DE3781204T2

DE3781204T2 - Verfahren zur herstellung von lymphokinaktivierten toetenden zellen.

Info

Publication number: DE3781204T2
Application number: DE8787107755T
Authority: DE
Inventors: Kam Hung Leung; John J Rinehart
Original assignee: Terumo Corp; Ohio State University Research Foundation
Current assignee: Terumo Corp; Ohio State University Research Foundation
Priority date: 1986-05-30
Filing date: 1987-05-27
Publication date: 1993-01-14
Anticipated expiration: 2007-05-28
Also published as: EP0247613B1; EP0247613A2; DE3781204D1; IE871414L; JPS6328388A; EP0247613A3; IE59610B1; CA1296667C; JP2540544B2; US4849329A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK-Zellen) sowie die Verwendung derselben in Transfer-Therapien.
Thiele et al., in J. o. Immunology 134, S. 786 ff (1985), legen dar, dass der Methylester von L-Leucin (Leu-OMe) die lysosomale. Zerstörung und das Absterben von Human-Monozyten verursacht. Zusätzlich löschte das Leu-OMe die Aktivität der natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) von Mononucleozellen in peripherem Human-Blut aus. Die Autoren schreiben, dass eine kurze Prä-Inkubation von peripheren Human-Mononucleozellen mit Leu-OMe (1 bis 5 mM) den irreversiblen Verlust an NK-Funktion bewirkte, wie eine Lyse von K 652-Zielzellen gezeigt hat. Andere Methylester der Aminosäure, z.B. solche der L-Glutamin-, L-Valin- und L-Isoleucinsäure, bewirkten ebenfalls eine reversible Inhibierung der NK-Aktivität, aber nicht den irreversiblen Verlust aller NK-Funktionen. Sogar bei wesentlich höherer Konzentration der andern Aminosäure-Methylester war es trotzdem nur der Ester der L-Glutaminsäure, der zu irreversiblen Aenderungen der NK-Funktionen führte. Toxisch hinsichtlich der Human-Monozyten waren also nur Leu-OMe und der Dimethylester der L-Glutaminsäure. Die Autoren erwähnen den Phenylalanin-Methylester nicht.
Lanier et al,. in J. o. Immunology 134, S. 794 ff (1985), schreiben, dass hochreines rekombinantes Interleukin-2 die durch NK- Zellen bewirkte Zytotoxizität von Lymphozyten aus peripherem Human-Blut erhöht. Alle auf rekombinantes Interleukin-2 zytotoxischen NK-Zellen wurden in der Menge derjenigen Lymphozyten gefunden, welche den Leu-11-Marker exprimierten, ein mit dem Fc-IgG-Rezeptor assoziiertes Antigen an Human-NK-Zellen. Die genannte Aktivierung der Leu-11&spplus;-NK-Zellen resultierte aus einem direkten Effekt von rekombinantem Interleukin-2 auf diese Zellen; sie erforderte keine Anwesenheit von T-Lymphozyten und wurde durch eine solche auch nicht amplifiziert.
Rayner et al., in Cancer 55, S. 1327 ff (1985) schreiben, dass LAK-Zellen durch das Inkubieren von Lymphozyten aus frischem, peripherem Human-Blut in Interleukin-2 generiert werden können. Diese LAK-Zellen zerstören frische autologe und allogene Human- Tumorzellen in vitro. Die genannten LAK-Zellen können dabei aus peripherem Blut sowohl von gesunden wie auch von tumorkranken Individuen gewonnen werden. Die Autoren geben an, dass reines, rekombinantes Interleukin-2 LAK-Zellen generiert, welche sehr verschiedene Tumorzellen zu zerstören imstande sind, u.a. Sarkom- Zellen, solche des Dickdarmes, der Pankreas, der Nebennieren und des Oesophagus. Dieses LAK-System soll sich von denjenigen der natürlichen und klassischen zytolytischen T-Lymphoid-Systeme unterscheiden. Mittels rekombinantem Interleukin-2 generierte LAK-Zellen sind in der Lage, NK-resistente Tumorzellen zu lysen. Die Verwendung von LAK-Zellen, eventuell zusammen mit der systemischen Einnahme von rIL-2, kann, nach Ansicht der Autoren, ein verheissungsvoller Weg zur zukünftigen Immunotherapie bei Human- Tumor darstellen.
Shau et al., in J. o. Immunology 134, S. 1136 ff (1985), schreiben, dass die Aktivität von Human-NK-Zellen in Lymphozyten von peripherem Blut völlig inhibiert wird durch eine Vor-Behandlung der Effektorzellen mit einem lysomotropischen Agens, dem Methylester von L-Leucin. Die Aktivität der NK-Zellen in von NK-Zellen entleerten peripheren Blut-Lymphozyten kann, gemäss dieser Veröffentlichung, aber durch die Inkubation mit IL-2 oder durch die Zugabe von gemischten Lymphozyt-Kulturen regeneriert werden.
Thiele et al., in J. o. Immunology, 131, S. 2282 ff (1983), beschreiben die Verwendung der lysomotropischen Verbindung L-Leucinmethylester, um den Phänotypen der zur in-vitro-Aktivierung von Human-B- und -T-Zellen notwendigen Zellen zu bestimmen. Leu-OMe verursacht die lysosomale Zerstörung und das selektive Absterben von Human-Monozyten; eine Prä-Inkubation mit der gleichen Verbindung beendigt jede mitogen-induzierte Lymphozyt-Reaktion. Die Möglichkeit der genannten Reaktionen wurde aber vollständig wiederhergestellt durch eine gemeinsame Kultur mit einer an Monozyten angereicherten, an Glas anhaftenden Zellpopulation.
Thiele et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, S. 2468 ff (1985), lehren, dass, wenn Mononucleo-Phagozyten oder polymorphnucleide Leukozyten zusammen mit leu-OMe inkubiert wurden, sich der L-Leucyl-L-Leucinmethylester (Leu-Leu-OMe) bildet, welcher alle NK-Funktionen von gemischten Lymphozyt-Population eliminiert. Dieser Effekt trat auch ohne die Anwesenheit von Mononucleo- Phagozyten auf. Wenn anstelle von Leucin Aminosäuren mit nichtpolaren R-Gruppen in beiden Stellungen eingesetzt wurden, zeigte der sich ergebende Dipeptidmethylester immer auch eine gewisse Toxizität hinsichtlich NK-Zellen. Fröhere Versuche hatten gezeigt, dass Verbindungen wie die Methylester der Valin- und der Phenylalaninsäure oder Kombinationen davon die NK-Funktion von Mononucleo-Zellen aus peripherem Human-Blut nicht entfernten.
Mangan et al., in Infection and Immunity 46, S. 332 ff (1984), schreiben, dass die Entfernung von Monozyten aus unfraktionierten Blutzellen mittels verschiedener Methoden - auch mittels des Einsatzes von Leu-OMe - zu einer Zellpopulation führte, welche einer durch Fusobacterium nucleatum induzierten polyklonalen B-Lymphozyt-Aktivierung (PBA) zugänglich und einer durch Pokeweed-mitogenisch induzierten PBA nicht zugänglich war.
Meineke et al, in Fed. Proc. 44, S. 1688 (1985), schreiben, dass, wenn Mononucleo-Zellen aus peripherem Blut auf einen Restgehalt von 4 % Monozyten gebracht werden - z.B. mittels Adhäsion an Kunststoff-Oberflächen, an Nylonfasern oder durch Einsatz von L-Leucinmethylester -, jedesmal eine erhöhte LAK-Aktivierung und eine veringerte Abhängigkeit von der Zellkonzentration der Monozyten festzustellen war.
Rosenberg et al., in the New England Journal of Medicine 313, S. 1485 ff (1985), veröffentlichten vorläufige Resultate einer systemischen Verabreichung von autologen Lymphokin-aktivierten Killerzellen zusammen mit rekombinantem IL-2 an Patentien mit fortgeschrittenem Tumor. 25 Patienten mit metastasierendem Tumor, bei denen die Standard-Therapie keine Verbesserung gezeigt hatte, wurden so behandelt. Eine objektive Röckbildung des Krebses (> 50-%-Reduktion) wurde in 11, eine vollständige Rückbildung in einem Fall (metastasierendes Melanom; Fortdauern dieses Zustandes auch 10 Monate nach der Behandlung) festgestellt.
Um die oben angegebenen Wirkungen von LAK-Zellen und rIL-2 in der Immuntherapie gegen Tumor weiter zu verbessern und praktikabel zu machen, sind aber zusätzliche Massnahmen noch sehr wichtig.
Die hier behandelte Erfindung betrifft daher ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK-Zellen). Innerhalb des Prozesses, in dem Mononucleo-Zellen von peripherem Blut kultiviert werden, um eine Zellpopulation, die gegenüber frischen Tumorzellen toxisch ist, zu erhalten, besteht die erfinderische Verbesserung darin, die Mononucleo-Zellen bzw. die Lymphozyten aus dem peripheren Blut vorerst mit einem Niederalkylester einer L-Aminosäure oder dessen HCl-Salz in Kontakt zu bringen; die genannte L-Aminosäure ist dabei ausgewählt aus der Gruppe Alanin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin, Phenylalanin, Prolin, Tyrosin, Tryptophan und Valin, sowie Mischungen davon. Anschliessend werden die so vorbehandelten Zellen kultiviert. Die Erfindung schafft auch eine verbesserte pharmazeutische Zusammensetzung, welche u.a. die gemäss dem genannten Verfahren erhaltenen LAK-Zellen enthält, wobei die letzteren in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger dispergiert sind, und die gegen Tumorerkrankungen wirksam sind, wenn sie zusammen mit Interleukin-2 verabreicht werden. Ebenso umfasst die Erfindung die Verwendung der genannten pharmazeutischen Zusammensetzung zur Tumor-Immunotherapie zwecks Rückbildung des Tumors.
"Interleukin-2 (IL-2)" steht hier für Human-Interleukin-2, ein Glykoprotein mit einem MG von etwa 15'000 Daltons, bestehend aus einem 133-Aminosäuren-Polypeptid mit einer einzigen Disulfid- Brücke. Der Begriff umfasst natürliches und rekombinantes IL-2 (rIL-2) sowie biologisch funktionelle Aequivalente davon. "Biologisch funktionelle Aequivalente" sind Polypeptide mit gleichen oder sehr ähnlichen biologischen Aktivitäten, wie beispielsweise mutierte rIL-2 gemäss dem US Patent 4 518 584 und die rIL-2- Proteine mit einem Methionin anstelle des terminalen NH&sub2;-Alanin im nativen IL-2. Der Inhalt des US Patentes 4 518 584 hinsichtlich mutierter rIL-2 ist als Teil auch dieser Beschreibung zu betrachten. Diese mutierten Verbindungen haben anstelle des an der Position 125 des nativen Human-IL-2 sich befindenden Cystein entweder gar nichts oder eine neutrale Aminosäure und sie zeigen die biologische Aktivität des normalen Human-IL-2.
Mit "mittels Lymphokin aktivierte Killerzellen (LAK-Zellen)" wird hier diejenige zytotoxische Zellpopulation bezeichnet, die die Fähigkeit zeigt, autologe und NK-resistente Tumorzellen zu lysen. Sie wird üblicherweise durch Kultivierung von Monokern-Zellen aus peripherem Blut zusammen mit Interleukin-2 hergestellt.
"Bestehend im wesentlichen aus" wird hier in dem Sinne verwendet, dass die im Satz genannte(n) Zusammensetzung(en) noch weitere Ingredientien enthalten kann/können, so weit als deren grundsätzlich neue Charakteristiken materiall nicht geändert werden, bzw. deren hohe LAK-Aktivitäten bei hoher Zellkonzentration.
"Lymphozyten aus peripherem Blut" steht für Zellen mit einem Zellkern aus peripherem Blut, aus dem die Monozyten entfernt worden sind.
"Niederalkyl" steht hier für Cl bis C4-Alkyl.
Es ist festgestellt worden, dass die Induktion von LAK-Zellen bei hohen Zellkonzentrationen, z.B. bei 2,5 10&sup6; Zellen/ml, inhibiert wird. Das erfindungsgemässe Verfahren erlaubt nun LAK-Zellinduktion bei 5 bis 10 mal höherer Zellkonzentration, ohne das Gebiet oder den Bereich der LAK-Zellen-Aktivität zu verändern.
Wenn auch - im folgenden - diese Erfindung speziell im Hinblick auf periperes Human-Blut (Monokern-Zellen oder Lymphozyten) beschrieben wird, muss darauf hingewiesen werden, dass die Erfindung auch anwendbar ist auf entsprechende Zellen anderer Säuger. Bevorzugterweise wird die Erfindung aber auf Human-Zellen und zur immuntherapeutischen Behandlung von Menschen angewandt.
Gemäss dem Verfahren dieser Erfindung werden LAK-Zellen hergestellt durch Kontaktierung von Monokern-Zellen aus peripherem Human-Blut (PBM-Zellen) oder von Lymphozyten aus solchem mit einem speziellen Niederalkylester einer Aminosäure oder mit dessen HCl-Salz. Die Kontaktierung wird während mindestens 15 Minuten aufrecht erhalten, bevorzugterweise während 20 bis 40 Min. Die resultierenden Zellen werden anschliessend kultiviert, um zu einer Population von toxischen Zellen zu gelangen, welche frische Tumorzellen zu lysen imstande ist.
Die PBM-Zellen können dabei mittels der Ficoll-Hypaque Dichtegradient-Separation von durch EDTA antikoaguliertem venösem Blut aus gesunden Blutspendern erhalten werden. Die so gewonnenen Zellen werden dann mit einer geeigneten Salzlösung, z.B. mit "Seligman's balanced salt solution (SBSS)" von GIBCO, Grand Island, NY, gewaschen und dann in einem geeigneten Medium resuspendiert, z.B. in "RPMI 1640 medium" von M.A. Bioproducts, Walkerville, MD, versetzt mit 1 mM L-Glutaminlösung, 1 % Penicillin- Streptomycinlösung, 1 % antibiotisch-antimykotischer Lösung, 20 mM HEPES (GIPCO) und 10 % durch Hitze inaktiviertes gepooltes Human-Serum (HIS). Die angegebenen % sind V-%, falls nicht anders spezifiziert. Andere geeignete Medien sind bekannt, siehe dazu auch Rosenberg et al, in The New England J. o. Medicine 313, S. 1485 ff (1985).
Die resuspendierten PBM-Zellen werden dann mit dem Niederalkylester der Aminosäure oder dessen HCl-Salz kontaktiert. Geeignete Ester sind dabei solche von Alanin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin, Phenylalanin, Prolin, Tyrosin, Tryptophan und Valin oder Kombinationen davon. Die bevorzugten Aminosäuren sind Phenylalanin oder Tyrosin, speziell Phenylalanin. Niederalkyle sind Methyl, Aethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl oder t-Butyl; bevorzugterweise ist es Methyl oder Aethyl, speziell Methyl. Die PBM-Zellen können auch in anderen geeigneten Medien resuspendiert werden, beispielsweise in RPMI 1640 ohne Serum. Bevorzugterweise wird das HCl-Salz des Niederalkylesters der L-Aminosäure in RPMI gelöst und der pH-Wert der Lösung vor der Zugabe der Lösung zur PBM-Zellsuspension auf etwa 7,4 eingestellt. Der Niederalkylester der Aminosäure liegt in Konzentrationen zwischen etwa 1 bis etwa 5 mM, bezogen auf das Gesamtvolumen der Zellsuspenion und der Esterlösung, vor. Die Kontaktierung geschieht bevorzugterweise bei Temperaturen zwischen etwa 20 bis etwa 25ºC.
In einer andern Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden die Monozyten von den PBM-Zellen abgetrennt, bevor die Behandlung mit dem Aminosäureester eingeleitet wird. Die genannte Abtrennung kann dabei mittels bekannter Methoden, wie mit Fe-Karbonyl oder Ablaufenlassen der PBM-Zellsuspension über Glasperlen geschehen. Anschliessend werden die erhaltenen Lymphozyten aus dem peripheren Blut so wie oben beschrieben mit einem Niederalkylester der speziellen Aminosäure behandelt.
Falls die PBM-Zellen vor der Entfernung der Monozyten mit den veresterten Aminosäuren behandelt werden, verursacht eben die genannte Behandlung die Entfernung der Monozyten und ergibt die LAK- Zellenaktivität bei höherer Zellkonzentration. Wenn die Entfernung der Monozyten vor der Behandlung mit dem Ester ausgeführt wird, ist es die gleiche Behandlung, welche zur verbesserten Aktivität führt. In der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden die PBM-Zellen ohne vorhergehende Entfernung der Monozyten mit dem L-Aminosäureester in Kontakt gebracht. Gemäss dieser Erfindung wird von "Entfernung der Monozyten" gesprochen, wenn der Restgehalt derselben unter ungefähr 10 % - bezogen auf die Gesamtzahl PMB-Zellen - liegt.
In einer andern Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden die PBM-Zellen vor der Ficoll-Hypaque-Dichtegradiententrennung mit dem genannten Aminosäureester behandelt. Anschliessend können dann das genannte Trennungsverfahren sowie die anderen Verfahrensschritte des erfindungsgemässen Prozesses ausgeführt werden. Die so erhaltenen PMB-Zellen mit verringertem Monozyten-Gehalt werden dann mit eine geeigneten Lösung - etwa mit SBSS - gewaschen und z.B. in cRPMI - 10 % HIS oder in einem andern geeigneten Medium resuspendiert.
Als nächstes wird die Suspension der PBM-Zellen mit verringertem Monozytengehalt (Lymphozyten aus peripherem Blut) während einer Inkubationsperiode von etwa 2 bis 7 Tagen kultiviert, dies bevorzugterweise bei Temperaturen zwischen etwa 35 und 39ºC, speziell bei 37ºC. Die Kultivierung geschieht bevorzugterweise in Anwesenheit von etwa 3 bis 7 V-% CO&sub2;, speziell bei 4 V-% CO&sub2;. Bevorzugterweise werden die Lymphozyten aus peripherem Blut zu Konzentrationen von etwa 2 10&sup5; bis 2 10&sup7; Zellen/ml, speziell bei 5 10&sup6; bis 1 10&sup7; Zellen/ml suspendiert. Die Kultivierung geschieht in einem geeigneten Medium auch ohne IL-2, bevorzugterweise aber in Anwesenheit von IL-2. Wenn Monokern-Zellen oder Lymphozyten aus peripherem Blut erfindungsgemäss mit einem Niederalkylester einer L-Aminosäure behandelt werden, führt die Kultivierung in Anwesenheit von IL-2 zu einer LAK-Aktivität, die vier bis fünf mal höher ist als eine Aktivität, die bei Kultivierung ohne IL-2 erreicht wird. Die erhöhte LAK-Aktivität zeigt sich gegen NK-Zell-resistente und auch gegen auf NL-Zellen reagierende Tumorzellen. Bevorzugterweise liegt dabei die IL-2-Konzentration zwischen etwa 1,5 10² und etwa 1,5 10&sup4; pM, speziell zwischen 1000 und 2000 pM. Bevorzugterweise wird rIL-2 eingesetzt, speziell in Form einer Zusammensetzung aus Wasser, rIL-2 und, gegebenenfalls, einem Polyol. Diese Zusammensetzung zeigt eine spezifische IL-2-Aktivität von mindestens etwa 120'000 Einheiten/mg, d.h. von mindestens 40 % von Jurkat-IL-2. Diese spezielle rIL-2-Zusammensetzung ist beschrieben in der US Patentanmeldung SN 825 133, eingereicht am 31. Januar 1986 und übertragen an E.I.DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY; ihr Inhalt wird als Teil dieser Beschreibung angesehen. Hergestellt wird die genannte rIL-2-Zusammensetzung a) durch Mischen des rIL-2 mit Wasser, um eine Suspension zu erhalten, wobei das rIL-2 vorgängig mittels HP-Flüssigchromatographie gereinigt und dann lyophilisiert wird, und b) durch Halten der Suspension auf Temperaturen zwischen etwa 25ºC und etwa 95ºC während mindestens etwa zwei Stunden. Die Kultivierung kann dann in üblichen Behältnissen, wie T-Kolben, Petrischalen, Clusterschalen und PP-Röhrchen ausgeführt werden.
LAK-Zellen, die mittels des erfindungsgemässen Verfahrens erhalten worden sind, zeigen höhere Aktivitäten als unbehandelte Zellen und auch eine hohe Ausbeute an Lyse-Einheiten. Die LAK-Zellen können in pharmazeutisch akzeptablen Trägermedien, wie Salzlösungen, Salzlösungen mit 5 % normalem Humanserum-Albumin oder Hank's- Lösungen, suspendiert werden, um so eine Zusammensetzung zu erhalten, welche dem Tumorpatienten infundiert werden kann. Der Patient kann dabei gleichzeitig mit rIL-2 behandelt werden, wie dies Rosenberg et al in The New England Journal of Medicine, 313, S. 1485 ff (1985), beschrieben haben. Dabei wird das dem Patienten entnommene Blut einem Leukapherese-Verfahren unterworfen, und die gewonnenen Zellen werden sofort kultiviert, um LAK-Zellen zu erhalten. Diese LAK-Zellen werden dem Patienten innerhalb dreier Tage wieder infundiert. Typischerweise werden dabei 3 bis 14 10¹&sup0; LAK-Zellen in 4 bis 9 Dosen eingegeben. Interleukin-2 wird alle 8 Stunden administriert in Dosen von 10'000, 30'000 oder 100'000 Einheiten pro kg Körpergewicht. Die Gesamtbehandlung mit Leukapherese und Re-Infusion dauert normalerweise zwei Wochen; in der dritten Woche folgt eine Wiederholung. In der infundierten LAK- Zellen-Suspension kann IL-2 enthalten sein. Die vorliegend beschriebene Erfindung kann entsprechend der oben gegebenen, allgemeinen Beschreibung ausgeführt werden: sie ist dadurch jedoch nicht eingeschränkt.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele näher detailliert, wobei die angegebenen Prozente V-% und die gegebenen Temperaturen ºC sind, ausser dort wo es ausdrücklich anders steht.
Die Zytotoxizität wurde mittels des folgenden Verfahrens bestimmt: Wenn nichts anderes angegeben ist, wurde der 4-Stunden &sup5;¹Cr-Freisetzungstest zur Messung der Zytotoxizität von LAK-Zellen gegenüber Tumorzellen angewendet. Tumorzellen wurden, bei Konzentrationen von etwa 2 10&sup6; bis 10 10&sup6; mit 50 µCi an Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; in 0,4 ml mit Tris-Phosphat gepufferter Salzlösung 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Zellen werden dann vier mal gewaschen und zwar mit RPMI 1640 mit 5 oder 10 % fötalem Kälberserum (FCS) und dann entweder in cRPMI - 20 % FCS oder RPMI - 10 % FCS zu 1 10&sup5; Zellen/ml resuspendiert. Die Effektorzellen (= LAK-Zellen) werden zu verschiedenen Konzentrationen suspendiert, und Portionen zu je 0,1 ml werden in runde Mikroliterschalen gegeben. Dazu werden ebenfalls je 0,1 ml der mit &sup5;¹Cr markierten Zielzellen gegeben, worauf fünf Minuten lang bei 200 g zentrifugiert wird. Nun wird vier Stunden lang bei 37ºC inkubiert und wieder zentrifugiert. Den Proben werden dann je 0,1 ml der überstehenden Flüssigkeit entnommen, deren Aktivität dann im -Zähler bestimmt wird.
Die prozentuale Zytotoxizität % Z wird nun anhand der folgenden Formel berechnet:
% Z = experimentell bestimmte cpm* - spontan erfolgende cpm* / Gesamtsumme cpm* - spontane cpm*
cpm: Anzahl gemessene Zerfälle pro Minute
Jede Grösse wird dreifach bestimmt, und das Resultat wird entweder als % Zytotoxizität oder als Lyse-Einheit angegeben. Eine Lyse- Einheit entspricht dabei der Anzahl Tumorzellen multipliziert mit 1 10², welche durch 8 10³ Effektorzellen gelyst worden sind. Die Lyse-Einheiten werden anhand von vorliegenden Kurven berechnet; sie berücksichtigen die gemessene Aktivität bei allen Effektor- zu Ziel-Zellen-Verhältnissen. In einigen Beispielen wird die Lyse- Ausbeute auf der Basis der ursprünglichen PBM-Zellenpopulation berechnet. Der dazu verwendete Zytotoxizitäts-Test ist beschrieben in "Selected Methods in Cellular Immunology", Mishell/Shiigi, Herausgeb., S. 124 ff; W.H.Freeman & Co.,-Verlag, San Francisco (1980).

Beispiel 1

PBM-Zellen wurden mittels des Ficoll-Hypaque-Trennverfahrens von durch EDTA-anticoaguliertem venösem Blut von zwei gesunden Spendern erhalten. Die Zellen, welche 25 % Monozyten enthielten, wurden drei mal mit SBSS gewaschen und dann resuspendiert im RPMI 1640-Trägermedium, welches versetzt war mit 1 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % einer antibiotisch-antimykotischen Lösung, 20 mM HEPES und 10 % HIS. Die PBM-Zellen wurden anschliessend aufgeteilt und zu 5 10&sup6; Zellen/ml in serumlosem RMPI 1640 suspendiert. So wurden die Zellen zusammen mit verschiedenen Gehalten an Methylester von L-Phenylalanin oder an Methylester von L-Leucin (Vergleich) 40 Minuten lang in konischen 50-ml-PP-Röhrchen bei Raumtemperatur inkubiert; Details siehe die folgende Tabelle 1. Die erhaltenen Lymphozyt-Zellen, welche nun weniger als 2 % Monozyten enthielten, wurden zwei mal mit kaltem SBSS gewaschen und in cRPMI - 10 % HIS resuspendiert.
Diese Lymphozyten wurden nun zusammen mit 1500 pM gereinigtem, natürlichem IL-2 bei einer Konzentration von 5 10&sup6; Zellen/ml vier Tage lang bei 37ºC und unter 4 % CO&sub2; kultiviert. Die LAK-Zellen wurden dann gewonnen und in cRPMI - 20 % FCS (der Firma Sterile Systems, Logan, UT) resuspendiert; so wurden sie dann für die Zytotoxizitäts-Untersuchungen an Raji-Zellen (Burketts-Lymphom) als Zielzellen verwendet. Die Resultate sind ebenfalls in der folgenden Tabelle 1 dargestellt. Unter "Lyse-Einheiten" stehen Mittelwerte für Doppelversuche, in der linken Kolonne solche betreffend Einkern-Zellen, die ursprünglich kultiviert worden waren. "Unbehandelte Zellen" sind Einkern-Zellen, die bei Konzentrationen von 1 10&sup6; Zellen/ml in Anwesenheit von 1500 pM IL-2 kultiviert worden waren. Tabelle 1 Lyse-Einheiten Lyse-Einheiten 1 10&sup6; Einkern-Zellen unbehandelte Zellen

Beispiel 2

PBM-Zellen wurden mittels des Ficoll-Hypaque-Trennverfahrens von durch EDTA-anticoaguliertem venösem Blut von gesunden Spendern erhalten. Die Zellen wurden drei mal mit PBS gewaschen und dann resuspendiert im RPMI 1640-Trägermedium, welches versetzt war mit 1 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % einer antibiotisch-antimykotischen Lösung, 20 mM HEPES und 10 % FCS. Die PBM- Zellen wurden aufgeteilt und zu 1 10&sup7; Zellen/ml resuspendiert in RPMI 1640 - 10 % FCS. So wurden die Zellen nun mit verschiedenen Estern von Aminosäuren in diversen Konzentrationen inkubiert; die Agenzien waren: Methylester des L-Phenylalanins (Phe-OMe), Aethylester des L-Phenylalanins (Phe-OEt), t-Butylester des L-Phenylalanins (Phe-OtBu), Dimethylester der L-Glutaminsäure (Glu-(OMe)&sub2;), Methylester des L-Tyrosins (Tyr-OMe) und Methylester von L-Leucin (Leu-OMe) als Vergleich. Inkubiert wurde in konischen 50-ml-PP- Röhrchen während 40 Minuten bei Raumtemperatur. Die erhaltenen Lymphozyten von peripheren Blut wurden zwei mal mit kaltem RPMI gewaschen und in PPMI - 10 % FCS resuspendiert.
Falls nicht anders angegeben, wurden diese Lymphozyten in einem geeigneten Medium zusammen mit 10 Einheiten/ml rIL-2 bei Konzentrationen zwischen 5 10&sup6; und 1 10&sup7; Zellen/ml vier Tage lang unter 5 % CO&sub2; bei 37ºC kultiviert. Die dermassen gewonnenen LAK-Zellen wurden in RPMI - 10 % FIS resuspendiert und so in Zytotoxizitäts-Untersuchungen gegen Raji-Zellen, K 562-Zellen oder gegen frische Tumorzellen als Zielzellen eingesetzt. Die Resultate der Untersuchungen sind in den folgenden Tabellen 2 und 3 zusammengestellt. Die Aktivität ist die prozentuale Zytotoxizität ± Standardabweichung aus drei Bestimmungen. Das Verhältnis Effektor- zu Ziel-Zellen war 20 : 1. Die Bezeichnung der Zielzellen ist die folgende: Raji-Zellen = (R), K 562-Zellen = (K) und frische Tumorzellen = (F). Eine Einheit an IL-2 wird definiert gemäss Gehmans et al, J. O. Immunological Methods, 74, S. 39 ff, )1984). Tabelle 2 Ester Konz. (mM) Ziel-Zellen Nur Medium % Zytotoxizität rIL-2 Tabelle 3 Ester Ziel-Zellen Nur Medium % Zytotoxizität

Beispiel 3

In einem dem im Beispiel 2 beschriebenen analogen Verfahren wurden PBM-Zellen mit den Methylestern verschiedener L-Aminosäuren behandelt und mit diesen Zytotoxizitäts-Untersuchungen ausgeführt. Die Abkürzungen der neu verwendeten Aminosäuren sind: Tryptophan = Trp, Asparaginsäure = Asp, Cystein = Cys, Valin = Val, Alanin = Ala. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengestellt. Tabelle 4 Ester Konz. (mM) Ziel-Zellen Nur Medium % Zytotoxizität rIL-2 (10 µ/ml)

Claims

1. Verfahren zur Herstellung Lymphokin-aktivierter Killerzellen, wobei periphere einkernige Blutzellen kultiviert werden, um eine Population von Zellen zu ergeben, die cytotoxisch sind für Tumorzellen, welche gegen natürliche Killerzellen resistent sind, umfassend das Zusammenbringen der daraus resultierenden peripheren einkernigen Blutzellen oder peripheren Blut-Lymphocyten mit einem Niederalkyl-Ester einer L-Aminosäure oder dessen Hydrochlorid-Salz, wobei die L-Aminosäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alanin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin, Phenylalanin, Prolin, Tyrosin, Tryptophan und Valin oder einer Mischung aus irgendwelchen der vorgenannten, und anschließendes Kultivieren der resultierenden Zellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die peripheren einkernigen Blutzellen menschliche Zellen sind.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 2, wobei das Zusammenbringen über einen Zeitraum von wenigstens 15 min erfolgt, vorzugsweise von etwa 20 min bis etwa 40 min.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Hydrochlorid-Salz des Niederalkylaminosäureesters in einer Konzentration von etwa 1 bis 5 mM eingesetzt wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei die Aminosäure Phenylalanin oder Tyrosin ist.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei die Niederalkyl-Gruppe Methyl, Ethyl oder t-Butyl ist.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei die peripheren einkernigen menschlichen Blutzellen oder die daraus resultierenden peripheren Blut-Lymphocyten in Gegenwart von Interleukin-2 kultiviert werden.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei die peripheren einkernigen menschlichen Blutzellen oder peripheren Blut-Lymphocyten in Abwesenheit von Interleukin-2 kultiviert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die peripheren Blut- Lymphocyten mit dein Hydrochlorid-Salz des Niederalkylaminosäureesters zusammengebracht werden.

10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die peripheren einkernigen menschlichen Blutzellen mit dem Hydrochlorid- Salz des Niederalkylaminosäureesters zusammengebracht werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die durch das Zusammenbringen mit dem Niederalkylaminosäureester erhaltenen peripheren Blut-Lymphocyten gewaschen und resuspendiert werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die resuspendierten peripheren Blut-Lymphocyten 2-7 Tage lang in Gegenwart von rekombinantem Interleukin-2 bei einer Konzentration von etwa 150 pM bis 15 000 pM kultiviert werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Konzentration an rekombinantem Interleukin-2 etwa 1000 pM bis etwa 2000 pM beträgt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Konzentration an peripheren Blut-Lymphocyten etwa 1 10&sup6; Zellen/ml bis etwa 1 10&sup8; Zellen/ml beträgt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Aminosäure Phenylalanin oder Tyrosin ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Niederalkyl-Gruppe Methyl oder Ethyl ist.

17. Zusammensetzung, im wesentlichen bestehend aus isolierten, Lymphokin-aktivierten Killerzellen, hergestellt gemäß den Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei sich die Zellen in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger befinden und gegenüber einem Tumor reaktiv sind, wenn sie mit Interleukin-2 einem Menschen verabreicht werden, der von dem Tumor befallen ist.