HU215233B - Eljárás az IL-11, egy új emlős citokin előállítására - Google Patents

Eljárás az IL-11, egy új emlős citokin előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU215233B
HU215233B HU9201712A HU171292A HU215233B HU 215233 B HU215233 B HU 215233B HU 9201712 A HU9201712 A HU 9201712A HU 171292 A HU171292 A HU 171292A HU 215233 B HU215233 B HU 215233B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
sequence
amino acid
cell
dna
Prior art date
Application number
HU9201712A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT64595A (en
HU9201712D0 (en
Inventor
Frances K. Bennett
Yu-Chung Yang
Original Assignee
Children's Medical Center Corp.
Genetics Institute Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Children's Medical Center Corp., Genetics Institute Inc. filed Critical Children's Medical Center Corp.
Publication of HU9201712D0 publication Critical patent/HU9201712D0/hu
Publication of HUT64595A publication Critical patent/HUT64595A/hu
Publication of HU215233B publication Critical patent/HU215233B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2073—IL-11
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5431—IL-11
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás új emlős citőkin, az IL–11 előállítására.Az IL–11 gyógyászati készítményekben alkalmazható azőknak a sejtekneka serkentésére és/vagy működésének javítására, amel ek azimműnválaszban vesznek részt, valamint azőknak a sejteknek aserkentésére, amelyek a hematőpőietikűs rendszer helyes működésébenszerepelnek. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás az immun- és a hematopoietikus sejtek működését serkentő új citokin kinyerésére és előállítására rekombináns DNS technikával.
Növekvő számú olyan szabályozó fehérjefajtát azonosítottak, amelyek jeleket közvetítenek az immunrendszer sejtjei között. Ezeket a szabályozó molekulákat citokin néven ismerik. Számos citokinről kiderült, hogy szabályozzák a növekedést és a fejlődést, valamint a hematopoietikus és immunrendszer sejtjeinek működését. Ezek közé a molekulák közé tartozik az összes telepstimuláló faktor (azaz a GM-CSF, G-CSF, M-CSF és a multi-CSF vagy interleukin-3), az interleukinok (az IL—1 -tői az IL—9-ig), az interferonok (alfa, béta és gamma), a tumor nekrózis faktorok (alfa és béta), az eritropoietin, a makrofág gátló fehérjék, a tumor növekedési faktorok és a leukémia gátló faktor (LIF). Ezek a citokinek széles körű biológiai aktivitást mutatnak a csontvelőből, perifériális vérből, magzati májból és más limfoid vagy hematopoietikus szervből származó célsejteken [Balkwill, F. R. and Bürke, Immunology Today, 10 (9), 299 (1989); G. Wong and S. Clark, Immunology Today 9 (5), 137 (1988); és S. C. Clark and R. Kamen, Science, 236, 1229-1237 (1987)].
Bizonyos citokinek biokémiai és biológiai azonosítását, valamint jellemzését megnehezíti, hogy a természetben előforduló faktorok csak kis mennyiségben hozzáférhetők a természetes forrásokban, azaz a vérben és a vizeletben. Számos citokint klónoztak nemrég, heterológ rendszerben expresszálták, és homogenitásig tisztították. Számos ilyen tisztított faktorról azt találták, hogy szabályozó hatást mutat a hematopoietikus és immunrendszerre in vivő, ilyenek például a GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, TNF, az interferon és az eritropoietin.
A szakterületen továbbra is fennáll az igény természetes forrásból izolált vagy más módszerrel homogén formában előállított további olyan fehérjék iránt, amelyek képesek serkenteni az immunválaszoló képességet és a hematopoietikus sejtfejlődést, és amelyek alkalmasak a gyógyászatban való alkalmazásra.
A találmány tehát egy új emlős citokin, az IL— 11 előállítására vonatkozik, amely lényegében mentes más emlős fehérjéktől. Ezt a fehérjét rekombináns DNS módszerrel lehet előállítani. Tisztítható továbbá olyan sejtekből, amelyek a faktort természetben, illetve más faktorokkal való indukció hatására termelik. Az IL-11 szintetizálható továbbá kémiai módszerekkel is, illetve a fenti technikák kombinációjával.
Az aktív, érett emlős IL-11 egy körülbelül 178 aminosavból álló fehérje, molekulatömege körülbelül 20 kD, amit az IL-11 cDNS-sel fertőzött COS-1 sejtek 35S-sel jelzett felülúszójából állapítottuk meg dodecilszulfát-poliakrilamid-gélelektroforézissel. Az érett fehérje számított molekulatömege is körülbelül 20 kD.
A találmány szerinti eljárással előállított IL-11 fehérje biológiai aktivitással rendelkezik különböző vizsgálatokban, ami az általános serkentő szerepét jelzi különböző hematopoietikus és immun funkcióban. A találmány szerinti eljárással előállított IL—11 fehérje proliferatív aktivitással rendelkezik egy IL-6 dependens egér plazmacitóma sejtvonalon, a T1165-ön. Az előzetes vizsgálatok során az IL-11-ről kiderült az is, hogy képes serkenteni, közvetve vagy közvetlenül, a B-sejtek érését. Pontosabban, az IL-11-ről az a kép alakult ki, hogy serkenti a B sejtek T-sejt függő fejlődését. Továbbá szinergizmust mutat az IL-3-mal a megakariocita proliferációt serkentő vizsgálatban, de képes más vonalakra is hatást kifejteni.
A találmány tárgya továbbá eljárás egy DNS-szekvencia előállítására, amely az emlős IL-11 fehérje expresszióját kódolja. Ez a DNS-szekvencia tartalmazhat egy izolált DNS-szekvenciát, amely az emlős IL—11 fehérje expresszióját kódolja, a fentiek szerint. Az aktív IL-11-et kódoló DNS-szekvencia ugyanazt vagy lényegében ugyanazt a szekvenciát vagy annak egy fragmentjét tartalmazza, mint ami az I. táblázatban látható. Ez a DNS-szekvencia 5’ és 3’ emlős nem-kódoló szekvenciákat tartalmazhat, amelyek az IL-1 kódoló szekvencia előtt és után találhatók. A DNS-szekvencia egy amino-terminális szignál-peptidet is kódolhat. Az I. táblázatban bemutatjuk ezeket a nem-kódoló 5’ és 3’ határoló szekvenciákat, valamint az emlős IL—11 egy szignál szekvenciáját, amelyet a PU34 főemlős sejtvonalból izoláltunk, és COS-1 sejtekben fejeztünk ki.
A találmány szerinti eljárással előállított DNS-szekvencia azonban esetleg nem tartalmazza az összes határoló szekvenciát vagy ezek közül egyet sem tartalmaz. A találmány szerinti eljárással előállított DNS szekvencia, amely egy biológiailag aktív emlős IL-11 fehéijét kódol, tartalmazhat továbbá egy olyan DNS-t is, amely megfelelő körülmények között képes az I. táblázat egy izolált DNS szekvenciájához hibridizálni, illetve, amely az említett körülmények között képes lenne hibridizálni, ha a genetikai kód degeneráltsága nem állna fenn. így a találmány szerinti eljárással előállított DNS szekvencia tartalmazhat vagy tartalmaz módosításokat a nem-kódoló szekvenciákban, a szignál szekvenciákban vagy a kódoló szekvenciákban az allélikus variációk, faj variációk vagy szándékos módosítások alapján.
A találmány további tárgya eljárás egy olyan rekombináns DNS molekula előállítására, amely egy vektor DNS-t és az emlős IL-11-et kódoló DNS-t tartalmazza. A DNS molekulában az IL-11-nek megfelelő DNS működőképes kapcsolatban van egy olyan szabályozó szekvenciával, amely képes a replikáció és az IL-11 expressziójának szabályozására egy kiválasztott gazdasejtben. A rekombináns IL-11 fehérje expressziója céljából ilyen DNS molekulákkal transzformáit gazdasejtek előállítása is a találmány tárgykörébe tartoznak.
A találmány szerinti eljárással előállított DNS molekulákat és transzformált sejteket más célra is használhatjuk, éspedig egy új eljárásban rekombináns emlős IL-11 fehérje vagy annak peptid ffagmentjei előállítására. Ebben az eljárásban a rekombináns DNS kifejezését lehetővé tevő körülmények között egy olyan sejtvonalat tenyésztünk, amelyet IL—11 fehérje vagy annak egy ffagmense expresszióját kódoló DNS szekvenciával (vagy egy, az előzőekben leírt rekombináns DNS
HU 215 233 Β molekulával) - egy alkalmas szabályozó vagy expressziós szabályozó szekvenciával operatív kapcsolatban - transzformáltunk. Ezután a kifejezett IL—11 fehérjét alkalmas módszerrel kinyerjük a gazdasejtből vagy a tény észfolyadékból. Az eljárásban számos ismert sejtet használhatunk gazdasejtként a fehéqe kifejezéséhez. Az IL-11 előállításához jelenleg előnyösen alkalmazhatók az emlős és baktérium sejtek.
A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyászati készítmények előállítására, amelyek az emlős IL—11-ből, illetve annak egy vagy több biológiailag aktív peptid ffagmensből gyógyászatilag hatékony mennyiséget tartalmaznak. Ezeket a fehérjéket vagy peptid fragmenseket gyógyászatilag elfogadható hordozóval kombinálva alkalmazhatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítményeket adagolhatjuk önmagukban vagy más alkalmas gyógyászati hatóanyaggal kombinálva, olyan betegségek kezelésére, amelyekre a hematopoietikus sejtek aktivitásának különböző fokú hiánya jellemző. Az IL-11 -et tartalmazó gyógyászati készítmények használhatók az immunrendszer megbetegedéseinek, például az immunhiányok kezelésére is.
Az IL—11 -et tartalmazó készítmények használhatók a megakariocita növekedés és differenciálódás serkentésére az IL-3-mal szinergizálva. A további felhasználási területek a vérlemezke képződés, a szerzett kemoterápiás vagy csontvelőhöz kapcsolódó trombocitopénia. Az IL-11 valószínűleg effektor molekulaként is működik, más citokinek működésének javításában is. Az IL—11 készítmények arra is használhatók lehetnek, hogy közvetlenül vagy közvetve sekentsék a B sejtek termelődését vagy működését. Az IL-11 készítmények tehát felhasználhatók a rák és fertőzések kezelésében, a sebgyógyulás felgyorsításában, illetve általában az immunrendszer serkentésében. Az IL-11 használható bizonyos antigének, főleg vakcinák által kiváltott immunválasz erősítésére is.
A találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítmények alkalmazhatók ezeknek és/vagy más patológiai állapotoknak a kezelésére oly módon, hogy egy betegnek az IL—11, illetve annak egy peptid fragmense terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk alkalmas gyógyászati hordozóval kombinálva. Az említett gyógyászati eljárásokban az IL-11-et, illetve egy peptid fragmensét más citokin, hematopoietin, interleukin, növekedési faktor vagy antitest hatásos mennyiségével egyszerre is adagolhatjuk.
A találmány egy további tárgya eljárás olyan antitestek előállítására, amelyek az emlős IL—11, illetve fragmentjei ellen irányulnak. E szempontból a találmány kiterjed olyan sejtvonalak előállítására is, amelyek az ilyen antitesteket szekretálják.
A mellékelt 1. ábra a rágcsáló NP-reaktív B sejtek fejlődésének javulását ábrázolja, amit pClR6-tal transzfektált COS-1 sejtek táptalajában a rágcsáló tarfoltképző vizsgálatban vettünk fel.
A 2. ábra az IL-3 dependens rágcsáló megakariocita telepek fejlődésének javulását ábrázolja, amit pClRótal transzfektált COS-1 sejtek kondicionált táptalajában rágcsáló fíbrinrögvizsgálatban vettünk fel.
A találmány tárgya tehát eljárás egy biológiailag aktív, emlős citokin, az IL-11 más emlős fehérjéktől és fehéijeszerű anyagoktól lényegében mentes formában történő előállítása. Ezt a fehéijét rekombináns technikával lehet előállítani, így készíthető nagy mennyiségű tiszta, aktív IL-11 a gyógyászati alkalmazások céljára. Egy másik módszer szerint a fehérjét homogén fehérje formájában állíthatjuk elő úgy, hogy egy, a fehérjét szekretáló vagy expresszáló emlős sejtvonalból tisztítjuk. Az IL-11-et vagy aktív fragmentjét emellett kémiailag is szintetizálhatjuk.
Az emlős IL-11 -et először egy főemlős sejtvonalból izoláltuk, amely sejtvonalat úgy állítottunk elő, hogy egy egészséges makákó majomból származó csontvelő sejteket hosszú idejű tenyészetbe vittünk, és az U19-5 retrovírussal fertőztünk (Dr. Roger Cone, Tufts Medical School). A megfelelő antibiotikummal való inkubálás után egy pPU34 jelű élő sejtvonalat választottunk ki a növekedési jellemzők alapján, és Escherichia coli-ban expresszált IL-1 alfával indukáltuk. A kondicionált táptalaj az IL-6 dependens egér plazmacitóma sejtekkel végzett proliferációs vizsgálatban IL-6 semlegesítő antitestek jelenlétében aktivitást mutatott. Egy cDNS könyvtárat készítettünk az IL—1gyel serkentett (2 egység/ml IL-124 óránként) PU34 sejtek mRNS-éből, a korábban leírt expressziós klónozási módszerrel [G. G. Wong és munkatársai, Science, 228, 810-815 (1985); Y. C. Yang és munkatársai, Cell, 47, 3-10 (1986); és A. E. Namen és munkatársai, Natúré, 333, 571-573 (1988)].
A könyvtárat egy expressziós vektorban készítettük el, amely lehetővé teszi a cDNS inszertek expresszióját emlős sejtekben, például a COS-1 sejtekben. A könyvtár átvizsgálását úgy végeztük, hogy a COS-1 sejteket 5 pg, 200-500 cDNS klónból készült anyaggal transzfektáltuk. A felülúszó folyadék aktivitását a TI 165 vizsgálattal megvizsgálva, IL—11 aktivitással rendelkező cDNS kiónokat azonosítottunk.
Egy TI 165 aktivitással rendelkező izolált kiónt a pPU34-TRA jelzéssel láttunk el (használjuk még a pClR6 jelölést is), és meghatároztuk a szekvenciáját. Az I. táblázatban megadtuk az IL-11 polipeptidnek mind az emlős, mind a humán klónból származó cDNS-szekvenciáját, valamint az aminosav-szekvenciáját (egybetűs kóddal). A főemlős szekvencia 1-721-es nukleotid-szekvenciáját a pClR6-ból határoztuk meg. A megmaradó, 721-1102-es nukleotidok szekvenciáját egy másik főemlős cDNS-ből határoztuk meg, melyet a pClR6-tal való hibridizációval választottunk ki. Egy humán cDNS-t, amely az IL-11 plazmacitóma serkentő aktivitását kódolja, az MRC5 humán tüdő sejtvonalból készített cDNS könyvtárból izoláltuk [Jacobs és munkatársai, Natúré, 227, 43 (1970)] oly módon, hogy közvetlenül a pPU34-TRA (pClR6) inszertjével hibridizáltuk. A humán IL-11 nukleotid-szekvenciában talált különbségeket az I. táblázatban, a főemlős szekvencia fölött, míg az aminosav-szekvenciában létrejött változásokat alul, a megfelelő főemlős szekvencia alatt jelöljük.
A főemlős nukleotid-szekvencia 1100 bázispárt tartalmaz. A főemlős szekvencia 72 bp hosszúságú 5’
HU 215 233 Β nem-kódoló szekvenciát tartalmaz. Az I. táblázatban egy 431 bp hosszúságú 3’ nem-kódoló szekvencia is látható. A humán nukleotid-szekvencia hasonlóképpen egyetlen 597 nukleotidból álló leolvasási keretet tartalmaz.
Mind a humán, mind a főemlős szekvenciát egyetlen hosszú leolvasási keret jellemzi, amelyből egy módosítatlan, 199 aminosav hosszúságú polipeptid következtethető ki, amely az I. táblázat 73-as pozíciójában kezdődik. Mind a főemlős, mind a humán kiónban az IL—11 megjósolt aminosav szekvenciája az 1 -es (Met) pozíciótól kezdődően a 21-es (Alá) pozícióig tartó első 21 aminosavban egy hidrofób aminosav szakaszt tartalmaz, amely emlékeztet a szokásos emlős szekréciós vezető szekvenciára [D. Perlman és munkatársai, Journal of Molecular Biology, 167, 391-409 (1983)]. Az érett IL—11 fehérje N-terminálisa (az I. táblázatban aláhúzva) a Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly aminosav-szekvenciát tartalmazza. A fehérje először egy 199 aminosavból 5 álló prekurzor formájában szintetizálódik, amely a 134—135-ös nukleotidok között proteolitikusan hasad, így keletkezik az érett, 178 aminosavból álló polipeptid, amely a Pro-Gly szekvenciával kezdődik a 22-23-as aminosav-pozíciókban, és a 199-es aminosav pozícióval fejeződik be a TGA terminációs triplettnél, a 671-672-es nukleotid-pozícióban. Az érett fehéije számított molekulatömege jól megfelel azon új fehérjecsík molekulatömegének, amelyet IL—11 cDNS-sel transzfektált COS-1 sejtek felülúszó folyadékából állítottunk elő, azaz körülbelül 20 kD mindkét esetben.
HU 215 233 Β
I. táblázat
Főemlős és humán IL—11 szekvencia, 5’-3’
A humán és a főemlős szekvencia közötti különbséget a főemlős nukleotid- és aminosav-szekvencia felett bázisokkal, alatta aminosavakkal jelöltük.
GGGAAGGTGG AAGGGTTAAA GGCCCCCGGC TCCCTGCCCC 40
CTGCCCTGGG GAACCCCTGG CCCTGCGGGG AC ATG AAC TGT GTT 84 Met Asn Cys Val
TGC CGC CTG GTC CTG GTC GTG CTG AGC CTG TGG CCA GAT 123
Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro Asp
10 15 szignál szekvencia hasítási hely
C * C
ACA GCT GTT G££ CCT GGG CCA CCA CCT GGC TCC CCT CGA 162
Thr Alá Val Alá Pro Glv Pro Pro Pro Glv Ser Pro Arg
25 Pro 30
N-terminális érett
IL-ll
T
GCT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC GTG 201
Alá Ser Pro Asp Pro Arg Alá Glu Leu Asp Ser Thr Val
Val 35 40
CTC CTG ACC CGC TCT CTC CTG C GAG GAC ACG CGG CAG CTG 240
Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Glu Asp Thr Arg Gin Leu
45 50 Alá 55
G GC G
ACT ATA CAG CTG AAG GAC AAA TTC CCA GCT GAC GGG GAC 279
Thr Ile Gin Leu Lys Asp Lys Phe Pro Alá Asp Gly Asp
Alá Alá 60 Arg 65
CAC AAC CTG GAT TCC CTG CCC ACC CTG GCC ATG T AGC GCG 318
His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Alá Met Ser Alá
70 75 80
A G
GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC CCG AGT GTG CTG ACA 357
Gly Alá Leu Gly Alá Leu Gin Leu Pro Ser Val Leu Thr
85 90 Gly 95
HU 215 233 Β
1. táblázat (folytatás)
AGG CTG CGA GCG GAC CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAT GTG 396
Arg Leu Arg Alá Asp Leu Leu Ser Tyr-Leu Arg His Val
100 105
C GGT
CAG TGG CTG CGT CGG GCA ATG GGC TCT TCC CTG AAG ACC 435
Gin Trp Leu Arg Arg Alá Met Gly Ser Ser Leu Lys Thr
110 Gly 120
115
C G A
CTG GAG CCT GAG CTG GGC ACC CTG CAG ACC CGG CTG GAC 474
Leu Glu Pro Glu 125 Leu Gly Thr Leu Gin 130 Thr Alá Arg Leu Asp
CGG CTG CTG CGC CGG CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG 513
Arg 135 Leu Leu Arg Arg Leu 140 Gin Leu Leu Met Ser 145 Arg Leu
CA G
GCC CTG CCC CAG CTG CCC CCA GAC CCG CCG GCG CCC CCG 552
Alá Leu Pro Gin Leu Pro Pro Asp Pro Pro Alá Pro Pro
150 Pro 155 160
CTG GCG CCC CCC TCC TCA G ACC TGG GGG GGC ATC AGG GCC 591
Leu Alá Pro Pro Ser Ser Thr Trp Gly Gly Ile Arg Alá
165 Alá 170
GCC CAC GCC ATC CTG GGG Leu Gly GGG Gly 180 CTG Leu CAC CTG His Leu ACA CTT GAC 630
Alá His Alá 175 Ile Thr Leu Asp 185
A G
TGG GCC GTG AGG GGG CTA CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG 669
Trp Alá Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu
190 195 199
TGA CCCGAGGCCC AGAGCCACCA CCGTCCTTCC 702
End
AAAGCCACAT CTTATTTATT TATTTATTTC GGTACTGGGG 742
GCGAAACAGC CAGGTGATCC CCCTGCCTTT AGCTCCCCCT 782
AGTTAGAGAC AGTCCTTCCG TGAGGCTGGG GGGCATCTGT 822
GCCTTATTTA TACTTATTTA TTTCAGGAGC GGGGGTGGGC 862
HU 215 233 Β
1. táblázat (folytatás)
TCCTGGGTCC CCGAGGAGGA GGGAGCTGGG GTCCCGGATT 902
CTTGTGTCCA CAGACTTCTG CCCTGGCTCC TCCCCCTCGA 942
GGCCTGGGCA GGAATACATA CTATTTATTT AAGCAATTAC 982
TTTTCATGTT GGGGTGGGGA GGGAGGGGAA AGGGAAGCCT 1022
GGGTTTTTGT ACAAAAATGT GAGAAACCTT TGTGAGACGG 1062
AGAACAAGGA ATTAAATGTG TCATACATAA AAAAAAAA 1100
Az IL—11 cDNS nukleotid-szekvenciáját a Genbankban tárolt nukleotid-szekvenciákhoz hasonlítottuk. A nukleotid-szekvenciákban nem találtunk lé- 20 nyeges hasonlóságot más fehérjék publikált DNS szekvenciájával. Csak gyenge homológia volt megfigyelhető az IL-11 leader szekvenciája, valamint a gamma-interferon és az IL-6 leader szekvenciája között. Lényeges homológia nem volt található az IL-11 szekvencia és más, publikált polipeptid szekvencia között.
Emellett, amint azt a 11. példában részletesen ismertetjük, az IL-11 egy szinergisztikus faktora a primitív elősejtek IL-3 dependens szaporodásának. A szinergizmus eredményeképpen az őssejtek Go periódusa megrövidül. Az IL—11 legalább egy tenyészetben, az IL-6hoz hasonlóan, szinergizálja az IL-3-t a megakariocita telepképződés támogatásában [S. R. Paul és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciencey, USA, 87, 7512-7516 (1990)]. Úgy tűnik tehát, hogy az IL-11, valamint a G-CSF és az IL-6 kölcsönhatásba lép a korai és késői hematopoietikus vonalakkal. Az IL-6-tal ellentétben azonban, amely szintén egy szinergisztikus faktor, az IL-11 az egyesített csírasejtek szekunder tenyészetben való makrofág szaporodásának serkentését preferálja. Tehát az IL-11 másnak tűnik, mint az ismert limfokinek, faktorok és fehérjék. Az IL-11 a limfoid vonalakban is szerepet játszik, ennek eredménye a védelmi rendszer több ágának serkentése. Tehát az IL-11-től elvárható, hogy hasznos az őssejtek manipulálásában, mind kísérleti, mind klinikai szempontból.
Az ezzel a szekvenciával kódolt emlős IL-11 biológiai aktivitását a megfelelő expressziós kontroll szekvenciák szabályozása alá helyzeti klónozott szekvenciával transzfektált emlős sejtek által termelt funkcionális fehérjékben mutattuk ki. A pPU34-TRA (pClR6)-ban klónozott főemlős szekvenciát (lásd I. táblázat) az American Type Culture Collection-nál (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) helyeztük letétbe 1989. november 14-én, ATCC 68172 letéti szám alatt. Az I. táblázatban (a főemlős szekvenciától való eltérést mind nukleotid, mind aminosav szinten jelezve) bemutatott klónozott humán szekvenciát az American Type Culture Collection-nál (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland) helyeztük letétbe 1990. március 30-án, ATCC 68 284 letéti szám alatt.
Az IL-11 polipeptid aktív a TI 165 vizsgálatban, amint azt az alábbiakban ismertetjük. A kezdeti vizsgálatokban az IL-11-ről azt állapították meg, hogy lényegesen megnöveli az immunoglobulint szekretáló B sejtek képződését egy standard rágcsáló lépsejt tarfolt25 képződési vizsgálatban, még 1:500-as végső hígításban is. Ez a rendszer a B sejtek kifejlődését méri olyan tenyészetben, amely egy specifikus immunogénre, a 4hidroxi-3-nitrofenil-acetillel módosított ló-vörösvérsejtre (NP-HRBC) reagál, a lép normál sejtes összete30 vői között. A lépsejt-tenyészetek T sejtjeinek Thy 1 kiegészítő által közvetített kiürülése a válasz teljes megszűnését eredményezte, jelezve, hogy az NP-re reagáló B-sejtek számának növekedése, még az emlős IL-11 jelenlétében is, legalább részben a T-sejtek jelenlététől 35 függ. Az IL-11 aktivitása tehát nem rendelhető hozzá egy közvetlen B-sejt mitogén hatáshoz, mivel a B-sejt mitogének, például a lipopoliszacharidok serkentik az NP-specifikus tarfoltképző sejtek képződését a T-sejtek távollétében. Tehát az IL-11 képes szabályozni a T és B 40 limfociták szaporodását, differenciálódását és aktiválódását.
Az IL-11 különböző hematopoietikus sejtrendszerekben való hatásának elemzése meglepő hatásokra derített fényt a megakariocita fejlődésben. Rágcsáló csont45 velő sejtekkel mint célsejtekkel az IL-11-nek egyedül kis hatása van, de háromszorosan serkenti az IL-3-mal támogatott megakariocita telepképződést. A CFU-Meg képződés IL-3-mal és IL-11-gyel háromszorosan meghaladta az aplasztikus kutya szérummal elért szintet, 50 amelyet pozitív kontrollként használtunk.
Az alábbiakban ismertetett módon előállított IL-11 polipeptidek olyan faktorokat is tartalmaznak, amelyeket az I. táblázatban az IL-ll-et kódoló szekvenciához hasonló szekvenciák kódolnak, de amelyek55 be a módosítások természetesen kerülnek bele vagy szándékosan visszük bele. A találmány tehát kiterjed ezen új DNS-szekvenciák előállítására is, amelyek mentesek más főemlős fehérjéket kódoló DNS-szekvenciáktól, és az IL-11 polipeptidek expresszióját kó60 dolják. Ezek közé a DNS-szekvenciák közé tartoznak
HU 215 233 Β az olyan szekvenciák, amelyek ugyanazok, illetve lényegében ugyanazok, mint az előzőekben definiált DNS-szekvencia és annak fragmensei, valamint az olyan szekvenciák, amelyek szigorú hibridizálási körülmények között [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 387-389. old., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)] hibridizálnak az I. táblázatban található szekvenciához. Az ilyen szigorú körülmények között végzett hibridizálási körülmény például: 4XSSC 65 °C-on, majd mosás O,lXSSSC-ben 65 °C-on egy óra hosszat. Egy másik szigorú hibridizálási körülmény: 50% formamid, 4XSSC, 42 °C.
Azok a DNS szekvenciák, amelyek enyhébb körülmények között hibridizálnak az IL—11 szekvenciákhoz vagy annak aktív fragmenseihez, és amelyek IL— 11 biológiai aktivitással rendelkező IL-11 polipeptideket kódolnak, szintén új IL-11 polipeptideket kódolnak. Ilyen enyhébb körülmények például: 4XSSC, 50 °C, illetve hibridizálás 30—40% formamidban 42 °C-on. Például, ha egy DNS szekvencia az IL-11 szekvenciákkal lényeges homológiát mutató régiókat tartalmaz, és egy olyan polipeptidet kódol, amely az IL-11 egy vagy több biológiai aktivitásával rendelkezik, világos, hogy egy IL-11 polipeptidet kódol, még akkor is, ha a DNS szekvencia szigorú körülmények között nem hibridizál az I. táblázat szerinti IL—11 szekvenciához, illetve annak IL-11 aktivitással rendelkező peptideket kódoló fragmenseihez.
Hasonlóképpen, az olyan DNS szekvenciák előállítása, amelyek IL-11 polipeptideket kódolnak, de amelyeknek a kodonhasznosítása eltérő a genetikai kód degenerációja következtében, szintén a találmány oltalmi körébe tartozik. Az IL—11 fehérje, illetve annak az IL-11 biológiai aktivitásával rendelkező peptidfragmensei szekvenciáját kódoló DNS-szekvenciákban előforduló allélikus variációk (a természetben előforduló báziscserék a faj-populációban, amely eredményezhet vagy nem eredményezhet amínosav cserét), valamint ezeknek az analógjai, illetve származékai szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak. Az IL—11 DNSszekvenciájában keletkező egyéb variációk, amelyeket pontmutációk vagy indukált módosítások hoznak létre, hogy az IL-11 fehéije bizonyos jellemzőit, úgymint az általuk kódolt termék biológiai aktivitását, felezési idejét megjavítsák, szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.
Az IL-11 polipeptidek cDNS-szekvenciák felhasználásával, rekombináns technikával történő előállítás mellett előállíthatok ismert, szokásos kémiai szintézissel is. A találmány szerinti polipeptidek szintetikus előállítását szolgáló módszerek ismertek a szakterületen jártas szakember számára. A szintetikusan előállított IL—11 polipeptid szekvenciák vagy azok fragmensei, amelyek megkettőznek vagy részlegesen megkettőznek az I. táblázatban levő aminosavcsoportokat, szintén a találmány tárgyát képezik. A szintetikusan előállított IL-11 polipeptid-szekvenciák, mivel a természetes IL-11 polipeptidek primer, szekunder vagy tercier szerkezeti és konformációs jellemzőit hordozzák, ezért az
IL—11 polipeptid biológiai tulajdonságaival is rendelkezhetnek. Azaz használhatók a természetes, tisztított
IL-11 polipeptidek biológiailag aktív vagy immunológiai helyettesítőiként a terápiás és immunológiai folyamatokban.
Az IL—11 fehérjében, peptidben vagy DNS-szekvenciában vagy annak aktív fragmenseiben a szakterületen jártas szakember számára ismert technikákkal végezhetünk módosításokat. Az IL—11 szekvenciában végzett, számunkra érdekes módosítások lehetnek egy vagy több amínosav helyettesítése, inszerciója vagy deléciója a kódoló szekvenciákban. Az ilyen helyettesítéshez, inszercióhoz vagy delécióhoz használt mutagén kezelések jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára (lásd például a 4 518 584 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).
Az IL-11 polipeptid szekvenciájának egyéb specifikus mutációi közé tartozhat például egy vagy több glikozilezési hely beépítése. Egy aszparaginhoz kapcsolt glikozilezési felismerési hely a szekvenciába delécióval, szubsztitúcióval vagy amínosav addícióval vihető be, a DNS szekvencia módosításával. Az ilyen változtatások a molekula bármely olyan részén, amelyet O-kapcsolt szénhidrát vagy egyéb csoportok módosítanak, illetve a molekula egyéb részein végrehajthatók. Az ilyen megváltoztatott nukleotid- vagy peptid-szekvencia variánsok expressziója olyan variánsokat eredményez, amelyek ezeken a helyeken glikozilezve lehetnek, és amelyek megváltoztatott vagy javított farmakológiai, illetve biológiai tulajdonságokkal rendelkeznek.
Az IL-11 szekvencia további analógjai és származékai, amelyek várhatóan az IL-11 aktivitását részben vagy teljesen megtartják, szintén könnyen előállíthatok a szakterületen jártas szakember számára szokásos módon, az alábbi leírás alapján. Egy ilyen módosítás lehet polietilén-glíkol (PEG) kapcsolása az IL-11 szekvencián található lizin-csoportokhoz vagy szokásos technikákkal egy vagy több lizin vagy egyéb olyan aminosavcsoport beépítése a szekvenciába, amelyek képesek a PEG-gel vagy egyéb PEG-származékokkal reagálni, ezzel lehetővé téve a PEG egységek kapcsolódását. Az ilyen módosítások szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak.
A találmány tárgya továbbá eljárás IL—11 polipeptidek, illetve ezek aktív fragmentjeinek előállítása. A találmány szerinti egyik ilyen eljárás szerint az IL-11et kódoló cDNS-t egy expressziós vektorba építjük be, ezzel az IL-11-hez előállítunk egy expressziós rendszert. Egy kiválasztott gazdasejtet transzformálunk a vektorral, majd tenyésztjük. Tehát a találmány szerinti eljárás abban áll, hogy egy alkalmas sejtet vagy sejtvonalat tenyésztünk, amelyet egy IL-11 polipeptidet vagy annak fragmensét kódoló DNS szekvenciával transzformálunk, ahol a DNS fragmens egy ismert szabályozó szekvencia szabályozása alatt áll. A kifejezett faktort kinyeijük, izoláljuk és tisztítjuk a tenyészfolyadékból (vagy a sejtből, ha intracellulárisan fejezzük ki) a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel.
A találmány szerinti eljárásban használható sejtek vagy sejtvonalak lehetnek emlős sejtek, például kínai
HU 215 233 Β hörcsög petefészek sejtek (CHO) vagy 3T3 sejtek. Az alkalmas emlős gazdasejtek kiválasztása és a transzformálási, tenyésztési, amplifikálási, átvizsgáló és a termék-előállítási, valamint tisztítási módszerek jól ismertek a szakterületen [Gething and Sambrook, Natúré, 293, 620-625 (1981); Kaufman és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 5 (7), 1750-1759 (1985); vagy a 4 419 446 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, szerzői Howley és munkatársai]. Más, alkalmas emlős sejtvonal lehet a majom COS-1 sejtvonal és a CV-1 sejtvonal. További emlős sejtek lehetnek főleg főemlős sejtvonalak és rágcsáló sejtvonalak, beleértve a transzformált sejtvonalakat is. A normál diploid sejtek, a primer szövetek in vitro tenyésztéséből származó sejttörzsek, valamint a primer explantátumok is alkalmasak. Az alkalmazandó sejtek genotípusosan sérültek lehetnek a szelekciós génben, vagy tartalmazhatnak egy dominánsan ható szelekciós gént. Más alkalmas emlős sejt lehet, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a HeLa, egér Liter-929 sejtek, a Swiss, Balb-c vagy NIH egerekből származó 3T3 vonalak, a BHK vagy HaK hörcsög sejtvonalak.
Gazdasejtként hasonlóképpen alkalmasak a baktériumsejtek. Például az Escherichia coli különböző törzsei (például a HB101 és MCI061) jól ismert gazdasejtek a biotechnológia terén. A Bacillus subtilis, Pseudomonas különböző törzsei, más bacillusok és hasonló törzsek is használhatók a találmány szerinti eljárásban.
Számos ismert élesztő törzs is alkalmazható gazdasejt a találmány szerinti polipeptid expressziójához. Emellett, ha szükséges, akkor a találmány szerinti eljárásban rovarsejtek is használhatók [Miller és munkatársai, Genetic Engineering, 8, 277-298 Plenum Press (1986), valamint a további idézetek].
A találmány tárgya továbbá rekombináns DNS molekulák vagy vektorok, az új IL—11 polipeptidek expressziójára használt eljárásban való alkalmazásra. Ezek a vektorok tartalmazzák az új izolált DNS szekvenciákat, amelyek a találmány szerinti IL-11 polipeptideket kódolják. Egy másik módszer szerint a fentiekben ismertetett módosított szekvenciákat tartalmazó vektorok előállítása is a jelen találmány oltalmi körébe tartozik és az IL—11 polipeptidek expressziójára használhatók. A módszer során alkalmazott vektor szintén tartalmaz meghatározott szabályozó szekvenciákat a találmány szerinti DNS kódoló szekvenciával operatív kapcsolatban, amelyek képesek irányítani annak replikációját és szelekcióját egy kiválasztott gazdasejtben.
Az alábbi példákban alkalmazott vektor, a pXM [Y. C. Yang és munkatársai, Cell, 47, 3-10 (1986)]. Az alábbiakban ismertetett emlőssejt expressziós vektorokat a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvalóan jól ismert módszerekkel szintetizálhatjuk. A vektorok komponensei, például a replikonok, szelekciós gének, enhanszerek, promoterek és hasonlók természetes forrásokból állíthatók elő, illetve ismert módszerekkel szintetizálhatok [Kaufman és munkatársai, Journal of Molecular Biology, 159, 511-521 (1982); Kaufman, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 689-693 (1985)]. Egy másik módszer szerint a vektor DNS tartalmazhatja a papillóma vírus genomját vagy annak egy részét [Lusky és munkatársai, Cell, 36, 391N01 (1984)], és stabil episzomális elem formájában egy sejtvonalban, például a C127 egérsejtekben tartható fenn. Ezeknek a vektoroknak a megfelelő gazdasejtekbe történő transzformálása eredményezheti az IL-11 polipeptidek expresszióját.
Más alkalmas expressziós vektorok, amelyeknek számos típusa ismert a szakirodalomban emlős, rovar, élesztő, fonalasgomba és baktérium sejtben való expresszióhoz, szintén használható erre a célra.
A sejt-forrásokból homogenitásig tisztított vagy rekombináns, illetve szintetikus úton előállított IL-11-t gyógyászati készítményekben immunhiányos megbetegedések vagy immunológiai rendellenességek kezelésére használhatjuk. Az IL-11 használható még a hematopoietikus őssejtek hiányosságainak kezelésére, illetve az ezekhez kapcsolódó rendellenességek kezelésére. Az IL-11 készítmények alkalmazhatók rák és más, betegségből, besugárzás vagy gyógyszer hatásából származó patológiás állapotok kezelésére, ideértve például a leukopéniát, baktérium- vagy vírusfertőzést, anémiát, Bsejt vagy T-sejt hiányosságokat, beleértve a csontvelő transzplantáció utáni immunsejt vagy hematopoietikus sejt hiányosságokat. Az IL-11-t használhatjuk az immunválasz potencírozására számos vakcina esetében, ezzel hosszabb ideig tartó és hatásosabb immunitást hozva létre. Amint azt az előzőekben említettük, az IL-11 készítmények használhatók B-sejtek és megakariociták fejlődésének serkentésére. Az ilyen betegségi állapotok ezekkel az IL—11 polipeptid készítményekkel történő kezelése lehetővé teszi, hogy a nemkívánt mellékhatások, amelyeket a jelenleg használatban levő gyógyszerek okoznak, elkerülhetők legyenek.
A találmány szerinti eljárással előállított polipeptidek használhatók még - önmagukban vagy más citokinekkel, hematopoietínekkel, interleukinokkal, növekedési faktorokkal vagy antitestekkel kombinálva - az előbb említett állapotok kezelésére.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan gyógyászati készítmények előállítására, amelyek az előbb említett állapotok kezelésére. Az ilyen készítmények egy, a találmány szerinti IL-11 polipeptidből egy gyógyászatilag hatásos mennyiséget tartalmaznak gyógyászatilag elfogadható hordozóval elkeverve. Ez a készítmény adagolható szisztémásán parenterálisan. Egy másik módszer szerint a készítmény intravénásán adagolható. Kívánt esetben a készítmény adagolható szubkután vagy topikális úton is, például a seb területére. Ha szisztémásán adagoljuk, akkor a találmány szerinti gyógyászati készítmény egy pirogénmentes parenterálisan elfogadható vizes oldat formájában található. Egy ilyen parenterálisan elfogadható fehéije oldat elkészítése, figyelembe véve a pH-t, az izotonicitást, stabilitást és hasonlókat, a szakterületen jártas szakember számára kézenfekvő.
Az előzőekben említett állapotok kezelésére alkalmazott dózistartományokat a kezelőorvos határozza meg, figyelembe véve számos faktort, amelyek módosítják a gyógyszer hatását, például a beteg állapotát,
HU 215 233 Β testtömegét, nemét, étrendjét, az esetleges fertőzés súlyosságát, az adagolás idejét és egyéb klinikai faktorokat. A napi dózis általában 1-1000 pg polipeptid vagy 50-5000 egység testtömeg-kilogrammonként (ahol egy egység az a polipeptid-koncentráció, amely a TI 165 vizsgálatban a maximális serkentés felét eredményezi).
A találmány szerinti gyógyászati eljárásokban és készítményekben alkalmazhatunk más humán faktorokat is. E célra használható citokinek vagy hematopoietinek például az ismert IL1-IL9 faktorok, a GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIF, Meg-CSF, az interferonok, a TNF és az eritropoietin. Az IL-11-terápiában való alkalmazáshoz különösen alkalmas az IL-3 és az IL-6. A növekedési faktorok, mint például a B-sejt növekedési faktor, a B-sejt differenciálódási faktor vagy az eozinofil differenciálódási faktorok is hasznosnak bizonyulhatnak az IL-11-gyel együtt való adagolásban. Az előzőekben említett dózist a gyógyászati készítményben levő egyéb komponensek hatásának kompenzálása érdekében korrigálni kell. A kezelt beteg állapotát szokásos módszerekkel követhetjük.
Az új polipeptidek alkalmazhatók továbbá antitestek standard módszerekkel in vivő vagy in vitro előállítására, amelyeket diagnosztikus vagy terápiás célra alkalmazhatunk. Az ilyen antitestek lehetnek monoklonális és poliklonális antitestek, valamint kiméra antitestek vagy „rekombináns” antitestek, ismert módszerekkel előállítva. A találmány tárgykörébe tartoznak továbbá azok a sejtvonalak, amelyeket úgy állítunk elő, hogy az IL-11-t vagy annak egy fragmensét antigénként bemutatjuk egy kiválasztott emlősnek, majd az állat sejtjeit bizonyos ráksejtekkel íúzionáltatjuk, így állítunk elő „örökéletűvé” tett sejteket ismert módszerekkel. Az ilyen, a találmány szerinti emlős IL—11 polipeptid vagy fragmense elleni antitestek, valamint sejtvonalak előállítására szolgáló módszerek szintén a találmány tárgykörébe tartoznak.
A találmány szerinti eljárással előállított antitesteket in vivő és in vitro diagnosztikai célokra használhatjuk, például az antitesteket detektálható jelöléssel vagy jelölési rendszerekkel kapcsolva. Egy másik módszer szerint ezek az antitestek alkalmazhatók in vivő és in vitro terápiás célokra, azaz például bizonyos toxikus vagy gyógyhatású vegyülettel vagy egységgel kombinálva, amelyek ismertek a szakterületen jártas szakemberek számára.
Az alábbi példákkal közelebbről illusztráljuk az alkalmazott klónozási, expressziós eljárásokat és az emlős IL-11 előállítását, valamint a találmány szerinti más módszereket és termékeket. Ezek a példák csak a találmány illusztrálását szolgálják, nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.
1. példa mRNS izolálása és a cDNS könyvtár készítése
Egy főemlős sejtvonalat a pU34-et fejlesztettük ki, és úgy találtuk, hogy lényeges aktivitást fejt ki a 7. példa szerinti TI 165 vizsgálatban, az IL-6 elleni neutralizáló antitest jelenlétében. A PU-34 támasztószöveti sejtvonal egy hosszú ideig tenyésztett főemlős velőtenyészetből származik, amelyet egy defektív amfotróp transzformáló retrovirális vektorral örökéletűvé tettük. Az U19 retrovírus plazmidot a korábban leírt módon állítottuk elő [P. S. Jat és munkatársai, J. of Virol., 59, 746-750 (1986)], ez tartalmazza az SV40 nagy T antigén szekvenciáját és a G418-rezisztenciát kódoló neofoszfotranszferáz szekvenciát, amely a Moloney rágcsáló leukémia vírus hosszú terminális ismétlődő szakaszáról fejeződik ki. Egy amfotróp termelő kiónt állítottunk elő úgy, hogy a pszi-AM pakoló sejtvonallal fertőztük [R. Cone és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81, 6349-6353 (1984)], majd a pszi-2U 19-5-tői ekotróp víruskinyerést végeztünk [P. S. Jat és munkatársai, J. of Virol., 59, 746-750 (1986)], majd 0,75 mg/ml G418 tartalmú táptalajon szelektáltuk.
Az egyik klón, a pszi-AMU19-BL rekombináns SV40 vírust termelt 5*1O1 * 3 G418-rezisztens CFU/ml titerrel, ha NIH—3T3 sejteken vizsgáltuk. A hosszú ideig tenyésztett velősejteket standard módszerek alkalmazásával hoztuk létre, 10% borjúembrió-szérummal, 10% lószérummal, 100 egység/ml penicillinnel és 100 pg/ml sztreptomicinnel (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kiegészített Iscove-féle módosított Dulbecco-féle táptalajban (IMDM) tartottuk fenn, amely egy komplett, hosszú idejű tenyésztésre alkalmas táptalaj.
Az LTMC tapadó réteget 7 és 10 nappal a készítés után 2 ml pszi-AMU19-BL vírussal fertőztük 8 pg/ml polybrene jelenlétében (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) 2,5 óra hosszat 33 °C-on. A fertőzés utáni harmadik napon a tenyészeteket 0,5 mg/ml G418ban szelektáltuk. Tizennégy nappal a fertőzés után G418 rezisztens telepeket izoláltunk, és sok mélyedéses lemezen (Corning Glassware, Corning, NY) elszaporítottunk.
Az egyik, PU-34 jelű sejtvonal kondicionált táptalaját alaposan megvizsgáltuk arra nézve, hogy támogatja-e az őssejteket hosszú ideig tenyésztett kultúrákban. Ez a sejtvonal képes volt a multipotens humán és főemlős őssejteket több mint három hétig tenyészetben fenntartani. Az ismert növekedési faktor aktivitások mellett, beleértve az IL-6-ot, az IL-7-et, a GM-CSF-et, az M-GSF-et és a LIF/HILDA-t, az IL-1 α-val serkentett PU34 kondicionált táptalaj képesnek bizonyult a TI 165 rágcsáló plazmacitóma sejtvonal szaporodásának serkentésére, amely normális körülmények között reagál az IL-6-ra (R. P. Nordan és munkatársai, id. h.), még a humán IL-6 elleni neutralizáló antiszérum jelenlétében is. Ezt a biológiai vizsgálatot alkalmaztuk egy, a PU-34-ből generált cDNS könyvtár expressziós klónozása során. A biológiai vizsgálatot részletesen az alábbi, 7. példában ismertetjük.
A PU-34 sejtekből származó cDNS könyvtárat a következő módon állítottuk elő: PU-34 sejteket 24 óra hosszat 2 egység/ml koncentrációban ILl-a-val stimuláltunk, majd ismert módszerekkel poliadenilezett RNS-t (poliA+ RNS) állítottunk elő belőlük. Az összes RNS-t Chirgwin és munkatársai módszerével extrahál10
HU 215 233 Β tűk [Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)] a stimulált PU34 sejtekből. mRNS-t állítottunk elő oligo(dT)-cellulóz kromatográfíával [H. Aviv és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 69, 1408-1412 (1972)].
Az mRNS-ből öt pg-ot használtunk kétszáíú cDNS előállítására [G. G. Wong és munkatársai, Science, 228, 810-815 (1985)], a második szál reakcióban DNSpolimeráz I-et és RN-áz H-t használva [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)]. A pXM COS-1 sejt expressziós vektort [Y. C. Yang és munkatársai, Cell, 47, 3-10 (1986)] az egyetlen Xhol restrikciós enzim hasítási helyen linearizáltuk, majd ekvimoláris mennyiségben szemi-XhoI adaptált cDNS-sel ligáltuk. A ligáló reakcióelegyet használjuk kompetens Escherichia coli (HB101 törzs) transzformálására [Y. C. Yang és munkatársai, Cell, 47, 3-10 (1986)], és így körülbelül 500000 ampicillin rezisztens telepből álló könyvtárat állítottunk elő.
2. példa
DNS előállítás a COS-1 sejtek transzjektálása
A korábban Wong és munkatársai által leírt expressziós rendszert [G. G. Wong és munkatársai, Science, 228, 810-815 (1985)] használtuk az IL—11 aktivitást kódoló cDNS izolálására, az alábbi módon.
Baktérium telepeket nitrocellulóz szűrőlapokra replikáztunk. Az egyes szűrőlapokon levő telepeket L-táptalajba kapartuk, majd plazmid DNS-t izoláltunk belőlük [J. A. Meyers és munkatársai, Journal of Bacteriology, 127, 1529-1536 (1976)]. Az egyes primer DNS mintákat 200-500 összegyűjtött telepből állítottuk elő.
Az egyes plazmid DNS-ekből öt gg-ot használtunk COS-1 sejtek transzfektálására dietil-amino-dextrános (DEAE) módszer szerint, 0,1 mmol/1 klorokin adagolásával [L. M. Sompayrac és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78, 7575-7578 (1981); Luthman és munkatársai, Nucleic Acids Research, 11, 1295-1308 (1983); Y. C. Yang és munkatársai, Cell, 47, 3-10 (1986)]. A transzfektált COS-1 sejtekből származó tenyészet felülúszóját a transzfekció után 72 órával összegyűjtöttük, és megvizsgáltuk a TI 165 stimuláló hatását (lásd 7. példa).
Az átvizsgált 317 telepgyűjteményből kettő volt pozitív. Ezek az IL-6 kimutatható szintjét tartalmazták (ezt az anti-IL-6 antitesttel való semlegesítéssel lehetett meghatározni), továbbá maradék aktivitással rendelkeztek a TI 165 vizsgálatban az anti-IL-6-antitest jelenlétében. Az ezekből a gyűjteményekből származó plazmid DNS-t COS-1 sejtekbe re-transzfektáltuk, és a transzfektált felülúszókat újból átvizsgáltuk, hogy rendelkeznek-e aktivitással a TI 165 vizsgálatban. Egy ilyen aktivitással rendelkező gyűjteményt szelektáltunk, és kevesebb számú kiónt tartalmazó csoportokra osztottuk. Ebből a csoportból kiválasztottunk egy olyan gyűjteményt, amely magasabb aktivitással rendelkezett a vizsgálatban, mint a gyűjtemények összessége. Ebből a gyűjteményből egyes telepeket izoláltunk. DNS-üket kinyertük, transzfektáltuk, és a transzfektált sejtek felülúszójának vizsgáltuk az aktivitását a TI 165 vizsgálatban. Két pozitív kiónt azonosítottunk, az egyik expresszált IL-6 aktivitást, a másik által expresszált aktivitás nem volt neutralizálható az anti-IL-6 antitestekkel. Ez utóbbi gyűjteményt újra felosztottuk, és a transzfekciós eljárást addig ismételtük, amíg egyetlen pozitív plazmidot (jele pCIRő vagy pPU34-TRA) kaptunk, amely az új TI 165 proliferációs aktivitással rendelkezett. Ezt a kiónt újra vizsgáltuk a 7. példa szerinti módon.
A pClR6-tal transzfektált COS-1 sejtekről származó kondicionált táptalaj aktivitását más citokinekkel is összehasonlítottuk, például a rágcsáló és humán IL-6-tal és a rágcsáló GM-CSF-fel. A kondicionált táptalaj mérhető mennyiségű 3H-timidin beépülését serkentette a TI 165 sejtekbe, még 1:1000 hígításban is. Optimális koncentrációkban az új citokin olyan beépülést támogatott, amely több mint 100-szorosa volt a háttérszintnek.
Ezen cDNS inszertjének a szekvenciáját a didezoxiláncterminációs módszerrel határoztuk meg természetes konfigurációjú (super-coiled) templáton, szintetikus oligonukleotid indító molekulák alkalmazásával [Sanger és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 5463-5467 (1977)]. A pClR6 cDNS-nek az I. táblázatban látható nukleotidszekvenciája egyetlen hosszú nyílt leolvasási keretet tartalmazott, ennek hossza 597 nukleotid, és egy ebből kikövetkeztethető 199 aminosavból álló polipeptidet kódol. Közvetlenül a feltételezett iniciációs kodon mellett található egy 17-20 hidrofób aminosavból álló szakasz, amely egy szokásos fehérje szekréciós leaderszekvenciára hasonlít.
Jóllehet az indító cDNS klón, a pClR6 nem bizonyult teljesnek, a további cDNS-ek vizsgálata felfedte, hogy ez a transzkriptum körülbelül 420 bázispár hosszúságban a 3 ’ nem-kódoló szekvenciában több példányban tartalmazza az RNS instabilitási szekvenciát az ATTTA-t, amelyről feltételezik, hogy fontos szabályozó eleme a citokin gének expressziójának [G. Shaw és munkatársai, Cell, 46, 659-667 (1986)].
3. példa
Fehérje elemzése
A pPU34-TRA cDNS által kódolt polipeptidet impulzus-jelölési módszerrel azonosítottuk. Negyvennyolc órával a klorokinnel történő indukció után az IL—11 kiónok rekombináns DNS-ével transzfektált COS-1 sejtekből származó tenyészet felülúszókat eltávolítottuk, és a sejteket 0,5 mCl [35S]-metioninnal impulzus-jelöltük 1,0 ml DMEM-ben négy óra hosszat 37 °Con. A radioaktívan jelzett felülúszóból 10 μΐ térfogatú mintákat vettünk, majd 15%-os SDS-poliakrilamid gélelektroforézisnek vetettük alá Laemmli puffer-rendszerben egy 12%-os gélen [U. K. Laemmli, Natúré, 227, 680-685 (1970)]. Az elektroforézis után a gélt egy fluorográfiás erősítő oldatba merítettük (Enhance; New England Nuclear, Boston, MA), megszárítottuk, majd röntgen filmre exponáltuk.
A [35S]-metioninnal impulzus-jelzett pClR6-tal transzfektált COS-1 sejtekből származó kondicionált
HU 215 233 Β táptalaj SDS-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) elemzése kimutatta egy jellegzetes 20 kD méretű fehérje jelenlétét nagy mennyiségben, amely nem volt jelen a mock-transzfektált kontrollokban, és molekulatömege megegyezett azzal, amit egy körülbelül 180 aminosavat tartalmazó fehérjéről feltételezhetünk.
Ez a méretbecslés, és az expresszált fehérje heterogenitásának hiánya összhangban van a konszenzus szekvencia (Asn-X-Thr/Ser) hiányával [R. J. Winzler in „Hormonal Proteins and Peptides”, ed. Li, C. H. (Academic Press, New York), 1. (1973)]. A konszenzus szekvencia az aszparaginhoz kötött szénhidrát hozzáadásához kell. Az érett fehérje kikövetkeztetett aminosav-szekvenciája nem tartalmaz cisztein csoportokat, ez egy olyan tulajdonság, amit eddig még nem találtak citokin génekben.
4. példa
IL-11-t expresszáló humán sejtvonalak
Két olyan humán sejtvonalat azonosítottak, amelyek legalább egyféle IL—11-nek a forrásai. Nevezetesen az MRC-5 humán tüdő fibroblaszt sejtvonalat, amely az American Type Culture Collection-nél van letétbe helyezve ATCC CCL 171 letéti szám alatt. Ezt egy egység/ml rekombináns humán IL-l-alfával (Genetics Institute, Inc.) és 10-7 mol/1 forbol-12-13-butiráttal (Sigma) indukálva, vizsgáltuk a TI 165 tesztben. Az indukált kondicionált táptalaj nagyobb percenkénti beütésszámot adott a vizsgálatban, mint az IL-6 telítési szinten, azaz hasonlót ahhoz az aktivitáshoz, amelyet a PU34 indukált kondicionált táptalaja mutatott. Megjegyezzük, hogy az IL—11 jelenléte felerősített egy gyenge IL-6 jelet. Emellett, amint azt az alábbiakban ismertetjük, ennek a sejtvonalnak a Northern biot vizsgálata igazolta az IL—11 mRNS jelenlétét.
Emellett, a TPA30-1 humán trofoblasztos sejtvonal, amely az ATCC-nél van letétbe helyezve CRL 1538 letéti szám alatt, szintén mutatta az indukálatlan IL-11 mRNS jelenlétét a Northern biot vizsgálatban.
Az IL—11 egyéb humán forrásai is elérhetők, és könnyen azonosíthatók a jelen találmány kitanításai alapján.
5. példa
RNS elemzése
A. PU34
Bakteriális IL-1-alfával indukált PU34 sejtekből származó össz-celluláris RNS öt mikrogramját elektroforetizáltuk 2,2 mol/1 formaldehidet tartalmazó 1,2%-os agaróz gélen [H. Lehrach és munkatársai, Biochemistry, 16, 4743 (1977)]. A formaldehiddel denaturált RNS-t nylon szűrőlapra vittük át (Zetabind; Cuno, Meriden, CT), a leírások szerint [Ε. M. Southern, Journal of Molecular Biology, 98, 503-517 (1975)], és 32P-vel jelzett cDNS próbákat használtunk hozzá.
Egy cDNS próbát úgy állítottunk elő, hogy a cDNS inszerteket Xhol restrikciós enzimmel kihasítottuk a vektorból, és az inszerteket 32P-dCTP-vel jeleztük, indító molekulaként random oligonukleotidokat használva a DNS polimeráz I nagy fragmensének jelenlétében [A. P. Feinberg és munkatársai, Analytical Biochemistry, 132, 6-13 (1983)]. A nylon szűrőt 4 óra hosszat 65 °C-on előhibridizáltuk, majd 16 órán át 65 °C-on 32P-dCTP-vel jelzett cDNS próbával hibridizáltuk hibridizáló oldatban, amelynek az összetétele: 4><SSC, 0,5% SDS 5x Denhardt-féle oldat és 100 pg/ml denaturált heringsperma-DNS. Más próbák lehetnek a humán (rh) IL-1 a, rhIL-2, rhIL-3, rhIL-4, rhIL-5, rhIL-6, rhIL-7, rhIL-9, rhGM-CSF, rhM-CSF, LIF/HILDA és a főemlős IL-11.
A hibridizálás után a szűrőlapot kétszer mostuk 2xSSC/0,l% SDS összetételű oldatban 30 percig, 65 °C-on, majd 0,2xSSC/0,l% SDS összetételű oldatban 30 percig 65 °C-on. A szűrőlapot azután megszárítottuk, és röntgen filmre helyeztük kalciumwolframát erősítő fólia jelenlétében, és -70 °C-on exponáltuk.
Ez a Northern biot elemzés kiderítette, hogy a PU34 mRNS kétfajta IL—11 mRNS-t tartalmaz, ezek mérete körülbelül 2,5 kb, illetve körülbelül 1,5 kb, és mindegyik hibridizál a pCIR6 próbával. Az I. táblázatban található cDNS-szekvencia mérete a kisebb mRNSnek felel meg. Ez a különbség az eltérő illesztésből adódik, és további 3’ nem-kódoló szekvenciát hoz létre a nagyobb mRNS-ben, amint azt további cDNS kiónok izolálásával és elemzésével igazoltuk. A két mRNS jelenléte a PU34 sejtekben IL-Ία által szabályozottnak tűnik, mivel egyik mRNS sem volt evidens az IL-la indukció nélkül.
Egyik mRNS-t sem lehetett kimutatni RNS folt elemzéssel humán C10-MJ2 T sejtvonalakból származó [Leary és munkatársai, Blood, 69, 953 (1987)], C5-MJ2 sejtvonalból [Arya és munkatársai, Science, 223, 1086 (1984)] és MO sejtvonalakból [Golde és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 593 (1980)] mRNS-ből, valamint lektűrnél stimulált humán perifériális vér limfocitákból vagy humán placentális vér limfocitákból. Ezért úgy tűnik, hogy az IL—11 egyetlen azonosítható forrása a mesenchyma eredetű tapadó sejtek.
B. MRC-5
A humán magzati tüdő fibroblaszt sejtekről (MRC-5) [Jacobs és munkatársai, Natúré, 227, 43 (1970)] úgy találtuk, hogy mindkét mRNS-t expresszálják 50 ng/ml forbol-mirisztát-acetáttal (PMA) és 1 egység/ml IL-la-val való serkentés után.
Amint azt az előzőekben a PU34 RNS-re leírtuk, ebben a sejtvonalban kétfajta mRNS-t lehet azonosítani, amelyeknek a mérete megegyezik az előző 2,5 kb, illetve 1,5 kb mérettel. Az MRC-5 sejtvonalból izolált humán cDNS szekvenciáról megállapítottuk, hogy a főemlős és a humán kódoló régiók 95%-os azonosságot mutatnak nukíeotid szinten.
C. TPA30-1
Amikor ugyanezt az eljárást alkalmaztuk a humán SV40-nel transzformált, TPA30-1 jelű trofoblasztos sejtvonalon, ugyanazt a próbát használva, akkor csak a nagyobb, körülbelül 2,3 kb méretű IL-11 mRNS-t lehetett azonosítani.
HU 215 233 Β
6. példa
DNS-szekvencia elemzése
A pPU34-TRA cDNS klón nukleotid szekvenciáját ismert módon [G. G. Wong és munkatársai, Science, 228, 810-815 (1985); Y. C. Yang és munkatársai, Cell, 47, 3-10 (1986)] határoztuk meg oly módon, hogy átfedő fragmensek rendezett csoportját állítottuk elő Bal31 nukleázos emésztéssel, majd M13 vektorba szubklónoztuk őket [M. Poncz és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 4298-4302 (1982); J. Messing és munkatársai, Gene, 19, 269-276 (1982)]. Egyszálú DNS-t állítottunk elő, majd a nukleotid-szekvenciát a didezoxiláncterminációs módszerrel határoztuk meg [F. Sanger és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 5463-5467 (1977)]. Ezt a nukleotid-szekvenciát mutatjuk be az I. táblázatban.
7. példa
Biológiai aktivitás a vizsgálatokban
A) TI 165 proliferációs vizsgálat
A TI 165 IL-6 dependens rágcsáló plazmacitóma sejteket [R. P. Nordan és munkatársai, Science, 233, 566 (1986)] növesztettünk RPMI táptalajban, amelyet 10% hővel inaktivált borjúembrió szérummal, 2 mmol/1 glutaminnal, 100 egység/ml penicillinnel, 100 pg/ml streptomicinnel (mindegyik Gibco, Grand Island, NY gyártmány), 5xl0~5 mol/1 β-merkapto-etanollal (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) egészítettünk ki, majd 10-20 egység/ml CHO sejtekben előállított rekombináns humán IL-6-ot (Genetics Institute, Inc.) tettünk bele. Kettő-négy nappal az átoltás után a sejteket eltávolítottuk a tenyészetből, mostuk a maradék IL—6 eltávolítására, majd 7,5 xlO4 - 1χ105 sejt/ml koncentrációban szuszpendáltuk.
A vizsgálandó mintából sorozathígításokat (vagy PU34-gyel kondicionált táptalajjal vagy pClR6-tal transzfektált COS-sejttel kondicionált táptalajjal) készítettünk két párhuzamosban 100 μί térfogatú tenyésztáptalajban IL-6 nélkül, 96 mélyedéses mikrotiter lemezeken. A fenti sejtszuszpenzióból 100 μΐ-t adagoltunk az egyes mélyedésekbe, majd a lemezeket 37 °Con 2-3 napig inkubáltuk; 0,5 pCi 3H-timidint (DuPont, Wilmington, DE) adtunk hozzá mélyedésenként a vizsgálat utolsó hat órájára. A sejteket GFC típusú szűrőpapírra (LKB) gyűjtöttük, vízzel és etanollal mostuk, majd szárítottuk. A szűrőlapokat ezután szcintillációs folyadékba merítettük, és egy LKB laposfenekű szcintillációs számlálóban mértük. A proliferációt a 3Htimidin felvételével határoztuk meg.
A PU34 sejtekből származó indukált kondicionált táptalaj nagyobb proliferációt okozott a TI 165 sejteknél, mint a telítési szintű IL-6, ezzel jelezve egy másik faktor jelenlétét. Ha humán IL-6 elleni antitest jelenlétében vizsgáltuk, akkor egy alacsony, de szignifikáns aktivitás megmaradt a kondicionált táptalajban. A nagyon alacsony koncentrációban IL-6-ot tartalmazó, IL-l-gyel indukált PU34-ből keletkezett kondicionált táptalajból származó frakcionált mintákat is vizsgáltuk humán IL-6 ellenes antitest jelenlétében, illetve anélkül, és az eredmények arra utaltak, hogy egy olyan faktor van jelen, amely önmagában is kismértékű proliferatív hatást fejt ki, és képes kismennyiségű IL-6tal szinergizálni.
A PU34 könyvtár transzfekciójából származó COSsejt felülúszók aktivitását is vizsgáltuk, önmagukban vagy egy olyan elegy jelenlétében, amely humán IL-6 elleni antitestet és szuboptimális mennyiségű rágcsáló IL-6-t tartalmazott. Az antitest képes a PU34 sejtek által termelt főemlős IL-6 semlegesítésére, de nem képes a rágcsáló IL-6 semlegesítésére. Tehát egy szinergizáló faktort kellene keresni, a könyvtárban levő PU34 IL-6 jelenlétével való interferencia nélkül.
Az I. táblázat szerinti érett IL-11 fehérjére ebben a vizsgálatban 100 hígítási egység per ml fél-maximális aktivitás j ellemző.
B) B-sejt tarfolt képzési vizsgálat
B-sejt tarfolt képződési vizsgálatot végeztünk az IL-10-et expresszáló COS-sejteken, az R. M. O’Hara és munkatársai által leírt módszer alkalmazásával [R. M. O’Hara és munkatársai, Journal of Immunology, 141, 2935-2942 (1988)]. A rágcsáló tarfolt képződési vizsgálatot úgy hajtottuk végre, hogy érintetlen C57B1/6 egerekből származó 7,5><106 lépsejtet a vizsgált mintákkal, illetve anélkül (COS-sejtek kondicionált táptalaja, amely IL—11-t tartalmazott) 5 napig inkubáltunk 3χ106 4-hidroxi-3-nitrofenil-acetillel módosított ló vörös vérsejttel (NP-HRBC) 0,75 ml, 5% borjúembrió szérummal kiegészített Mishell-Dutton táptalajban [R. I. Mishell és munkatársai, J. Exp. Med., 126, 423—442 (1967)]. NP-vel kapcsolt ló vörös vérsejteket (H-RBC), illetve birka vörös vérsejteket (S-RBC) úgy állítottunk elő, hogy 10 mg NP-O-szukcinimidet (Cambridge Biochemical, Inc., Cambridge, England) dimetil-formamidban oldottunk (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), majd reagáltattuk 1 ml pakolt H-RBC-vel vagy S-RBC-vel (Colorado Serum Co., Denver, CO), amint azt P. B. Hausman és munkatársai ismertették [J. of Immunoi., 134, 1388-1396 (1985)].
A tenyészetekhez naponta 0,1 ml kiegészítő táptalajt adtunk, amely 5% boíjúembrió szérumot tartalmazott, vizsgálati minták nélkül (a kondicionált táptalajok). Az NP-re reagáló B-sejteket a tenyésztési periódus végén azonosítottuk, az NP-vel kapcsolt birka RBC tarfoltvizsgálat alkalmazásával, Dresser és munkatársai leírása szerint [Dresser és munkatársai, „Handbook in Experimental Immunology” (D. M. Weir, Blackwell, Oxford), 271. old. (1973)]. A százalékos választ úgy számítottuk ki, hogy az IL—11-et tartalmazó kondicionált táptalajjal támogatott tenyészetekkel kapott tarfoltok számát összehasonlítottuk azokkal, amelyeket csak táptalajjal támogatott tenyészetekkel kaptunk. Egy tipikus kísérletben az exogén faktorok nélküli háttérválasz 6000 NP-fajlagos tarfoltképző sejtet eredményezett 7,5 x106 szélesztett sejtből.
Egy ilyen vizsgálatnak az eredményei láthatók az 1. ábrán. A kontroli-válasz százalékát az NP-re reagáló Bsejtek számában bekövetkezett növekedés mutatja az NP-HRBC-vel serkentett érintetlen lépsejtek ötnapos tenyészetében, amelyeket a pClR6-tal transzfektált
HU 215 233 Β
COS-1 sejtek kondicionált táptalajával a jelzett hígításban támogattuk, a csak a táptalajokkal támogatott kontroll tenyészetekhez képest. A COS által termelt emlős IL—112,5-3-szoros növekedést okozott a tarfoltképző egységek/tenyészet arányban ebben a vizsgálatban, ami arra utal, hogy az IL-11 vagy közvetlen szerepet játszik a B-sejt serkentésében és differenciálódásában, vagy közvetett szerepe van a T-sejtek arra való serkentésében, hogy más citokineket szekretáljanak, amelyek befolyásolják a B-sejtek válaszát.
C) Rágcsáló fibrinrögvizsgálat A COS sejtek által termelt emlős IL-11-et megvizsgáltuk abból a szempontból is, hogy milyen aktivitást fejt ki a megakariocita telepképzési vizsgálatban, amit lényegében az S. Kuriya és munkatársai által leírt módon végeztünk [S. Kuriya és munkatársai, Exp. Hematol., 75, 896-901 (1987)], azzal a módosítással, hogy 2% borjú szérumot adtunk hozzá. Röviden ismertetve, a rágcsáló telepképző egység megakariocita (CFU-Meg) vizsgálatot úgy hajtottuk végre, hogy 2,5 *105 rágcsáló csontvelő sejtet szélesztettünk hat mélyedéses lemezekre 0,4 ml, 20% borjúembrió szérummal kiegészített IMDM-ben. A rögképződést 0,25 mg fibrinogén és 0,25 egység trombin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) hozzáadásával indítottuk el 37 °Con. A vizsgálati mintákat különböző hígításban adtuk a fibrinröghöz, és ezt követően hat napig 37 °C-on inkubáltuk. A rögöket 2,5% glutáraldehiddel rögzítettük, és 0,5 mg/ml acetil-tiokolin-jodiddal festettük [S. Kuriya és munkatársai, Exp. Hematol., 75, 896-901 (1987); A. Nakeff és munkatársai, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 757, 587-590 (1976)]. A pozitív telepeket (amelyek csak megakariocitákat tartalmaztak) közvetlenül mikroszkóp alatt számoltuk meg. A telepszámokat két párhuzamosban értékeltük ki.
Az eredmények a 2. ábrán láthatók. A telepszám a megakariocita telepek összes számát jelenti (acetilkolin-észteráz pozitív sejtek) az egércsontvelő sejtek hatnapos tenyészeteiben, amelyeket a következőkkel támogattunk:
(1) kutya aplasztikus anémia szérum 1:10 hígítása;
(2) 150 egység/ml rágcsáló IL-3;
(3) nincs serkentés;
(4) csak pClR6-tal transzfektált COS-1 sejtek kondicionált táptalaja 1:10 hígításban (5) csak pClR6-tal transzfektált COS-1 sejtek kondicionált táptalaja 1:50 hígításban;
(6) 150 egység/ml rágcsáló IL-3-mal kiegészített pClR6-tal transzfektált COS-1 sejtek kondicionált táptalaja 1:10 hígításban;
5’ oligonukleotid: 5’ ATGGAl 3’ oligonukleotid: 5’ TCAAGC
Ezeket az oligonukleotidokat alkalmaztuk azután a polimeráz láncreakcióban az MRC-5 vagy TPA30-1 cDNS könyvtár alapján, és így állítottuk elő a humán IL-11 szekvenciákat belőlük. A PCR technikát a szakterületen általánosan alkalmazott módon használtuk. A kapott PCR terméket ezután egy megfelelően (7) 150 egység/ml rágcsáló IL-3-mal kiegészített pClR6-tal transzfektált COS-1 sejtek kondicionált táptalaja 1:50 hígításban.
Amikor az IL-11 -et csak ebben a vizsgálatban vizs5 gáltuk, akkor nagyon kis választ kaptunk. Ha azonban az IL-11-t ebben a vizsgálatban rekombináns rágcsáló IL-3 jelenlétében vizsgáltuk, akkor a vizsgálati eredmények azt mutatták, hogy az IL-11 és az IL-3 kombinációja ebben a vizsgálatban jelentős mértékben ser10 kenti a megakariocita sejtek termelődését és érését. Ez a vizsgálat azt igazolja, hogy az emlős IL—11 szinergisztikus hatással rendelkezik az IL-3-mal a megakariocita fejlődés serkentésében.
8. példa
Humán IL-11 előállítása
A humán IL-11 klónozott szekvenciájának előállításához a humán IL—11 mRNS-sel hibridizáló (1. 5. példát) PU34 IL—11 cDNS-t használtuk egy olyan cDNS könyvtár átvizsgálására, amelyet az előzőekben leírt MRC-5 humán tüdő fibroblaszt sejtvonalból állítottunk elő. Az ebből a könyvtárból kapott rekombinánsokat szélesztettük, és a lemezekről két példányban nitrocellulóz replikákat készítettünk. Ezeket a repliká25 kát egy éjszakán át hibridizáltuk 65 °C-on standard hibridizáló oldatban (4xSSC) a 32P-vel jelzett emlős IL—11 cDNS-sel (a jelöléshez a random priming jelző kitet használtuk) [A. P. Feinberg és munkatársai, Analytical Biochemistry, 132, 6-13 (1983)]. A szűrőla30 pokat ezután 0,2xSSC-ben mostuk ugyanazon a hőmérsékleten, egészen addig, amíg a háttér radioaktivitása elfogadható szintre nem csökkent, ami lehetővé tette a specifikusan hibridizálódó szekvenciák kimutatását. Azokat a telepeket izoláltuk, amelyek a másik szűrőla35 pon az emlős IL-11 próbával hibridizáltak, és ezekből plazmid DNS-t izoláltunk.
A humán IL-11 teljes szekvenciáját azokkal a módszerekkel analóg módon határoztuk meg, amelyeket az előzőekben ismertettünk az emlős IL-11-nek
PU34 sejtvonalból való izolálására. A humán szekvenciát is bemutatjuk az I. táblázatban. Ahol a humán szekvencia különbözik a főemlős szekvenciától, ott a humán nukleotidot az I. táblázatban a főemlős szekvencia felett külön kiírtuk.
Egy másik módszer szerint oligonukleotidokat készíthetünk az I. táblázatban található szekvencia alapján, a szubklónozási célokra alkalmas restrikciós helyek bevitelével, majd polimeráz láncreakciót alkalmazva a humán IL—11 DNS-szekvencia előállítására. A követ50 kező oligonukleotidokat szintetizáltuk:
ZCACATGAACTGTGTTTGCCG 3’ ’TTCACAGCCGAGTCTTCAGC 3’ emésztett pXM vagy egyéb expressziós vektorba szubklónoztuk. A fenti oligonukleotidok esetében a pXM vektort BamHI vagy HindlII restrikciós enzimmel emésztettük a szubklónozáshoz.
Egy harmadik módszer a humán IL-11 szekvencia előállítására abban áll, hogy egy humán genomi könyv14
HU 215 233 Β tárat vizsgálunk át az I. táblázatban szereplő szekvenciát alkalmazva próbaként.
9. példa
A rekombináns IL—11 expressziója
A rekombináns emlős IL— 11 előállításához, beleértve a humán faktort is, az ezt kódoló cDNS-t egy megfelelő expressziós vektorba vittük át, amelyből számos ismert a szakirodalomban emlős- és rovarsejtekben, élesztőben, gombában és baktériumban való expresszió céljára, ismert molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával [Y. C. Yang és munkatársai, Cell, 47, 3-10 (1986)].
Amint azt az előzőekben az emlős IL-11 kapcsán ismertettük, a humán IL—11 cDNS-t standard módszerek alkalmazásával szintetizáltuk, majd a pXM expressziós vektorba [Y. C. Yang és munkatársai, Cell, 47, 3-10 (1986)] klónoztuk. Ez a vektor lehetővé teszi a cDNS inszertek expresszióját emlős sejtekben, például a COS-1 sejtekben. A pXM tartalmazza az SV40 fokozó szekvenciát, a fő adenovírus késői promotert, háromrészes leader szekvenciát és a kis hibrid megszakító szekvenciát, a DHFR kódoló szekvenciát, az SV40 késői mRNS poli A addiciós szekvenciáját és az adenovírus Val génjét. Ezt a vektort az Xhol restrikciós enzimmel linearizálni lehet, majd ekvimoláris mennyiségű IL—11 cDNS-hez lehet ligálni, amelyet előzőleg úgy módosítottunk, hogy komplementer Xhol tapadós végeket generáló szintetikus oligonukleotidokat adtunk hozzá. Az ilyen oligonukleotidok a kereskedelmi forgalomban hozzáférhetők. (Collaborative Research, Lexington, MA).
Egy másik vektor, amelyről kimutatták, hogy jól expresszálja a citokineket a CHO sejtekben, az a pEMC2Bl vektor. Ez a vektor a pMT2pc-ből származhat, amelyet az American Type Culture Collection-nál (ATCC) helyeztünk letétbe (Rockville, Módosít, USA), ATCC 40 348 letéti sorszám alatt. A plazmid DNS-t PstI restrikciós enzimmel emésztve linearizáltuk. A kapott lineáris molekulán tompa véget alakítottunk ki T4 DNS polimerázzal. Egy 5’ TGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGA 3’ szekvenciájú oligonukleotidot ligáltunk ezután a DNS-hez, ezzel regenerálva a PstI restrikciós enzim hasítási helyet az 5’ végen, plussz létrehozva egy EcoRI és egy Xhol hasítási helyet a DHFR cDNS ATG triplettje előtt. Ennek a plazmidnak a jele pMT21. A pMT plazmidot EcoRI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztettük, amely enzimek a plazmidot két szomszédos klónozási helyen hasítják. Egy 508 bp méretű EMCV fragmenst kivágtunk a pMT2ECAT1-ből [S. K. Jong és munkatársai, J. Virol, 63, 1651-1660 (1989)] az EcoRI és Taql restrikciós enzimekkel emésztve. Egy pár 68 nukleotid hosszúságú oligonukleotidot szintetizáltunk, amellyel duplikáltuk az EMCV szekvenciát az ATG-ig. Az ATG-t ATT-re változtattuk, egy C-t adtunk hozzá, ezzel létrehoztunk egy Xhol restrikciós hasítási helyet a 3’ végen. Egy Taqal hasítási hely található az 5’ végen. Az oligonukleotidok szekvenciája az alábbi:
5’ CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCC GAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAA ACACGATTGC 3’, valamint ennek komplementer szála.
A pMT21 EcoRI-XhoI fragmensét az EMCV EcoRI-Taqal fragmenshez, valamint a Taqal/Xhol oligonukleotidokhoz ligáivá kaptuk a pEMC2Bl vektort. Ez a vektor az SV40 replikácíós origót és enhanszert tartalmazza, valamint az adenovírus késői fő promoterét, az adenovírus háromrészes leader szekvenciája legnagyobb részének egy cDNS másolatát, egy kis hibrid megszakító szekvenciát, egy SV40 poliadenilezési szignált és az adenovírus VA I génjét, a DHFR és β-laktamáz markereket és egy EMC szekvenciát, olyan megfelelő elrendezésben, amely a kiválasztott cDNS emlős sejtekben való magas szintű expresszióját képes vezérelni. Az EMC2B1 vektort az EcoRI restrikciós enzimmel linearizáltuk, majd ezt követően ekvimoláris mennyiségű IL-ll-et kódoló cDNS-hez ligáltuk, amelyet előzőleg úgy módosítottunk, hogy EcoRI komplementer végeket generáló szintetikus oligonukleotidokat adtunk hozzá, ezzel az expresszióhoz előállítottuk a konstrukciókat.
Az IL-11-et tartalmazó keresett vektort egy megfelelő gazdasejtbe juttattuk, szokásos génsebészeti módszerekkel. A transzformált sejteket tenyésztettük, az expresszált IL-11-et kinyertük és tisztítottuk a tenyésztő tápfolyadékból, standard módszerek alkalmazásával.
A) Emlős-sejt expresszió
Abból a célból, hogy az IL-11 polipeptidet emlős gazdasejtekben expresszáljuk, az IL—11 DNS szekvenciát tartalmazó pXM vektort COS sejtekbe transzfektáltuk, a 2. példában leírtak alapján. A transzfektált COS sejtek kondicionált táptalaja IL-11 aktivitást tartalmazott, a TI 165 vizsgálat alapján. Hasonlóképpen, az IL—11 cDNS-t tartalmazó pEMC-2Bl konstrukciót CHO sejtekbe transzfektáltuk.
A szakterületen jártas szakember más emlős expressziós vektor előállítására is képes, amely összehasonlítható a pXM/IL-11 vektorral, például úgy, hogy a megfelelő plazmidból származó IL-11 DNS szekvenciát Xhol restrikciós enzimet alkalmaz jól ismert rekombináns génsebészeti technikákkal és ismert vektorokat (például a pJL3 és pJL4 vektorokat) használ [Gough és munkatársai, EMBO J., 4, 645-653 (1985)], valamint a pMT2 vektort használva (kiindulásként a pMT2-VWF vektort használva, ATCC 67122; lásd a PCT/US87/00033 számú nemzetközi szabadalmi bejelentést.
Ezeknek a vektoroknak a megfelelő gazdasejtekbe való transzformációja eredményezi az IL—11 polipeptidek expresszióját. A COS sejtektől eltérő emlős gazdasejtek is használhatók az IL-11 expressziójára. Például a vektor DNS stabil integrációjának elérésére, majd a vektor DNS ezt követő amplifikációjához, mindegyiket a szokványos módszerekkel, a CHO sejteket használhatjuk emlős gazdasejtekként.
Ha egyszer a vektorokat és a gazdasejteket kiválasztottuk és transzformáltuk, akkor a stabil transzformánsokat szelektáljuk az IL-11 expresszió szempontjából
HU 215 233 Β standard immunológiai vagy enzimatikus vizsgálatokkal. Az IL— 11 polipeptideket kódoló DNS vagy mRNS jelenlétét standard módszerekkel, például Southern vagy Northern biot elemzéssel tudjuk kimutatni. A polipeptideket kódoló DNS tranziens expresszióját az expressziós vektor DNS-nek az alkalmas gazdasejtbe való bejuttatását követő néhány napban szelekció nélkül mérjük a tenyésztő táptalajban levő fehérje aktivitási vagy immunológiai vizsgálatával, például a TI 165 vizsgálattal.
Bakteriális expressziós rendszerek
Hasonlóképpen a szakterületen jártas szakember oly módon tudja befolyásolni az IL—11 szekvenciáját, hogy a kódoló szekvencia körüli szabályozó szekvenciákat eliminálja, majd baktérium szekvenciákat épít be, hogy olyan baktérium vektorokat állítson elő, amelyek a találmány szerinti IL—11 polipeptidek intracelluláris vagy extracelluláris expresszióját tudják biztosítani baktérium sejtekben.
A faktort kódoló DNS-t tovább módosíthatjuk a szakterületen ismert adatok alapján, hogy olyan kodonokat tartalmazzon, amelyek a baktériumban történő expresszió céljából eltérnek. Az érett IL—11 szekvenciát (az I. táblázat szerinti 21-199-es aminosavakat kódoló nukleotidokat) előnyösen leolvasási fázisban olyan nukleotid-szekvenciához kapcsoljuk, amely a baktéri5 umban expressziót és szekréciót lehetővé tevő szekréciós leader polipeptidet kódol, és az érett variáns fehérjét nyeljük, szintén a szakterületen ismert módon. A baktérium gazdasejtekben expresszált vegyületeket a fizikokémiai, biokémiai és/vagy klinikai paraméterek alapján nyerjük ki és tisztítjuk (mindegyik ismert módszer).
Egy másik módszer szerint az IL-ll-et citoplazmatikus fehérje formájában is expresszálhatjuk Escherichia coli-ban. Ebben az esetben legvalószínűbb, hogy hagyni kell, hogy a molekula felvegye a természe15 tes konformációját, miután teljesen denaturáltuk guanidin-hidrokloriddal, ami szintén egy ismert eljárás a szakterületen. A jelenleg előnyben részesített eljárás szerint az IL—11 Escherichia coliban való expressziójához az kell, hogy a humán IL—11 szekvencia első
31 kodonját eltávolítsuk. Majd az alábbi szekvenciát kapcsoljuk a 32-es kodonnál a humán IL-11 szekvenciához:
ATG CCA GGT CCA CCA CCA GGT CCA CCT CGA GTT 1 5 10
C) Rovar- vagy élesztősejt expresszió
Hasonló manipulációk hajthatók végre egy rovar vektor előállítására (lásd például az 155 476 számú közrebocsátott európai szabadalmi bejelentésben ismertetett eljárásokat) rovarsejtekben való expresszió céljából. Egy élesztő vektor is előállítható, élesztő szabályozó szekvenciákat alkalmazva a találmány szerinti fehéijék élesztőben való intracelluláris vagy extracelluláris expressziója céljából. (Lásd például a WO 86/00639 számon közrebocsátott PCT szabadalmi bejelentést és az EP 123 289 számú európai szabadalmi bejelentést.)
10. példa
IL-ll-et nagy mennyiségben expresszáíó CHO sejtvonalak előállítása
A találmány szerinti, emlős sejtekből származó IL—11 polipeptidek előállítására szolgáló módszer magában foglalja olyan sejtek előállítását, amelyek a heterológ IL—11 gén több kópiáját tartalmazzák. A heterológ gént egy amplifikálható markerhez lehet kapcsolni, például a dihidrofolát-reduktáz (DHFR) génhez, így olyan sejtek szelektálhatok, amelyek nagyszámú kiválasztott génkópiát tartalmaznak. A sejteket metotrexát (MTX) megemelt koncentrációja alapján lehet szelektálni, Kaufman és Sharp módszerével [Kaufman and Sharp, Journal of Molecular Biology, 159, 511-521 (1982)]. Ezt a megközelítést használhatjuk számos különböző sejttípushoz. Egy másik módszer szerint az IL-11 cDNS és a hatóanyag-rezisztencia szelekciós géneket (például a DHFR-t) ugyanabban a vektorban juttathatjuk be a sejtekbe. Ehhez a megközelítéshez egy előnyösen használható vektor a pEMC2Bl.
Például az IL-11 gént és vele más plazmid szekvenciákat (amelyek lehetővé teszik az expressziót) tartalmazó pXM vektort és a DHFR expressziós plazmidot, a pAdA26SV(A)3 vektort [Kaufman és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 3 (9), 1598-1608 (1983)] együtt juttat30 hatjuk be DHFR deficiens CHO sejtekbe, DUKX-BIIbe, a kalcium-foszfát koprecipitációs és transzfekciós módszerrel.
Egy másik módszer szerint a pEMC2Bl vektort, amely az IL—11 gént más plazmid szekvenciákkal 35 amelyek lehetővé teszik expresszióját - operatív kapcsolatban tartalmaz, DHFR deficiens CHO sejtekbe juttatjuk (DUKX-BII) protoplaszt fúzióval és transzfekcióval. Mind az IL—11 gén, mind a DHFR marker hatékonyan expresszálódott, ha a pEMC2B 1 -be
IL-9-et juttattunk. Az IL-11 gént az előzőekben leírt módon lehet bejuttatni a pMT2 vektorba, és az így kapott vektort használhatjuk a pXM/IL-11 és a pAdA26SV(A)3 vektorok helyett.
A DHFR-t expresszáíó transzformánsokat a növeke45 dés alapján szelektáljuk alfa táptalajon, dializált borjúembrió szérummal. A transzformánsoknak vizsgáljuk az IL-9 expresszióját biológiai vizsgálattal, immunológiai vizsgálattal, illetve RNS biot analízissel, és a pozitív transzformánsokat egyesítjük, majd amplifikációra szelektáljuk, növekedés alapján növekvő koncentrációjú MTX jelenlétében [Kaufman and Sharp, Journal of Molecular Biology, 159, 511-521 (1982)]. Az amplifikált vonalakat klónozzuk, majd a biológiailag aktív IL-11 polipeptidek expresszióját a TI 165 vizsgá55 lattal ellenőrizzük. Az IL—11 polipeptid expressziótól az várható, hogy a növekvő mértékű MTX rezisztenciával az is növekszik.
Az előzőekben ismertetett expressziós rendszerek bármelyikében a keletkező sejtvonalakat tovább ampli60 fikálhatjuk a megfelelő hatóanyag-szelekcióval, a kelet16
HU 215 233 Β kező sejtvonalakat újraklónozzuk, és az expresszió szintjét az alábbiakban ismertetett TI 165 vizsgálattal becsüljük meg.
Az IL-ll-et expresszáló CHO sejtvonalak adaptálhatók szérummentes táptalajban való növekedéshez. Homogén IL—11 izolálható a sejtvonal kondicionált táptalajából a szakterületen ismert módszerekkel, beleértve az olyan technikákat, mint a lektin-affinitás kromatográfia, fordított fázisú HPLC és hasonlók.
11. példa
Az IL—11 hatása a proliferációra a korai rágcsáló őssejtek tenyészetében
Metilcellulózos sejttenyészeteket hoztunk létre 35 mm-es Lux szuszpenziós tenyésztő lemezeken (No. 5221, Nunc, Inc. Naperville, IL).
5-Fluoro-uracilt (5-FU) (Adria Laboratories, Columbia, OH) adtunk intravénásán 10-15 napos nőstény BDF! egerek (ARS Sprague Dawley, Indianapolis, IN) farokvénájába 150 mg/testtömeg-kg mennyiségben [T. Suda és munkatársai, J. Cell. Physiol., 117, 308-318 (1983); G. S. Hodgson és munkatársai, Natúré, 281, 391-382 (1979)]. Egysejt szuszpenziókat készítettünk három egér egyesített combcsontjából vagy lépéből. Kis sűrűségű (<l,077) mononukleáris sejteket gyűjtöttünk a Ficoll-Pague határfelületről 400 g-vel való centrifügálás után. Miután hagytuk, hogy ezek a sejtek műanyag felületre kitapadjanak, a nem-tapadó mononukleáris (csontvelő és lép) sejteket kinyertük az 5-FU injektálás után 2, illetve 5 nappal.
Egy ml tény észfolyadék 2*104 normál egérből származó velősejtet, illetve 5-FU-val kezelt egérből származó 5χ104 velősejtet vagy lxlO6 lépsejtet tartalmazott, valamint α-táptalajt (Flow Laboratories, Inc., McLean, VA), 1,2% 1500 cps metil-cellulózt (Fisher Scientific Co., Norcross, GA), 30% borjúembrió szérumot (FCS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan UT), 1% szarvasmarha szérumalbumin V-ös ionmentesített frakciót (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 1 xl0~4 mol/l 2-merkapto-etanolt (Eastman Organic Chemicals, Rochester, NY) és hematopoietikus faktorokat. A lemezeket 37 °C-on inkubáltuk 5% CO2-vel dúsított, nedvesített atmoszférában, A megakariocita telepek kivételével az 50 vagy annál több sejtet tartalmazó telepeket megszámláltuk egy inverz mikroszkóp alatt az inkubáció egy meghatározott napján. A megakariocita telepeket akkor számláltuk meg, amikor négy vagy több megakariocitát tartalmaztak. A teleptípusok rövidítése a következő: GM, granulocita/makrofág; Mást, emlősejt telepek; M, megakariocita telepek; GMM, granulocita/makrofág/megakariocita telepek [T. Nakahata és munkatársai, J. Cell. Physiol., 111, 239-246 (1982)]; GEMM, granulocita/eritrocita/makrofág/megakariocita telepek [T. Nakahata és munkatársai, J. Cell. Physiol., 111, 239-246 (1982); A. A. Fauser és munkatársai, Blood, 52, 1243-1248 (1978)]; és Β1, blasztsejt telepek [T. Nakahata és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 79, 3843-3847 (1982); T. Suda és munkatársai, J. Cell. Physiol., 117, 308-318 (1983)].
A blasztsejtek hematopoietikus potenciálját a blasztsejt telep újraszélesztésével határoztuk meg. Az inkubálás 5-15. napján az egyes blasztsejt telepeket, amelyek 50-150 telepet tartalmaztak, egy Eppendorf pipettával izoláltuk, majd szekunder metil-cellulóz tenyészetekben újra szélesztettük, amelyek 2 egység/ml, humán vizeletből származó eritropoietint (Ep) tartalmaztak (aktivitása 370 egység/mg, hozzáférhető Dr. Makoto Kawakitánál, Kumamoto University Medical School, Kumamoto, Japan), valamint 1% (térf/térf.) koncentrált (x20) felülúszót a WEHI-3 sejtek tenyészetéből.
A blasztsejteket arra is használtuk, hogy a hematopoietikus sejtek számára egyszerű célsejtekként szolgáljanak annak meghatározására, hogy az IL—11 megfigyelt hatásai közvetlenek, vagy más faktorok kibocsátásának következményei-e. Egymillió négynapos poszt-5-FU lépsejtet tenyésztettünk 100 egység/ml rekombináns rágcsáló IL-3 jelenlétében. Az IL-3-t kínai hörcsög petesejttel (CHO) kondicionáltuk, amelyeket genetikailag úgy módosítottunk, hogy nagy mennyiségben termeljék a rágcsáló IL-3-antitestet (körülbelül 30 000 egység/ml). Egy napon az egyes blasztsejt telepekből (50—150 számú sejtet tartalmaznak) nyolcat kivettünk a tenyészetekből, egyesítettük, kétszer mostuk táptalajjal, és szekunder tenyészetekben újra szélesztettük úgy, hogy mind más faktor-kombinációt tartalmazott.
A rekombináns humán IL—6-ot 4χ106 egység/mg fehérje specifikus aktivitással Escherichia coliban expresszáltuk. Az IL—11 táptalajjal kondicionált (CM), a rágcsáló plazmacitóma serkentő aktivitást kódoló cDNS-sel transzfektált COS sejtekkel [S. R. Paul és munkatársai, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, (1990)].
A. α Telepképződés normál egerek velősejtjeiből
A normál velősejtekből való telepképződést az IL—11 támogatja. 2 egység/ml Ep jelenlétében vagy anélkül az IL-11 telepképződést eredményezett, dózisfüggő módon. Az IL-11 1:100-szoros hígítása maximális telepképződést eredményezett. Az IL-11-gyel való inkubálás 8. vagy 16. napján észlelt telepek össz-száma azonban lényegesen kevesebb volt, mint az IL-3-t tartalmazó tenyészetekben. Az IL-11-t tartalmazó tenyészetekben talált telepek főleg GM típusúak voltak, jóllehet néhány többvonalú (multilineage) (GEMM és GMM) telepet is megfigyelhettünk. Az IL—11 1:100aminosav hígításban támogatta három blasztsejt telep megjelenését az inkubálás 16. napján.
B. Telepképződés 5-FU-val kezelt egerek velősejtjeiből
A telepképződést olyan velősejtekből vizsgáltuk, amelyeket két nappal azután vettünk, hogy 150 mg/kg 5-FU-t adtunk be injekcióban [T. Suda és munkatársai, J. Cell. Physiol., 117, 308-318 (1983); G. S. Hodgson és munkatársai, Natúré, 281, 391-382 (1979)], olyan tenyészetekben, amelyeket csak IL-11, IL-6 vagy IL-3, illetve ezek különböző kombinációja jelenlétében hoztunk létre, annak megállapítására, hogy az IL—11 szinergisztikusan hat-e az IL-3-mai a primitív őssejtek szaporodásának támogatásában.
HU 215 233 Β
Ha az IL-ll-et l:100-szoros és 1:1000-szeres hígításban adtuk az IL-3 optimális koncentrációjához, akkor ez jelentősen megnövelte a telepképződést. Pontosabban, az IL-ll és az IL-3 l:100-szoros hígításának jelenlétében a telepképződés kinetikája felgyorsult az egyes faktorok jelenlétében mérthez viszonyítva. A telepképződés időbeli lefutása, valamint a támogatott telepek összes száma hasonló volt ahhoz, mint amit az IL-6 és az IL-3 kombinációja jelenlétében figyelhettünk meg. Az IL-ll egyedül l:100-szoros hígításban gyengén támogatta a telepképződést, hosszú inkubációs idő után is. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az IL-ll javítja a primitív őssejtek IL-3 dependens proliferációját.
Az IL—11 és IL-6 kombinációjának hatását a telepképződés hatására az 5-FU adagolását követő 2 napos velősejtekből, összehasonlítva az egyes szinergisztikus faktorok hatásával, külön vizsgáltuk. Az IL-6 és az IL—11 jelentősen megnövelte az IL-3 dependens telepképződést. Az IL-6 és az IL—11 kombinációjának hatásai azonban nem különböztek az egyes faktorok hatásaitól.
C) Az 5-FU adagolást követő negyedik napon vett lépsejtekből történő csírasejt telepfejlődés sorozatmegfigyelése
Az egyes csírasejt telepek növekedési sebességeit sorozatban ábrázoltuk a tenyészet térképezési vizsgálatok során. Az eredmények azt mutatják, hogy az IL-ll szinergisztikus hatásai attól függenek, hogy az őssejtek mennyivel kevesebb időt töltenek a pihenő állapotban, ez a hatás nagyon hasonlít ahhoz, amit az IL-6-tal vagy a G-CSF-fel figyelhetünk meg, mivel a növekedési sebességek ezekben a tenyészet rendszerekben statisztikusan nem különböznek egymástól.
D) Az újraszélesztési potenciálok összehasonlítása a csírasejt telepeknél
Azoknak a csírasejt telepeknek a proliferatív potenciálját vizsgáltuk újraszélesztési kísérletekben, amelyek reagálnak az IL—11-re és az IL-6-ra. Az egyes csírasejteknél lényeges variációk figyelhetők meg a szekunder újraszélesztési hatásfokban, amint azt már korábban leírták [K. Ikebuchi és munkatársai, Blood, 72, 2007-2014 (1988)]. Nem volt azonban lényeges különbség azoknak a csírasejt telepeknek az újraszélesztési hatásfokában, amelyek a három különböző primer tenyésztési körülmény mellett szaporodtak.
Az előző megfigyelésekhez hasonlóan [K. Ikebuchi és munkatársai, Blood, 72, 2007-2014 (1988)], a szekunder GEMM telepek százaléka a szekunder telepek között, valamint a szekunder GEMM telepek előfordulása a csírasejt telepek között lényegesen magasabb volt azok között a primer csírasejt telepekből származók között, amelyeket IL-ll-et vagy IL-6-ot tartalmazó tenyészetekből azonosítottunk, mint azok között, amelyek a csak IL-3-t tartalmazó tenyészetekben láthatók. Nem volt lényeges különbség ezekben a paraméterekben azok között a tenyészetek között, amelyek IL—11-t plusz IL-3-t tartalmaztak, és amelyek IL-6-t és IL-3-t tartalmaztak.
Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az IL—11 és az IL-6 szinergisztikus hatásai hasonlóak, és a szekunder
GEMM telepek megjelenésének növekedése annak lehet a következménye, hogy az őssejteknek megrövidül a G periódusa a csírasejt telepképződés során [K.
Ikebuchi és munkatársai, Blood, 72, 2007-2014 (1988)].
E) Az egyesített csírasejtek újraszélesztési vizsgálatai
Az IL—11 és az IL-6 GM telepképződésre gyakorolt közvetlen hatásának összehasonlításához olyan egyesített célsejteket használtunk, amelyeket úgy állítottunk elő, hogy csírasejtek IL-3-mai támogatott korai tenyészetéből származó sejteket egyesítettünk. Az egyesített csírasejtek mentesek voltak a támasztószöveti sejtektől, és nagyon magas újraszélesztési hatásfokot mutattak.
Az IL-3-at tartalmazó tenyészetekben azonosított 50-100 sejtet tartalmazó csírasejt telepeket izoláltuk és egyesítettük, majd újra szélesztettük IL-ll-et, IL-6-ot vagy IL-3-at tartalmazó szekunder tenyészetekben, illetve 2 egység/ml Ep jelenlétében. Ezek az adatok azt jelzik, hogy a csírasejteknek legalább 70%-a hematopoietikus őssejt.
Míg az IL-3 és az Ep kombinációja támogatja számos egyvonalas és többvonalas telep képződését, addig az IL-11 és az Ep csak a makrofág telepek képződése támogatja. Az IL-6 és az Ep kombinációja hasonló számú tiszta makrofág telepek képződését támogatja, de támogatja neutrofil/makrofág telepek képződését is. Az IL-ll-gyei támogatott makrofág telepek kisebbek voltak, mint az IL-6-tal támogatott makrofág telepek.
Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az IL-11 és az IL-6 kölcsönhatásba lép az átfedő, de különböző őssejt csoportokkal, és az IL-11 inkább a makrofág őssejt populációt támogatja.
F) A neutralizálő anti—IL—6 antitest hatásai az IL-ll szinergisztikus hatásaira
Abból a célból, hogy megerősítsük azt, hogy az IL-11 és az IL-6 közötti közvetlen teleptámogató képesség nem a COS sejt CM nyers természetének az eredménye, a neutralizálő anti-IL-6-antitestet (amelyről ismert, hogy gátolja a COS eredetű IL-6-ot) használtuk az IL-11 és IL-6 szinergisztikus hatásainak vizsgálatára az alvó őssejtekből való IL-3 dependens proliferációra.
Az IL-6 vagy az IL-11 jelenlétében, és az antitestek távollétében az 5-FU-val négy nappal korábban kezelt lépsejtekből való telepképződés lényegesen meggyorsult, amint azt a 8. napon észlelt telepek száma mutatta. Ha anti-IL-6 antitest volt jelen, akkor az IL-6 szinergisztikus hatásai teljesen megszűntek, míg az IL-11 hatásai nem. Az antitestnek ezek a hatásai megmaradtak a 16. napig. Ezek az eredmények kizáqák annak a lehetőségét, hogy a látszólagos szinergisztikus hatásokat a COS sejt CM-ben az IL-6 befolyásolja.
Az IL-11 cDNS-sel transzfektált COS sejtek kondicionált táptalajáról (CM) úgy találtuk, hogy növeli a multipotenciális őssejtek tenyészetben való IL-3 dependens szaporodását, amely aktivitást eredetileg az IL-6-hoz kapcsoltak. A növelés mechanizmusáról úgy tűnik, hogy megrövidíti az alvó őssejtek G. periódusát.

Claims (3)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás IL—11 fehérje vagy fragmense előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az alábbi aminosavszekvenciák valamelyikét kódoló DNS szekvenciával transzformált sejteket tenyésztünk:
    (a) az I. táblázatban megadott főemlős aminosav szekvencia 21-199. aminosavát tartalmazó szakasza, (b) az I. táblázatban megadott humán aminosavszekvencia 21-199. aminosavát tartalmazó szakasza, (c) az I. táblázatban megadott főemlős 1-199. aminosavát tartalmazó szakasza, (d) az I. táblázatban megadott humán 1-199. aminosavát tartalmazó szakasza.
    (Elsőbbsége: 1989. 11. 22.)
    2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az I. táblázatban megadott humán aminosav-szekvencia 21-199. aminosavát kódoló DNS-szekvenciával transzformált sejteket tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1990. 05.21.)
    3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, a replikációt és az említett DNS-szekvencia expresszióját szabályozó expressziós kontroll szekvenciával operatív kapcsolatban levő, az említett aminosav-szekvenciát kódoló DNS-szekvenciával transzformáit sejteket tenyésztünk. (Elsőbbsége: 1989. 11.22.)
    4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, az I. táblázat szerint említett aminosav-szekvenciát kódoló DNS-szekvenciával, annak ffagmensével vagy ahhoz hibridizálódó DNS-szekvenciával transzformált sejteket tenyésztünk, ahol az említett aminosav-szekvencia az alábbi tulajdonságok közül eggyel vagy többel rendelkezik:
    (1) biológiai aktivitás TI 165 vizsgálatban;
  2. (2) biológiai aktivitás IL-3 jelenlétében megakariocita kolóniaképző vizsgálatban;
  3. (3) biológiai aktivitás B-sejt foltképző vizsgálatban. (Elsőbbsége: 1989. 11.22.)
    5. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított IL-11 fehérjét vagy annak biológiailag aktív fragmensét a gyógyszergyártásban szokásos hígító-, hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk. (Elsőbbsége: 1989. 11. 22.)
    6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett hatóanyag mellett még hematopoietint, citokint, növekedési faktort vagy antitestet is alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1989. 11. 22.)
HU9201712A 1989-11-22 1990-11-20 Eljárás az IL-11, egy új emlős citokin előállítására HU215233B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US44110089A 1989-11-22 1989-11-22
US07/526,474 US5215895A (en) 1989-11-22 1990-05-21 Dna encoding a mammalian cytokine, interleukin-11

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9201712D0 HU9201712D0 (en) 1992-09-28
HUT64595A HUT64595A (en) 1994-01-28
HU215233B true HU215233B (hu) 1998-11-30

Family

ID=27032674

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9201712A HU215233B (hu) 1989-11-22 1990-11-20 Eljárás az IL-11, egy új emlős citokin előállítására

Country Status (13)

Country Link
US (4) US5215895A (hu)
EP (1) EP0504177B1 (hu)
JP (2) JP2688539B2 (hu)
KR (1) KR970005050B1 (hu)
AT (1) ATE199096T1 (hu)
CA (1) CA2069428C (hu)
DE (1) DE69033700T2 (hu)
DK (2) DK0504177T3 (hu)
ES (1) ES2156852T3 (hu)
GR (1) GR3035627T3 (hu)
HU (1) HU215233B (hu)
MX (1) MX9203439A (hu)
WO (1) WO1991007495A1 (hu)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5215895A (en) * 1989-11-22 1993-06-01 Genetics Institute, Inc. Dna encoding a mammalian cytokine, interleukin-11
JP3149182B2 (ja) * 1990-08-29 2001-03-26 ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド 多領域造血刺激因子類
JP2752819B2 (ja) * 1990-11-08 1998-05-18 三共株式会社 新規サイトカイン
EP0612348B1 (en) 1991-11-04 2003-04-23 Genetics Institute, LLC Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use
US5460810A (en) * 1992-09-02 1995-10-24 Genetics Institute, Inc. Method for maintaining gut epithelial cells by treatment with a cytokine such as interleukin 11
US5602301A (en) 1993-11-16 1997-02-11 Indiana University Foundation Non-human mammal having a graft and methods of delivering protein to myocardial tissue
CZ288926B6 (cs) * 1994-03-31 2001-09-12 Amgen Inc. MGDF derivát, způsob jeho výroby a farmaceutický prostředek s jeho obsahem
US5795569A (en) * 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
US6270757B1 (en) * 1994-04-21 2001-08-07 Genetics Institute, Inc. Formulations for IL-11
US5582821A (en) * 1994-07-22 1996-12-10 Genetics Institute, Inc. Methods for treating bleeding disorders
US6274547B1 (en) 1996-06-14 2001-08-14 Genetics Institute, Inc. Methods comprising the use of human interleukin-11 receptor proteins
JPH10511266A (ja) 1994-12-22 1998-11-04 ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド ヒト・インターロイキン−１１受容体
US5760189A (en) * 1995-06-02 1998-06-02 Genetics Institute, Inc. Protein recovery & purification methods
US5824789A (en) * 1995-06-07 1998-10-20 Systemix, Inc. Human growth factors, nucleotide sequence encoding growth factors, and method of use thereof
JPH11507663A (ja) * 1995-06-09 1999-07-06 イエダ リサーチ アンド デベロツプメント カンパニー リミテツド レストリクチンｐ／アクチビンａを含む薬学的組成物及びｉｌ−６及び／又はｉｌ−１１のアンタゴニストとしてのその用途
US6126933A (en) * 1995-06-27 2000-10-03 Genetics Institute Methods of treating inflammatory bowel diseases by administering IL-11
US5679339A (en) * 1995-06-27 1997-10-21 Keith; James Method of using IL-11 for treating spondyloarthropies
US6540993B1 (en) * 1995-06-27 2003-04-01 Wyeth Method of treating inflammatory bowel disease using a topical formulation of IL-11
US6887461B1 (en) * 1998-10-26 2005-05-03 Genetics Institute, Llc Method of using IL-11 for treating mucositis
US5686246A (en) * 1995-08-03 1997-11-11 Kornman; Kenneth S. Detecting genetic predisposition to periodontal disease
EP0871472A4 (en) * 1995-10-27 2001-05-30 Amrad Operations Pty Ltd CYTOKINES AND THEIR USE IN THE TREATMENT AND / OR PROPHYLAXIS OF BREAST CANCER
KR100426286B1 (ko) * 1996-01-09 2004-06-30 주식회사 엘지생명과학 효모를이용한인간인터루킨-11의제조방법
AUPO439396A0 (en) 1996-12-24 1997-01-23 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The A method of treatment and prophylaxis
CA2318382A1 (en) * 1998-01-23 1999-07-29 Genetics Institute, Inc. Method of using il-11 to enhance cell mediated immunity for treating various viral and parasitic infections and cancer
CA2237915A1 (en) 1998-05-19 1999-11-19 Stephen Shaughnessy Osteoporosis treatment
US6265165B1 (en) * 1998-11-12 2001-07-24 The Regents Of The University Of California Methods for EST-specific full length cDNA cloning
WO2000053214A1 (en) * 1999-03-11 2000-09-14 Genetics Institute, Inc. Use of interleukin-11 to prevent immune-mediated cytotoxicity
US6953777B2 (en) * 1999-03-11 2005-10-11 Genetics Indtitute LLC Use of interleukin-11 to prevent immune-mediated cytotoxicity
CA2345920A1 (en) 1999-04-15 2001-02-01 Genetics Institute, Inc. Use of interleukin-11 to treat gastrointestinal disorders
US6274135B1 (en) * 1999-06-22 2001-08-14 Genetics Institute, Inc. Method of using IL-11 for inflammation associated with acute pancreatitis
JP2003522735A (ja) * 1999-07-15 2003-07-29 ジェネティクス インスティチュート，エルエルシー Ｉｌ−１１に関する組成物
WO2003049693A2 (en) * 2001-12-06 2003-06-19 Wyeth Method and composition for inducing weight loss
US6982080B2 (en) * 2002-03-15 2006-01-03 Wyeth Hydroxyethyl starch—containing polypeptide compositions
AU2003296413A1 (en) * 2002-09-16 2004-04-30 Wyeth Delayed release formulations for oral administration of a polypeptide therapeutic agent and methods of using same
PL1675608T3 (pl) 2003-09-12 2007-11-30 Wyeth Corp Stałe fosforanowo wapniowe pałeczki do wstrzyknięć dla dostarczania białek osteogennych
WO2005085283A1 (ja) * 2004-03-03 2005-09-15 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. 修飾インターロイキン−１１及びそれを含有する医薬組成物
WO2006081379A1 (en) * 2005-01-26 2006-08-03 Wyeth Use of sfrps as markers of bmp activity
CA2628756A1 (en) * 2005-12-06 2007-06-14 Wyeth Interleukin-11 compositions and methods of use
US20080069796A1 (en) * 2006-07-31 2008-03-20 Kim Jong-Mook Low Dose Treatment with an Interleukin-11 Analog
WO2011151716A1 (en) 2010-06-04 2011-12-08 Lupin Limited Process for the purification of recombinant human il-11
US9725689B2 (en) 2010-10-08 2017-08-08 Terumo Bct, Inc. Configurable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
US9320777B2 (en) 2011-05-13 2016-04-26 Bolder Biotechnology, Inc. Methods and use of growth hormone supergene family protein analogs for treatment of radiation exposure
EP3068866B1 (en) 2013-11-16 2018-04-25 Terumo BCT, Inc. Expanding cells in a bioreactor
EP3613841B1 (en) 2014-03-25 2022-04-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
CN106715676A (zh) 2014-09-26 2017-05-24 泰尔茂比司特公司 按计划供养
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
US11229683B2 (en) 2015-09-18 2022-01-25 Bolder Biotechnology, Inc. Hematopoietic growth factor proteins and analogs thereof and angiotensin converting enzyme inhibitors for treatment of radiation exposure
US11965175B2 (en) 2016-05-25 2024-04-23 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
JP7227159B2 (ja) * 2017-01-16 2023-02-21 ナンシャ・バイオロジックス・（ホンコン）・リミテッド 酵母における組換えｉｌ－１１の生産のためのシステムおよび方法
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
EP3656841A1 (en) 2017-03-31 2020-05-27 Terumo BCT, Inc. Cell expansion
US12043823B2 (en) 2021-03-23 2024-07-23 Terumo Bct, Inc. Cell capture and expansion

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4863727A (en) * 1986-04-09 1989-09-05 Cetus Corporation Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor
US5215895A (en) * 1989-11-22 1993-06-01 Genetics Institute, Inc. Dna encoding a mammalian cytokine, interleukin-11
US5371193A (en) * 1990-05-21 1994-12-06 Genetics Institute, Inc. - Legal Affairs Mammalian cytokine, IL-11
JPH0571866A (ja) * 1991-09-17 1993-03-23 Matsushita Refrig Co Ltd 断熱箱体

Also Published As

Publication number Publication date
DK0504177T3 (da) 2001-04-02
WO1991007495A1 (en) 1991-05-30
AU644389B2 (en) 1993-12-09
US5854028A (en) 1998-12-29
DK66692D0 (da) 1992-05-21
ES2156852T3 (es) 2001-08-01
EP0504177A1 (en) 1992-09-23
US5700664A (en) 1997-12-23
GR3035627T3 (en) 2001-06-29
HUT64595A (en) 1994-01-28
US5215895A (en) 1993-06-01
MX9203439A (es) 1992-08-01
JP2783361B2 (ja) 1998-08-06
JPH104982A (ja) 1998-01-13
CA2069428A1 (en) 1991-05-23
CA2069428C (en) 2001-07-31
AU6757890A (en) 1991-06-13
JPH05504560A (ja) 1993-07-15
KR970005050B1 (ko) 1997-04-11
US6066317A (en) 2000-05-23
ATE199096T1 (de) 2001-02-15
HU9201712D0 (en) 1992-09-28
DE69033700D1 (de) 2001-03-15
KR920703819A (ko) 1992-12-18
DK66692A (da) 1992-07-22
DE69033700T2 (de) 2001-09-13
JP2688539B2 (ja) 1997-12-10
EP0504177B1 (en) 2001-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU215233B (hu) Eljárás az IL-11, egy új emlős citokin előállítására
AU637620B2 (en) A human cytokine, interleukin-9
US4877729A (en) Recombinant DNA encoding novel family of primate hematopoietic growth factors
US4959455A (en) Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
EP0494268B1 (en) Method for inhibiting growth of stem cells
CA1341355C (en) Production and use of il-6
US5639453A (en) Therapeutic uses of IL-3
HU212277B (en) Process for producing m-csf
US5371193A (en) Mammalian cytokine, IL-11
US5414071A (en) Human cytokine IL-9
AU644389C (en) A mammalian cytokine, IL-11
US6787645B1 (en) DNA encoding human JE cytokine
US6284237B1 (en) Methods of treatment using IL-6

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: CHILDREN S MEDICAL CENTER CORP., US

Owner name: GENETICS INSTITUTE, LLC, US