DE69033700T2

DE69033700T2 - Il-11 aus säugetier

Info

Publication number: DE69033700T2
Application number: DE69033700T
Authority: DE
Inventors: K. Bennett; Boston Stephen R. Paul; Yu-Chung Yang
Original assignee: Childrens Medical Center Corp; Genetics Institute LLC
Current assignee: Childrens Medical Center Corp; Genetics Institute LLC
Priority date: 1989-11-22
Filing date: 1990-11-20
Publication date: 2001-09-13
Anticipated expiration: 2010-11-21
Also published as: AU6757890A; DE69033700D1; US5854028A; US6066317A; DK66692A; MX9203439A; WO1991007495A1; DK66692D0; JPH104982A; US5700664A; ES2156852T3; CA2069428A1; CA2069428C; EP0504177B1; JP2783361B2; AU644389B2; EP0504177A1; KR920703819A; ATE199096T1; HUT64595A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Cytokin, das die Funktion von Zellen des Immunsystems und des hämatopoetischen Systems stimuliert, und Verfahren, um diesen Faktor zu erhalten und mittels rekombinanter gentechnischer Methoden zu produzieren.

Hintergrund der Erfindung

Eine wachsende Familie von regulatorischen Proteinen, die Signale zwischen den Zellen des Immunsystems liefern, ist identifiziert worden. Diese regulatorischen Moleküle sind als Cytokine bekannt. Bei vielen der Cytokine ist gefunden worden, dass sie das Wachstum und die Entwicklung ebenso wie die biologischen Aktivitäten der Zellen des hämatopoetischen Systems und des Immunsystems kontrollieren. Diese regulatorischen Moleküle umfassen alle Kolonie-stimulierenden Faktoren (z. B., GM-CSF, G-CSF, M-CSF und multi-CSF oder Interleukin-3), die Interleukine (IL-1 bis IL-9), die Interferone (alpha, beta und gamma), die Tumor-Nekrose-Faktoren (alpha und beta), Erythropoietin, Makrophagen inhibierende Proteine, die Tumorwachstumsfaktoren und Leukämie inhibierender Faktor (LIF). Diese Cytokine zeigen einen weiten Bereich von biologischen Aktivitäten mit Zielzellen vom Knochenmark, peripheren Blut, fötaler Leber und anderen lymphoiden oder hämatopoetischen Organen. Siehe, z. B., F. R. Balkwill und F. Burke, Immunology Today, 10 (9): 299 (1989); G. Wong und S. Clark, Immunology Today, 9 (5): 137 (1988); und S. C. Clark und R. Kamen, Science, 236: 1229-1237 (1987).
Die biochemische und biologische Identifizierung und Charakterisierung gewisser Cytokine wurde behindert durch die kleinen Mengen der natürlich vorkommenden Faktoren, die aus natürlichen Quellen wie, z. B., Blut und Urin verfügbar sind. Viele der Cytokine sind mittlerweile molekular geclont, heterolog exprimiert und zur Homogenität aufgereinigt worden. Von mehreren dieser gereinigten Faktoren ist gefunden worden, dass sie in vivo regulatorische Effekte am hämatopoetische System und dem Immunsystem zeigen, einschließlich GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, TNF, die Interferone und Erythropoietin.
Im Fachgebiet besteht jedoch weiterhin ein Bedarf nach zusätzlichen Proteinen, von ihren natürlichen Quellen gereinigt oder auf andere Weise in homogener Form produziert, die in der Lage sind, die Immunantwort und die Entwicklung der hämatopoetischen Zellen zu stimulieren oder zu erhöhen und die für die pharmazeutische Verwendung geeignet sind.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein neues Säuger-Cytokin bereit, das IL-11 genannt wird und das im wesentlichen frei ist von anderen Säugerproteinen. Dieses Protein kann mittels rekombinanter gentechnischer Verfahren produziert werden. Es kann auch aus zellulären Quellen gereinigt werden, die den Faktor natürlicherweise oder nach Induktion mit anderen Faktoren produzieren. IL-11 kann auch mittels chemischer Techniken synthetisiert werden, oder durch eine Kombination der vorstehend aufgelisteten Techniken.
Aktives, reifes Säuger-IL-11 ist ein Protein mit ungefähr 178 Aminosäuren, das durch ein offensichtliches Molekulargewicht von ungefähr 20 kd charakterisiert ist, wie bestimmt mittels einer Analyse von 35S-Methionin-markierter Überstandsflüssigkeit, die von mit IL-11- cDNA transfizierten COS-1-Zellen gewonnen war, mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese. Das berechnete Molekulargewicht für das reife Protein ist ebenfalls ungefähr 20 kd.
Das IL-11-Protein dieser Erfindung hat bei verschiedenen Tests biologische Aktivitäten gezeigt, die eine Rolle als generelles Stimulans einer Vielzahl von hämatopoetischen und immunologischen Funktionen anzeigen. Das IL-11-Protein dieser Erfindung zeigt proliferative Aktivität in einer IL-6-abhängigen Maus-Plasmacytom-Zelllinie, T1165. IL-11 hat in vorläufigen Tests ebenfalls die Fähigkeit gezeigt, entweder direkt oder indirekt die Reifung von B-Zellen zu stimulieren. Spezifisch nimmt man an, dass IL-11 die T- Zell-abhängige Entwicklung von B-Zellen stimuliert. Es hat weiterhin Synergie mit IL-3 in einem Test zur Stimulierung der Megakaryocyten-Proliferation gezeigt, kann aber auch auf andere Linien wirken.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine DNA-Sequenz, die die Expression eines Säuger-IL-11-Proteins codiert. Diese DNA-Sequenz kann eine isolierte DNA-Sequenz umfassen, die die Expression eines Säuger-IL-11-Proteins codiert, wie vorstehend beschrieben. Die DNA-Sequenz, die aktives IL-11 codiert, ist dadurch gekennzeichnet, dass sie dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Nucleotidsequenz in Tabelle I umfaßt oder Fragmente davon. Diese DNA-Sequenz kann auch 5'- und 3'- nicht codierende Säugersequenzen umfassen, die die IL-11 codierende Sequenz flankieren. Die DNA-Sequenz kann auch ein Signalpeptid am Aminoende codieren. Tabelle I zeigt diese nicht codierenden, 5'- und 3'- flankierenden Sequenzen und eine Signalsequenz von Säuger-IL-11, das aus der Primatenzelllinie PU34 isoliert und in COS-1-Zellen exprimiert wurde.
Es ist jedoch zu verstehen, dass die DNA-Sequenz dieser Erfindung einige oder alle dieser flankierenden oder Signalsequenzen ausschließen kann. Darüber hinaus kann die DNA- Sequenz der vorliegenden Erfindung, die ein biologisch aktives Säuger-TL-11-Protein codiert, auch eine DNA umfassen, die in der Lage ist, unter geeigneten Bedingungen an eine isolierte DNA-Sequenz von Tabelle I zu hybridisieren, oder die in der Lage wäre, unter geeigneten Bedingungen zu hybridisieren, wenn es nicht die Degenerierung des genetischen Codes gäbe. Somit kann die DNA-Sequenz dieser Erfindung Modifikationen der nicht codierenden Sequenzen, der Signalsequenzen oder der codierenden Sequenzen, basierend auf allelischen Variationen, Spezies-Variationen oder eine absichtliche Modifikation umfassen oder enthalten.
Durch die vorliegende Erfindung wird ebenfalls ein rekombinantes DNA-Molekül bereitgestellt, das eine Vektor-DNA umfaßt und eine DNA-Sequenz, die Säuger-IL-11 codiert. Das DNA-Molekül stellt eine IL-11-DNA in operativer Assoziation mit einer regulatorischen Sequenz bereit, die in der Lage ist, die Replikation und Expression von IL-11 in einer ausgewählten Wirtszelle zu steuern. Wirtszellen, die mit solchen DNA-Molekülen zur Verwendung bei der Expression eines rekombinanten IL-11-Proteins transformiert sind, werden durch die vorliegende Erfindung ebenfalls bereitgestellt.
Die DNA-Moleküle und die transformierten Zellen der Erfindung werden bei einem anderen Aspekt verwendet, einem neuen Verfahren zur Produktion von rekombinantem Säuger-IL-11-Protein, oder Peptidfragmenten davon. Bei diesem Verfahren wird eine Zelllinie, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die die Expression von IL-11-Protein oder eines Fragments davon codiert (oder mit einem vorstehend beschriebenen rekombinanten DNA-Molekül), in operativer Assoziation mit einer geeigneten regulatorischen oder Expressionskontroll-Sequenz, die in der Lage ist, die Expression des Proteins zu kontrollieren, unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, die die Expression der rekombinanten DNA erlauben. Das exprimierte IL-11-Protein wird dann aus den Wirtszellen oder dem Kulturmedium mittels geeigneter konventioneller Verfahren gewonnen. Dieses beanspruchte Verfahren kann eine Reihe von bekannten Zellen als Wirtszellen für die Expression des Proteins verwenden. Gegenwärtig bevorzugte Zellen zur Produktion von IL-11 sind Säugerzelllinien und Bakterienzellen.
Ein anderer Aspekt dieser Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge von Säuger-IL-11 oder von einem oder mehreren biologisch aktiven Peptidfragmenten davon enthalten. Diese Protein- oder Peptidfragmente können in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger dargeboten werden. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können, allein oder in Kombination mit anderen geeigneten pharmazeutischen Mitteln, in Verfahren zur Behandlung von Krankheitszuständen verwendet werden, die durch einen Mangel in der Zahl oder dem Aktivitätsniveau von hämatopoetischen Zellen gekennzeichnet sind. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die IL- 11 enthalten, können auch bei der Behandlung von Krankheiten des Immunsystems, wie Immunmangelzuständen, angewendet werden.
Zusammensetzungen, die IL-11 enthalten, können auch verwendet werden, um das Wachstum und die Differenzierung von Megakaryocyten in Synergie mit IL-3 zu stimulieren. Zusätzliche Anwendungsgebiete sind bei der Blutplättchenbildung, bei der erworbenen chemotherapeutischen oder bei der Knochenmarks-bezogenen Thrombocytopenie. Wahrscheinlich arbeitet IL-11 auch als Effektormolekül bei der Verbesserung der Funktion anderer Cytokine. Zusammensetzungen mit IL-11 können auch von Nutzen sein bei der direkten oder indirekten Stimulierung der Produktion oder Funktion von B-Zellen. Deshalb können IL-11-Zusammensetzungen bei Therapien für Krebs, für die Behandlung von Infektionen, für die Beschleunigung der Wundheilung und für die generelle Stimulierung des Immunsystems verwendet werden. IL-11 kann auch für die Verstärkung der Immunantwort auf gewisse Antigene, insbesondere Impfstoffe, verwendet werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Behandlung dieser und/oder anderer Krankheitszustände durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von IL-11 oder eines Peptidfragments davon in einem geeigneten pharmazeutischen Träger an einen Patienten. Diese therapeutischen Verfahren können die simultane oder aufeinanderfolgende Verabreichung einer wirksamen Menge von zumindest einem anderen Cytokin, Hämatopoetin, Interleukin, Wachstumsfaktor oder Antikörper zusammen mit IL-11 oder einem Peptidfragment davon umfassen.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Antikörper, die gegen Säuger-IL-11 oder ein Peptid davon gerichtet sind. Als Teil dieses Aspekts beansprucht die Erfindung daher Zelllinien, die in der Lage sind, solche Antikörper zu sezernieren und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden weiterhin in der folgenden ausführlichen Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.

Kurze Beschreibung der Abbildungen.

Fig. 1 stellt graphisch die Verstärkung der Entwicklung von NP-reaktiven Maus-B- Zellen durch pC1R6-transfizierte cos-1-Zellen konditioniertes Medium beim Maus- Plaquebildungstest dar.
Fig. 2 stellt graphisch die Verstärkung der Entwicklung von IL-3-abhängigen Maus- Megakaryocyten-Kolonien durch pC1R6-transfizierte cos-1-Zellen konditioniertes Medium beim Maus-Fibrinklümpchentest dar.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein DNA-Molekül bereit, das ein Protein codiert, dessen reife Form die biologische Aktivität von IL-11 hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(a) einem DNA-Molekül, das die Aminosäuresequenz codiert, die in Tabelle I gezeigt ist;
(b) einem DNA-Molekül, das die Aminosäuresequenz von Aminosäure #22 bis Aminosäure #199 codiert, die in Tabelle I gezeigt ist;
(c) dem DNA-Molekül, das in Tabelle I gezeigt ist, welches die Aminosäuresequenz codiert, die in Tabelle I gezeigt ist;
(d) dem DNA-Molekül, das in Tabelle I gezeigt ist, welches die Aminosäuresequenz von Aminosäure #22 bis Aminosäure #199 codiert, die in Tabelle I gezeigt ist;
(e) einem DNA-Molekül, das ein Fragment, eine allelische oder eine andere Variante des DNA-Moleküls von (a), (b), (c) oder (d) ist;
(f) einem DNA-Molekül, dessen komplementärer Strang mit dem DNA-Molekül von (a), (b), (c), (d) oder (e) hybridisiert; und
(g) einem DNA-Molekül, dessen Sequenz sich in der codierenden Sequenz von der Sequenz eines DNA-Moleküls, welches in (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) beschrieben ist, aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.
Diese DNA-Moleküle erlauben die Produktion von IL-11 mittels rekombinanter Techniken, was ermöglicht, große Mengen an reinem, aktivem IL-11 zu produzieren, was von Nutzen ist für therapeutische Anwendungen. In einer anderen Ausführungsform kann dieses Protein als ein homogenes Protein erhalten werden, das von einer Säuger-Zelllinie gereinigt wird, die es sezerniert oder exprimiert. Darüber hinaus können IL-11 oder aktive Fragmente davon chemisch synthetisiert werden.
Säuger-IL-11 wurde ursprünglich aus einer Primaten-Zelllinie isoliert, die durch Plazierung von Knochenmarkszellen von einem gesunden Makaken in Langzeitkultur und ihrer Infektion mit dem Retrovirus U19-5 [Dr Roger Cone, Tufts Medical School]. Nach Inkubation mit dem geeigneten Antibiotikum wurde eine lebende Zelllinie wegen ihrer Wachstumseigenschaften ausgewählt, die als PU34 bezeichnet wurde, und mit IL-1 alpha induziert, das in E. coli exprimiert worden war. Konditioniertes Medium zeigte Aktivität in einem Proliferationstest mit IL-6-abhängigen Maus-Plasmacytomazellen in Anwesenheit von neutralisierendem Antikörper gegen IL-6. Eine cDNA-Bibliothek wurde aus mRNA von mit IL-1 stimulierten (2 u/ml IL-1 für 24 Stunden) PU34-Zellen hergestellt entsprechend dem Expressions-Clonierungs-Verfahren, das kürzlich beschrieben wurde in, z. B., G. G. Wong et al. Science, 228: 810-815 (1985); Y. C. Yang et al. Cell, 47: 3-10 (1986); und A. E. Namen et al. Nature, 333: 571-573 (1988).
Die Bibliothek wurde in einem Expressionsvektor hergestellt, der die Expression von cDNA-Insertionen in Säugerzellen erlaubt, z. B. COS-1-Zellen. Die Durchmusterung der Bibliothek wurde durch Transfektion von COS-1-Zellen mit 5 ug DNA durchgeführt, die aus Pools von 200-500 cDNA-Clonen gewonnen war. Durch Testung der Überstandsflüssigkeit auf Aktivität in dem T1165-Test wurden cDNA-Clone identifiziert, die die IL-11-Aktivität exprimierten.
Ein isolierter Clon, der T1165-Aktivität hatte, wurde pPU34-TRA genannt (auch pC1R6 genannt) und wurde sequenziert. Tabelle I zeigt die cDNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz (Einzelbuchstabencode) von sowohl den Primaten- als auch den menschlichen Clonen des IL-11 Polypeptids. Die Nucleotidsequenz von Position 1-721 für die Primatensequenz wurde von pC1R6 erhalten. Der Rest, von den Nucleotiden 721-1102, wurde von einer zweiten Primaten-cDNA sequenziert, die durch Hybridisierung mit pC1R6 isoliert worden war. Eine menschliche cDNA, die die Plasmacytom-stimulatorische Aktivität von IL- 11 codierte, wurde aus einer cDNA-Bibliothek isoliert, die von der menschlichen Lungenzelllinie MRCS [beschrieben von Jacobs et al. Nature, 227: 43 (1970)] durch direkte Hybridisierung mit der Insertion von pPU34-TRA (pC1R6). Die Unterschiede, die in der menschlichen IL-11-Nucleotidsequenz gefunden wurden, werden in Tabelle I oberhalb der Primatensequenz angezeigt und die resultierenden Veränderungen in der Aminosäuresequenz werden unterhalb der entsprechenden Aminosäure in der Primatensequenz angezeigt.
Die Primatennucleotidsequenz umfaßt 1100 Basenpaare. Die Primatensequenz enthält 5' eine nicht codierende Sequenz von 72 Basenpaaren. Die Sequenz von Tabelle I zeigt auch 3' eine nicht codierende Sequenz von 431 Basen. Die menschliche Nucleotidsequenz enthielt in ähnlicher Weise einen einzelnen langen Leserahmen von 597 Nucleotiden.
Sowohl die Primaten- als auch die menschlichen Sequenzen sind gekennzeichnet durch einen einzelnen, offenen langen Leserahmen, der ein nicht prozessiertes Polypeptid von 199 Aminosäuren vorhersagte, das an der Position 73 des Primatennucleotids in Tabelle I beginnt. Die ersten 21 Aminosäuren von Position (1) Met bis Position (21) Ala in der vorhergesagten Aminosäuresequenz von IL-11 von sowohl den Primaten- als auch den menschlichen Clonen enthalten eine Strecke von hydrophoben Aminosäuren, die einer herkömmlichen sekretorischen Säuger-Leader-Sequenz ähneln [D. Perlman et al. J. Mol. Biol., 167: 391-409 (1983)]. Der N-Terminus des reifen IL-11-Proteins (in Tabelle I unterstrichen) besteht aus der Aminosäuresequenz PRO-GLY-PRO-PRO-PRO-GLY. Das Protein wird zunächst als ein Vorläufer von 199 Aminosäuren synthetisiert, der zwischen den Nucleotiden #134-135 ptoteolytisch gespalten wird, um ein reifes Polypeptid von 178 Aminosäuren zu ergeben, das mit der Sequenz Pro-Gly an den Aminosäurepositionen 22-23 beginnt und nach der Aminosäureposition 199 am TGA-Terminationstriplett an den Nucleotidpositionen 671-672 endet. Das berechnete Molekulargewicht des reifen Proteins korrespondiert gut mit dem offensichtlichen Molekulargewicht einer neuen Proteinbande, die sich bei SDS-PAGE (reduzierende Bedingungen) von Überstandsflüssigkeit zeigt, die von mit IL-11-cDNA transfizierten COS-1-Zellen gewonnen ist, das heißt ungefähr 20 kd in beiden Fällen.

TABELLE I

Primaten und menschliche IL-11-Sequenz, 5'- 3'
Unterschiede zwischen menschlicher und Primatensequenz werden durch Basen oberhalb der Primatennucleotidsequenz angezeigt und Aminosäuren unterhalb der Primatenaminosäuresequenz.
Die Nucleotidsequenz von IL-11-cDNA wurde verglichen mit Nucleotidsequenzen, die in Genbank aufgezeichnet waren. Es wurden keine auffälligen Ähnlichkeiten in der Nucleotidsequenz mit publizierten DNA-Sequenzen von anderen Proteinen gefunden. Es wurde nur eine schwache Homologie zwischen der Leader-Sequenz von IL-11 und denen von gamma-Interferon und IL-6 gefunden. Es wurde kein auffällige Homologie zwischen der codierenden Sequenz von IL-11 und anderen publizierten Polypeptidsequenzen gefunden.
Zusätzlich ist IL-11, wie ausführlicher in Beispiel 11 beschrieben, ein synergistischer Faktor für die IL-3-abhängige Proliferation von primitiven Vorläuferzellen. Ein Ergebnis der Synergie ist die Verkürzung der G&sub0;-Periode der Stammzellen. In zumindest einem Kultursystem agiert IL-11, wie IL-6, synergistisch mit IL-3 bei der Unterstützung der Megakaryocyten-Koloniebildung [S. R. Paul et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 87: 7512- 7516 (1990)]. Deshalb scheint es, dass IL-11, ebenso wie G-CSF und IL-6, mit frühen und späten hämotopoetischen Linien wechselwirkt. Im Gegensatz zu IL-6 jedoch, das auch solch ein synergistischer Faktor ist, stimuliert IL-11 vorzugsweise nur die Proliferation von Makrophagen in sekundären Kulturen von gepoolten Blastenzellen. Deshalb scheint IL-11 verschieden zu sein von anderen bekannten Lymphokinen, Faktoren und Proteinen. IL-11 hat auch die Aufgabe, innerhalb der lymphoiden Linien eine Rolle zu spielen, was in einer Stimulation der verschiedenen Arme des Verteidigungssystems resultiert. Deshalb ist zu erwarten, dass Il-11 von Nutzen ist bei der Manipulation von Stammzellen für sowohl experimentelle als auch klinische Zwecke.
Die biologische Aktivität des Säuger-IL-11, das durch diese Sequenz codiert wird, wurde bei den funktionellen Polypeptiden nachgewiesen, die von Säugerzellen produziert wurden, die mit der clonierten Sequenz unter der Kontrolle geeigneter Expressions- Kontrollsequenzen transfiziert worden waren. Die clonierte Primatensequenz in Plasmid pPU34-TRA (pC1R6), wie in Tabelle I dargestellt, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland am 14. November 1989 unter der ATCC No. 68172 hinterlegt. Die clonierte menschliche Sequenz, die in Tabelle I durch die Modifikationen von der Primatensequenz auf sowohl dem Nucleotidlevel als auch dem Aminosäurelevel dargestellt ist, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland am 30 März 1990 unter der ATCC No. 68284 hinterlegt.
Das IL-11-Polypeptid ist in dem nachstehend beschriebenen T1165-Test aktiv. In anfänglichen Untersuchungen wurde gefunden, dass IL-11 die Bildung von Immunglobulinsezernierenden B-Zellen in einem Standard-Maus-Milzzellen-Plaquebildungstest beträchtlich erhöht, sogar bei so hohen Endverdünnungen wie 1 : 500. Dieses System mißt die Entwicklung von B-Zellen in Kultur, die auf ein spezifisches Immunogen ansprechen, 4-Hydroxy-3- nitrophenyl-acetyl-modifizierte rote Blutzellen vom Pferd (NP-HRBC), in der Gegenwart der normalen zellulären Bestandteile der Milz. Thy-1 Komplement-vermittelte Entfernung von T- Zellen von der Milz-Zellkultur resultierte in einer vollständigen Aufhebung der Antwort, was zeigte, dass das Anwachsen an auf NP reagierenden B-Zellen, sogar in der Gegenwart von Primaten-IL-11, zumindest teilweise von der Gegenwart von T-Zellen abhängt. Die Aktivität von IL-11 ist daher nicht einem direkten mitogenen Effekt auf B-Zellen zuordenbar, weil B- Zell-Mitogene, wie Lipopolysaccharide, die Bildung von NP-spezifischen Plaque-bildenden Zellen in der Abwesenheit von T-Zellen stimulieren. Daher kann IL-11 die Proliferation, Differenzierung und Aktivierung von T- und B-Lymphocyten regulieren.
Die Analyse der Effekte von IL-11 in einer Vielzahl von hämatopoetischen Kultursystemen zeigte eindeutige Wirkungen auf die Megakaryocyten-Entwicklung. Mit Maus-Knochenmarkszellen als Ziel hatte IL-11 allein wenig Wirkung, stimulierte aber dreifach die Megakaryocyten-Koloniebildung, die von IL-3 unterstützt wurde. CFU-Meg- Bildung mit IL-3 und IL-11 überstieg die von aplastischem Hundeserum, das als positive Kontrolle verwendet wird.
Die hier bereitgestellten IL-11-Polypeptide umfassen auch Faktoren, die durch ähnliche Sequenzen codiert werden wie die von rekombinantem IL-11 in Tabelle I, in denen aber Modifikationen natürlicherweise bereitgestellt oder bewußt eingebaut werden. Deshalb umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese neuen DNA-Sequenzen, die frei sind von Assoziationen mit DNA-Sequenzen, die andere Primaten-Proteine codieren, und die die Expression von IL-11-Polypeptiden codieren. Diese DNA-Sequenzen umfassen Sequenzen, die dieselben oder im wesentlichen dieselben sind wie die vorstehend identifizierten DNA- Sequenzen und Fragmente davon, und solche Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen [siehe T. Maniatis et al. Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 387 bis 389] an die DNA-Sequenzen von Tabelle I hybridisieren. Ein Beispiel einer solchen stringenten Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung in 4XSSC bei 65ºC, gefolgt von Waschen in 0.1XSSC bei 65ºC für eine Stunde. Eine alternative, beispielhafte, stringente Hybridisierungsbedingung ist 50% Formamid, 4XSSC bei 42ºC.
DNA-Sequenzen, die an die Sequenzen für IL-11 oder oder aktive Fragmente davon unter milden Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und die die Expression von IL-11- Peptiden codieren, die die biologischen Aktivitäten von IL-11 haben, codieren ebenfalls neue IL-11-Polypeptide. Beispiele für solche nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen sind 4XSSC bei 50º oder Hybridisierung bei 30-40% Formamid bei 42ºC. Zum Beispiel codiert eine DNA-Sequenz, die Bereiche von beträchtlicher Homologie mit den Sequenzen von IL-11 gemeinsam hat und die ein Protein codiert, das eine oder mehrere biologische Aktivitäten von IL-11 hat, eindeutig ein IL-11-Polypeptid, selbst wenn eine solche DNA-Sequenz nicht stringent an die Sequenzen von Tabelle oder von Fragmenten davon hybridisieren, die Peptide mit IL-11-Aktivität codieren.
In ähnlicher Weise werden DNA-Sequenzen, die IL-11-Polypeptide codieren, die sich aber wegen der Degeneration des genetischen Codes in der Codon-Sequenz unterscheiden, auch von dieser Erfindung umfaßt. Allelische Variationen (natürlicherweise vorkommende Basen-Veränderungen innerhalb der Spezies-Population, die in einem Aminosäure-Austausch resultieren können oder auch nicht) in den DNA-Sequenzen, die die IL-11-Protein-Sequenzen und Peptidfragmente davon codieren, die die biologische Aktivität von IL-11 zeigen, werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung erfaßt, ebenso wie Analoga oder Derivate davon. Andere Variationen in der DNA-Sequenz von IL-11, die durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen hervorgerufen werden, um gewisse Charakteristika des IL-11- Proteins zu verbessern, wie die biologische Aktivität, die Halbwertszeit oder die Produktion der davon codierten Polypeptide, werden ebenfalls von der Erfindung umfaßt.
Zusätzlich zu der Verwendung der vorstehenden cDNA-Sequenzen bei rekombinanten Techniken können die IL-11-Polypeptide dieser Erfindung mittels bekannter chemischer Synthese produziert werden. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide der vorliegenden Erfindung mittels synthetischer Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Die synthetisch hergestellten IL-11-Polypeptid-Sequenzen oder Fragmente davon, die kontinuierliche Sequenzen der Aminosäurereste von Tabelle I duplizieren oder teilweise duplizieren, sind ebenfalls Teil dieser Erfindung. Die synthetisch hergestellten IL-11- Polypeptid-Sequenzen können dadurch, dass sie primäre, sekundäre oder tertiäre Struktur- und Konformationscharakteristika mit natürlichem IL-11 gemeinsam haben, mit diesem IL-11 biologische Eigenschaften gemeinsam haben. Deshalb können sie Anwendung finden als biologisch aktive oder immunologische Ersatzstoffe für natürliche, gereinigte IL-11- Polypeptide bei therapeutischen und immunologischen Verfahren.
Modifikationen in den Protein-, Peptid- oder DNA-Sequenzen von IL-11 oder aktiven Fragmenten davon können unter Verwendung bekannter Verfahren von einem Durchschnittsfachmann vorgenommen werden. Modifikationen von Interesse in den IL-11- Sequenzen können den Ersatz, die Insertion oder Deletion von einer oder mehreren ausgewählten Aminosäureresten in der codierenden Sequenz umfassen. Mutagenese- Verfahren für einen solchen Ersatz, Insertion oder Deletion sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt [siehe, z. B., United States Patent 4,518,584.]
Andere spezifische Mutationen der Sequenzen des hier beschriebenen IL-11- Polypeptids können, z. B., die Insertion von einer oder mehrerer Glycosilierungsstellen umfassen. Eine mit Asparagin verknüpfte Glycosylierungs-Erkennungsstelle kann in die Sequenz durch die Deletion, Substitution oder Addition von Aminosäuren in die Peptidsequenz oder von Nucleotiden in die DNA-Sequenz inseriert werden. Solche Veränderungen können an jeder Stelle des Moleküls vorgenommen werden, das durch die Addition von O-verknüpften Carbohydraten modifiziert wird, oder an anderen Stellen im Molekül. Die Expression von solchen veränderten Nucleotid- oder Peptidsequenzen produziert Varianten, die an diesen Stellen glycosyliert werden können und die veränderte oder verbesserte pharmakologische oder biologische Eigenschaften haben können.
Zusätzliche Analoga und Derivate der Sequenz von IL-11, von denen zu erwarten ist, dass sie die IL-11-Aktivität ganz oder teilweise erhalten, können von einem Durchschnittsfachmann durch die hier gegebene Offenbarung leicht gemacht werden. Eine solche Modifikation kann die Anheftung von Polyethylenglycol (PEG) an bestehende Lysin- Reste in der IL-11-Sequenz sein oder die Insertion von einem oder mehrerer Lysin-Reste oder anderer Aminosäurereste, die mit PEG oder PEG-Derivaten reagieren können, in die Sequenz mittels herkömmlicher Verfahren, um die Anheftung von PEG-Gruppen zu ermöglichen. Es wird angenommen, dass solche Modifikationen von der Erfindung umfaßt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Produktion von IL-11- Polypeptiden oder aktiven Fragmenten davon bereit. Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt die Einführung von cDNA, die ein IL-11-Polypeptid codiert, in einen Expressionsvektor, um ein Expressionssytem für IL-11 herzustellen. Eine ausgewählte Wirtszelle wird mit dem Vektor transformiert und gezüchtet. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt daher die Kultur einer geeigneten Zelle oder Zelllinie, die mit einer DNA- Sequenz transformiert wurde, die die Expression eines IL-11-Polypeptids oder eines Fragments davon unter der Kontrolle bekannter regulatorischer Sequenzen codiert. Der exprimierte Faktor wird dann aus dem Kulturmedium (oder aus der Zelle, wenn er intrazellulär exprimierte wird) mittels geeigneter, dem Durchschnittsfachmann geläufiger Verfahren gewonnen, isoliert und gereinigt.
Geeigneten Zellen oder Zelllinien für dieses Verfahren können Säugerzellen sein, wie Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder 3T3-Zellen. Die Auswahl geeigneter Säugerwirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultur, Amplifizierung, Durchmusterung und Produktgewinnung und Reinigung sind im Stand der Technik bekannt. Siehe, z. B., Gething und Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981), oder alternativ Kaufmann et al. Mol. Cell. Biol., 5 (7): 1750-1759 (1985) oder Howley et al. U. S. Patent 4,419,446. Andere geeignete Säugerzelllinien sind die COS-1-Zelllinie vom Affen und die CV-1-Zelllinie. Weitere beispielhafte Säugerzellen umfassen insbesondere Primaten-Zeillinien und Nagetier- Zelllinien, einschließlich transformierte Zelllinien. Normale diploide Zellen, Zellstämme, die von in vitro-Kultur von primärem Gewebe abgeleitet sind, ebenso wie primäre Explantate, sind auch geeignet. Kandidatenzellen können genotypisch des Selektionsgens ermangeln oder können ein dominant agierendes Selektionsgen enthalten. Andere geeignete Säugerzelllinien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, HeLa, Maus-L-929-Zellen, 3T3-Linien, die von Swiss-, Balb-c- oder NIH-Mäusen abgeleitet sind, BHK- oder HaK-Hamster-Zelllinien.
Von ähnlichem Nutzen als Wirtszellen, die geeignet sind für die vorliegende Erfindung, sind Bakterienzellen. Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z. B., HB 101 und MC 1061) wohl bekannt als Wirtszellen im Gebiet der Biotechnologie.
Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas, andere Bazillen und dergleichen können bei diesem Verfahren ebenfalls zum Einsatz kommen.
Viele Stämme von Hefezellen, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, stehen als Wirtszellen für die Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung ebenfalls zur Verfügung. Zusätzlich können, wo erwünscht, auch Insektenzellen als Wirtszellen bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Siehe, z. B. Miller et al. Genetic Engineering, 8: 277-298 (Plenum Press 1986) und dort zitierte Literatur.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls rekombinante DNA-Moleküle oder Vektoren, zur Verwendung bei dem Verfahren zur Expression der neuen IL-11-Polypeptide bereit. Diese Vektoren enthalten die neu isolierten DNA-Sequenzen, die die IL-11-Polypeptide der Erfindung codieren. Alternativ sind auch Vektoren, die, wie vorstehend beschrieben, modifizierte Sequenzen beinhalten, Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und von Nutzen zur Produktion von IL-11-Polypeptiden. Der Vektor, der in dem Verfahren zur Anwendung kommt, enthält auch ausgewählte regulatorische Sequenzen in operativer Assoziation mit den codierenden DNA-Sequenzen der Erfindung, die in der Lage sind, die Replikation und Expression dieser in ausgesuchten Wirtszellen zu steuern.
Der Vektor, der in den nachstehenden Beispielen benutzt wird, ist pXM [Y. C. Yang et al. Cell, 47: 3-10 (1986)]. Die dort beschriebenen Säugerzell-Expressionsvektoren können mittels Verfahren synthetisiert werden, die dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt sind. Die Komponenten der Vektoren, z. B. Replicons, Selektionsgene, Enhancer, Promotoren und dergleichen, können aus natürlichen Quellen erhalten werden oder mittels bekannter Verfahren synthetisiert werden. Siehe Kaufmann et al. J. Mol. Biol., 159: 511-521 (1982); und Kaufmann, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 689-693 (1985). In einer anderen Ausführungsform kann die Vektor-DNA das gesamte oder Teile des Genoms des Rinder-Papilloma-Virus enthalten [Lusky et al. Cell, 36: 391-401 (1984)] und in Zelllinien wie C127-Mauszellen als stabiles episomales Element gebracht werden. Die Transformation dieser Vektoren in geeignete Wirtszellen kann in einer Expression der IL-11-Polypeptide resultieren.
Andere geeignete Expressionsvektoren, von denen zahlreiche Typen für Säuger-, Insekten-, Hefe-, Pilz- und Bakterienexpression im Stand der Technik bekannt sind, können ebenfalls für diesen Zweck verwendet werden.
IL-11, das aus zellulären Quellen zur Homogenität gereinigt ist, oder rekombinant oder synthetisch produziert ist, kann in pharmazeutischen Zubereitungen oder Formulierungen zur Behandlung von Immundefekten oder Immunstörungen verwendet werden. IL-11 kann auch zur Behandlung von Defekten bei hämatopoetischen Vorläufer- oder Stammzellen oder damit zusammenhängenden Störungen verwendet werden. IL-11-Zubereitungen können auch bei Verfahren zur Behandlung von Krebs und anderen pathologischen Zuständen zur Anwendung kommen, die von Krankheiten, Einwirkung von Strahlung oder Medikamenten resultieren, umfassend, z. B., Leukopenie, bakterielle und virale Infektionen, Anämie, B-Zell- oder T-Zell- Defekte, einschließlich Immunzell- oder hämatopoetische Zelldefekte nach einer Knochenmarkstransplantation. IL-11 kann auch verwendet werden, um die Immunantwort auf eine Reihe von Impfstoffen zu verstärken, was eine länger anhaltende und effektivere Immunität schafft. Wie früher erwähnt können IL-11-Zubereitungen verwendet werden, um die Entwicklung von B-Zellen und Megakaryocyten zu stimulieren. Die therapeutische Behandlung von solchen Krankheitszuständen mit diesen IL-11-Polypeptid-Zubereitungen kann unerwünschte Nebeneffekte vermeiden, die bei der Behandlung mit den gegenwärtig verfügbaren Medikamenten auftreten.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch, allein oder in Kombination mit anderen Cytokinen, Hämatopoietinen, Inteleukinen, Wachstumsfaktoren oder Antikörpern, verwendet werden zur Behandlung der vorstehend identifizierten Zustände.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren und therapeutische Zubereitungen zur Behandlung der vorstehend zitierten Zustände bereit. Solche Zubereitungen umfassen eine therapeutische wirksame Menge eines IL-11-Polypeptids der vorliegenden Erfindung in Beimischung zu einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Diese Zubereitung kann systematisch parenteral verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Zubereitung intravenös verabreicht werden. Wenn erwünscht, kann die Zubereitung subkutan oder topisch, d. h. an der Stelle der Wunde, verabreicht werden. Wenn die therapeutische Zubereitungen zur Verwendung bei dieser Erfindung systemisch verabreicht wird, ist sie in der Form einer pyrogenfreien, parenteral akzeptierten, wäßrigen Lösung. Die Herstellung einer solchen pharmazeutisch akzeptablen Proteinlösung, unter angemessener Berücksichtigung des pH, der isotonen Bedingungen, der Stabilität und dergleichen ist für den Fachmann möglich.
Der Dosisbereich, der bei einem Verfahren zur Behandlung der vorstehend beschriebenen Zustände einzuhalten ist, wird durch die Überlegungen des begleitenden Arztes hinsichtlich verschiedener Faktoren bestimmt, die die Wirkung von Medikamenten modifizieren, wie, z. B., der Zustand, das Körpergewicht, das Geschlecht und die Diät des Patienten, die Schwere jeglicher Infektion, der Zeitpunkt der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Im allgemeinen sollte die tägliche Dosis im Bereich von 1-1000 Mikrogramm an Polypeptid oder 50 bis 5000 Einheiten (d. h., eine Einheit ist die Konzentration, die zur halb-maximalen Stimulierung im T1165-Test führt) an Polypeptid pro Kilogramm Körpergewicht sein.
Die therapeutischen Verfahren und Zubereitungen der vorliegenden Erfindung können auch die gleichzeitige Verabreichung von anderen menschlichen Faktoren umfassen. Beispielhafte Cytokine oder Hämatopoietine für eine solche Verwendung umfassen die bekannten Faktoren IL-1 bis IL-9, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIF, LIF, Meg-CSF, die Interferone, TNF und Erythropoietin. Besonders wünschenswerte Kandidaten zur Beteiligung bei der IL-11-Therapie können IL-3 und IL-6 umfassen. Auch Wachstumsfaktoren wie der B- Zell-Wachstumsfaktor, der B-Zell-Differenzierungsfaktor oder der eosinophile Differenzierungsfaktor können sich bei der gleichzeitigen Verabreichung mit IL-11 als nützlich erweisen. Die vorstehend erwähnten Dosierungen würden angepaßt werden, um solche zusätzlichen Komponenten in der therapeutischen Zubereitung auszugleichen. Eine Verbesserung bei dem behandelten Patienten können mittels herkömmlicher Verfahren festgestellt werden.
Andere Verwendungen für diese neuen Polypeptide liegen in der Entwicklung von Antikörpern, die mittels Standardverfahren für in vivo oder in vitro diagnostische oder therapeutische Verwendungen erzeugt werden. Solche Antikörper können sowohl monoclonale als auch polyclonale Antikörper umfassen, ebenso wie chimäre Antikörper oder "rekombinante" Antikörper, die mittels bekannter Verfahren erzeugt werden. Ebenso werden durch diese Erfindung die Zelllinien bereitgestellt, die erzeugt werden durch Darbieten von IL- 11 oder eines Fragments davon als Antigen an einen ausgewählten Säuger, gefolgt von einer Fusionierung von Zellen diese Tieres mit gewissen Krebszellen, um mittels bekannter Verfahren unsterbliche Zelllinien zu erzeugen. Die Verfahren, die zur Herstellung solcher Zeillinien und Antikörper, die gegen das gesamte oder Teile von Säuger-IL-11-Polypeptid der vorliegenden Erfindung gerichtet sind, angewendet werden, werden durch diese Erfindung ebenfalls umfaßt.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können für Zwecke der in vivo- und in vitro-Diagnostik verwendet werden, wie durch Assoziation der Antikörper mit nachweisbaren Markern oder Markienzngssystemen. Alternativ können diese Antikörper für Zwecke der in vivo- und in vitro-Therapie verwendet werden, wie durch Assoziation mit gewissen toxischen oder therapeutischen Verbindungen oder Gruppen, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
Die folgenden Beispiele beschreiben illustrativ die Clonierung, Expression und Produktion von Säuger-IL-11 und andere Verfahren und Produkte der vorliegenden Erfindung. Diese Beispiele sind zur Verdeutlichung und beschränken nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1 - Isolierung von mRNA und Konstruktion einer cDNA-Bibliothek.

Eine Primaten-Zelllinie, pU34, wurde entwickelt und es wurde gefunden, dass sie in der Gegenwart von neutralisierendem Antikörper gegen IL-6 eine signifikante Aktivität im T1165-Test von Beispiel 7 entwickelte. Die Stroma-Zelllinie pU-34 wurde von einer Langzeit- Primaten-Markkultur durch Immortalisierung mit einem defekten amphotropen, transformierenden, retroviralen Vektor abgeleitet. Das U19 retrovirale Plasmid wurde wie kürzlich berichtet [P. S. Jat et al. J. of Virol 59: 746-750 (1986)] konstruiert und enthält die große SV40-T-Antigen-Sequenz und die neo-Phosphotransferase-Sequenz, die die G418- Resistenz codiert, die vom langen, terminalen Repeat des Moloney-Maus-Leukämievirus exprimiert wird. Ein amphotroper Produktionsclon wurde hergestellt durch Infektion der verpackenden Zelllinie ψAM [R. Cone et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 6349-6353 (1984)] mit einer Ernte an ecotropem Virus von ψ2U19-5 [P. 5. Jat, vorstehend zitiert], gefolgt von Selektion in 0,75 mg/ml G418.
Ein Clon ψAMU19-BL produziert rekombinanten SV40-Virus mit einem Titer von 5 · 10³ 6418-resistenten CFU/ml, wenn auf NIH/3T3-Zellen getestet. Langzeit-Markkulturen (LTMC) wurden unter Verwendung von Standardverfahren etabliert und in Iscove's modifiziertem Dulbecco's Medium (IMDM) gehalten, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 10% Pferdeserum, 100 Einheiten Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) vollständiges Langzeit-Kulturmedium.
Die an LTMC adhärente Schicht wurde 7 und 10 Tage nach Etablierung mit 2 ml an ψAMU19-BL-Virus-Vorratslösung in der Gegenwart von 8 ug/ml Polybren (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) für 2,5 Stunden bei 33ºC infiziert. Beginnend drei Tage nach der Infektion wurden die Kulturen in 0,5 mg/nil G418 selektioniert. Vierzehn Tage nach der Infektion wurden G418-resistente Kolonien gesammelt und in Multiwell-Platten (Corning Glassware, Corning, NY) expandiert.
Das konditionierte Medium von einer Zelllinie, als PU-34 bezeichnet, wurde ausführlich analysiert, basierend auf seiner Fähigkeit, Vorläuferzellen in Langzeit-Kultur zu erhalten. Diese Zelllinie zeigte die Fähigkeit, multipotente menschliche und Primaten- Vorläuferzellen für bis zu drei Wochen in Kultur zu erhalten. Zusätzlich zu den bekannten Wachstumsfaktor-Aktivitäten einschließlich IL-6, IL-7, GM-CSF, M-CSF, G-CSF und LIF/HILDA zeigte sich konditionierte Medium von mit IL-1a stimuliertem PU-34 in der Lage, die Proliferation der T1165-Maus-Plasmacytom-Zelllinie zu stimulieren, die normalerweise auf IL-6 reagiert [R. P. Nordan et al. vorstehend zitiert], sogar in der Gegenwart von neutralisierendem Antiserum gegen menschliches IL-6. Dieser biologische Test wurde während der Expressionsclonierung einer cDNA-Bibliothek verwendet, die aus PU-34 hergestellt worden war. Dieser biologische Test wird nachstehend in Beispiel 7 ausführlich beschrieben.
Die cDNA-Bibliothek von PU-34-Zellen wurde wie folgt hergestellt: PU-34-Zellen wurden 24 Stunden mit IL-1α bei einer Konzentration von 2 Einheiten/ml stimuliert. Polyadenylierte RNA (Poly A + RNA) wurde von diesen Zellen unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt. Die gesamte RNA wurde entsprechend dem Verfahren von Chirgwin et al. Biochemistry, 18: 5294-5299 (1979) von den stimulierten pU34-Zellen extrahiert. mRNA wurde mittels Oligo (dT)-Cellulose-Chromatographie [H. Aviv et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 1408-1412 (1972)] gewonnen.
Fünf Mikrogramm an mRNA wurden verwendet, um doppelsträngige cDNA zu synthetisieren, wie von Wong et al. vorstehend zitiert, beschrieben, mit DNA-Polymerase 1 und RNAse H bei der zweiten Strangreaktion [T. Maniatis et al. vorstehend zitiert]. Der Cos- 1-Zellen-Expressionsvektor pXM [Y. C. Yang et al. Cell 47: 3-10 (1986)] wurde an der einzigen Xho I-Stelle linearisiert und ligiert mit äquimolaren Mengen an halb-Xho-adaptierter cDNA. Die Ligierungsreaktion wurde verwendet, um kompetente E. coli (Stamm HB 101) [Y. C. Yang et al. vorstehend zitiert] zu transformieren, um eine Bibliothek von etwa 500000 Ampicillin-resistenten Kolonien zu erzeugen.

Beispiel 2 - DNA-Herstellung und COS-1-Zell-Transfektion

Das Expressions-Clonierungssystem, das zuvor von G. G. Wong et al. vorstehend zitiert, beschrieben worden war, wurde wie folgt angewendet, um eine cDNA zu isolieren, die die IL-11-Aktivität codiert.
Bakterienkolonien wurden auf Nitrocellulosefilter repliziert. Kolonien von jedem Filter wurden in L-Brühe gekratzt und Plasmid-DNA wurde mittels zuvor beschriebener Verfahren [J. A. Meyers et al. J. Bacteriol., 127: 1529-1536 (1976)] isoliert. Jede primäre DNA-Probe wurde aus einem Pool von 200-500 Kolonien hergestellt.
Fünf Mikrogramm von jeder Plasmid-DNA wurden verwendet, um Cos-1-Zellen mittels des Diäthylaminoäthyl-Dextran (DEAE)-Protokolls unter Zugabe von 0,1 mM Chloroquin [L. M. Sompayrac et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7575-7578 (1981) und H. Luthman et al. Nucl. Acids Res., 11: 1295-1308 (1983)]; Y. C. Yang et al. vorstehend zitiert] zu transfizieren. Kulturüberstand von transfizierten Cos-1-Zellen wurde 72 Stunden nach der Transfektion geerntet und auf T1165-stimulierende Aktivität getestet (siehe Beispiel 7).
Von den 317 durchmusterten Pools wurde die Plasmid-DNA von den zwei positiven Pools, die nachweisbare Level von IL-6 enthielten (bestimmt durch Neutralisation mit anti-IL- 6-Antikörper) und restliche Aktivität in dem T1165-Test in Gegenwart von anti-IL-6- Antikörper, in COS-1-Zellen re-transfiziert und die transfizierten Überstände wurden erneut durchmustert auf Aktivität in dem T1165-Test. Ein Pool mit solcher Aktivität wurde ausgewählt und aufgeteilt, um eine kleinere Zahl an Clonen zu enthalten. Ein Pool von dieser Gruppe wurde ausgewählt, der eine höhere Aktivität in dem Test zeigte als die gesamte Sammlung an Pools. Von diesem Pool wurden individuelle Kolonien gesammelt. Ihre DNAs wurden gewonnen, transfiziert und die transfizierten Überstände wurden durchmustert auf Aktivität in dem T1165-Test. Zwei positive Clone wurden identifiziert, einer exprimierte IL-6- Aktivität, der andere exprimierte eine Aktivität, die durch anti-IL-6-Antikörper nicht neutralisiert wurde. Dieser letztere Pool wurde aufgeteilt und das Transfektions-Verfahren wiederholt, bis ein einziges positives Plasmid, das alternativ pC1R6 oder pPU34-TRA genannt wurde, erhalten wurde, das die neue T1165-Proliferations-Aktivität codierte. Dieser Clon wurde erneut überprüft in dem Test von Beispiel 7.
Die Aktivität von dem konditionierten Medium von pC1R6-transfizierten Cos-1-Zellen wurde auch mit anderen Cytokinen verglichen, d. h. Maus- und menschliches IL-6 und Maus- GM-CSF. Das konditionierte Medium stimulierte einen meßbaren Einbau von ³H-Thymidin durch T1165-Zellen, sogar bei Endverdünnungen von bis zu 1 : 1000. Bei optimalen Konzentrationen unterstützte das neue Cytokin einen Einbau, der mehr als 100-fach über dem Hintergrund lag.
Die Insertion dieser cDNA wurde mittels des Didesoxy-Kettenbeendigungsverfahrens auf supergeknäulten Matrizen mit synthetischen Oligonucleotid-Primern [F. Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 5463-5467 (1977)] sequenziert. Die Nucleotidsequenz der pC1R6- cDNA, die in Tabelle I gezeigt wird, enthält einen einzigen, langen, offenen Leserahmen von 597 Nucleotiden, der ein vorhergesagtes Polypeptid von 199 Aminosäuren codiert. In direkter Nachbarschaft zu dem putativen Initiationscodon gelegen ist eine Strecke von 17-20 hydrophoben Aminosäuren, die einer herkömmlichen sekretorischen Leader-Sequenz von Proteinen ähnelt.
Obwohl sich der anfängliche cDNA-Clon, pC1R6, als unvollständig herausstellte, ergab die Analyse von zusätzlichen Clonen, dass dieses Transkript ungefähr 420 Basenpaare der 3' nicht codierenden Sequenz enthält mit vielen Kopien der RNA-Instabilitätssequenz, ATTTA, von der man glaubt, dass sie ein wichtiges regulatorisches Element für die Genexpression der Cytokine ist [G. Shaw et al. Cell, 46: 659-667 (1986)].

Beispiel 3 - Proteinanalyse

Das Polypeptid, das von der cDNA von pPU34-TRA codiert wird, wurde unter Verwendung von Puls-Markierungsexperimenten identifiziert. Achtundvierzig Stunden nach Induktion mit Chloroquin wurden die Kulturüberstände von COS-1-Zellen, die mit rekombinanter DNA von IL-11-Clonen transfiziert worden waren, entfernt und die Zellen wurden mit 0,5 mCi [³&sup5;S]-Methionin in 1,0 ml DMEM vier Stunden bei 37ºC Puls-markiert. Proben von 10 Mikroliter des radiomarkierten Überstands wurden gesammelt und dann einer 15% SDS-PAGE mit dem Laemmli-Puffer-System auf einem 12% Gel [U. K. Laemmli, Nature, 227: 680-685 (1970)] unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in eine die Fluorographie verstärkende Lösung [Enhance; New England Nuclear, Boston, MA] getaucht, getrocknet und ein Röntgenfilm belichtet.
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Analyse von konditionierten Medium von pC1R6-transfizierten Cos-1-Zellen, die mit ³&sup5;S-Methionin markiert waren, zeigte die Anwesenheit einer dominanten 20 kD-Spezies, die in den scheintransfizierten Kontrollen nicht anwesend war, in Übereinstimmung mit dem Molekulargewicht, das für ein sezerniertes Protein von etwa 180 Aminosäuren zu erwarten ist.
Die Größenschätzung ebenso wie das Fehlen von Heterogenität des exprimierten Proteins sind in Übereinstimmung mit der Abwesenheit der Consensus-Sequenz (Asn-X- Thr/Ser) [R. J. Winzler in "Hormonal Proteins and Peptides", Hrsg. Li C. H. (Academic Press, New York), pp. 1 (1973)] für die Addition von Asparagin-verknüpften Kohlenhydraten. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz des reifen Proteins umfaßt keine Cystein-Reste, eine Eigenschaft, die bei keinem anderen Cytokingen gefunden wird.

Beispiel 4 - Menschliche Zelllinien, die IL-11 exprimieren

Zwei menschliche Zeillinien wurden als Quelle für zumindest eine Art von IL-11 identifiziert. Insbesondere wurde die menschliche Lungen-Fibroblasten-Zelllinie MRC-5, erhältlich von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC CCL 171, wenn sie mit einer Einheit/ml von rekombinantem menschlichem IL-1-alpha (Genetics Institute, Inc.) und 107M Phorbol-12-13-dibutyrat (Sigma) induziert worden war, in dem T1165-Test getestet. Bei dem induzierten konditionierten Medium wurde beobachtet, dass es bei dem Test mehr cpm zeigte als es IL-6 beim Sättigungsgrad tut, d. h. eine ähnliche Aktivität zu der, wie sie induziertes konditioniertes Medium von PU34 zeigt. Es ist festgestellt worden, dass die Anwesenheit von IL-11 ein niedriges IL-6-Signal verstärken wird. Wie nachstehend detailliert beschrieben, zeigt der Northern-Blot dieser Zelllinie zusätzlich die Anwesenheit von Messenger für IL-11.
Außerdem zeigt auch die menschliche trophoblastische Zelllinie TPA30-1, erhältlich von ATCC unter der Hinterlegungsnummer CRL 1583, ohne Induktion die Anwesenheit von Messenger für IL-11 in Northern-Blots.
Andere menschliche Quellen für IL-11 können auch verfügbar sein und können gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung leicht identifiziert werden.

Beispiel 5 - RNA-Analyse

A. PU34

Fünf Mikrogramm der gesamten zellulären RNA von bakteriellen, IL-1-alpha induzierten PU34-Zellen wurden durch ein 1, 2% Agarose-GeI, das 2.2M Formaldehyd enthält [H. Lehrach et al. Biochemistry, 16 : 4743 (1977)], einer Elektrophorese unterworfen. Die Formaldehyd-denaturierte RNA wurde auf ein Nylon-Filter (Zetabind; Cuno, Meriden, CT) übertragen, wie beschrieben [E. M. Southern, J. Mol. Biol., 98: 503-517], und mit ³²P- markierten cDNA-Sonden durchmustert.
Eine cDNA-Sonde wurde durch Ausschneiden der cDNA-Insertionen aus dem Vektor mit dem Restriktionsenzym Xho I und Markierung der Insertionen mit ³²P-dCTP unter Verwendung von zufälligen Oligonucleotid-Primern in der Gegenwart des großen Fragments der DNA-Polymerase I [A. P. Feinberg et al. Analy. Biochemistry, 132: 6-13 (1983)] hergestellt. Das Nylon-Filter wurde 4 Stunden bei 65ºC prähybridisiert, mit der ³²P-dCTPmarkierten cDNA-Sonde in Hybridisierungslösung, die aus 4XSSC, 0,5% SDS 5X Denhardt's Lösung und 100 ug/ml denaturierter Heringssperma-DNA bestand, 16 Stunden bei 65ºC hybridisiert. Andere verwendete Sonden umfaßten menschliches (rh) IL-1α, rhIL-2, rhIL-3, rhIL-4, rhIL-5, rhIL-6, rhIL-7, rhlL-9, rhGM-CSF, rhM-CSF, LIF/HILDA und Primaten-IL- 11.
Nach der Hybridisierung wurde das Filter zweimal mit 2XSSC/0,1% SDS 30 Minuten bei 65ºC gewaschen, dann mit 0,2XSSC/0,1% SDS 30 Minuten bei 65ºC. Das Filter wurde dann getrocknet und dann bei -70ºC in der Gegenwart eines Calciumwolframat- Verstärkungsschirms auf einen Röntgenfilm appliziert.
Die Northern-Blot-Analyse zeigte, dass die PU34-mRNA zwei Arten von IL-11- Transkripten hat, mit einer Messenger-Größe von etwa 2,5 kb und etwa 1,5 kb, die mit der pC1R6-Sonde hybridisieren. Die Größe der cDNA-Sequenz der vorstehenden Tabelle I korreliert gut mit dem kleineren Messenger. Diese Differenz resultiert aus alternativem Spleißen, um zusätzliche 3'-nicht codierende Sequenzen in dem größeren Transkript zu ergeben, wie gezeigt durch die Isolierung und Analyse zusätzlicher cDNA-Clone. Die Anwesenheit der zwei Transkripte bei PU34-Zellen scheint von IL-1a reguliert zu werden, denn keines der Transkripte war in der Abwesenheit von IL-1a-Induktion erkennbar.
Keines der Transkripte wurde mittels RNA-Blot-Analyse bei Präparationen von mRNA von den menschlichen T-Zelllinien C10-MJ2 [Leary et al. Blood, 69: 953 (1987)], CS- MJ2 [Arya et al. Science, 223: 1086 (1984)] und Mo [Golde et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77: 593 (1980)] von Lektin-stimulierten, menschlichen peripheren Blutlymphozyten oder von menschlicher Plazenta identifiziert. Deshalb sieht es so aus, dass die einzige identifizierte Quelle für IL-11 vom Mesenchym abgeleitete adhärente Zellen sind.

B. MRC-5

Von der menschlichen, fötalen Lungenfibroblasten-Zelllinie (MRC-5), wie beschrieben von Jacobs et al. Nature, 227: 43 (1970), wurde gefunden, dass sie beide Transkripte nach Stimulierung mit 50 ng/ml Phorbal-myristat-acetat (PMA) und 1 Einheit/ml IL-1a exprimiert.
Wie vorstehend für PU34-RNA beschrieben, wurden zwei Arten von Transkripten identifiziert mit identischer Messenger-Größe von etwa 2,5 kb und etwa 1,5 kb in dieser Zelllinie. Die Analyse der menschlichen cDNA-Sequenz, die von der MRC-5-Zelllinie isoliert worden war, zeigte, dass die codierenden Bereiche von Primaten und Mensch auf der Nucleotidebene etwa 95% Identität besitzen.

C. TPA30-1

Wenn die gleichen Verfahren auf die menschliche, SV40-transformierte Trophoblasten-Zelllinie TPA30-1 angewendet wurden, unter Verwendung der gleichen Sonde, wurde nur der größere, etwa 2, 3 umfassende kb IL-11-Messenger identifiziert.

Beispiel 6 - DNA-Sequenzanalyse

Die Nucleotidsequenz des cDNA-Clons von pPU34-TRA wurde wie beschrieben [G. 6. Wong et al und Y. C. Yang et al. vorstehend zitiert] bestimmt durch Erzeugung geordneter Sätze von überlappenden Fragmenten mittels Verdau mit Bal 31-Nuclease und Subclonierung in den M13-Vektor [M. Poncz et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 : 4298-4302 (1982); und J. Messing et al. Gene, 19: 269-276 (1982)]. Einzelsträngige DNA wurde hergestellt und die Nucleotidsequenz mittels des Didesoxynucleotid-Kettenbeendigungs-Verfahrens [F. Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977)] bestimmt. Diese Nucleotidsequenz erscheint vorstehend in Tabelle I.

Beispiel 7. Biologische Aktivität in Tests

A. T1165-Proliferationstest.

IL-6-äbhängige T1165-Maus-Plasmacytoma-Zellen [R. P. Nordan et al. Science, 233: 566 (1986); erhalten von Dr. Nordan, National Institute of Health] werden routinemäßig in RPMI wachsen gelassen, ergänzt mit 10% Hitze-inaktiviertem, fötalem Kälberserum, 2mM Glutamin, 100 u/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin (alles von Gibco, Grand Island, NY), 5 · 10&supmin;&sup5; M beta-Mercaptoethanol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), und ergänzt mit 10-20 U/ml rekombinantem, menschlichem IL-6, das in CHO-Zellen produziert worden war (Genetics Institute, Inc.). Zwei bis vier Tage nach der Passage werden die Zellen aus der Kultur entfernt, zweimal gewaschen, um restliches IL-6 zu entfernen, und mit einer Konzentration von 7,5 · 10&sup4; bis 1 · 10&sup5; Zellen/ml resuspendiert.
Serielle Verdünnungen der zu testenden Probe (entweder PU 34-konditioniertes Medium oder pC1R6-transfizierte COS-Zellen-konditioniertes Medium) werden doppelt in 100 ul Kulturmedium ohne IL-6 in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gemacht. 100 ul der obigen Zellsuspension werden dann zu jeder Vertiefung zugegeben und die Platten werden bei 37ºC 2-3 Tage inkubiert; 0,5 uCi von 3H-Thymidin [DuPont, Wilmington, DE] werden pro Vertiefung für die letzten sechs Stunden des Tests zugegeben. Die Zellen werden auf GFC Typ C Filterpapier (LKB) geerntet, mit Wasser und Ethanol gewaschen und getrocknet. Die Filter werden dann in Scintillationsflüssigkeit getaucht und auf einem LKB Flachbett- Scintillationszähler gezählt. Die Proliferation wird mittels der Aufnahme von ³H-Thymidin gemessen.
Induziertes konditioniertes Medium von PU34-Zellen verursachte eine größere Proliferation der T1165-Zellen als Sättigungsgrade von IL-6, was die Anwesenheit eines anderen Faktors nahelegt. Wenn in der Gegenwart von Antikörper gegen menschliches IL-6 getestet wurde, verblieb eine niedrige, aber eindeutige Aktivität in dem konditionierten Medium. Fraktionierte Proben von konditioniertem Medium von IL-1-induzierten PU34, die sehr niedrige Spiegel an IL-6 enthielten, wurden ebenfalls mit und ohne Antikörper gegen menschliches IL-6 getestet und die Ergebnisse legten die Anwesenheit eines Faktors nahe, der in kleinem Maße selbst proliferativ war und in der Lage, mit niedrigen Spiegel an IL-6 synergistisch zu wirken.
Überstände von COS-Zellen von der Transfektion der pU34-Bibliothek wurden ebenfalls auf Aktivität getestet, allein und in der Anwesenheit eines Cocktails von Antikörpern gegen menschliches IL-6 plus sub-optimale Spiegel von Maus-IL-6. Der Antikörper ist in der Lage, das Primaten-IL-6 zu neutralisieren, das von den PU34-Zellen produziert wird, ist aber nicht in der Lage, das Maus-IL-6 zu neutralisieren. Deshalb konnte auf einen synergistischen Faktor durchmustert werden, ohne Interferenz von dem PU-34-IL-6, das in der Bibliothek anwesend war.
Das reife IL-11-Protein von Tabelle I ist charakterisiert durch halb-maximale Aktivität von 100 Verdünnungseinheiten pro ml in diesem Test.

B. B-Zell-Plaquebildungstest.

Ein B-Zell-Plaquebildungstest wurde auf von COS-Zellen exprimiertes IL-10 entsprechend den von R. M. O'Hara et al. J. Immunol., 141: 2935-2942 (1988) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Der Maus-Plaquebildungstest wurde durch Inkubation von 7,5 · 10&sup6; Milzzellen von naiven C57B1/6-Mäusen mit 3 · 106 4-Hydroxy-3-nitrophenyl-acetylmodifizierten roten Blutzellen des Pferds (NP-HRBC) in 0,75 ml Mishell-Dutton-Medien [R. I. Mishell et al. J. Exp. Med., 126: 423-442 (1967)], die mit 5% fötalem Kälberserum ergänzt waren, mit oder ohne Testprobe (COS-Zellen-konditioniertes Medium, das IL-11 enthielt) für 5 Tage durchgeführt. NP-gekoppelte rote Blutzellen des Pferds (H-RBC) oder rote Blutzellen des Schafs (S-RBC) wurden hergestellt durch Reaktion von 10 mg NP-O-Succinimid (Cambridge Biochemical, Inc., Cambridge, England) in Dimethylformamiid (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) mit 1 ml gepackten H-RBC oder S-RBC (Colorado Serum Co., Denver, CO), wie zuvor beschrieben [P. B. Hausman et al. J. of Immunol., 134: 1388-1396 (1985)].
Diese Kulturen wurden täglich durch Zugabe von 0,1 ml Ergänzungsmedium gefüttert, das 5% fötales Kälberserum ohne Testprobe enthielt (das konditionierte Medium). Auf NP ansprechende B-Zellen wurden am Ende der Kulturperiode unter Verwendung des NP- gekoppelten Schaf-RBC-Plaquetests, wie von Dresser et al. in "Handbook in Experimental Immunology" (D. M. Weir, Blackwell, Oxford), S. 271 (1973) beschrieben, identifiziert, wobei der Prozentsatz Ansprechen berechnet wurde durch Vergleich der Zahl an Plaques, die mit Kulturen erhalten wurden, die von konditioniertem Medium versetzt wurden, das IL-11 enthielt, mit den Kulturen, die mit Medium allein versetzt wurden. In einem typischen Experiment ergaben die Hintergrund-Antworten in der Abwesenheit von exogenen Faktoren 6000 NP-spezifische Plaque-bildende Zellen pro 7,5 · 10 plattierten Zellen.
Die Ergebnisse eines solchen Tests können in Fig. 1 gesehen werden. Der Prozentsatz an Kontrollantwort ist der Anstieg bei der Entwicklung an NP-ansprechenden B-Zellen in 5- Tages-Kulturen von naiven Milzzellen, die mit NP-HRBC stimuliert wurden, die mit den angezeigten Verdünnungen von pC1R6-transfizierten cos-1-Zellen-konditioniertem Medium versetzt wurden, verglichen mit Kontrollkulturen, die mit Medium allein ergänzt wurden. COS-produziertes Säuger-IL-11 produziert einen zweieinhalb- bis dreifachen Anstieg der Plaque-bildenden Einheiten/Kultur bei diesem Test, was anzeigt, daß IL-11 entweder eine direkte Rolle spielt bei der B-Zellen-Stimulierung und -Differenzierung oder eine indirekte Rolle in der Stimulierung der T-Zellen zur Sekretion anderer Cytokine, die die B-Zell-Antwort beeinflussen.

C. Maus-Fibrinklümpchen-Test

Von COS-Zellen produziertes Säuger-IL-11 wurde ebenfalls auf Aktivität in dem Megakaryocyten-Koloniebildungstest untersucht, im wesentlichen durchgeführt wie von S. Kuriya et al. Exp. Hematol., 15: 896-901 (1987) beschrieben und modifiziert durch die Zugabe von 2% Kälberserum. Kurz beschrieben wurde der Maus-Koloniebildungseinheit- Megakaryocyten (CFU-Meg)-Test durch Ausplattierung von 2,5 · 10&sup5; Maus- Knochenmarkszellen in 0,4 ml an IMDM, ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum, in Gefäßen mit sechs Vertiefungen. Die Klümpchenbildung wurde durch Zugabe von 0,25 mg Fibrinogen und 0,25 Einheiten Thrombin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei 37ºC initiiert. Die Testproben mit den verschiedenen Verdünnungen wurden zu den Fibrinklümpchen zugegeben und die Kulturen anschließend 6 Tage bei 37ºC inkubiert. Die Klümpchen wurden mit 2,5% Glutaraldehyd fixiert und mit 0,5 mg/ml Acetylthiocholinjodid gefärbt, wie beschrieben in Kuriya et al. vorstehend zitiert, und A. Nakeffet al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 151: 587-590 (1976). Positive Kolonien (die nur Megakaryocyten enthielten) wurden unter einem Direkt- Mikroskop ausgezählt. Die Koloniezahlen wurden zweifach ausgewertet.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse. Die Koloniezahl steht für die Gesamtzahl an Megakaryocyten-Kolonien (Acetylcholinesterase-positive Zellen) in 6-Tage-Kulturen von Maus-Knochenmarkszellen versehen mit: (1) einer 1 : 10-Verdünnung von aplastischem Anämie-Serum vom Hund; (2) 150 Einheiten/ml Maus-IL-3; (3) kein Stimulus; und Verdünnungen von (4) 1 : 10 oder (5) 1 : 50 an pC1R6-transfizierten cos-1-Zellenkonditioniertem Medium allein oder (6) 1 : 10 oder (7) 1 : 50 an pC1R6-transiizierten cos-1-Zellen-konditioniertem Medium ergänzt mit 150 Einheiten/ml Maus-IL-3. Wenn IL-11 in diesem Test allein getestet wurde, wurde wenig Antwort nachgewiesen.
Wenn jedoch IL-11 in diesem Test in der Anwesenheit von rekombinantem Maus-IL-3 getestet wurde, zeigten die Testergebnisse, daß die Kombination von IL-11 und IL-3 die Produktion und Reifung von Megakaryocytenzellen in diesem Test in beträchtlichem Maß stimulierte. Dieser Test zeigte, daß Säuger-IL-11 mit IL-3 einen synergistischen Effekt auf die Stimulierung der Megakaryocytenentwicklung hat.

Beispiel 8 - Erhalten von menschlichen IL-11

Um die clonierte Sequenz für menschliches IL-11 zu erhalten, wurde die PU34 IL-11- cDNA, die mit der menschlichen IL-11-mRNA von vorstehendem Beispiel 5 hybridisierte, verwendet, um eine cDNA-Bibliothek zu durchmustern, die von der vorstehend beschriebenen menschlichen Lungenfibroblasten-Zelllinie MRC-5 hergestellt worden war. Rekombinante von dieser Bibliothek wurden ausplattiert und von diesen Platten wurden doppelte Nitrocellulose-Replikate gemacht. Diese Replikate wurden über Nacht bei 65ºC in Standard- Hybridisierungslösung (4XSSC) mit der Säuger-IL-11-cDNA hybridisiert, die unter Verwendung des Zufalls-"priming"-Markierungsverfahrens [A. P. Feinberg, vorstehend zitiert] mit ³²P-dCTP markiert worden war. Die Filter wurden dann bei der gleichen Temperatur mit 0,2XSSC gewaschen, bis die Hintergrund-Radioaktivität bis zu einem akzeptablen Spiegel vermindert war, um den Nachweis von spezifisch hybridisierenden Sequenzen zuzulassen. Die Kolonien, von denen gefunden wurde, daß sie mit der Säuger-IL- 11-Sonde auf den duplizierten Filtern hybridisierten, wurden gesammelt und verwendet, um Plasmid-DNA herzustellen.
Die volle Sequenz für menschliches IL-11 wurde entsprechend Verfahren bestimmt, die analog denen sind, die vorstehend für die Isolierung von Säuger-IL-11 von der PU34- Zelllinie beschrieben wurden. Die menschliche Sequenz wird ebenfalls in Tabelle I gezeigt. Wo die Nucleotide der menschlichen Sequenz sich unterscheiden von der Primaten-Sequenz, wird das menschliche Nucleotid oberhalb der Primatennucleotidsequenz in Tabelle I gezeigt.
In einer anderen Ausführungsform können Oligonucleotide von der Sequenz von Tabelle I mit geeigneten Restriktionsstellen für Subclonierungs-Zwecke konstruiert werden, und die Polymerase-Kettenreaktion angewendet werden, um die menschliche DNA-Sequenz für IL-11 zu erzeugen. Zum Beispiel werden die folgenden Oligonucleotide synthetisiert:
5'-Oligonucleotid: 5'ATGGATCCACATGAACTGTGTTTGCCG 3'
3'-Oligonucleotid: 5'TCAAGCTTTCACAGCCGAGTCTTCAGC 3'
Diese Oligonucleotide werden dann bei der Polymerase-Kettenreaktion in der cDNA- Bibliothek von MRC-5 oder TPA30- 1 verwendet, um daraus die DNA-Sequenz für menschliches IL-11 zu erhalten. Das PCR-Verfahren wird gemäß Verfahren durchgeführt, die jetzt im Fachgebiet Standard sind. Das erhaltene PCR-Produkt wird dann in einen geeignet verdauten pXM-Expressionsvektor, oder einen anderen, subcloniert. Für die obigen Oligonucleotide würde der pXM-Vektor für die Subclonierung mit BamHI und HindIII verdaut werden.
Ein drittes Verfahren zum Erhalten der Sequenz von menschlichem IL-11 umfaßt die Durchmusterung einer menschlichen genomischen Bibliothek unter Verwendung der Sequenz von Tabelle I als Sonde.

Beispiel 9 - Expression von rekombinantem IL-11

Um rekombinantes Säuger-IL11 einschließlich des menschlichen Faktors zu produzieren, wird die codierende cDNA mittels molekularbiologischer Standardverfahren in einen geeigneten Expressionsvektor transferiert, von denen im Fachgebiet zahlreiche Typen für Säuger-, Insekten-, Pilz-, und bakterielle Expression bekannt sind. Siehe, z. B. Y. C. Yang et al., Cell, 47: 3-10 (1986).
Wie zuvor für Säuger-IL11 beschrieben, wird die cDNA für menschliches IL-11 unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert und in den Expressionsvektor pXM (Yang et al. vorstehend zitiert) cloniert. Dieser Vektor erlaubt die Expression von cDNA-Insertionen in Säugerzellen, z. B. COS-1-Zellen. pXM enthält den SV40-Enhancer, den Adenovirus "major late promotor", die "dreiteilige" Leader-Sequenz, und die kleine, hybride "intervening" Sequenz, die DHFR codierende Sequenz, die Stelle zum Hinzufügen von SV40 "late message" Poly A und das Adenovirus VaI-Gen. Dieser Vektor kann mit dem Endonuclease-Enzym XhoI linearisiert werden und mit äquimolaren Mengen an IL-11-cDNA ligiert werden, die zuvor durch das Hinzufügen von synthetischen Oligonucleotiden, die komplementäre, cohäsive Xho- Enden schaffen, modifiziert worden ist. Solche Oligonucleotide sind kommerziell erhältich [Collaborative Research, Lexington, MA].
Ein anderer Vektor, von dem gezeigt wurde, daß er Cytokine in CHO-Zellen gut exprimiert, ist pEMC2B 1. Dieser Vektor kann aus pMT2pc abgeleitet werden, das bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA) unter der Zugangsnummer ATCC 40348 hinterlegt wurde. Die DNA wird durch Verdau des Plasmids mit PstI linearisiert. Die DNA wird dann unter Verwendung von T4 DNA Polymerase mit glatten Enden versehen. Ein Oligonucleotid 5' TGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGA 3' wird dann in die DNA ligiert, was die PstI-Stelle am 5'-Ende wiederherstellt und eine EcoRI-Stelle und eine XhoI- Stelle vor dem ATG der DHFR-cDNA hinzufügt. Dieses Plasmid wird pMT21 genannt. pMT21 wird mit EcoRI und XhoI geschnitten, was das Plasmid an zwei benachbarten Clonierungsstellen spaltet. Ein EMCV-Fragment von 508 Basenpaaren wurde aus pMT&sub2;ECAT&sub1; [S. K. Jong et al. J. Virol., 63: 1651-1660 (1989)] mit den Restriktionsenzymen EcoRI und TaqaI ausgeschnitten. Ein Paar von Oligonucleotiden von 68 Nucleotiden Länge wurde synthetisiert, um die EMCV-Sequenz bis zum ATG zu verdoppeln. Das ATG wurde zu einem ATT verändert, und ein C wird hinzugefügt, was am 3'-Ende eine Xho-Stelle schafft. Eine TaqαI-Stelle ist am 5'-Ende gelegen. Die Sequenzen der Oligonucleotide waren: 5'CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTG AAAAACACGATTGC 3' und sein komplementärer Strang.
Ligierung des pMT21-EcoRI-bis-XhoI-Fragments an das EMCV-EcoRI-bis-TaqαI- Fragment und an das TaqaI/XhoI-Oligonucleotid produzierte den Vektor pEMC2B 1. Dieser Vektor enthält den SV40-Replikationsursprung und -Enhancer, den wichtigen Adenovirus "major late promotor", eine cDNA-Kopie des Großteils der Adenovirus-dreiteiligen" Leader- Sequenz, eine kleine hybride "intervening"-Sequenz, ein SV40-Polyadenylierunssignal und das Adenovirus VaI-Gen, DHFR- und β-Lactamase-Marker und eine EMC-Sequenz, in geeigneten Verhältnissen, um die Expression der gewünschten cDNA auf hohem Niveau in Säugerzellen zu steuern. Der EMC2B1-Vektor wird mit dem Endonuclease-Enzym EcoRI linearisiert und anschließend separat in äquimolaren Mengen an die cDNA ligiert, die IL-11 codiert, die zuvor durch Hinzufügen von synthetischen Oligonucleotiden, die EcoRIkomplementäre Enden schaffen, modifiziert worden war, um Konstrukte für die Expression zu schaffen.
Der gewünschte Vektor, der IL-11 enthält, wird dann mittels konventioneller gentechnischer Verfahren in geeignete Wirtszellen eingebracht. Die transformierten Zellen werden gezüchtet und das exprimierte IL-11 wird aus dem Kulturmedium mittels Standardverfahren gewonnen und gereinigt.

A. Säugerzell-Expression

Um die Expression des IL-11-Polypeptids in Säuger-Wirtszellen zu erhalten, wird der pXM-Vektor, der die IL-11 DNA-Sequenz enthält, wie in Beispiel 2 beschrieben, in COS- Zellen transfiziert. Das konditionierte Medium von den transfizierten COS-Zellen enthält die biologische Aktivität von IL-11, wie in dem T116S-Test gemessen wird. In ähnlicher Weise wird das pEMC-2B 1-Konstrukt, das die cDNA für IL-11 enthält, in CHO-Zellen transfiziert.
Ein Durchschnittsfachmann kann auch andere Säuger-Expressionsvektoren konstruieren, die dem pXMJIL-11-Vektor vergleichbar sind, durch z. B. Insertion der DNA- Sequenz für IL-11 aus den jeweiligen Plasmiden mit XhoI und unter Anwendung wohl bekannter rekombinanter gentechnischer Verfahren und anderer bekannter Vektoren, wie pJL3 und pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4: 645-6S3 (1985)] und pMT2 (beginnend mit pMT2-VWF, ATCC #67122; siehe PCT-Anmeldung PCT/US87/00033).
Die Transformation dieser Vektoren in geeignete Wirtszellen kann in einer Expression der IL-11-Polypeptide resultieren. Andere Säuger-Wirtszellen als COS-Zellen können auch für die IL-11-Expression verwendet werden. Zum Beispiel können für die stabile Integration der Vektor-DNA und für die anschließende Amplifikation der integrierten Vektor-DNA, beides mittels konventioneller Verfahren, CHO-Zellen als Säuger-Wirtszellen der Wahl vorzugsweise verwendet werden.
Nachdem die Vektoren und die Wirtszellen ausgewählt und transformiert sind, werden stabile Transformanten mittels immunologischer oder enzymatischer Standardtests auf Expression von IL-11 durchmustert. Die Anwesenheit von DNA oder mRNA, die die IL-11- Polypeptide codieren, kann mittels Standardverfahren wie Southern- oder Northern-Blotting nachgewiesen werden. Die transiente Expression der DNA, die die Polypeptide codiert, während mehrerer Tage nach der Einführung der Expressionsvektor-DNA in geeignete Wirtszellen, wird ohne Selektion mittels Aktivität oder immunologischer Tests, z. B. den T1165-Test, der Proteine im Kulturmedium gemessen.

B. Bakterielle Expressionssysteme

In ähnlicher Weise könnte ein Durchschnittsfachmann die Sequenz von IL-11 durch Eliminierung jeglicher regulatorischer Säuger-Sequenzen, die die codierende Sequenz flankieren, und die Insertion von bakteriellen Sequenzen manipulieren, um bakterielle Vektoren für die intrazelluläre oder extrazelluläre Expression der IL-11-Polypeptide der Erfindung durch Bakterienzellen zu schaffen.
Die DNA, die den Faktor codiert, kann weiterhin modifiziert werden, so dass sie verschiedene Codons für die bakterielle Expression enthält, wie im Fachgebiet bekannt ist. Vorzugsweise wird die reife IL-11-Sequenz (die Nucleotide, die die Aminosäuren 21 bis 199 in Tabelle I codieren) im Rahmen operativ verknüpft mit einer Nucleotidsequenz, die eine sekretorisches Leader-Polypeptid codiert, das die bakterielle Expression, Sekretion und Prozessierung des reifen, varianten Proteins erlaubt, wie ebenfalls im Fachgebiet bekannt ist. Die Verbindungen, die in bakteriellen Wirtszellen exprimiert werden, können dann gewonnen, gereinigt und/oder in Bezug auf die physikochemischen, biochemischen und/oder klinischen Parameter charakterisiert werden, alles mittels bekannter Verfahren.
Alternativ kann das IL-11 als ein cytoplasmatisches Protein in E. coli exprimiert werden. In diesem Fall müßte das Molekül höchstwahrscheinlich nach völliger Denaturierung mit Guanidinhydrochlorid gefaltet werden, ein im Fachgebiet bekanntes Verfahren. Das gegenwärtig bevorzugte Verfahren zur Expression von IL-11 in E. coli umfaßt die Entfernung der ersten 31 Codons von der menschlichen IL-11-Sequenz. Die folgende Sequenz wird dann an Codon 32 der reifen menschlichen IL-11-Sequenz angeheftet:

C. Insekten- oder Hefezellexpression

Ähnliche Manipulationen können für die Konstruktion eines Insektenvektors [siehe z. B. Verfahren, die in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 155,476 beschrieben sind] zur Expression in Insektenzellen durchgeführt werden. Ein Hefevektor könnte ebenfalls durch Verwendung von regulatorischen Sequenzen für die intrazelluläre oder extrazelluläre Expression der Proteine der vorliegenden Erfindung durch Hefezellen konstruiert werden [siehe z. B. Verfahren, die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 86/00639 und der Europäischen Patentanmeldung EP 123,289 beschrieben sind].

Beispiel 10 - Konstruktion von CHO-Zelllinien, die hohe Spiegel an IL-11 exprimieren

Ein Verfahren zur Produktion von hohen Spiegeln der IL-11-Polypeptide der Erfindung aus Säugerzellen umfaßt die Konstruktion von Zellen, die vielfache Kopien des heterologen IL-11-Gens enthalten. Das heterologe Gen kann mit einem amplifizierbaren Marker verknüpft sein, z. B. das Dihydrofolat-Reduktase- (DHFR)-Gen, nach dem Zellen, die erhöhte Genkopien enthalten, durch Propagation in steigenden Konzentrationen an Methotrexat (MTX) selektiert werden können, entsprechend dem Verfahren von Kaufmann & Sharp, J. Mol. Biol., (1982) nachstehend. Dieser Weg kann für eine Zahl von verschiedenen Zelltypen verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform können die IL-11-cDNA und das Selektionsgen für Medikamentenresistenz (z. B. DHFR) in denselben Vektor eingebaut werden. Ein bevorzugter Vektor für diesen Weg ist pEMC2B1.
Zum Beispiel können der pXM-Vektor, der ein IL-11-Gen in operativer Verknüpfung mit anderen Plasmidsequenzen hat, die seine Expression ermöglichen, und das DHFR- Expressionsplasmid pAdA26SV(A)3 (Kaufmann & Sharp, Mol. Cell Biol., 3 (9): 1598-1608 (1983) gleichzeitig in DHFR-defiziente CHO-Zellen, DUKX-BII, durch Calciumphosphat-Co- Präzipitation und Transfektion eingeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann der pEMC2B1-Vektor, der das IL-11-Gen in operativer Verknüpfung mit anderen Plasmidsequenzen hat, die seine Expression ermöglichen, in DHFR-deiiziente CHO-Zellen, DUKX-BII, durch Protoplastenfusion und Transfektion eingeführt werden. Das IL-11-Gen und das DHFR-Markergen werden beide effizient exprimiert, wenn IL-9 in pEMC2B1 eingeführt wird. Das IL-11-Gen kann wie vorstehend erwähnt in pMT2 eingebracht werden und der resultierende Vektor anstelle von pXMIIL-11 und pAdA26SV(A)3 verwendet werden.
Transformanten, die DHFR exprimieren, werden selektiert auf Wachstum in alpha- Medien mit dialysiertem fötalem Kälberserum. Transformanten werden auf Expression von IL-9 mittels Biotests, Immuntests oder RNA-Blotting überprüft und positive Pools werden anschließend auf Amplifikation durch Wachstum in wachsenden Konzentrationen von MTX (aufeinanderfolgende Schritte von 0,02, 0,2, 1,0 und 5 uM MTX) selektiert, wie in Kaufmann et al. Mol. Cell Biol., 5: 1750 (1983) beschrieben. Die amplifizierten Linien werden cloniert, und die Expression biologisch aktiver IL-11-Polypeptide wird mittels des T1165-Tests verfolgt. Man erwartet, daß die Expression der IL-11-Polypeptide mit steigenden Spiegeln von MTX-Resistenz anwächst.
In jedem der vorstehend beschriebenen Expressionssysteme können die resultierenden Zeillinien mittels geeigneter Medikamentenauswahl weiter amplifiziert werden, die resultierenden Zeillinien können erneut cloniert werden und der Expressionsspiegel unter Verwendung des hier beschriebenen T1165-Tests beurteilt werden.
Die CHO-Zelllinien, die IL-11 exprimieren, können an Wachstum in serumfreiem Medium adaptiert werden. Homogenes IL-11 kann von konditioniertem Medium von der Zelllinie unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, isoliert werden, einschließlich Verfahren wie Lektin-Affinitätschromatographie, Umkehrphasen-HPLC, FPLC und dergleichen.

Beispiel 11 - Wirkung von IL-11 auf die Proliferation in Kulturen von frühen Maus- Vorläuferzellen

Methylcellulose-Zellkulturen wurden in 35 mm Lux-Suspensionskultur-Gefäßen (#5221 R, Nung, Inc. Naperville, IL) etabliert.
5-Fluorouracil (5-FU) (Adria Laboratories, Columbia, OH) wurde intravenös durch die Schwanzvenen von 10 bis 15 Wochen alten weiblichen BDF&sub1; Mäusen [ARS Sprague Dawley, Indianapolis, IN) mit 150 mg/kg Körpergewicht verabreicht [T. Suda et al. J. Cell. Physiol., 117: 308-318 (1983) und G. S. Hodgson et al. Nature, 281: 381-382 (1979)]. Einzelzell- Suspensionen wurden von den gesammelten Oberschenkelknochen oder Milzen von drei Mäusen hergestellt. Lichtdichte (< 1,077) mononucleare Zellen wurden von der Zwischenschicht von Ficoll-Paque nach Zentrifugation bei 400 g gesammelt. Nach Adhärenz dieser Zellen über Nacht an Plastikgefäße wurden nicht adhärente mononucleare (Knochenmark und Milz) Zellen jeweils 2 und 5 Tage nach der 5-FU-Injektion geerntet.
1 ml Kultur enthielt bei normalen Mäusen 2 · 10&sup4; Markzellen, bei 5-FU-behandelten Mäusen 5 · 10&sup4; Markzellen oder 1 · 10&sup6; Milzzellen, α-Medium (Flow Laboratories, Inc., Molean, VA), 1,2% 1 500 cps Methylcellulose (Fisher Scientific Co., Norcross, GA), 30% fötales Kälberserum (FCS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT), 1% deionisierte Fraktion V-Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 1 · 10&sup4; M 2- Mercaptoethanol (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY) und hämatopoetische Faktoren. Die Gefäße wurden bei 37ºC in einer feuchten Atmosphäre, die mit 5% CO&sub2; gespült wurde, inkubiert. Außer bei den Megakaryocyten-Kolonien wurden die Kolonien, die aus 50 oder mehr Zellen bestanden, am spezifischen Tag der Inkubation auf einem Inversionsmikroskop bewertet. Megakaryocyten-Kolonien wurden bewertet, wenn sie vier oder mehr Megakaryocyten enthielten. Die Abkürzungen für die Kolonietypen sind wie folgt:
GM, Granulocyt/Makrophage; Mast, Mastzellkolonien; E, erythroide "bursts"; M, Megakaryocyten- Kolonien; GMM, GranulocytlMakrophage/Megakaryocyt-Kolonien [T. Nakahata et al., J. Cell Physiol., 111: 239-246 (1982)]; GEMM, Granulocyt/Erythrocyt/Makrophage/Megakaryocyt-Kolonien [T. Nakahata et al. vorstehend zitiert; und A. A. Fauser et al. Blood, 52: 1243-1248 (1978)]; und B1, Blastzell-Kolonien [T. Nakahata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 3843-3847 (1982); und T. Suda et al., vorstehend zitiert].
Das hämopoetische Potential der Blastenzellkolonien wurde durch erneutes Ausplattieren der Blastenzellkolonie bestimmt. Zwischen den Tagen 5 und 10 der Inkubation wurden individuelle Blastenzellkolonien, die 50 bis 150 Zellen enthielten, mit einer Eppendorf Pipette gesammelt und in sekundären Methylcellulose-Kolonien erneut ausplattiert, die 2 U/ml an menschlichem Erythropoeitin (Ep) aus Urin (Ep) [Aktivität von 370 U pro mg, verfügbar von Dr. Makoto Kawakita, Kumamoto University Medical School, Kumamoto, Japan], 1% (v/v) konzentrierter (X20) Überstand von Kulturen von WEHI-3-Zellen.
Blastenzellen wurden auch als reine Zielpopulationen von hämopoetischen Zellen verwendet, um zu bestimmen, ob die beobachteten Wirkungen von IL-11 direkt waren oder wegen der Freisetzung von anderen Faktoren. Eine Million Milzzellen vom Tag 4 nach 5-FU wurden in der Gegenwart von 100 U/ml an rekombinantem Maus-IL-3 gezüchtet. IL-3 wurde konditioniert durch Eierstockzellen vom chinesischen Hamster (CHO), die gentechnisch verändert waren, um einen hohen Titer an Maus-IL-3 zu produzieren (ungefähr 30000 U/ml). Am Tag 8 der Kultur wurden individuelle Blastenzellkolonien (zwischen 50 und 150 Zellen) von den Kulturen gesammelt, gepoolt, zweimal mit Medium gewaschen und in sekundären Kulturen erneut ausplattiert, die verschiedene Kombinationen an Faktoren enthielten.
Rekombinantes menschliches IL-6 mit einer spezifischen Aktivität von 4 · 10&sup6; U/mg Protein wurde in E. coli exprimiert. IL-11 wurde Medium-konditioniert (cm) durch COS-1- Zellen, die mit cDNA transfiziert waren, die Maus-Plasmacytoma-stimulierende Aktivität codierte [S. R. Paul et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, im Druck (1990)].

A. Koloniebildung von Markzellen von normalen Mäusen

Koloniebildung von normalen Markzellen wurde durch IL-11 unterstützt. In Anwesenheit oder Abwesenheit von 2 U/ml Ep verursachte IL-11 Kolonien auf Dosisabhängige Weise. Eine 1 : 100-Verdünnung von IL-11 ergab eine maximale Koloniebildung. Die Gesamtzahl an Kolonien jedoch, die am Tag 8 oder 16 der Inkubation mit IL-11 gefunden wurde, war deutlich niedriger als in Kulturen mit IL-3. Die Kolonien, die in IL-11-haltigen Kulturen gefunden wurden, waren vor allem vom GM-Typ, obwohl einige Kolonien mit vielen Linien (GMM und GEMM) auch beobachtet wurden. IL-11 in einer 1 : 100-Verdünnung ergab die Bildung von drei Blastenzellkolonien am Tag 16 der Inkubation.

B. Koloniebildung von Markzellen von 5-FU-behandelten Mäusen

Die Koloniebildung von Markzellen, die zwei Tage nach der Injektion von 150 mg/kg 5-FU [T. Suda et al. vorstehend zitiert; und G. S. Hodgson et al. vorstehend zitiert] geerntet waren, in Kulturen, die in der Anwesenheit von IL-11, IL- 6 und IL-3 allein und in verschiedenen Kombinationen angelegt wurden, wurde untersucht, um zu bestimmen, ob IL- 11 synergistisch mit IL-3 bei der Unterstützung der Proliferation von primitiven Vorläuferzellen wirkt.
Die Zugabe von IL-11 mit Endverdünnungen von 1 : 100 und 1 : 1 000 zu optimalen Konzentrationen von IL-3 erhöhte die Koloniebildung beträchtlich. Insbesondere in der Anwesenheit einer 1 : 100 Verdünnung von IL-11 und IL-3 war die Kinetik im Vergleich zu der von den individuellen Faktoren getragenen beschleunigt. Der Zeitverlauf der Koloniebildung ebenso wie die Gesamtzahl an unterstützen Kolonien waren ähnlich wie für die Kombination von IL-6 und IL-3 beobachtet. IL-11 allein in einer 1 : 100 Verdünnung ergab eine schwache Koloniebildung nach einer langen Inkubationsperiode. Diese Ergebnisse zeigen an, daß IL-11 die IL-3-abhängige Proliferation von primitiven Vorläuferzellen verstärkt.
Die Wirkungen einer Kombination von IL-11 und IL-6 auf die Kinetik der Koloniebildung von Markzellen am Tag 2 nach 5-FU relativ zu den Wirkungen der einzelnen synergistischen Faktoren wurden separat getestet. IL-6 und IL-11 beschleunigten beträchtlich die IL-3-abhängige Koloniebildung bestimmt. Die Wirkungen der Kombination von IL-6 und IL-11 jedoch unterschieden sich nicht von denen von einzelnen Faktoren.

C. Serielle Beobachtungen der Entwicklung von Blastenzellkolonien von Milzzellen am Tag 4 nach 5-FU

Die Wachstumsraten von einzelnen Blastenzellkolonien wurden seriell durch Kulturkartierungsstudien bestimmt. Die Ergebnisse zeigten an, daß die synergistische Wirkung von IL-11 von einer Abnahme der Zeit resultierte, die Stammzellen im ruhenden Zustand verbringen, eine Wirkung sehr ähnlich der, die mit IL-6 oder G-CSF beobachtet wurde, weil die Wachstumsraten in diesen Kultursystemen nicht statistisch anders waren.

D. Vergleich des Wiederausplattierungspotentials von Blastenzellkolonien

Das proliferative Potential von Blastenzellkolonien, die auf IL-11 und IL-6 ansprechen, wurde mittels Wiederausplattierungsexperimenten getestet. Signifikante Variationen bei der sekundären Wiederausplattierungs-Effizienz wurden zwischen individuellen Blastenzellkolonien gesehen, wie zuvor berichtet [K. Ikebuchi et al. Blood, 72: 2007-2014 (1988)]. Es gab jedoch keine signifikanten Unterschiede bei der Wiederausplattierungs- Effizienz von Blastenzellkolonien, die unter den drei verschiedenen Primärkulturbedingungen gewachsenen waren.
Ähnlich zu vorhergehenden Beobachtungen [K. Ikebuchi et al. vorstehend zitiert] waren die Prozentzahlen von sekundären GEMM-Kolonien in sekundären Kolonien und das Vorkommen von sekundären GEMM-Kolonien pro Blastenzellkolonien beträchtlich höher von den primären Blastenzellkolonien, die in Kulturen identifiziert wurden, die IL-11 oder IL- 6 enthielten, als es bei den Kulturen gesehen wurde, die IL-3 allein enthielten. Es gab keine signifikanten Unterschiede bei diesen Parametern zwischen Kulturen, die IL-11 plus IL-3 enthielten und Kulturen, die IL-6 plus IL-3 enthielten.
Diese Ergebnisse zeigten an, daß die synergistischen Aktivitäten von IL-11 und IL-6 ähnlich sind und daß die Zunahme des Vorkommens von sekundären GEMM-Kolonien wegen der Verkürzung der G-Periode von Stammzellen während der Blastenzell-Koloniebildung sein kann [K. Ikebuchi et al, vorstehend zitiert].

E. Wiederausplattierungsstudien von gepoolten Blastenzellen

Zielzellen, die durch Poolen von Blastenzellen von frühen Kulturstadien, die durch IL- 3 unterstützt wurden, gewonnen waren, wurden verwendet, um die direkten Wirkungen von IL-11 und IL-6 auf die GM-Koloniebildung zu vergleichen. Gepoolte Blastenzellen haben keine Stroma-Zellen und zeigen sehr hohe Wiederausplattierungs-Effizienz.
Blastenzellkolonien, die 50 bis 150 Zellen enthielten und die in Kulturen identifiziert wurden, die IL-3 enthielten, wurden gesammelt und gepoolt und wurden in sekundären Kulturen wiederausplattiert, die IL-11, IL-6 oder IL-3 in Anwesenheit von von 2 U/ml Ep enthielten. Diese Ergebnisse zeigen an, daß zumindest 70% der Blastenzellen hämopoetische Vorläuferzellen sind.
Während die Kombination von IL-3 und Ep die Bildung einer Anzahl von Einzellinien- und Mehrfachlinien-Kolonien unterstützte, unterstützten IL-11 und Ep nur die Bildung von Makrophagen-Kolonien. Die Kombination von IL-6 und Ep unterstützte die Bildung einer ähnlichen Zahl von reinen Makrophagen-Kolonien, aber auch Neutrophile/Makrophagen- Kolonien. Die Makrophagen-Kolonien, die durch IL-11 unterstützt wurden, waren kleiner als die Makrophagen-Kolonien, die durch IL-6 unterstützt wurden.
Diese Ergebnisse zeigten an, daß IL-11 und IL-6 mit überlappenden, aber unterschiedlichen Vorläuferzellen-Subklassen interagieren und daß IL 11 vorzugsweise die Makrophagen-Vorläuferpopulation unterstützt.

F. Die Wirkungen von neutralisierendem anti-IL-6-Antikörper auf die synergistischen Wirkungen von IL-11

Um zu bestätigen, daß die direkte Kolonie-unterstützende Fähigkeit zwischen IL-11 und IL-6 nicht ein Ergebnis der rohen Natur der Cos-Zellen-CM war, wurde neutralisierender anti-IL-6-Antikörper, von dem bekannt ist, daß er Cos-abgeleitetes IL-6 inhibiert, verwendet, um die synergistischen Wirkungen von IL-11 und IL-6 auf die IL-3-abhängige Proliferation von ruhenden Vorläuferzellen zu untersuchen.
Bei der Anwesenheit von IL-6 oder IL-11 und bei der Abwesenheit von Antikörpern war die Koloniebildung von Milzzellen vom Tag 4 nach 5-FU signifikant beschleunigt, wie angezeigt durch die Zahl der Kolonien am Tag 8. Wenn anti-IL-6-Antikörper anwesend war, wurden die synergistischen Wirkungen von IL-6 vollständig aufgehoben, während die Wirkungen von IL-11 es nicht waren. Die Wirkungen des Antikörpers hielten bis zum Tag 16 an. Diese Ergebnisse schlossen die Möglichkeit aus, daß die offensichtlichen synergistischen Wirkungen in Cos-Zellen-cm durch IL-6 vermittelt wurden.
Von konditioniertem Medium (cm) von COS-Zellen, die mit IL-11-cDNA transfiziert waren, ist gefunden worden, daß es die IL-3-abhängige Proliferation von multipotenten Vorläuferzellen in Kultur erhöht, eine Aktivität, die ursprünglich mit IL-6 assoziiert wurde. Der Mechanismus dieser Erhöhung scheint die Verkürzung der G-Periode der ruhenden Stammzellen zu sein.
Die vorstehenden Beschreibungen erläutern gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Es wird erwartet, daß zahlreiche Modifizierungen und Variationen bei der Durchführung dieser Erfindung dem Durchschnittsfachmann einfallen werden. Solche Modifizierungen und Variationen werden durch die folgenden Ansprüche umfaßt.

Claims

1. DNA-Molekül, das ein Protein codiert, dessen reife Form die biologische Aktivität von IL-11 hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) DNA-Molekül, das die Aminosäuresequenz codiert, die in Tabelle I gezeigt ist;

(b) DNA-Molekül, das die Aminosäuresequenz von Aminosäure #22 bis Aminosäure #199 codiert, die in Tabelle I gezeigt ist;

(c) DNA-Molekül, das in Tabelle I gezeigt ist, welches die Aminosäuresequenz codiert, die in Tabelle I gezeigt ist;

(d) DNA-Molekül, das in Tabelle I gezeigt ist, welches die Aminosäuresequenz von Aminosäure #22 bis Aminosäure #199 codiert, die in Tabelle I gezeigt ist;

(e) DNA-Molekül, das ein Fragment, eine allelische oder eine andere Variante des DNA-Moleküls von (a), (b), (c) oder (d) ist;

(f) DNA-Molekül, dessen komplementärer Strang mit dem DNA-Molekül von (a), (b), (c), (d) oder (e) hybridisiert; und

(g) DNA-Molekül, dessen Sequenz sich in der codierenden Sequenz von der Sequenz eines DNA-Moleküls, welches in (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) beschrieben ist, aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.

2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, das ein Vorläuferprotein eines reifen Proteins codiert, welches die biologische Aktivität von IL-11 hat.

3. DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, das menschliches IL-11 codiert.

4. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches cDNA ist.

5. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressions-Kontrollsequenz.

6. Rekombinantes DNA-Molekülumfassend das DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

7. Vektor, umfassend das DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder das rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 6.

8. Vektor nach Anspruch 7, welcher ein Plasmidvektor ist.

9. Zelle oder Zelllinie, die mit einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 6 oder dem Vektor nach Anspruch 7 oder 8 transformiert wurde.

10. Zelle oder Zelllinie nach Anspruch 9, welche eine Säuger- oder Bakterienzelle ist.

11. Protein oder biologisch aktives Proteinfragment, das von einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 6 oder dem Vektor nach Anspruch 7 oder 8 codiert wird.

12. Protein oder Proteinfragment nach Anspruch 11, welches menschliches IL-11 ist.

13. Protein oder Proteinfragment nach Anspruch 11 oder 12, welches biologische Aktivität in dem T1165-Test hat.

14. Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 11 bis 13, welches eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist:

(1) unter reduzierenden Bedingungen bei einer SDS-PAGE ein offenbares Molekulargewicht von etwa 20 kd;

(2) ein berechnetes Molekulargewicht von etwa 20 kd;

(3) biologische Aktivität in einem Megakaryocyten-Koloniebildungstest in Anwesenheit von IL-3;

(4) biologische Aktivität in einem B-Zellen Plaquebildungstest.

15. Verfahren zur Herstellung des Protein oder Proteinfragments nach einem der Ansprüche 11 bis 14, umfassend;

(a) Züchtung der Zellen nach Anspruch 9 oder 10; und

(b) Gewinnung des Proteins nach einem der Ansprüche 11 bis 14 aus dem konditionierten Medium.

16. Arzneimittel umfassend ein Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 11 bis 14 in einem pharmakologisch wirksamen Vehikel.

17. Arzneimittel nach Anspruch 16, ferner umfassend ein zusätzliches Cytokin, Hematopoietin, Wachstumsfaktor oder Antikörper.

18. Arzneimittel nach Anspruch 17, wobei das Cytokin aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus IL-1 bis IL-9, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, Interferone, Meg-CSF, MIF, LIF, TNF und Erythropoietin.

19. Arzneimittel nach Anspruch 18, wobei das Cytokin IL-3 oder IL-6 ist.

20. Injizierbare Zubereitung für die Stimulierung des Immunsystems oder des hematopoetischen Systems oder für die Behandlung von Erkrankungen davon, umfassend das Protein nach einem der Ansprüche 11 bis 14 in einem pyrogenfreien, parenteral verträglichen, wässrigen Vehikel.

21. Verwendung des Proteins nach einem der Ansprüche 11 bis 14 für die Zubereitung eines Arzneimittels, welches geeignet ist für die Stimulierung des Immunsystems oder des hematopoetischen Systems oder für die Behandlung von damit in Zusammenhang stehenden Erkrankungen.

22. Antikörper, welcher gegen das Protein nach einem der Ansprüche 11 bis 14 gerichtet ist.

23. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper nach Anspruch 22.

24. Arzneimittel, umfassend den Antikörper nach Anspruch 22.

25. Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die Isolierung von RNA aus einer geeigneten Quelle, Herstellung der entsprechenden mRNA, Konstruktion einer cDNA-Bibliothek, Suchen nach einer gewünschten DNA und die Isolierung der gewünschten DNA.

26. Verfahren zur Gewinnung eines rekombinanten DNA-Moleküls gemäß der Definition in Anspruch 6, wobei ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit weiteren DNA-Sequenzen verbunden wird.

27. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels gemäß der Definition in einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei das Protein oder das Proteinfragment nach einem der Ansprüche 11 bis 14 mit einem pharmakologisch verträglichen Träger kombiniert wird.

28. Verfahren zur Herstellung einer injizierbaren Zubereitung gemäß der Definition in Anspruch 20, wobei das Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 11 bis 14, in einem pyrogenfreien, parenteral verträglichen wässrigen Vehikel hergestellt wird.

29. Verfahren für die Herstellung eines Antikörpers gemäß der Definition in Anspruch 22, wobei das Protein oder Proteinfragment nach einem der Ansprüche 11 bis 14 einem ausgewählten Säuger als Antigen präsentiert wird, worauf Zellen des Tieres mit bestimmten Krebszellen fusioniert werden, um unsterblich gemachte Zelllinien herzustellen.

30. Verfahren zur Herstellung einer diagnostischen Zubereitung gemäß der Definition in Anspruch 23, wobei der Antikörper nach Anspruch 22 mit Mitteln kombiniert wird, die im allgemeinen in der Diagnostik verwendet werden.

31. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels gemäß der Definition in Anspruch 24, wobei der Antikörper nach Anspruch 22 mit einem pharmakologisch verträglichen Träger kombiniert wird.