JPH11507663A

JPH11507663A - レストリクチンｐ／アクチビンａを含む薬学的組成物及びｉｌ−６及び／又はｉｌ−１１のアンタゴニストとしてのその用途

Info

Publication number: JPH11507663A
Application number: JP9502868A
Authority: JP
Inventors: ジポリ，ドブ; バーシュタイン，イイガル
Original assignee: イエダリサーチアンドデベロツプメントカンパニーリミテツド
Priority date: 1995-06-09
Filing date: 1996-06-09
Publication date: 1999-07-06
Also published as: EP0833656A4; EP0833656A2; WO1996041607A3; WO1996041607A2

Abstract

(57)【要約】多面的サイトカインであるレストリクチンＰ/アクチビンＡはＩＬ-６および/またはＩＬ-11のインビボ活性を修飾し、たとえば、腫瘍治療または骨髄移植を受けていてＩＬ-６で処置されている患者におけるＩＬ-６の有害作用を遮断または減弱させるために有用な医薬組成物の製造に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】レストリクチンＰ／アクチビンＡを含む薬学的組成物及びＩＬ−６及び／又はＩＬ−１１のアンタゴニストとしてのその用途発明の分野本発明は、形質細胞腫およびハイブリドーマ増殖インヒビターサイトカイン、本発明において間質起源のアクチビンＡと同一であることが確認され、サイトカインのインターロイキン(ＩＬ)-6および/またはＩＬ-11のアンタゴニストであるレストリクチンＰ，ならびにとくに上記レストリクチンＰ/アクチビンＡからなる医薬組成物、およびＩＬ-6および/またはＩＬ-11のインビボ活性の修飾のためのレストリクチンＰ/アクチビンＡの使用方法に関する。発明の背景造血の調節は直接的機構を介して働くサイトカインによって誘導される。一部は、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）のように、増殖とそれに続く分化を誘導することにより造血細胞の蓄積を促進する。また、他の一部は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のように、細胞周期の静止を惹起し、その結果、細胞の蓄積を制限する。増殖因子と細胞の間の相互作用の帰結は、多くの場合、標的細胞の本質に依存し、同じサイトカインが、ある細胞型には刺激性であり、他の細胞型には阻害性である。一部のインヒビターは細胞増殖の減速または最終分化の誘導によって作用し、他のインヒビターはアポトーシスの誘導によって細胞死を起こさせる。レストリクチンＰは、以前に本発明者らの一人により、形質細胞腫細胞の増殖のインヒビターとして報告された（Ziporiら，1986；Honigwachs-Sha'ananiら， 1991）。この因子の生物活性は最初、形質細胞腫細胞の増殖を減速する初代間質細胞の選択的能力によって注目された（Zipori，1980 および 1981）。同様の機能は、マウス起源の骨髄細胞由来間質細胞系、ＭＢＡ-2.1の緩和な処置によって得られるトリプシン-ＴＰＣＫ放出タンパク質によって発揮された（Ziporiら，1 986）。放出された粗製タンパク質混合物は一連の形質細胞腫およびハイブリトマの増殖を阻害したが、リンパ球、赤血球および骨髄細胞起源の様々な他の白血病細胞系の増殖に対しては有意な作用をもたなかった（Ziporiら，1986）。同様に、正常細胞集団たとえばコロニー刺激因子に応答する骨髄細胞やマイトジェンにより誘導される脾臓細胞に対する作用は観察されなかった（Ziporiら.1986）。増殖の阻害を誘導する因子（単数または複数）が極めて少量、間質細胞系によって産生されることが見出され、したがってこの活性成分を単離するためには、その因子の大規模な産生のための条件を確立する必要があった。この産生細胞系，ＭＢＡ-2.1は完全にタンパク質を含まない条件下バイオリアクター中に負荷した不織布ポリエステルの三次元担体上で増殖できることが見出された（Kadouri ら，1992）。このようなバイオリアクターの研究から、この細胞はタンパク質を含まない条件下に10カ月まで維持可能で、この間トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β，マクロファージ(Ｍ)-ＣＳＦおよびＩＬ-6とともにレストリクチンＰを産生することが見出された。バイオリアクターシステムから得られたレストリクチンＰは、その標的細胞に初期Ｇ₁/Ｇ₀静止、形態学的変化および細胞傷害の徴候を誘導し（Honigwachs-Sha'ananiら．1991）、これは細胞内イオン変化を伴っていた（Malikら，1992）。ＩＬ-6は多面的なサイトカインであり、様々な組織および臓器内の細胞に影響する。ＩＬ-6はプラズマ様細胞に対して増殖促進作用を有し、造血系内において多様な造血細胞型の増殖および分化の誘導ならびに増殖阻害のような過程に関与する（Ikebuchiら，1987；Hoangら，1988；Botら，1989）。したがってＩＬ-6の活性は厳密に調節されていることが期待される。これは、他のサイトカインまたは多様なメディエーターの活性の結果としてＩＬ-6遺伝子の発現のレベルで起こるものと考えられる。ＩＬ-6によるヒト患者処置、たとえば腫瘍治療および骨髄移植において、ＩＬ-6は健康な細胞および組織にも有害に作用し、したがってＩＬ-6の有害作用を遮断または減弱させることは重要である。アクチビンはＴＧＦβファミリーのメンバーであり、多くの生物学的現象の調節に関与している。ＦＳＨ放出タンパク質（ＦＲＰ）としても知られるアクチビンＡはフレンド赤白血病細胞の分化を誘導して（Murataら．1988；Yuら．1987； Etoら，1987），正常な造血前駆細胞に影響する（Broxmeyerら，1988；Nakaoら，1991）ことが示されている赤血球分化因子（ＥＤＦ）と同一である。アクチビンＡは間質細胞により発現されることが見出されている（Yamashitaら,1992）。アクチビンＡはさらにＢ９形質細胞腫細胞およびＵ266Ｂ１骨髄腫細胞系を殺滅することが明らかにされている（Nishiharaら．1993）。Ｕ266Ｂ1細胞はＩＬ-6非依存性であり、血清を補充した培地中で増殖し、増殖にＩＬ-６を要求しない。同じ刊行物で著者らは、Ｂ９細胞をＩＬ-６とともにまたはＩＬ-６の不存在下に増殖させた短期実験において、アクチビンＡに暴露された場合と同程度に死滅することを示した。さらに、この文献ではアクチビンＡによって誘導されるＢ9細胞のアポトーシスがＩＬ-6によって防止されないとが述べられている。アクチビンＡは形質細胞腫細胞を殺滅するが、この作用はＩＬ-6とは無関係であると結論されている。組換え宿主細胞の発現産物として、ホルモン様の活性を示すヒトおよびブタアクチビンＡからなる組成物がMasonらに付与された米国特許第4,798,885号に記載されている。Vake．Jr.らに付与された米国特許第4,973,577号には、アクチビンＡのダイマーであるタンパク質の有効量を投与することからなり、ＦＳＨの分泌を増大させるように脊椎動物を処置する方法が開示されている。Perrineらに付与された米国特許第4,997.815号には、β-グロブリン障害に冒されている対象におけるγ-グロブリンのβ-グロブリンへのスイッチを阻害する方法において、その対象に生涯を通じて周期的にアクチビン、インヒビンまたはそれらのチェーンから選択される化合物を導入することからなる方法が記載されている。Yuらに付与された米国特許第5,032,507号にはヒトにおいて赤血球集団を増大させる方法であって、上記ヒト前駆細胞をＦＳＨ放出タンパク質（ＦＲＰ，アクチビンＡと同一である）と接触させることからなる方法が記載されている。Woodruffらに付与された米国特許第5,102.868号には、雌性動物の卵巣における卵胞の成熟を阻害する方法において、哺乳動物の卵巣にアクチビンＡの有効量を投与することからなる方法が開示されている。本発明によって、多面的なサイトカインであるアクチビンＡがレストリクチンＰと同一であること、およびこの分子はＩＬ-6および/またはＩＬ-11のアンタゴニストであることが初めて示された。発明の概要したがって、本発明は、活性成分としてレストリクチンＰ/アクチビンＡおよび医薬的に許容される担体からなり、ＩＬ-6および/またはＩＬ-11のインビボ活性を修飾するための医薬組成物を提供する。好ましい実施態様においては、この組成物は、たとえば腫瘍治療または骨髄移植時でＩＬ-6の投与を受けている患者でのＩＬ-6の有害作用を遮断または減弱させることを意図している。他の態様においては、本発明は、たとえばＩＬ-6および/またはＩＬ-11依存性細胞の異常または過剰増殖の場合におけるＩＬ-6および/またはＩＬ-11のインビボ活性の修飾用医薬組成物を製造するためのサイトカイン、レストリクチンＰ/ アクチビンＡの使用に関する。他の態様においては、本発明は、ＩＬ-6および/またはＩＬ-11のインビボ活性を修飾する方法において、それを必要とする患者にレストリクチンＰ/アクチビンＡの有効量を投与することからなる方法に関する。とくに、この方法は、腫瘍治療または骨髄移植を受けている患者でのＩＬ-6の有害作用を遮断または減弱させるのに適している。図面の簡単な説明図１Ａ〜Ｄは、実施例２に記載の間質細胞調整培地からのレストリクチンＰの最終精製を構成する一連の溶出プロフィルを示し、図１ＡはQ-Sepharose陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの溶出プロフィル、図１Ｂは Superdex 75ゲルろ過、図１ＣはＣ-8逆相ＨＰＬＣ-Ｉ（ＲＰ−ＨＰＬＣＩ），図１ＤはＣ-8逆相ＨＰＬＣ-II（ＲＰ−ＨＰＬＣII）カラムからの溶出プロフィルを示す。図２Ａ〜Ｂは、高度精製のレストリクチンＰの分析を示す。図２ＡはレストリクチンＰについて得られた配列を既知のアクチビンＡの配列と比較して示す。位置４．11および12におけるＸsは配列決定装置では通常検出されないシステイン残基の期待される位置であり、位置25におけるＸは検出できなかったＴrp残基に相当する。図２Ｂは、実施例２の記載のように、ＲＰ-ＨＰＬＣIIカラムから得られた高度に精製されたレストリクチンＰのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示す。図３は、実施例３に記載されたように、精製レストリクチンＰ（▲）および組換えウシアクチビンＡ（○）または対照（×）によるＭＰＣ-11形質細胞腫細胞の増殖の阻害を示す。図４Ａ〜Ｂは、実施例４に記載されたように、レストリクチンＰが、ＩＬ-６（４Ａ）およびＩＬ-11（４Ｂ）誘導Ｂ９細胞増殖に拮抗することを示す。Ｂ９細胞は指示された希釈度の組換えヒトＩＬ-６（４Ａ．○）もしくは組換えヒトＩＬ-11（４Ｂ，○）または精製レストリクチンＰおよびＩＬ-６（４Ａ，▲）もしくは精製レストリクチンＰおよびＩＬ-11（４Ｂ，▲）により処置した。図５Ａ〜Ｂは、実施例５に記載の実験において、レストリクチンＰがＢ９細胞へのＩＬ-６の結合を妨害しないことを示す。図６は、実施例６に記載したように、ＨepＧ2肝癌細胞において、レストリクチンＰが急性相プロテインα-酸グリコプロテイン（ＡＧＰ）およびハプトグロビン（ＨＧ）のＩＬ-６誘導性分泌を妨害することを示すウエスタンブロットの図である。図７は、実施例７に記載したように、ＨepＧ2肝癌細胞において、レストリクチンＰがＩＬ-６シグナリングに関与するＳＴＡＴの活性化を妨害しなかったことを示している。Stat3およびStat1αホモダイマーまたはStat3/Stat1αヘテロダイマーの量は実施例７に記載したように、別のインキュベーション条件下において追跡した。発明の詳細な説明本発明は、マウスの形質細胞腫およびハイブリドーマの増殖静止ついで細胞死を起こさせる間質細胞による調整培地中に見出されるレストリクチンＰと命名された活性が、形質細胞系ＭＢＡ-2.1による調整培地から均一に精製されたタンパク質によって誘導されることを見出し、また、このタンパク質はアクチビンＡモノマーと同一のＮ末端アミノ酸配列を有することが見出されたことに基づくものである。アクチビンＡは、間質細胞によって発現されることが見出されている（ Yamashitaら，1992）。ＰＡＧＥから推定されるされるレストリクチンＰモノマーの分子量は15kDaであって、モノマーアクチビンＡ（βＡインヒビン）とサイズが類似することから、これらの２つの分子は同一であると結論された。実際、組換えアクチビンＡはＭＰＣ-11形質細胞腫に対してレストリクチンＰと同程度に阻害性であることを以下に示す。レストリクチンＰはその精製型で、外部から添加したＩＬ-6またはエＬ-11と競合して、因子依存性ハイブリドーマ細胞系Ｂ9を殺滅した。270倍過剰の部分精製レストリクチンＰがr-Ｍｕ-[¹²⁵Ｉ]-ＩＬ-6結合と競合する能力を欠くこと（図５Ａ）または340倍過剰の高度精製レストリクチンＰがｒ-Ｈｕ-[¹²⁵Ｉ]-ＩＬ- 6ムテイン結合と競合する能力を欠くこと（図５Ｂ）に基づいて、レストリクチンＰは高親和性ＩＬ-6リガンド結合部位でＩＬ-6と競合することによってはその作用を発揮しないと結論される。レストリクチンＰの拮抗作用は、レストリクチンＰが他のサイトカイン依存性細胞系、たとえば増殖をＭ-ＣＳＦに依存する14Ｍ1.4マクロファージ、ＩＬ-3依存性であるＭＣ/9肥満細胞腫、またはＮＦＳ-60．ＧＭ-ＣＳＦ依存性細胞の増殖に影響しなかったことから（データは示していない）、ＩＬ-6およびＩＬ-11に特異的である。形質細胞腫およびハイブリドーマに厳密に特異的なレストリクチンＰの殺滅作用は、この因子が、この細胞型に特徴的な分子機構を検知することを示唆した。ＩＬ-６に対する依存性増殖は多くの形質細胞腫およびハイブリドーマに特徴的である。実際、本発明者らは、レストリクチンＰがハイブリドーマの生存に必須の増殖因子と競合することによってＢ９細胞の増殖を阻害することを本明細書に示す。しかしながら、ＭＰＣ-11クローンのような一部の細胞はサイトカイン非依存性であるもの、それらの増殖はレストリクチンＰによって阻害される。形質細胞腫は、ＩＬ-6シグナリングに応答する唯一の細胞型である。ＨepＧ2 肝癌細胞はＩＬ-6の影響下に急性相プロテインを放出し（Gauldieら．1987）、活性はレストリクチンＰによって阻害できる。さらにレストリクチンＰはＩＬ-6 によって誘導される効果、Ｍ１骨髄芽球細胞のミトコンドリアおよび増殖阻害活性ならびにその関連単球への分化の両者を消失させることができる。したがって、レストリクチンＰはＩＬ-6の普遍的なアンタゴニストであり、ＩＬ-6が活性なすべての系でＩＬ-6を阻害する。ここに間質性アクチビンＡとして同定されたレストリクチンＰは、プラズマ様細胞の増殖因子であるが、別の増殖因子に依存する他の細胞に拘束されないＩＬ -６および/またはＩＬ-11のアンタゴニストである。レストリクチンＰ/アクチビンＡはしたがって、たとえば免疫疾患の処置に使用できる。正常プラズマ細胞の生存および機能化に要求される増殖因子のアンタゴニストとして、抗体が寄与する疾患における病因的免疫状態において、これらの細胞の数を減少させ、これらの細胞を抑制するために使用できる。すなわち、レストリクチンＰ/アクチビンＡは、他の細胞型を傷害することなく、すなわち標的細胞に広いスペクトルを有する細胞傷害性薬物および免疫抑制剤の使用を回避してプラズマ細胞を殺滅することが要求される場合に推薦される。以下の範疇の免疫障害が、レストリクチンＰ/アクチビンＡによって処置できる。ａ．過敏症Ｉ型：ＩｇＥ感作マスト細胞は喘息または鼻炎のような症状を示す炎症反応を生じる。レストリクチンＰ/アクチビンＡは生存抗体産生プラズマ細胞の負荷を低下させるために使用できる。ｂ．過敏症II型：貧食、キラー細胞活性または補体誘発細胞溶解による抗体依存性細胞傷害。たとえば、赤血球の細胞表面に対する抗体は、新生児の溶血性疾患（抗Ｒｈ）および成人の自己免疫溶血性貧血を引き起こす。超急性移植片拒絶も抗体によって誘導される。重症筋無力症はアセチルコリン受容体に対する抗体によるものである。過敏症Ｉ型障害の場合のように、レストリクチンＰはこれらの場合にプラズマ細胞の負荷を軽減する。ｃ．過敏症III型：免疫複合体疾患。抗体と抗原の間の複合体は慢性Ｂ型肝炎、全身性ループスエリテマトーデス等で生じる。レストリクチンＰはこれらの場合に、他の連鎖に影響する可能性がある細胞傷害性薬物の使用を必要とせずに複合体産生プラズマ細胞の数を低下させるために使用できる。ｄ．自己抗体によって誘発されることが知られている甲状腺炎のような一部の自己免疫疾患の場合に、レストリクチンＰ/アクチビンＡが同様に使用できる。他の態様においては、レストリクチンＰ/アクチビンＡは、異常免疫グロブリン合成-プラズマ細胞疾患の処置に使用できる。一連の疾患はモノクローナル免疫グロブリンの蓄積を伴う。これらの状態の一部は制御され、モノクローナルタンパク質の量は十分に耐容されるが、他の場合には、重篤な疾患を生じて、プラズマ細胞の抑制に細胞傷害性薬物が使用される。レストリクチンＰ/アクチビンＡは、プラズマ様細胞に特異的なその殺滅作用によりはるかに良好なアプローチである。処置できる状態には慢性寒冷凝集素症、重鎖疾患、丘疹性粘液沈着症、壊疽性膿皮症、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、および免疫グロブリンアミロイド症が包含される。好ましい一実施態様においては、レストリクチンＰ/アクチビンＡは、造血幹細胞の増殖および分化の調節物質として知られ、多くの他の細胞型に影響する多面的サイトカインであるＩＬ-6のインビボ活性を修飾するために使用される。したがって、ＩＬ-6によるヒト患者の処置では、処置が向けられていない細胞に対しＩＬ-6によって引き起こされる副作用の問題に直面する。レストリクチンＰ/ アクチビンＡの使用は、骨髄移植および腫瘍治療の経過におけるＩＬ-6処置の場合に、ＩＬ-6のインビボ投与の影響を遮断または減弱させることを意味する。他の態様においては、上記ａ〜ｄに記載の免疫障害の場合に、ＩＬ-6およびＩＬ-11のアンタゴニストスとして、レストリクチンＰ/アクチビンＡは有用な可能性がある。本発明は、任意のアクチビンＡ，様々な種たとえばヒト、ブタ、ウシおよびラットからのネイティブなおよび組換えアクチビンＡを包含する。これらのアクチビンの間には100％のアミノ酸保存がある。様々な種のネイティブなおよび組換えアクチビンは、米国特許第4,798,885号（Masonら，Genentrech に譲渡），米国特許第4,973,577号（Vake，Jr.ら），米国特許第4,997,815号（Perrineら），米国特許第5,032,507号（Yuら）.米国特許5,071.834号（Burtonら，Genentrech に譲渡）および米国特許第5,102,868号（Woodruffら，Genentrech に譲渡）に記載されている。これらの記載は引用によりその全体が本明細書に導入される。本発明に使用される組成物は、標準操作に従いたとえば米国特許第5,102,868 号に記載されたように処方され服用される。この記載は引用により本明細書に導入される。１日用量は処置すべき疾患および患者の状態に依存することになるが約１μg/体重から約１mg/体重の範囲である。好ましい実施態様においては、レストリクチンＰ/アクチビンＡは非経口投与に適合する担体たとえば患者の血液と等張性のたとえばリン酸緩衝食塩溶液と製剤化し、注射により投与される。本発明を次に、以下の非限定的実施例によって例示する。実施例材料および方法（ｉ）細胞培養：ＭＢＡ-2.1間質細胞系（Ziporiら．1984）は100mmのプレート（Falcon 303，Oxnard，CA）中において増殖させ、10％熱失活ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Biolabs，Jerusalem，Israel）を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；Gibco，Grand Island，NY）からなる増殖培地中で１週間継代によって維持した。14Ｍ1.4マクロファージ（Ziporiら，1984）は、Ｍ-ＣＳＦをソースとして、20％Ｌ-細胞調整培地を添加した上述の培地中で増殖させた。ＭＰＣ-11（Laskov & Scharff．1970），ＳＰ-2．ＮＳＯ．Ｘ-24，Ｘ-63 およびＰ3. 1（Kohler & Milstein，1976）形質細胞腫細胞系は、10％ＦＣＳを含有するRosw ell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）1640（Gibco）中で増殖させた。ＡＢＬＳ-8（Sklarら，1975）およびＡＶＲij-1（Zipori & Bol，1978）プレ-Ｂリンパ腫細胞およにＴリンパ腫ＢＷ-5147（Hyman & Stallings，1974），骨髄腫瘍細胞系ＷＥＨＩ-265.1（Warnerら，1965）．Ｆ４Ｎフレンド赤白血球細胞系およびＰu-5-ＩＲマクロファージ細胞系（Ralphら．1976）はすべて、10％ＦＣＳおよび50ｍＭβ-メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ1640中で増殖させた。Ｂ9Ｂ細胞ハイブリドーマ細胞（Helleら，1988）は、10％ＦＣＳ．50ｍＭβ-メルカプトエタノールおよび10 IU/mlのヒト組換えＩＬ-6含有ＲＰＭＩ1640中で増殖させた。Ｍ1-S6（マウス骨髄性単球白血病Ｍ1細胞系；Ichikawa，1969）は10％ＦＣＳ補充ＲＰＭＩ1640中で増殖させた。ＨepＧ2肝癌細胞は８％ＦＣＳ補充ＲＰＭＩ164 0中で増殖させた。すべての細胞は空気中10％ＣＯ₂の加湿雰囲気下に37℃でインキュベートした。Ｂ9細胞は例外として空気中５％ＣＯ₂中でインキュベートした。（ii）サイトカインの生物学的アッセイ：レストリクチンＰはＭＰＣ-11形質細胞腫またはＢ9ハイブリドーマ細胞のいずれかを用いてモニターした。ＭＰＣ- 11細胞は、7.5％ＦＣＳ補充ＲＰＭＩ中、レストリクチンＰ含有サンプルの希釈系列または緩衝液（20ｍＭＴris-ＨＣl ｐＨ7.8または20ｍＭＨepes ｐＨ7.8 ）の存在下96-ウエルマイクロタイタープレート（100 ml/ウエル）（Coster,Cam bridge．MA）に8×10³細胞/ml で接種した。生存細胞数はインキュベーションの４日後に、ミトコンドリア活性によって細胞の生存度を測定する3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）比色アッセイを用いて測定した。ＭＴＴ（Sigma）（10μl/100μl培地；ＰＢＳ中５mg/ml の保存溶液）を各ウエルに加え、プレートを37℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後に150μlの酸-イソプロパノールを添加した。光学密度（ＯＤ）をついで固相酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）リーダー（Tite rtek Twinreader；FLAB，Helsinki．Finland）により、試験波長570mm，基準波長630mmで測定した。活性の１単位は上述の条件下に対照に対して50％増殖阻害を引き起こすタンパク質の量と指定した。このアッセイはＢ9細胞を用いた場合も、Ｂ9ハイブリドーマについて上述した培養条件以外は本質的に同じである。後者はＩＬ-6およびＩＬ-11レベルの滴定にも使用した。略述すればＢ9細胞（5 ×10³細胞/200μl）を試験サンプルおよび組換えヒトＩＬ-6およびＩＬ-11対照の存在下に96-ウエルプレート中で培養した。64 m時間インキュベートしたのち、細胞を³Ｈ-チミジン（Rotem Industries,Israel,１μＣi/mlウエル）と16時間パルスした。それぞれヒト組換えＩＬ-6およびＩＬ-11の標準曲線に関連させてＩＵＩＬ-6およびＩＬ-11を決定した。（iii）サイトカインおよび相当する中和抗体：使用したＴＧＦ-βに対する抗体はＴＧＦ-αおよびＴＧＦ-βの両者を中和するウサギ抗-ネイティブブタ血小板ＴＧＦ-β1とした。これら抗体はBritish Biotechnology Ltd.（Abingdon，Ox on，England）から購入した。ヒトＴＧＦ-β1も同じソースから入手した。ハムスター抗-マウスＩＮＦ-γ抗体は Genzyme Corporation（Boston，MA）から入手した。ＩＬ-3 は Peprotec から入手された。組換えヒト、およびマウスＩＬ-6 に対するモノクローナルラット抗-マウス中和抗体は、Genzyme Corporation（Bo ston，MA）から購入した。組換え，Ｎ末端切断換ヒトＩＬ-6（ムテニン）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は Pharmacia Biocenter（Nerviano，I taly）から恵与された。粗製の濃縮マウスＩＬ-6は Weizman InstituteのJ.Lote m博士から恵与された。マウスのＩＬ-6はLudwig Institute for CancerResearch ．BrusselsのJ．Van Snizk博士から入手した。ヤギ抗-Ｍ-ＣＳＦ中和抗血清はAl bert Einstein UniversityのR.E.Stanley博士から恵与された。組換えヒトＩＬ-1α，ＩＬ-2，ＩＬ-4およびＩＬ-7，ならびに組換えヒトＩＬ-1 0，ＩＬ-11およびＰＤＧＦは Genzyme Corporation（Boston，MA）から購入した。ヒトＧ-ＣＳＦはImmunex Corporation，SeattleのS．Gillis博士によって恵与された。組換えウシアクチビンＡはInnogenetics（belgiunl）から購入した。（iv）ＩＬ-6の標識：ＩＬ-6は既報（Chenら，1991）のようにして標識した。 100μlの緩衝液（100ｍＭリン酸カリウム．ｐＨ＝7.0．100ｍＭ酢酸ナトリウム．300ｍＭ食塩）中組換え(ｒ)-マウスＩＬ-6（10μg）またはｒ-ヒトＩＬ-6ムテイン（10μg）を４℃で２分間１mＣiの¹²⁵Ｉとプレインキュベートした20μlのクロラミンＴ（0.5mg/mlPBS，リン酸緩衝食塩溶液．Ｃａ⁺⁺．Ｍｇ⁺⁺を含まない）に加えた。45秒後にメタ重硫酸ナトリウム（20μl，１mg/ml PBS）を加え、ついで直ちに100μlのＫＩ（10mg/mlPBS）を加えた。0.25％ゼラチンならびに0.02 ％のナトリウムアジド含有ＰＢＳ中[¹²⁵Ｉ]-ＩＬ-6を中等度コースのSephadex G -25（Pharmacia）を用いてヨードを含まない型に分離した。（ｖ）Ｂ9細胞における競合結合：ｒ-Ｍu-[¹²⁵Ｉ]-ＩＬ-6（47,000 cpm/500μ l）は2×10⁶Ｂ9細胞と結合緩衝液（ＲＰＭＩ，20mＭＨepes．８％ウシ胎児血清．0.02％ナトリウムアジド）中氷上で１時間インキュベートした。ｒ-Ｈu-[¹²⁵ Ｉ]-ＩＬ-6（210.000cpm/500μl）は3×10⁶Ｂ9細胞と0.1％ナトリウムアジドの結合緩衝液中37℃で30分間インキュベートした。Ｂ9細胞はアッセイ前24時間ＩＬ-6を含まない培地中に24時間維持し、使用前に結合緩衝液で３回洗浄した。使用したｒ-Ｍu-[¹²⁵Ｉ]-ＩＬ-6またはｒ-Ｈu-[¹²⁵Ｉ]-ＩＬ-6の量は飽和結合を与えた量の30〜40％であった。これらの条件下には2,070±530の高親和性結合部位が存在し、Ｍu-ＩＬ-6およびＨu-ＩＬ-6はＬＩＧＡＮＤプログラム（Munson & R odbard，1980）により測定してそれぞれ見掛けのＫｄ5.5×10-¹⁰および1.1×10-¹⁰ で結合した。特異的高親和性結合は様々な濃度の粗製濃縮マウスＩＬ-6，ｒ- Ｈu-ＩＬ-6ムテイン，部分精製または高度精製レストリクチンＰと指示したように競合した。競合結合試験の結果は過剰倍数の関数としてプロットし、Ｂ9細胞上で１単位のレストリクチンＰは１単位のＩＬ-6を50％阻害する。（vi）タンパク質の精製：ＭＡＢ-2.1調整培地（粗製材料：1400ml．3200mgタンパク質，レストリクチンＰ2.5×10⁶単位）を既報（Kadouriら．1992）のようにタンパク質を含まないバイオリアクターシステム中で調製した。90mlのアリコートを製造用Q Sepharoseカラム（100ml，XK50）にＦＰＬＣシステム（ＵＶＭ-I I検出装置，Pharmacia LKB，Sweden 使用）を用いて負荷した。負荷したカラムを1200mlの初期緩衝液（20ｍＭＴris-Ｃl ｐＨ7.8）により流速８ml/分で洗浄した。レストリクチンＰは、同じ流速で初期緩衝液中0.05Ｍ食塩400mlで溶出した。タンパク質の溶出はその280mmの吸収で追跡した。塩溶出物質を滅菌ろ過し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ，システムはＳＰ8700/ＳＰ 8750ポンプ，Spectra Physics，CA，および441型検出器，Water Associates，MA から構成）を用い濃縮した。各サンプル（450〜500ml）をAquapore RP-300カラム（7μ，4.6×100mm＋4.6×30mmプレカラム，Applied Biosystems，CA）に流速 1〜3ml/分で負荷した。負荷したカラムを30mlのアセトニトリル（ＡＣＮ，５％）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，0.1％）水溶液で洗浄した。タンパク質はついで３段階勾配により、ＡＣＮ水溶液中 0.1％ＴＦＡ，流速0.5ml/分；５〜35 ％ＡＣＮ/10分ついで35％ＡＣＮ/20分の平坦段階、最後に35〜80％ＡＣＮ/20分にて溶出した。１ml の分画を収集した。タンパク質の溶出はその214mmの吸収で追跡した。タンパク質含量はBradford試薬（Bio-Rad，Munich）で測定し、レストリクチンＰの含量は上述のようにしてアッセイした。分画をSavant SpeedVac 遠心分離装置で真空乾燥し、−20℃に保持した。レストリクチンＰ活性を示す分画を20ｍＭＨepes（ｐＨ7.8）に溶解し、プールし、遠心分離し、ろ過し、各5m l中10mgのバッチでSuperdex75ゲルろ過カラム（20/60Pharmacia）に負荷した。3 60mlの２×ＰＢＳで流速2ml/分/チューブでカラムを洗浄した。溶出パターンは 280mmで追跡した。タンパク質およびレストリクチンＰの含量は上述のように測定した。タンパク質サンプルはさらにＲＰ-ＨＰＬＣで精製した。ゲルろ過工程からの生物活性分画（3.0〜3.5mgタンパク質）をプールし、ＲＰ-300カラム（7 μ．4.6×100mm）に負荷し、カラムを５％ＡＣＮ水溶液中0.1％ＴＦＡにより流速0.5ml/分で洗浄した。ついでタンパク質をＡＣＮ水溶液中0.1％ＴＦＡの多段直線勾配によって溶出した。勾配は５〜25％ＡＣＮ/5分、ついで25〜40％ＡＣＮ/30分、40 〜80％ＡＣＮ/2分、80％ＡＣＮでの平坦段階とした。毎分0.5mlの分画を収集した。タンパク質の溶出はその214mmの吸収で追跡した。生物活性分画をプールし、再クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）で以下のわずかな改変を除き本質的に同一の条件で真空乾燥した。タンパク質ピークの溶出が始まった時点で（通常約30％ＡＣＮ）勾配プログラムを「ホールド」した。カラムからピークが完全溶出した時点で（約５〜８分以内）元の勾配プログラムを再開した。生物活性分画を真空乾燥し−20℃に保持した。様々なタンパク質分画をMini-Protein IIゲル装置（Bio-Rad Laboratories，CA）を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析した。銀染色は Quick-Silver キット（Amersham，UK）または S ilver Stain Plus Kit（Bio-Rad Laboratories，CA）により行った。クーマッシーブリリアント染色はServa blueG Stainを用いて実施した。例１．間質細胞株ＭＢＡ−２．１の調製培地中のレストリクチン−Ｐ活性の標的細の範囲表１に示す種々の細胞株は、材料と方法のセクション（ｉ）に示すように増殖させた。細胞は、９６−ウェルマイクロタイタープレート中で４００細胞／１００μｌ／ウエルで接種した。ＭＢＡ−２．１細胞からの部分的に精製した調整培地を、記載した濃度で加えた。培養物を４日間インキュベートし、ＭＴＴ比色測定法で生存活性を測定した。数値は、三重測定の平均±ＳＤである。表１に示すように、ＭＢＡ−２．１細胞からの調整培地で検出したレストリクチン−Ｐの阻害活性は、形質様腫瘍細胞株に特異的であった。異なる造血細胞系統および異なる成熟段階を示す種々の他の細胞株は、この因子によりほんのわずかに阻害されたかまたは全く影響を受けなかった。レストリクチン−Ｐ活性が、造血細胞に影響を与えることが知られているサイトカインの１つに起因する可能性を排除するために、我々は、レストリクチン−Ｐ様活性を有する可能性のある因子について探索した。ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ１、ＰＧＤＦ、ｂＦＧＦ、ＩＦＮ−γ、およびＬＩＦを、ある濃度範囲について試験した。これらのサイトカインは、レストリクチン−Ｐに対して感受性が高いＭＰＣ −１１形質細胞腫（ジポリ（Zipori）ら，１９８６）の増殖を阻害する能力を持たなかった。さらに、ＴＧＦβ１およびβ２、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γおよびＭ−ＣＳＦに対する中和抗体は、ＭＢＡ−２．１細胞の調整培地中のレストリクチン−Ｐ様活性を低下させなかった（結果は示していない）。形質様細胞の阻害が介在される機構のヒントを得るために、上記調整培地を使用した。ＭＢＡ−２．１細胞調整培地は、後述するようにＭＰＣ−１１形質細胞腫の増殖を阻害し、またこれは、Ｂ９細胞に及ぼすＩＬ−６の増殖促進作用を妨害した。例２．レストリクチン−Ｐの精製これらの２つの機能が、同じ分子により媒介されるかどうかを決定するために、レストリクチン−Ｐを均一になるまで精製することが必要であった。従って我々は、タンパク質を全く含まない条件下で細胞の調整培地によりレストリクチン −Ｐ活性が観察されるバイオリアクター製造システムを構築した（カドウリ（Ka douri）ら，１９９２）。調整培地の６００リットルのバッチを、透析濾過により濃縮し、次にアミコン（Amicon）限外濾過、そして次に自動ＦＰＬＣカラムを使用して分画した。分画には、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過および最後に均一になるまでの２工程の逆相ＨＰＬＣによる精製を使用した。間質細胞調整培地からのレストリクチン−Ｐの精製は、図１Ａ〜Ｄにグラフで示す。さらなる詳細は材料と方法、セクション（vi）に記載してある。Ｑ−セファロース陰イオン交換クロマトグラフィー（図１Ａ）では、９０ml中に１．５× １０⁵単位の粗レストリクチン−Ｐを含有するＭＢＡ−２．１細胞株の処理した調整培地を、Ｑ−セファロースの分取用カラム（１００ml、ＸＫ５０）にのせた。カラムを、流速8ml／分で初期緩衝液（２０mMトリス−塩酸、ｐＨ７．８）１２００mlで洗浄し、次に４００mlの初期緩衝液中０．０５ＭＮａＣｌで溶出した。レストリクチン−Ｐ活性を有する画分（１６０〜２２０分で溶出）をプールし、脱塩し、ＲＰ−ＨＰＬＣで濃縮した。スーパーデックス（Superdex）７５ゲル濾過（図１Ｂ）では、Ｑ−セファロースカラムからのレストリクチン−Ｐを含有する画分を、２０mMのヘペス（ｐＨ７．５）に溶解し、スーパーデックス（Superdcx）７５ゲル濾過カラム（２０／６０、ファルマシア（Pharmacia））にのせた（５ml中タンパク質１０mg）。カラムを３６０mlの２×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で流速２ml／分で洗浄した。８mlの画分を集めた。生物活性のある画分（１０２〜１０６分）をプールした。Ｃ−３逆相ＨＰＬＣ−Ｉ（ＲＰ−ＨＰＬＣＩ、図１Ｃ）では、スーパーデックス（Superdex）７５カラムからの生物活性のある画分を、アクアポア（Aquapo re）ＲＰ−３００カラム（７ｍ、４．６×１００mm＋４．６×３０mmのプレカラム）に、流速１〜３ml／分でのせた。吸着されたタンパク質を、０．１％ＴＦＡ中のＡＣＮ水溶液の多段階勾配で流速０．５ml／分、５〜３０％ＡＣＮ／５分、次に３０〜４５％ＡＣＮ／２５分、次に４５〜８０％ＡＣＮ／２分、そして最後に８０％ＡＣＮ／３０のアイソクラチック工程により、カラムから溶出した。１ mlの画分を集めた。レストリクチン−Ｐ生物活性は、３１〜３５分に溶出し、これを集めた。Ｃ−８逆相ＨＰＬＣ−II（ＲＰ−ＨＰＬＣ II、図１Ｄ）では、部分的に精製したレストリクチン−Ｐを、前の工程と基本的に同じ条件下で再度クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）にかけたが、タンパク質ピークが溶出し始めた後は（通常、約３６％ＡＣＮ）勾配プログラムを「ホールド」にした。タンパク質のピークが完全にカラムから溶出した後（約５〜８分以内）、本来の勾配プログラムを再開した。生物活性を有する画分を３３〜３４分に集めた。図１Ａ〜Ｄにおいて、破線は２８０nm（図１Ａと１Ｂ）または２１４nm（図１Ｃと１Ｄ）における吸収を示し、白丸と太線は、ＭＰＣ−１１測定法で測定したレストリクチン−Ｐの生物活性を示し、細線はアセトニトリルのパーセントを示す（図１Ｃと１Ｄ）。図１から明らかなように、最後の段階で、レストリクチン−Ｐの生物活性（すなわち、形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１の増殖を阻害する能力）に一致するタンパク質の単一のピークが得られた。この高度に精製されたレストリクチン−Ｐを以下のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。活性画分（ＲＰ−ＨＰＬＣ II、図１Ｄ）からのアリコートを、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにのせた（レーン１）。銀染色によりタンパク質のバンドを目視観察した（レーン２）。分子量マーカーは、カーボニックアンヒドラーゼ３１kDa、トリプシンインヒビター２１．５kDa、リゾチーム１４．４kDa、およびアプロチニン６．５kDaである。図２Ｂに示すように、還元条件下でのこの生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、１５kDaで単一のタンパク質バンドを示した。この精製されたペプチドのＮ−末端の配列を決定し、図２Ａに示すように、最初の３５残基は、インヒビンのβＡサブユニットの前駆体のもの（これは、１５kDaのポリペプチドを生成し（メーソン（Mason）ら，１９８５：ロバートソン（Robertson）ら，１９９２）、このサブユニットのダイマーはアクチビンＡである）と同じであった。例３．精製されたレストリクチン−Ｐと組換えアクチビンＡによるＭＰＣ−１１形質細胞腫細胞増殖の阻害レストリクチン−Ｐ（三角）、アクチビンＡ（白丸）または対照増殖培地（× ）の連続希釈物とともに、１０％ＦＣＳを含有する１００μｌのＲＰＭＩ中で、９６ウェルファルコン（Falcon）マイクロタイタープレートに細胞を接種した（４×１０²／ウェル）。細胞を４日間インキュベートし、その生存活性をＭＴＴ測定法で推定した。棒線は、二重測定の平均±ＳＤを示す。図３から、両方の因子とも、ＭＰＣ−１１細胞の増殖を抑制する同等の能力を有することが明らかである。これは、例２の結果と合わせると、レストリクチン−ＰがアクチビンＡと同一であることを示唆する。例４．レストリクチン−Ｐは、ＩＬ−６とＩＬ−１１に誘発されるＢ９細胞の増殖に拮抗するレストリクチン−Ｐ／間質性アクチビンＡが形質様細胞増殖を阻害する機構を調べるために、我々は、この作用が、可逆的な細胞性塞栓を介するかまたは細胞破壊を伴う機構が介するかを調べた。非精製型のレストリクチン−Ｐは、アポトシスに関連するイオン性変化を誘発するようであった（マリク（Malik）ら，１９９２）。この細胞死滅の様式は、その特異的増殖因子の欠如した造血細胞で起きることが知られている。Ｂ９ハイブリドーマは、その増殖がＩＬ−６に依存し、従ってレストリクチン−Ｐが増殖因子（ＩＬ−６）の作用を妨害して増殖を停止させる可能性を調べるためにこれを使用した。Ｂ９細胞を、５％ＦＣＳ（＝増殖因子）補足ＲＰＭＩで３回洗浄して微量のＩＬ−６を除去し、増殖培地中で一晩インキュベートした。次にこれらを増殖培地で洗浄（×３）し、記載した希釈率の組換えヒトＩＬ−６（図４Ａ、白抜きの記号）または同じＩＬ−６希釈物と１．５単位／ウェルの精製レストリクチン−Ｐ（図４Ａ、塗りつぶした記号）を補足した増殖培地中で、９６マイクロタイターウェルプレートに接種した（５×１０³細胞／２００μl／ウェル）。組換えヒトＩＬ−１１で同様の実験を行った。Ｂ９細胞に、このサイトカインの連続的希釈物（図４Ｂ、白抜きの記号）またはＩＬ−１１と０．０１８単位／ウェルのレストリクチン−Ｐ（図４Ｂ、塗りつぶした記号）を接種した。ＩＬ−１１はＢ９細胞をあまり刺激しないため、この低濃度のレストリクチン−Ｐを使用すると、完全な増殖阻害を引き起こすのに比較的低濃度のレストリクチン−Ｐが充分であった。細胞を４８時間インキュベートし、次に³Ｈ−チミジン（１μCi／ウェル）のパルスを１２時間かけた。数値は、三重測定の平均±ＳＤを示す。すなわち図４Ａに示すように、０．１IU/ウェルのＩＬ−６により多数のＢ９細胞の増殖が誘発され、上昇する濃度のこの精製サイトカインを添加するとわずかな増殖刺激が観察されたのみである。０．０１〜０．１IU/ウエルのＩＬ−６で刺激したＢ９細胞培養物にレストリクチン−Ｐを添加すると、ほぼ完全な増殖阻害が起きた。この阻害作用は、ＩＬ−６の濃度を上昇させると徐々に低下し、２００IU／mlのＩＬ−６でほぼなくなった（図４Ａ）。ＩＬ−１１は、形質様細胞の追加の刺激物質である（バーガーとグラマザキ（ Burger and Gramatzaki）．１９９３）。図４Ｂに示すように、レストリクチン −Ｐはまた、ＩＬ−１１刺激Ｂ９細胞の増殖を阻害し、この阻害は、ＩＬ−１１の濃度を上昇させることにより競合を受けた。例５．レストリクチン−ＰはＩＬ−６のＢ９細胞への結合を妨害しない前述のように、レストリクチン−ＰはＩＬ−６およびＩＬ−１１の増殖刺激作用を妨害し、高濃度のこれらのサイトカインは、レストリクチン−Ｐの作用に打ち勝った。従って、増殖因子ＩＬ−６とＩＬ−１１およびレストリクチン−Ｐは、シグナル化経路の生成に使用されるいくつかの標的機構に対して競合しているようである。レストリクチン−Ｐ作用の標的分子の候補は、ＩＬ−６受容体複合体であった。我々は、Ｂ９細胞の表面のその受容体への結合について放射能標識ＩＬ−６と競合するレストリクチン−Ｐの能力を試験することにより、レストリクチン−Ｐが受容体アンタゴニストである可能性を試験した。使用したｒ−Ｍｕ−［¹²⁵Ｉ］−ＩＬ−６またはｒ−Ｈｕ−［¹²⁵Ｉ］−ＩＬ− ６ムテイン（Muteine）の量は、飽和結合を与える量の３０〜４０％であった。Ｂ９細胞細胞は、結合測定法の２４時間前に増殖培地中でＩＬ−６から分離した。これらの条件下で、細胞は２０７０±５３０の高親和性結合部位を有し、ｒ− Ｍｕ−ＩＬ−６およびｒ−Ｈｕ−ＩＬ−６ともに高親和性で結合した（見かけのＫｄはそれぞれ５．５×１０^-10および１．１×１０^-10Ｍ）。図５Ａは、変化する濃度の粗濃縮マウスＩＬ−６（白抜きの記号）または部分精製したレストリクチン−Ｐ（塗りつぶした記号）と競合する一定量のｒ−Ｍｕ −［¹²⁶Ｉ］−ＩＬ−６の特異的高親和性結合を示す。結合したｒ−Ｍｕ−ＩＬ −６の全平均は、１１２０±４８cpmであった。図５Ｂは、一定量のｒ−Ｈｕ− ［¹²⁵Ｉ］−ＩＬ−６ムテイン（白抜きの記号）または精製レストリクチン−Ｐ（塗りつぶした記号）の特異的高親和性結合を示す。結合したｒ−Ｈｕ−ＩＬ− ６の全平均は、２３５０±６８cpmであり、これは２００倍過剰の粗濃縮マウスＩＬ−６と１２３±３０に競合Ｌた。競合結合実験の結果を、過剰倍数の関数としてプロットする（ここで、１単位のレストジクチン−Ｐは、Ｂ９細胞上で１単位のＩＬ−６を５０％阻害する）。誤差棒は、多重測定の標準偏差を示す。図５に示すように、「冷」ＩＬ−６は、予想通りその受容体への放射能標識１Ｌ−６の結合と競合した。一方、レストリクチン−Ｐは、ＩＬ−６の増殖刺激作用を完全に阻害する濃度で、その受容体への放射能標識ＩＬ−６の結合を低下させなかった。すなわち、レストリクチン−Ｐは、リガンド結合を妨害しないようである。例６．レストリクチン−Ｐは、急性相タンパク質であるα−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）とハプトグロビン（ＨＧ）のＩＬ−６誘発性分泌を妨害するＨｅｐＧ２肝癌は、ＩＬ−６の影響を受けて急性相タンパク質を放出する。ＨｅｐＧ２細胞をコンフルエンスになるまで増殖させ、１００単位/mlのＩＬ−６または３１２単位/mlのレストリクチン−Ｐとともに等量のＩＬ−６で刺激した。２４時間目に調整培地を集め、ＰＡＧＥ（ＡＧＰとＨＧについて、それぞれ１０％および７％ゲル）を行い、急性相タンパク質について対応する抗体（シグマ（Sigma）（イスラエル）から購入した）を使用してウェスタンブロッティング法により試験した。図６に示すように、ＨｅｐＧ２細胞中でＩＬ−６により誘発されたＡＧＰとＨＧの分泌は、レストリクチン−Ｐの添加により顕著に低下した。例７．ＳＴＡＴ活性化へのレストリクチン−Ｐの作用ジェーナスキナーゼ（Janus Kinases）（ＪＡＫ）は、ＩＬ−６受容体と会合する。これらは、リガンド結合を、転写のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター（ＳＴＡＴ）と呼ばれる転写因子のチロシンリン酸化と共役させる。ＩＬ−６シグナル生成に関与するＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路中のレストリクチン− Ｐの妨害の可能性を、ＨｅｐＧ２細胞で試験した。ＨｅｐＧ２細胞を、図７に示すように、ヒト組換えＩＬ−６（１０単位/ml）およびレストリクチン−Ｐとともにインキュベートした。ＩＬ−６とレストリクチン−Ｐは同時に加えるか、またはＩＬ−６添加の３０分または１６時間前にレストリクチン−Ｐを加えた。培地へのＩＬ−６添加の１５分後、細胞を採取し、ここから標準的方法により核抽出物を調製した。次に、ｃ−ｆｏｓプロモーターｓｉｓ−誘発性成分（ＳＩＥ）をカバーする³²Ｐ−標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ゲル遅延測定法により１０μgのタンパク質を解析した。結果は図７に示し、ここにＳｔａｔ３およびＳｔａｔ１αホモダイマーまたはＳｔａｔ３／Ｓｔａｔ１αヘテロダイマーを含有するＳｔａｔ１α ＤＮＡ−タンパク質複合体の位置を示してあり、ＨｅｐＧ２肝癌細胞中でレストリクチン−ＰはＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を妨害せず、ＳＴＡＴタンパク質活性化をわずかに上昇させることを証明している。例８．レストリクチン−ＰはＭ１骨髄細胞中のＩＬ−６強化ミトコンドリア活性を妨害する表２に示すように、レストリクチン−Ｐおよび／またはＩＬ−６の添加とともに、マイクロタイタープレートに５×１０⁴／mlでＭ１細胞を接種した。レストリクチン−Ｐは１３０単位/mlで添加し、ＩＬ−６は５０単位／ウェルで添加した。これらの条件下で、培養物をＭＴＴ比色測定法（材料と方法、セクション（ ii））で試験した時、３日目に細胞数の真の変化は起きなかった。示したデータは、実施した３つの実験の１つからのものであるが、いずれの実験も同様の結果を示した。実験は、レストリクチン−Ｐが、Ｍ１骨髄芽球のＩＬ−６介在ミトコンドリア活性を妨害することを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＩＬ，ＪＰ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．レストリクチンＰ/アクチビンＡおよび医薬的に許容される担体からなるＩＬ-6および/またはＩＬ-11のインビボ活性の修飾用医薬組成物。２．アクチビンＡはブタ、ウシおよびヒトアクチビンＡから選択される「請求項１」記載医薬組成物。３．アクチビンＡは組換えヒトアクチビンＡである「請求項１」記載医薬組成物。４．ＩＬ-6の有害作用を遮断または減弱させる「請求項１」記載医薬組成物。５．ＩＬ-6および/またはＩＬ-11のインビボ活性の修飾用の医薬組成物を製造するためのレストリクチンＰ/アクチビンＡの使用。６．ＩＬ-6の有害作用を遮断または減弱のための「請求項５」記載の使用。７．アクチビンＡはブタ、ウシおよびヒトアクチビンＡから選択される「請求項５または６」記載の使用。８．組換えヒトアクチビンＡの「請求項７」記載の使用。９．ＩＬ-6および/またはＩＬ-11のインビボ活性を修飾する方法において、それを必要とする患者にレストリクチンＰ/アクチビンＡの有効量を投与することからなる方法。 10．アクチビンＡはブタ、ウシおよびヒトアクチビンＡから選択される「請求項９」記載の方法。 11．アクチビンＡは組換えヒトアクチビンＡである「請求項10」記載の方法。 12．腫瘍治療時にＩＬ-6による処置を受けている患者のＩＬ-6の有害作用を遮断または減弱させる方法において、その患者にレストリクチンＰ/アクチビンＡの有効量を投与することからなる方法。 13．アクチビンＡはブタ、ウシおよびヒトアクチビンＡから選択される「請求項12」記載の方法。 14．アクチビンＡは組換えヒトアクチビンＡである「請求項13」記載の方法。 15．骨髄移植を受けていてＩＬ-6による処置が行われている患者のＩＬ-6の有害作用を遮断または減弱させる方法において、その患者にレストリクチンＰ /アクチビンＡの有効量を投与することからなる方法。 16．アクチビンＡはブタ、ウシおよびヒトアクチビンＡから選択される「請求項15」記載の方法。 17．アクチビンＡは組換えヒトアクチビンＡである「請求項16」記載の方法。 18．免疫障害に冒されている患者にレストリクチンＰ/アクチビンＡの有効量を投与することからなる免疫修飾方法。 19．プラズマ細胞を、患者の他の細胞型に影響を与えることなく殺滅する「請求項18」記載の方法。 20．アクチビンＡはブタ、ウシおよびヒトアクチビンＡから選択される「請求項18または19」記載の方法。 21．アクチビンＡは組換えヒトアクチビンＡである「請求項20」記載の方法。