDOTHELZELLEN DURCH ONCOSTATIN M IN VITRO
  • Die nachfolgend beschriebenen in vitro-Experimente zeigen inter alia, daß Oncostatin M die durch Zytokin stimulierte Expression von HLA-Antigenen der Klasse I und II auf humanen Endothelzellen, jedoch nicht auf Monozyten-Makrophagen, hemmt, und daß TGF-β mit Oncostatin M zur Erreichung dieses hemmenden Effekts zusammenwirkt.
    • 6.1. MATERIALIEN UND VERFAHREN 6.1.1 ENDOTHELZELLKULTUREN
  • Es wurden humane umbilikale Endothelzellen (HUVECs) aus einer Nabelvene, wie beschrieben, isoliert (Wall et al., 1978, J. Cell. Physiol. 96 : 203). Die Zellen wurden mit Kollagenase behandelt und auf Gelatine-beschichteten Plastikmaterialien in CS-1 definiertem serumfreien Medium (Cell Systems, Kirkland, WA), versetzt mit 50 ug/ml Heparin und rekombinantem ECGS (Bionetics), zum Konfluieren angezüchtet. Die Zellen wurden mindestens 12 Stunden vor dem Versuch mit frischem, nicht supplementiertem Medium versetzt.
    • 6.1.2 IMMUNFÄRBUNG
  • Es wurden verschiedene Flourescein-markierte, monoklonale Antikörper (Mabs) zur Entdeckung von HLA-Antigenen der Klasse I und II eingesetzt: HIDE (Gladstone et al., Histocompatability Testing, 429, Dupont, Ed., 1984) wurde zur Entdeckung von HLA-Antigenen der Klasse I verwendet; ein DR-spezifischer Antikörper, VI.15 (Gladstone et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 1235), wurde zur Entdeckung von HLA-DR-Antigenen der Klasse II verwendet; der Antikörper 33.1 wurde zur Entdeckung von HLA-DQ-Antigenen verwendet und von G. Marti bereitgestellt (Marti et al., 1983, J. Exp. Med. 158 : 1924 = 1983); HB10a wurde zur Entdeckung von HLA-DR- und HLA-DP-Antigenen der Klasse II verwendet und von Dr. E. Clark bereitgestellt (Regional Primate Research Center, Washington University, Seattle, WA).
    • 6.1.3. QUANTITATIVE ANTIGENUNTERSUCHUNG
  • Die Messung der zelloberflächenexpression von HLA-Antigenen wurde im wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (Gladstone et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1235-39), mit Veränderungen zur Fluorescent Activated Cell Sorter (FACS)-Analyse (Basham and Merigan, 1983, J. Immunol. 130: 1492). Es wurden 5 · 10&sup4; Zellen je Probe immungefärbt und die Expression von HLA-Antigenen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung eines FACS- Analysiergerätes quantitativ bestimmt. Die Mabs wurden in jedem Schritt während 45 Minuten inkubiert. Die Probenpopulationen wurden durch mittlere Channel-Fluoreszenz auf einer Vierdekaden-Logarithmenskala verglichen und, sofern es zweckdienlich schien, wurden durch Umkehrung äquivalente, lineare Fluoreszenzwerte erhalten.
    • 6.1.4 ZYTOKINE
  • Rekombinantes Oncostatin M wurde hergestellt gemäß Beschreibung in (Malik et al., 1989, Mol. Cell. Biol., in press), rekombinanter TGF-β, wie beschrieben in (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 3418), rekombinantes IFN-γ und rekombinanter TNF-α wurden bei der Firma Amgen Inc. gekauft. Natürliches Oncostatin M wurde hergestellt gemäß Beschreibung in (Zarling et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 38 : 9737).
    • 6.1.5. VERSUCH: ONCOSTATIN M-REZEPTOR
  • Hochreines humanes rekombinantes Oncostatin M wurde mittels IODO-GEN-Verfahren radioaktiv markiert (Fraker and Speck, 1978, Biochem. Biophys. Res. Comm. 80 : 849) für eine spezifische Aktivität von 52 uCi/ug. Es wurden Radiorezeptor- Versuche auf konfluierenden, monomolekularen Schichten von humanen umbilikalen Endothelzellen in situ durchgeführt, die in 24-Well-Gewebenährplatten (105 Zellen/Well) zweifach angezüchtet wurden. Die monomolekularen Schichten wurden zunächst zweimal mit einer bindenden Puffersubstanz gewaschen (Dulbecco's MEM + 0,1% Rinderserumalbumin + 15 mM HEPES) und danach wurden 250 ul einer 1 ng/ml radioaktiv markiertes Oncostatin M enthaltenden bindenden Puffersubstanz und eine veränderliche Menge nicht-markiertes Oncostatin M den monomolekularen Schichten hinzugefügt. Die Zellen wurden bei 23 Grad C über 3 Stunden inkubiert, um eine Bindung im stationären Zustand aufrechtzuerhalten (Linsley et al., 1988, J. Biol. Chem. 264: 4282). Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen mit einer kalten, bindenden Puffersubstanz gewaschen und in 1 N NaOH löslich gemacht. Mit Hilfe eines Gamma-Spektrophotometers wurde Radioaktivität festgestellt, und es wurden Daten nach der Scatchard-Methode ausgedruckt (Scatchard, 1949, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51 : 660). Es wurde eine nichtspezifische Bindung bei Vorhandensein eines 400-fachen molaren Überschusses an nicht-markiertem Oncostatin M gemessen.
    • 6.2 ERGEBNISSE 6.2.1 ONCOSTATIN M HEMMT EINE ZYTOKINSTIMULIERTE EXPRESSION VON HLA-ANTIGENEN AUF HUMANEN ENDOTHELZELLEN
  • Das Vermögen von Oncostatin M, die Regulation der Expression von MHC-Antigenen auf humanen umbilikalen Endothelzellen durch andere Zytokine zu verändern, wurde durch indirekte Immunfluoreszenz und Verwendung eines FACS-Analysiergerätes wie in "Materials and Methods", supra, beschrieben, quanti tativ bestimmt. In Tabelle I ist die Wirkung verschiedener Zytokine auf die Expression von HLA-Antigenen auf humanen umbilikalen Endothelzellen dargestellt. Bei einer Konzentration von 100U/ml, wurde die Expression von Klasse I- Antigenen sowohl durch IFN-γ als auch durch TNF-α wesentlich beeinflußt, indem die Expression um das Fünffache bzw. Zweifache erhöht wurde. Des weiteren erhöhte IFN-γ die Expression von Klasse II-Antigenen um mehr als das Sechsfache. Im Gegensatz hierzu konnten weder TGF-β noch Oncostatin M eine Erhöhung der Klasse I- oder Klasse II-Expression bewirken. TABELLE 1¹
  • ¹ Werte ausgedrückt in äquivalenten linearen Fluoreszenzwerten
  • Tabelle II stellt die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Oncostatin M auf die durch Zytokin induzierte Expression von Antigenen der Klasse I und II dar. Je nach der Höhe der Dosis wirkte Oncostatin M der durch IFN-γ und TNF-α stimulierten Expression von HLA-Antigenen entgegen. In einer Konzentration von 5 ng/ml hemmte Oncostatin M die durch IFN-γ stimulierte Expression von HLA-A,B,C-Antigenen der Klasse I um 51% und die durch TNF-α stimulierte Expression um 141%. Die Induktion von HLA-DR- und HLA-DQ-Antigenen der Klasse II durch IFN-γ wurde mit 50 ng/ml Oncostatin M um 84% bzw. 72% gehemmt. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß Oncostatin M bei der Abregulierung der Immunogenizität von Endothelzellen in vivo nützlich sein kann. TABELLE II¹
  • ¹ Werte ausgedrückt in äquivalenten linearen Fluoreszenzwerten
    • 6.2.2 SYNERGISTISCHE WIRKUNG VON ONCOSTATIN M UND TGF-β
  • Es wurde die Wirkung von Oncostatin M, TGF-β und Oncostatin M/TGF-β auf mit IFN-γ behandelte Endothelzellen bewertet und verglichen, um festzustellen, ob ein synergistisches Wirken zwischen TGF-β und Oncostatin M besteht. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 1 dargestellt. TGF-β allein zeigt ein schwaches Hemmvermögen gegenüber der durch IFN-γ stimulierten Expression von entweder HLA-A,B,C- Antigenen der Klasse I oder HLA-DR-Antigenen der Klasse II. Suboptimale Mengen an Oncostatin M in Kombination mit TGF-β hatten jedoch ein synergistisches Entgegenwirken bei der Klasse I- und II-Antigen-Expression zur Folge. Beispielsweise ergaben 50 pg/ml Oncostatin M kombiniert mit 0,5 ng/ml TGF-β eine Hemmung der Expression von Klasse I- Antigenen von 49%, während eine unabhängige Behandlung mit derselben Konzentration Oncostatin M bzw. TGF-β eine Hemmung von 7% bzw. 15% zur Folge hatte (Fig. 1A). Auf ähnliche Weise ergab die Kombination aus 0,5 ng/ml Oncostatin M und 1 ng/ml TGF-β eine Hemmung der Expression von HLA-DR- Antigenen der Klasse II um 80%, während eine unabhängige Behandlung in diesen Konzentrationen eine Hemmung von 13% (Oncostatin M) und 26% (TGF-β) ergab (Fig. 1B). Hinsichtlich der Hemmung der Expression von Antigenen sowohl der Klasse I als auch der Klasse II wurde daher eine um zweimal größere synergistische Wirkung beobachtet, als die vorausgesagte zusätzliche Wirkung, was darauf hinweist, daß sowohl TGF-β als auch Oncostatin M enthaltende Zusammensetzungen von besonders großem Nutzen sein können.
    • 6.2.3. GEWEBESPEZIFITÄT VON ONCOSTATIN M WIRKUNG AUF DIE EXPRESSION VON HLA-ANTIGENEN
  • Zur Untersuchung, ob die hemmende Wirkung von Oncostatin M auf die Expression von HLA-Antigenen für Endothelzellen spezifisch ist, wurde das Vermögen von Oncostatin M, der durch Zytokin induzierten Expression von MHC-Antigenen der Klasse II auf Monozyten- und Makrophagen-artigen Zellen entgegenzuwirken, bestimmt.
  • Es wurden humane Monozyten mittels Ficoll-Gradienten aus Blut isoliert und auf Plastiknährschalen adhäriert. Wie in "Materials and Methods" beschrieben, wurden die Zellen auf Klasse II-Antigene untersucht. Die Zellen wurden mit 100 und 250 U/ml IFN-y behandelt, um ein Grundausmaß an HLA- Antigenen der Klasse II zu aktivieren, und parallele Kulturen wurden ebenso mit 5 ng/ml Oncostatin M behandelt. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen wurden die Zellen mit Fluorescein-markierten Antikörpern gefärbt und, wie in "Materials and Methods", supra, beschrieben, durch indirekte Immunfluoreszenz und FACS-Mengenbestimmung analysiert.
  • Die Ergebnisse zeigen, daß Oncostatin M weder auf das Grundausmaß noch auf ein durch Zytokin induziertes Ausmaß der Expression von Klasse II-HLA-Antigenen hat.
  • In einem weiteren Experiment wurde die Wirkung von 1-10 ng/ml rekombinantem Oncostatin M auf die Expression von MHC-Antigenen der Klasse II in einer Makrophagen-artigen Zell-Linie von Mäusen (Wehi-3 Zellen) auf ähnliche Weise untersucht. In diesen Zellen wird die Expression von Klasse II-Antigenen entweder von IFN-y oder TNF-α stark induziert (Chang and Lee, 1968, J. Immunol. 137 : 2853). Im Fall von humanen Monozyten hatte Oncostatin M in diesen Zellen keine Wirkung auf das Grundausmaß oder auf das durch Zytokin induzierte Ausmaß der Expression von HLA-Antigenen der Klasse II.
  • Da diese Ergebnisse nahelegen, daß Oncostatin M nicht in der Lage ist, die Expression von HLA-Antigenen der Klasse II auf Zellen der Monozyten-Makrophagen-Linie zu hemmen, kann Oncostatin M eine therapeutisch spezifischere Alternative zur weitreichenden immunsuppressiven Wirkung bieten, die durch andere Zusammensetzungen, wie beispielsweise Cyclosporin A, Corticosteroide und Cyklophosphamide, induziert wird.
    • 6.2.4. EXPRESSION IN HOHEM AUSMASS VON ONCOSTATIN M-REZEPTOREN AUF HUMANEN UMBILIKALEN ENDOTHELZELLEN
  • Humane umbilikale Endothelzellen (HUVECs) wurden zum Zusammenfluß in 24-Well Gewebenährschalen angezüchtet, und es wurden Radiorezeptor-Versuche durchgeführt, wie in Abschnitt 6.1.5., supra, beschrieben. Fig. 2 zeigt die Sättigungskurve und ein Scatchard-Diagramm (Nebenbild) für die Bindung von Oncostatin M an HUVECs. Die Bindung ist saturierbar und das Scatchard-Diagramm zeigt eine krummlinige Isotherme, die auf das Vorhandensein von zumindest zwei Klassen von Zelloberflächenbindungsstellen auf humanen umbilikalen Endothelzellen (HUVECs) hindeutet. Nach einer Analyse gemäß des Zwei-Bindungsstellen-Modells wurde eine Gesamtkonzentration von 380 000 Bindungsstellen pro Zelle (Oncostatin M-Rezeptor) errechnet, worin 1700 Stellen hoher Affinität (Kd = 5,6 pM) und 378 300 Stellen geringer Affinität (Kd = 8,5 nM) enthalten waren. Eine halbmaximale Inanspruchnahme des Rezeptors erfolgte bei 2 ng/ml (67 pH), was übereinstimmt mit ED50 der Oncostatin M-Hemmung der durch Zytokin induzierten Expression von HLA-Antigenen (Abschnitt 6.2.1., supra). Diese humanen Endothelzellen scheinen etwa das Zehnfache an Oncostatin M-Rezeptoren zu exprimieren als Endothelzellen von Rindern.
  • Der Oncostatin M-Rezeptor auf humanen umbilikalen Endothelzellen (HUVECs) wurde des weiteren gekennzeichnet durch chemisches Vernetzen von [¹²&sup5;I] -Oncostatin M mit dessen Rezeptor und, wie beschrieben, durch die Analyse der strukturellen Eigenschaften des Komplexes durch Polyacrylamidgel- Elektrophorese (Linsley et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 4282-4289). Wie im Autoradiogramm in Fig. 2 dargestellt, wanderte der vernetzte Ligandenrezeptor-Komplex auf einer 6% SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen als eine auffallende 180 000 Molekulargewichtsbande (Streifen 3). Die Einbeziehung eines 400fachen molaren Überschusses an unmarkiertem Oncostatin M während der Bindungszeit übertraf definitiv die mit dieser Bande verbundene Radioaktivität definitiv (Streifen 4). Daher kommt die Anmelderin zu dem Schluß, daß der Oncostatin M-Rezeptor auf humanen Endothelzellen in Struktur und Funktion dem Oncostatin M-Rezeptor auf Endothelzellen des Rindes, ebenso wie dem Oncostatin M- Rezeptor auf humanen Zellen nicht-endothelen Ursprungs, ähnlich ist (Streifen 1 und 2).

Claims (24)

1. Verwendung von Oncostatin M für die herstellung vn einem Medikament zur Hemmung der Immunogenizität von endothelialen Gewebe, wodurch der Ausdruck von MHC Antigenen auf den endothelialen Zellen unterdrückt wird.
2. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß Anspruch 1, wobei die MHC- Antigene HLA-Antigene der Klasse I umfassen.
Die Verwendung von Oncostatin M gemäß Anspruch 1, wobei die MI-1C- Antigene HLA-Antigene der Klasse II umfassen.
4. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der vorgehenden Ansprüche 1 bis 3, wobei das Oncostatin M kovalent an ein Antikörpermolekül gekoppelt ist, das ein zelluläres Antigen darstellt.
Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der vorgehenden Ansprüche 1 bis 3, wobei das Oncostatin M kovalent an ein Hormon gekoppelt ist.
6. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der vorgehenden Ansprüche 1 bis 3, wobei das Oncostatin M kovalent an einen Wachstumsfaktor gekoppelt ist.
7. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der vorgehenden Ansprüche 1 bis 3, wobei das Oncostatin M kovalent an ein Zytokin gekoppelt ist.
8. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der vorgehenden Ansprüche 1 bis 3, wobei das Oncostatin M in einer Form für die gemeinsame Verabreichung mit einer wirksamen Menge von TGF-β ist.
9. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der vorgehenden Ansprüche 1 bis 8, wobei das Oncostatin M in einem Liposom verkapselt ist.
10. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der vorgehenden Ansprüche 1 bis 8, wobei das Oncostatin M in einer Mikrokapsel verkapselt ist.
11. Verwendung von Oncostatin M für die Herstellung von eineme Medikament für die Verbesserung der Wahrscheinlichkeit eines funktionellen Erfolgs von transplantierten Organen, wodurch die Expression von MHC-Antigenen in dem Gefäßsystem des Spenderorgans gehemmt wird.
12. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß Anspruch 11, wobei das transplantierte Organ ein Herz ist.
13. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß Anspruch 11, wobei das transplantierte Organ eine Lunge ist.
14. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß Anspruch 11, wobei das transplantierte Organ eine Niere ist.
15. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß Anspruch 11, wobei das transplantierte Organ eine Leber ist.
16. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei die MHC-Antigene HLA-Antigene der Klasse I umfassen.
17. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei die MHC-Antigene HLA-Antigene der Klasse II umfassen.
18. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei das Oncostatin M kovalent an ein Antikörpermolekül gekoppelt ist, das ein zelluläres Antigen darstellt.
19. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei das Oncostatin M kovalent an ein Hormon gekoppelt ist.
20. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei das Oncostatin M kovalent an einen Wachstumsfaktor gekoppelt ist.
21. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei das Oncostatin M kovalent an ein Zytokin gekoppelt ist.
22. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei das Oncostatin M in einer Form für die gemeinsame Verabreichung mit einer wirksamen Menge von TGF-β ist.
23. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei das Oncostatin M in einem Liposom verkapselt ist.
24. Die Verwendung von Oncostatin M gemäß einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei das Oncostatin M in einer Mikrokapsel verkapselt ist.
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