DE69532557T2

DE69532557T2 - Zubereitung enthaltend Glykane übereinstimmend mit Transferrin Glykaner als aktives Prinzip für die Induktion der Immuntoleranz gegen Antigene

Info

Publication number: DE69532557T2
Application number: DE69532557T
Authority: DE
Inventors: Walter Pierpaoli; Gonzague S. Kistler
Original assignee: Cellena (Cell Engineering) AG
Current assignee: Cellena (Cell Engineering) AG
Priority date: 1995-07-20
Filing date: 1995-07-20
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2015-07-21
Also published as: EP0754459A1; EP0754459B1; WO1997003680A1; AU715022B2; CA2226879A1; DE69532557D1; US6299878B1; JPH11511186A; ATE259235T1; AU6733896A

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Zubereitungen, insbesondere pharmazeutischen Zubereitungen, die einen oder mehrere Wirkstoffe enthalten, die imstande sind, die Immunreaktionen eines Wirtes gegen allogene oder xenogene Zellen, Gewebe oder Organe oder die Immunreaktion von immunkompetenten Zellen gegen einen immuninkompetenten oder immunsupprimierten Wirt zu kontrollieren, insbesondere jene Immunreaktionen, die an der sogenannten Wirt-gegen-Transplant-Reaktion (host versus-graft reaction, HvGR) und der sogenannten Transplant-gegen-Wirt-Reaktion (graft versus-host reaction, GvHR) oder Transplant-gegen-Wirt-Erkrankung (graft versus-host disease, GvHD) beteiligt sind, wie auch Immunreaktionen, die bei Knochenmarktransplantation (bone marrow transplantation, BMT) eine Rolle spielen, d. h. wenn der Wirt mit allogen- oder xenogen-inkompatiblem Knochenmark transplantiert wird.
Eine Reihe von Untersuchungen in Bezug auf die Knochenmarktransplantations-Promoteraktivität von Knochenmark-abgeleiteten Faktoren sind 1978 durch einen der Erfinder eingeleitet worden (Pierpaoli W. et al, Transplantation 1978; 26: 456–458) und (Pierpaoli W. et al, J. Clin. and Lab. Immunol. 1985; 16: 115–124). Die anfängliche Beobachtung bestand darin, dass der Überstand einer Lösung, in der Knochenmarkzellen suspendiert worden waren (Knochenmarküberstand, bone marrow supernatant: BM-SN), eine verstärkte Transplantationsaktivität ergab (Pierpaoli W. et al, Cell Immunol 1980; 52: 62–72). Dies deutete auf das Vorliegen von Faktoren hin, die imstande waren, die Fähigkeit von Knochenmark, das in einen bestrahlten Wirt transplantiert werden soll, zur Induktion von permanentem allogenen oder xenogenen Chimärismus zu modifizieren.
In einer umfangreichen Serie von Experimenten konnte ferner gezeigt werden, dass Fraktionen mit hohem Molekulargewicht, die durch Ultrafiltration durch poröse Membranen von dem nativen BM-SN, abgeleitet von Kaninchenmark, erhalten worden waren, Knochenmark-regulierende Faktoren (marrow-regulating factors, MRF) enthielten, die imstande waren, die gleiche Wirkung auszuüben, d. h. die Induktion von hämopoietischem Chimärismus durch die H-2 Barriere in dem murinen Model (Pierpaoli W. et al, Cell Immunol 1981; 57: 219–228). Jedoch waren die erhaltenen Resultate nicht reproduzierbar, zumindest nicht quantitativ; es trat eine deutliche Schwankung in den Ergebnissen auf und die Häufigkeit einer Sekundärerkrankung war hoch. Ferner konnte die Induktion des Chimärismus nicht in allen getesteten murinen H-2-Kombinationen erzielt werden (Pierpaoli W. et al, J. Lab. Clin. Immunol 1985; 16: 115–124).
In der europäischen Patentanmeldung Nr. EP 89 403 103.8 /0 426 924 (Pierpaoli W. et al, Cell Immunol 1981; 57: 219–228 und Pierpaoli W. et al, J Lab Clin Immunol 1985; 16: 115–124) ist berichtet worden, dass eine bestimmte Komponente aus Kaninchenknochenmark-abgeleiteten Fraktionen, insbesondere Transferrin, für die erleichterte allogene und xenogene Knochenmarktransplantation verantwortlich sein könnte, die zuvor mit von Kaninchen und Rind abgeleiteten Knochenmarkfraktionen erzielt worden war. Die Behandlung von letal-bestrahlten C57BL/6-Mäusen, die mit Knochenmark aus BALB/c-Spendern transplantiert worden waren, mit Eisen-gesättigtem humanen Transferrin oder Conalbumin führte zu einer bemerkenswert stabilen Transplantation, der Vermeidung von GvHD und anhaltendem Chimärismus in der Großzahl der Versuchstiere (Pierpaoli W. et al, Cell. Immunol 1991; 134: 225–234).
Die Transferrine als solche sind intensiv untersucht worden. Sie bestehen aus Einzelkettenproteinen mit zwei Bindungsstellen, die imstande sind, Metalle zu binden. Sie sind in physiologischen Fluiden und Zellen von Vertebraten weit verbreitet.
Jedes Transferrinmolekül besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette, mit einem Molekulargewicht in dem Bereich von 76.000–81.000, die zwei ähnliche, aber nicht identische Eisenbindungsstellen aufweist. Humanes Serumtransferrin enthält etwa 5% Kohlenhydrate, die an dem Protein in zwei identischen und nahezu symmetrischen verzweigten Heterosaccharidketten gebunden sind. Es weist ein Molekulargewicht von etwa 80.000 auf. 1 mg des Eisen-gesättigten Proteins enthält etwa 1,4 mg Eisen.
Die vollständige Aminosäuresequenz von humanen Plasmatransferrin ist vor kurzem von wenigstens 3 Arbeitsgruppen aufgestellt worden, indem CNBr-Spaltung (CNBr-cleavage, CNBr) und komplementäre DNS (cDNS)-Methoden verwendet wurden (MacGillivray, R. T. A., et al „The complete amino acid sequence of human serum transferrin". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2504–2508, 1982 und Uzan, G. et al, "Molecular cloning and sequence analysis of cDNA for human transferrin. Biochem. Biophys. res. Commun. 119: 273–281, 1984 und Yang, F. et al, "Human transferrin: cDNA characterization and chromosomal localization". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2752–2756, 1984). Es besteht aus 678 Aminosäureresten, die zusammen mit den zwei N-gebundenen Oligosaccharidketten ein berechnetes Molekulargewicht von 79.570 aufweisen (bei dem 6% durch den glucosidischen Bestandteil beigetragen wird: MacGillivray, R. T. A, et al und Uzan G. et al, "Molekular cloning and sequence analysis of cDNA for human transferrin". Biochem. Biophys. Res. Commun. 119: 273–281, 1984). Williams J. ("The evolution of transferrin", Trends Biochem. Sci. 7: 394–397, 1982) hat auf die Bedeutung von Sulfhydrylgruppen bei der Stabilisierung der meisten Bindungsstellen hingewiesen und hat deren Evolutionsentwicklung hin zu den 17 in humanen Transferrinen gefundenen Disulfiden aufgespürt.
Für einen allgemeinen Überblick über den Status des Fachwissens über Transferrine kann auf die allgemeine Veröffentlichung mit dem Titel „The Physiology of Transferrin and Transferrin Receptors" von Helmut A. Huebbers und Clement A. Finch in Physiological Reviews, vol. 67, Nr. 2, April 1987 verwiesen werden. Diese Veröffentlichung beschreibt auch Verfahren, um Transferrine zu erhalten. Insbesondere ist in dieser Veröffentlichung das Transferrin menschlichen Ursprungs in einem biologisch reinen Zustand beschrieben worden. Die bevorzugten Reinigungsverfahren basieren auf physicochemischen Trennungsschritten, gefolgt durch eine selektive Fixierung auf Matrix-gebundenem Antikörper oder Matrix-gebundenem Rezeptor.
Das gereinigte, Eisen-gesättigte Transferrin in einem im Wesentlichen biologisch reinen Zustand ist im Wesentlichen frei von Serumalbuminproteinen.
Während die vorstehend angesprochene Fähigkeit von Eisen-gesättigten humanen Transferrin, letal bestrahlte C5713L/6-Mäuseempfänger zu schützen, die mit Knochenmark von BALB/c-Mäusespendern transplantiert worden waren, nachgewiesen worden ist, war die Transplantationspromotoraktivität von humanem Transferrin in weiteren H-2-inkompatiblen murinen Kombinationen nicht in allen Fällen erfolgreich.
Humanes Transferrin induzierte keine Immuntoleranz in C57BL/6-Mäusen, die mit Knochenmark von C3H/He-Spendern transplantiert worden waren. Weitere Arbeiten führten dazu, dass der Erfinder in Betracht zog, dass fördernde (promoting) Wirkungen von Transferrin eher in Abhängigkeit der verwendeten histogenen H-2-Typkombinationen variierten, wobei der fördernde Effekt maximal war bei C57BL/6-Mäusen (H-^2b), die mit BALB/c (H-2^d) Knochenmark transplantiert worden waren, und nicht vorhanden war in C57BL/6-Mäusen, die mit C3H/HE (H-2^k) Knochenmark transplantiert worden waren (Pierpaoli W. Nat. Immun. 1992; 11: 356–365).
Es scheint daher, dass die Fähigkeit von Plasma-abgeleiteten Transferrinen (Tf), die Transplantation von allogenem oder xenogenem Knochenmark in letal bestrahlte Mäuse tiefgreifend zu beeinflussen, und einen fortwährenden Chimärismus zu produzieren, wenigstens zu einem gewissen Ausmaß von Matching der Transferrine des Spenders und der Zell- und Gewebeantigene in dem immunsupprimierten und transplantierten Wirt abhängt. In der Tat wird eine Induktion eines dauerhaften Zustands von immunologischer Nichtantwort oder „Toleranz" und folglich eine Erleichterung der Transplantation von xenogenen oder allogenen Antigenen, z. B. Knochenmark, von Spendern in bestrahlte oder chemisch immunsupprimierte Empfänger, die mit Transferrinen eines gleichen Spenders behandelt worden sind, erhalten, wenn diesen Empfängern simultan oder sequentiell die Transferrine und Antigene des Spenders verabreicht worden sind. Eine zeitliche genau abgestimmte Präsentation von sowohl Transferrin als auch den Antigenen, beispielsweise humanes Transferrin und humane Leukozyten in immunsupprimierten Mäusen während der anfänglichen Erholung der Immungeweben und -zellen führt später zu deren Unfähigkeit, humane Spenderlymphozyten zu „erkennen" und eine Immunantwort vom unmittelbaren Typ oder einem verzögerten Typ gegen die Antigene des entsprechenden humanen Spenders aufzubauen. Dieser „tolerante" Zustand der Empfängermäuse ist durch die Abwesenheit von cytotoxischen Antikörpern in den Seren der „toleranten" Maus gegen die Lymphozyten des humanen Spenders, durch die Unfähigkeit von „toleranten" Mäusen, eine Zell-vermittelte Immunreaktion in vivo gegen Leukozyten des humanen Spenders aufzubauen, und schließlich durch einen in vitro Reaktivitätsmangel von Splenozyten der „toleranten" Maus gegenüber bestrahlten Lymphozyten des humanen Spenders bestätigt worden. Zusammenfassend: Transferrine, die vom Blutplasma des Spenders abgeleitet sind, weisen die bemerkenswerte Fähigkeit auf, einen Zustand von dauerhafter Nichtantwort in einem immunsupprimierten Empfängerwirt zu induzieren, dem Antigene des gleichen Spenders im Laufe der Regenerierung von Stammzellen und immunkompetenten Zellen im Knochenmark und den lymphatischen Organen verabreicht worden waren.
Es scheint, dass Transferrin ein Hauptbestandteil der Selbsterkennungs- und des Immunmechanismen darstellt und dass es an der Entwicklung und Beibehaltung der Selbsttoleranz während der Ontogenese und dem Erwachsensein beteiligt ist. Dies könnte möglicherweise wenigstens zum Teil den genetischen Polymorphismus und die Heterogenität von humanen Serumtransferrinen erklären, möglicherweise die „Immunpersönlichkeit" eines menschlichen Individuums imitierend: siehe den Artikel mit der Überschrift „The Biology of transferrin" von de Jong G., Dijk J. P. und Van Ejk, H. C. Clinica Chimica ACTA, 1990, 1–46, Vol. 190.
Die letzte Clinica Chimica Acta Publikation ist auch als eine Bezugnahme auf die Definition von Transferrinen, wie sie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen eingesetzt wird, zu verstehen. Dieser Begriff ist weit auszulegen. Alle Moleküle werden als Transferrine erachtet, die, wie in diesem Artikel beschrieben, jener Klasse von Verbindungen angehören, die als ganze als Transferrine bezeichnet werden. Sie umfassen die sogenannten Apo-Transferrine, gesättigte Transferrine, Ferro-Transferrine usw.
Während das vorstehend genannte Verfahren geeignet erscheint, um einen sicheren, spezifischen und schnellen Zustand in einem Empfängerwirt für eine rasche Transplantation von histoinkompatiblen Zellen oder Geweben eines Spenderwirts zu ergeben und selbst einer Anpassung an unterschiedliche Arten, und auch an den Menschen, in einer großen Vielfalt von Pathologien zugänglich ist, ist dessen Anwendung unter vielen praktischen Umständen nicht so einfach, insbesondere wenn solch ein Verfahren immer notwendigerweise eine Identität zwischen dem Spender der Transferrine und dem Spender der Antigene, die in den Empfängerwirt transplantiert werden sollen, umfasst.
Der Befund, dass eine effiziente Induktion von Immuntoleranz in einem Empfängerwirt in Hinblick auf Antigene, z. B. Knochenmark oder Organe von allogenen oder xenogener Natur, auch erzielt werden kann, indem Mischungen von Transferrinen eingesetzt werden, die von einer beschränkten Anzahl von Spendern der gleichen Art wie jene der zu transplantierenden Antigene (z. B. Menschen, wenn der bestimmte Spender ein Mensch ist, Ferkel, wenn der Spender ein Ferkel ist usw.) erhalten worden sind, war von daher sehr bemerkenswert. Beispielsweise kann in Mäusen eine Induktion einer Immuntoleranz gegen Antigene eines humanen Spenders erzielt werden, indem die Mäuse mit humanen Transferrinen behandelt werden, die aus Plasmamischungen erhalten worden sind, welche aus dem Pool von Plasmas stammen, die von einer beschränkten Anzahl von Individuen erhalten worden waren. Mit anderen Worten: Es scheint, dass die Transferrine, die von gepoolten Plasmas – wie sie in der Industrie angewendet werden, die sich mit der Extraktion von bestimmten Blutfaktoren aus solchen gepoolten Plasmas befasst – erhalten worden sind, genug phenotypische Information enthielten, die erforderlich ist, um in Mäusen eine spezifische Toleranz gegen die Antigene der meisten, wenn nicht sogar aller humanen Spendern sicherzustellen.
Folglich können Mischungen oder „Pools" von Transferrinen (im Folgenden als „gepoolte Transferrine" oder p-Tf bezeichnet) von einer beschränkten Anzahl von Spendern erhalten werden, die ausreichen, um zu ermöglichen, dass diese Mischungen oder Pools genug phenotypische Information enthalten, die erforderlich ist, um eine Induktion und Toleranz in einem bestimmten immungeschwächten Empfängerwirt, der mit Antigenen eines bestimmten Spenderwirts transplantiert worden ist, sicherzustellen, nachdem dem Empfängerwirt eine Menge von solchen gepoolten Transferrinen verabreicht worden ist.
Es scheint daher, dass die kumulierte phenotypische Information, die von den Individuen gesammelt worden ist, welche die gepoolten Transferrine bereitgestellt haben, ausreicht, um eine spezifische Immuntoleranz in verschiedenen Empfängerwirten der gleichen Art zu induzieren, als ob die gepoolten Transferrine auch die Transferrine des bestimmten Spenders der zu transplantierenden Antigene enthalten hätten, unabhängig davon, ob dieses Individuum zu der Gruppe von Individuen gehörte, deren Plasmas – oder Transferrine – gepoolt worden waren, oder ob nicht.
Bevorzugt werden die gepoolten Transferrine von humanen Plasmapools erhalten, die in der Blutprodukt-Industrie hergestellt werden. Solche Plasmapools stammen oft von einigen 100 bis einigen 1.000 Spendern ab. Bevorzugt ergeben sich diese Transferrine aus dem Reinigungsprodukt, das aus dem Blut von wenigstens 1.000 Spendern erhalten worden ist. Folglich sind Transferrinpools leicht zugänglich. Und heutzutage bestehen selbstverständlich gepoolte Transferrine aus Hämoderivaten, von denen angenommen wird, dass die keine therapeutischen oder klinischen Anwendungen aufweisen. Sie werden im Wesentlichen entsorgt.
Obwohl bisher eigentlich keine Beziehung zwischen der genetischen Diversität von Transferrinen und dem hauptimmunogenem Komplex (major histocompatibility complex, MHC)-System im Menschen aufgestellt worden ist, kann nichts desto trotz die serologische Detektion und Bestätigung des Vorliegens einer genügenden Anzahl von den dominanten und relevanten HLA daraus gestützt werden, ob die Plasmapools, von denen die entsprechenden gepoolten Transferrine erhalten werden sollen, aus einer genügenden Anzahl von Spendern stammen. Beispielsweise sollte ein bevorzugter Anfangsplasmapool wenigstens 4 serologisch bestimmbare Antigene von jeder der sogenannten HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D und HLA-DR Serien enthalten. Es wird beispielsweise auf die 3.1, Seite 70 des Buchs mit dem Titel „Medical Immunology", herausgegeben 1979 durch James Irvine, Teviot Scientific Publications, Ediburgh, Great Britain, Bezug genommen werden.
Es wurde nun gefunden, dass die Immuntoleranz-induzierenden Eigenschaften von Transferrinen tatsächlich in deren Glykanbestandteilen konzentriert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft folglich insbesondere eine biologische Zubereitung, deren Wirkstoff aus einem oder mehreren Transferrin-abgeleiteten Glykanen ohne Transferrin-Polypeptid-Teilen besteht, wobei der Wirkstoff genug phenotypische Information umfasst, die benötigt wird, um eine Toleranzinduktion in einem bestimmten immungeschwächten Empfängerwirt sicherzustellen, dem diese biologische Zubereitung verabreicht worden ist und der mit Antigenen eines bestimmten Spenderwirts transplantiert worden ist.
Die bevorzugten Transferringlykane sind jene, die von der gleichen Säugerart wie der Spender abstammen oder erhältlich sind.
Der Ausdruck „Transferringlykane", wie er im Rahmen der vorliegenden Patentoffenbarung verwendet wird, erstreckt sich auf alle Glykane, die ein im Wesentlichen gleiches Profil wie jene, die direkt von den Transferrinen erhalten werden, aufweisen, nachweisbar durch jede der analytischen Methoden, auf die Bezug genommen wird in „Tools for Glycobiology", 1994 durch das Unternehmen herausgegeben, das auch als Oxford GlycoSystems bekannt ist, von dem Unternehmen selbst in den USA erhältlich, d. h. Oxford GlycoSystems, Inc., Cross Island Plaza, 133-33 Brookville Boulevard, Rosedale, NY 11422, USA., oder von dem europäischen Zweig, i. e. Oxford GlycoSystems Ltd., Hitching Court, Blacklands Way, Abingdon, OX14 1RG, UK.
Die Transferrin-Glykane als solche sind intensiv untersucht worden: es wird nichtbeschränkend auf allgemeine Veröffentlichungen verwiesen, die diese beschreiben, z. B. die Veröffentlichung mit dem Titel „Comparative study of the primary structures of sero-, lacto- and ovotransferrin glykans from different species" von Geneviève Spik et al, in Biochimie 70 (1988) 1459–1469, die Transferringlykane beschreibt, die von verschiedenen Säugerarten erhalten worden sind.
Als Glycoproteine enthalten alle Transferrine menschlichen oder tierischen Ursprungs Kohlenhydrate in Mengen, die zwischen 2 und 12% variieren. Es wurde festgestellt, dass humanes Serumtransferrin eine Mikroheterogenität auf der Grundlage des Vorliegens von bi- und triantennären Glykanen auf dem N-Acetyl-lactosamin-Typ aufweist. Es konnten drei Kohlenhydratmolekülvarianten von Transferrinen unterschieden werden: Tf-I (weniger als 1%) enthielt zwei triantennäre Glykane, Tf-II (unge fähr 17%) mit einem triantennären und einem biantennären Glykan und Tf-III (ungefähr 82%), das zwei biantennäre Glykane enthielt. Man fand heraus, dass sich die relativen Anteile dieser Varianten bei Frauen im letzten Trimester der Schwangerschaft verändern, wobei die Varianten I und II im Gegensatz zur Variante III, die auf etwa 67% absank, einen Anstieg aufwiesen (siehe Leger et al, auf den im Folgenden Bezug genommen wird). Zusätzlich wurde festgestellt, dass humanes Serumtransferrin zwei Asparaginglycosylierungsstellen in dem C-terminalen Teil der Einzelpolypeptidkette aufweist und dass die Glykane vollständig sialyliert und nicht fucosyliert sind. Ähnlich wie die entsprechenden Transferrine weisen die Glykane, die daraus erhalten werden können, ähnliche Mikroheterogenitäten auf.
Die Detektion der Säugerarten, von denen bestimmte Transferringlykane abstammen, kann durch jeden Fachmann durchgeführt werden, z. B. durch Reaktion dieser Glykane mit zuvor erhaltenen Antikörpersets gegen Glykane eine Anzahl von unterschiedlichen Säugerarten, darunter jene Arten, von der die untersuchten Glykane wahrscheinlich abstammen. Ohne darauf beschränkt zu werden kann auf einen Verfahrenstyp zurückgegriffen werden, wie er in der Veröffentlichung mit dem Titel „Physiological significance of the marked increased branching of the glykans of human serotransferrin during pregnancy" von Didier Lèger et al in Biochem. J., 257: 231–238 (1989) (gedruckt in Großbritannien) offenbart ist.
So können z. B. Transferringlykane, die von einem Menschen erhalten worden sind, mittels einer immunologischen Reaktion mit Antikörpern, die spezifisch gegen humane Glykane sind – oder sogar gegen die entsprechenden humanen Transferrine – und anschließend mit Meerrettich-peroxidase-konjugierten (horse-radish-peroxidase-conjugated) zweiten Antikörpern, die gegen tgl6 gezüchtet wurden, detektiert werden, in Übereinstimmung mit Towbin et al (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 1175–1179 und Burnette et al (1981) Anal. Biochem. 112: 195–203.
Für den gleichen Zweck können natürlich andere Arten von Reaktionen in Betracht gezogen werden, z. B. durch Vergleichsanalyse des elektrophoretischen Verhaltens der untersuchten Glykane und Standards, die von Transferrinen selbst erhalten werden, aus verschiedenen Säugerarten.
Eine bevorzugte Zubereitung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst Glykane, die von Transferrinen erhalten werden, die auch von dem Spender der in den Empfängerwirt zu transplantierenden Antigenen erhalten worden sind. Diese Glykane können von diesem Transferrin durch jede der wohlbekannten Verfahren erhalten werden, welche zur Entfernung der Polypeptidbestandteile und Rückgewinnung der entsprechenden Glykane anwendbar sind, z. B. ein Verfahren der Hydrazinolyse, wie in der Veröffentlichung von S. Takasaki et al mit dem Titel „Hydrazinolysis of Asparagine-Linked Sugar Chains to Produce Free Oligosaccharides in „Methods of Enzymology (1982) Vol. 83: 263–268, oder in der Veröffentlichung von T. Patel et al, mit dem Titel „Use of Hydrazine to Release in Intact and Unreduced Form both N- and O-Linked Oligosaccharides from Glycoproteins" in Biochemistry (1993) 32: 679–693 offenbart; oder durch enzymatische Spaltung in Gegenwart von einer Neuramididase- oder einer Endoglycosidaseaktivität, wie jene, die durch Flavobacterium meningosepticum produziert wird, beschrieben von J. H. Elder et al, (1982) in der Veröffentlichung mit dem Titel „Endo-β-Acetylglucosaminidase F: Endoglycosidase from Flavobacterium meningosepticum that cleaves both high-mannose and complex glycoproteins" in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 79: 4540–4544, August 1982, oder in Gegenwart von dem Endo-β-N-acetylglucosaminidase F (Endo F) oder Peptid: N-Glycosidase F (PNGase F), ebenfalls erhältlich aus den Kulturen von Flavobacterium meningosepticum, wie von A. L. Tarentino et al in der Veröffentlichung mit dem Titel „Deglycosylation of Asparagine-Linked Glykans by Peptide:N-Glycosidase F" offenbart.
Es kann auch auf die in „Tools for glycobiology" supra allgemein offenbarten Techniken Bezug genommen werden.
Wie in dem Fall der Transferrine umfassen bevorzugte biologisch wirksame Zubereitungen jedoch gepoolte Transferrin-abgeleitete Glykane, die von einer Anzahl an Spendern erhalten worden sind, die ausreichen, damit die gepoolten Transferrin-abgeleiteten Glykane alle phenotypische Information enthält, die benötigt wird, um eine Induktion einer immunspezifischen Toleranz gegen Antigene eines bestimmten allogenen oder xenogenen Spenders in einem immungeschwächten Empfängerwirt sicherzustellen, der mit diesen Antigenen transplantiert worden ist, nachdem diesem Wirt eine Menge solcher gepoolten Transferrin-abgeleiteten Glykane verabreicht worden ist, die wirksam diese immunspezifische Toleranz induziert.
Gepoolte Transferrin-abgeleitete Glykane menschlichen Ursprungs können von Transferrinen erhalten werden, die selbst auf dem Markt erhältlich sind: siehe „Tools for Glycobiology", bereits erwähnt. Humane Transferrin-abgeleitete Glykane, die im Wesentlichen frei sind von Transferrinpolypeptidbestandteilen, sind z. B. bei Oxford Clyco Systems, Inc. erhältlich.
Wie bei den Transferrinen stellt die serologische Detektion einer ausreichenden Menge der dominanten HLA-Antigene nichts desto trotz ein geeignetes Verifizierungssystem dafür dar, ob die Plasmapools, aus denen die entsprechenden gepoolten Glykane erhalten werden sollen, von einer genügenden Anzahl von Spendern abstammen. Ein bevorzugter Anfangsplasmapool sollte beispielsweise wenigstens 4 serologisch stimmbare Antigene von jeder der sogenannten HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D und HLA-DR Serien enthalten.
Es ist ferner anzuerkennen, dass, wie in der folgenden Beschreibung noch ausführlich dargelegt, die Ergebnisse – z. B. jene, die in der folgenden Beschreibung dargestellt sind –, die mit Transferrin-abgeleiteten Glykanen erhalten werden, die auch von dem Spender der Antigene abstammen, eine große Hilfe bei der Bestimmung des Tauglichkeitsgrads von gepoolten Transferrin-abgeleiteten Glykanen darstellen, um eine ähnliche Induktion der Immuntoleranz gegen die Antigene zu erzielen, die in einen Empfängerwirt transplantiert werden. Je ähnlicher die in dem gleichen experimentellen Protokoll mit den gepoolten Glykanen erzielten Ergebnisse zu den mit von dem Antigenspender abgeleiteten Glykanen erzielten Ergebnisse sind, desto besser ist das „phenotypische Matching" der gepoolten Glykane mit dem Organismus des Spenders.
Es ist ferner offensichtlich, dass je größer die Zahl von Fällen ist, in denen eine bestimmte Zusammensetzung, die gepoolte Glykane enthält, eine Induktion der Immuntoleranz in Empfängern gegen Antigene von verschiedenen Spendern so effizient liefert wie die Immuntoleranzen, die in den gleichen Empfängern durch die entsprechenden „individuellen Glykane" induziert werden, die durch die gleichen Empfänger bereitgestellt werden, desto größer ist die „Universalität" der gepoolten Glykane dieser biologischen Zubereitung. Diese „Universalität" sollte umso größer sein, wenn die gepoolten Glykane auch von einer größeren Anzahl von Personen abstammen. Dies wird dann durch eine ähnliche Fähigkeit der gepoolten Transferringlykane zur Induktion der im Wesentlichen gleichen Wirkungen oder Wirkungen gleicher Größenordnung in den Empfängern in ähnlichen Testprotokollen reflektiert, die vergleichbar ist mit jenen, die in den Empfängern durch die „individuellen Glykane" erzielt werden, die gleichfalls von den jeweiligen Spendern der in einen Empfänger zu transplantierenden Antigene erhältlich sind. Die genannten Wirkungen sind beispielsweise jene, die ausführlich in den folgenden Beispielen beschrieben werden, d. h. die Unfähigkeit, die Spenderlymphozyten zu „erkennen" und eine Immunantwort vom unmittelbaren Typ oder verzögerten Typ gegen die Antigene dieses Spenders aufzubauen, eine Abwesendheit von cytotoxischen Antikörpern in dem „toleran ten" Serum des Empfängers gegen die Lymphozyten des Spenders, eine Unfähigkeit des „toleranten" Empfängers, eine Zell-vermittelte Immunreaktion in vivo gegen die Leukozyten des Spenders aufzubauen, ein in vitro Mangel der Reaktivität der Splenozyten des „toleranten" Empfängers gegen bestrahlte Lymphozyten des Spenders, usw.
Es ist ferner zu würdigen, dass die Bezeichnung „Transferringlykane", d. h. Glykane, die im Wesentlichen frei sind von Transferrinpeptidbestandteilen, auch Teile dieser Glykane umfassen, d. h. Glykane, die frei sind von einem Teil oder allen der antennären Glykanketten, wenn sie mehrere dieser Ketten beinhalten, oder partiell desialylierte Ketten, oder eine dieser antennären Glykanketten, entweder in der sialylierten oder teilweise desialylierten Form, natürlich unter der Maßgabe, dass die so modifizierten Glykane oder Glykanteile nicht die Fähigkeit verlieren, die Immuntoleranzwirkungen der nichtmodifizierten Glykane zu induzieren, was beispielsweise mittels der in den Beispielen offenbarten Assay-Verfahren untersucht werden kann.
Die Erfindung betrifft ferner die Kombination der gepoolten Transferrin-abgeleiteten Glykane und wenigstens einem immunsuppressiven Arzneimittel, z. B. Prednisolon, Cyclophosphamid, Cyclosporin, FK-506 oder Methotrexat, besonders die Verwendung in einem humanen Wirt in der geeigneten Verabreichungssequenz, um in dem Wirt eine Immuntoleranz gegen allogene oder xenogene Antigene, die in diesen Wirt transplantiert werden sollen, zu induzieren.
Wie im Folgenden gezeigt werden wird, kann die Immunschwächung durch Verabreichung eines immunsuppressiven Arzneimittels, beispielsweise Cyclosporin, Prednisolon, Cyclophosphamid, usw. an den Wirt oder durch Bestrahlung des Wirts erzielt werden.
Es wurde festgestellt, dass bei Tieren die vollständige Zerstörung des Immunsystems des Empfängerwirts, der einer Knochenmarktransplantation unterworfen wird, nicht erforderlich sein muss. Die Verwendung von chemischen Immunsuppressiva, in Kombination mit den gepoolten Transferrin-abgeleiteten Glykanen, der geeigneten Verabreichungssequenz, wie sie im Folgenden besprochen wird, kann folglich einer letalen Bestrahlung vorzuziehen sein. Bei Leukämiepatienten, die bereits einer immunsuppressiven Chemotherapie, allogener oder xenogener Knochenmarktransplantation unterworfen werden, benötigen gegebenenfalls nicht einmal mehr eine zusätzliche Verabreichung eines immunsuppressiven Arzneimittels, in Kombination mit der Verabreichung der gepoolten Transferrin-abgeleiteten Glykane und der Transplanta tion von Knochenmarkzellen. Eine teilweise oder vollständige Körperbestrahlung, wie sie zuvor bei den Transplantationsprotokollen des Anmelders in seinen früheren Veröffentlichungen oder Patenten vorgeschlagen wurde, muss nicht länger notwendig sein.
Nach Verabreichung der geeigneten gepoolten Transferringlykane kann die Transplantation von Knochenmark durch die Transplantation von allogenen oder xenogenen Vorläuferzellen des peripheren Bluts ersetzt werden, die aus dem Knochenmark des Spenders in das periphere Blut durch Verabreichung von Cytokinen wie beispielsweise dem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (granulozyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) oder Multipotenz-CSF (multipotential-CFS, Interleukin-3) mobilisiert und durch Leukaphorese unter Verwendung eines Zellseparatorsystems gesammelt werden.
Im Falle von einer Organtransplantation können die Antigene des Spenders, die anfangs dem Empfängerwirt in Kombination mit den geeigneten Transferringlykanen vor der Transplantation des Organs selbst transplantiert werden, aus dem „buffy coat" oder aus Leukozyten aus dem peripheren Blut des Spenders nach Zentrifugation bestehen, die Granulozyten und Lymphozyten mit HLA-spezifischen Antigenmarkern des individuellen Spenders enthalten. Wie bei der Knochenmarktransplantation kann der „buffy coat" des Spenders ebenfalls durch allogene oder xenogene Vorläuferzellen des peripheren Bluts ersetzt werden, die wie beschrieben in das periphere Blut mobilisiert und gesammelt werden. Besonders bevorzugt wird diese Präsentation der Antigene nach einer chemischen Immunsuppression am Tiefpunkt der Suppression des Immunsystems vor dem Beginn des endogenen Wiederaufbaus vorgenommen. Das Stadium der Immunsuppression kann mittels der Zählung der Leukozyten in dem peripheren Blut bewertet werden. Anscheinend werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn die Verabreichung von Transferringlykanen und die Anfangspräsentation von Antigenen des Spenders gerade am Anfang des endogenen Wiederaufbaus des Immunsystems, der der chemischen Immunsuppression folgt, stattfinden. Die frühe Präsentation von Transferringlykanen (Spender-Typ oder Pool) zusammen mit Antigenen (z. B. am Tag 3 in dem Mausmodel der im folgenden dargestellten 1) wird in diesem Mensch-zu-Maus-Model eine Toleranz induzieren. Folglich umfassen wesentliche Elemente dieser Erfindung die Verabreichung von Transferringlykanen (Spender-Typ oder Pool) und die zeitgerechte Injektion von spezifischen Spenderantigenen, die möglicherweise eine Selektion oder Deletion von immunreaktiven Zellen und somit eine spezifische Immuntoleranz induzieren, sowohl in dem allogenen als auch in dem xenogenen Ansatz.
Die gleichen Betrachtungen gelten natürlich auch für weitere Arten von Antigenen. Selbstverständlich müssen das Timing und die Verabreichungssequenz in jedem Fall untersucht werden. Das zu transplantierende Organ sollte nicht zu spät nach der Immunsuppression und der anfänglichen Präsentation von Transferringlykanen und Antigenen verabreicht werden, insbesondere wenn die antigenreaktiven Zellen bereits wieder durch den Organismus des Empfängerwirts produziert worden sind. In solch einem Fall kann der Organismus des Empfängerwirts nicht mehr tolerant werden.
Die Erfindung ist nicht auf humane gepoolte Transferrin-abgeleitete Glykane beschränkt, insbesondere für die vorstehend genannten Anwendungen. Sie erstreckt sich auch auf gepoolte Transferrin-abgeleitete Glykane tierischen Ursprungs, insbesondere für eine Anwendung in Kombination mit der Transplantation, selbst im Menschen, von xenogenen Zellen, Geweben oder Organen, die von der gleichen Tierart wie die gepoolten Transferrine erhalten worden sind.
[A] Herstellung von Transferrin (Tf)
Ein Pool von humanem Plasma (ca. 1.000 Spender), Eisen-gesättigt mit Fe³⁺ gemäß Bates G. W. et al, J. Biol. Chem. 1973, 248: 3228–32, wird in Phosphatpuffer verdünnt und über Hohlfasern diafiltriert, cut-off 30.000, um einen Überschluss von Fe³⁺ zu entfernen, über eine Nacht bei 4°C gelagert und durch 0,45 μm sterilen Membranen filtriert. Das Reinigungsverfahren besteht aus zwei chromatographischen Schritten auf Ionenaustauschern, wobei Puffer mit geeigneter Ionenstärke und pH eingesetzt werden, um selektiv Verunreinigung wie z. B. Albumin und Immunglobuline zu entfernen, und um Tf mit einer Reinheit > 95% zu eluieren. Nach einer Diafiltration zur Wiederherstellung der physiologischen Salzbedingungen wird die Lösung von Apo- oder Eisen-gesättigten Tf gefriergetrocknet.
Die Extraktionsverfahren für Transferrine sind wohlbekannt. Auf einige davon wird in dem früheren Patent des Anmelders EP 0426924 oder in der bereits vorstehend angegebenen Clinica Chemica Acta Publikation Bezug genommen.
Humane gepoolte Transferrine können beispielsweise wie im folgenden offenbart erhalten werden.
[B] Herstellung von Transferrin-abgeleiteten Glykanen
Die Glykane werden aus dem humanen Tf-Pool (ca. 1.000 Spender) isoliert, mittels der Hydrazinolysemethode, die wie in der Publikation von S. Takasaki et al, auf die vorstehend Bezug genommen worden ist, beschrieben ausgeführt wird. 1 mg Tf-Pool enthält ungefähr 20 μg Glykane. In allen im Folgenden angegebenen Beispielen wurden die Glykane mit einer Dosis von 5 μg/Maus i. p. eingesetzt, was einem Glykangehalt in der üblichen Dosis von Tf (200 μm/Maus) in früheren Experimenten entspricht.
[C] Induktion der Transplantationstoleranz
Die experimentellen Protokolle, die eingesetzt worden sind, werden im folgenden kurz in Erinnerung gerufen, bevor sie im folgenden näher ausgeführt werden.
Als Immunsuppressiva wurden Prednisolon (Pr) und Cyclophosphamid (Cy) ausgewählt; deren jeweilige Dosierungen wurden in unterschiedlichen Mausstämmen in Abhängigkeit der Veränderungen der immunologischen Parameter eingestellt. Bei Verwendung dieses Models wurden die ersten Anzeichen der Toleranz-induzierenden Wirksamkeit von Tf-Glykanen in Vorstudien zur Immunantwort von Mäusen auf humane Erythrozyten festgestellt. Es wurde gefunden, dass eine Behandlung mit humanen Tf-Glykan in immunsupprimierten und antigen-behandelten Mäusen die primäre und die sekundäre Immunantwort gegen humane rote Blutzellen (human red blood cells, HRBC) inhibiert (Tabellen 2A und 2B).
Da die Histokompatibilitätsantigene vorwiegend auf Leukozyten präsentiert werden, war es wichtig zu wissen, ob die Tf-Glykan-Behandlung eine Spender-spezifische Transplantationstoleranz in Mäusen induzieren kann, die mit peripherem Blut „buffy coat" Leukozyten injiziert worden waren. Die Aufhebung einer Zell-vermittelten Immunantwort gegen die Tf-Glykan-Spendergewebeantigene konnte in der Tat mit dem Kniekehlenlymphknotenassay in chemisch immunsupprimierten Mäusen nachgewiesen werden, die mit Tf-Glykan des Spenders behandelt worden waren.
Auch die Abwesenheit von Spender-spezifischer Antikörper- und komplementvermittelter Cytotoxizität von Mäuseserum gegen humane Lymphozyten in chemisch immunsupprimierten Mäusen, die mit humanen einzelnen Tf-Glykanen oder gepoolten Tf-Glykanen behandelt worden waren, konnte durch den Ausschlussassay mit Trypanblau bestätigt werden (Tabellen 6A und 6B).
Aus den in der vorliegenden Beschreibung vorgestellten Daten kann entnommen werden, dass auch die Verabreichung von Glykanen aus einem humanen Plasmapool, kombiniert mit einer genau getimten Präsentation von einzelnen spezifischen Zellantigenen (Leukozyten), den Zustand der immunologischen Toleranz erzeugen kann. Neben der Toleranz-induzierenden Eigenschaften weisen humane gepoolte Tf-Glykane auch eine bemerkenswerte immunprotektive Wirkung auf, indem sie eine Thymusinvolution und eine Lymphopenie verhindern und die Überlebensrate von chemisch immunsupprimierten Mäusen steigern.
Das vorstehend angeführte Mensch-zu-Maus-Model und die Ergebnisse deuten auf einen klaren Toleranz-induzierenden Effekt von humanen Glykanen durch sequenzielle und/oder kombinierte Verabreichung von gepoolten Tf-Glykanen und Zellantigenen hin. Einzelne Tf-Glykane allein sind nicht immunsuppressiv und sind unfähig, eine Toleranz gegen humane Antigene in der Maus zu erzeugen.
Die aus den offenbarten Modellen abgeleiteten Folgerungen sind offensichtlich. Solch ein Transplantationssystem sollte auf größere Säuger und auf den Menschen übertragbar sein. Des Weiteren verdient das Verständnis des Mechanismus, nach dem Transferrin-abgeleitete Glykane aus Plasmapools eine Toleranz erzeugen, sicherlich intensive Untersuchungen in Hinblick auf eine mögliche Anpassung des Models für eine Reihe von pathologischen Bedingungen wie z. B. Krebs, Autoimmunerkrankung, Immunschwäche-Erkrankungen (z. B. AIDS), genetische Effekte oder Diabetes.
Im folgenden wird die Beschreibung ohne irgendeine beschränkende Absicht weiter ausgeführt, z. B. unter Bezug auf 1, die eine Abbildung des „Mensch-zu-Maus-Models" des Anmelders für die Induktion einer spezifischen Transplantationstoleranz darstellt.
Im Laufe der Beschreibung wurden die folgenden Abkürzungen verwendet.
Abkürzungen

Ag = Antigen
BM = Knochenmark (bone marrow)
BMT = Knochenmarktransplantation (bone marrow transplantation)
Con A = Concanavalin A
Cy = Cyclophosphamid
HRBC = humane rote Blutzellen (human red blood cells)
HAS = humanes Serumalbumin
IS = Immunsuppression
i. p. = intraperitoneal
MTT = (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrasoliumbromid
OD = optische Dichte
PLNT = Kniekehlenlymphknotentest (popliteal lymph node test)
Pr = Prednisolonacetat
Tf = Transferrin
Tf-Glykane = Glykane, die von Transferrinen erhalten werden

Materialien und Methoden
Tiere. Erwachsene Inzucht, 3–8 Monate alt, männliche oder weibliche C57BL/6 oder BalB/c-Mäuse wurden in unseren Tierunterkünften unter üblichen Bedingungen gehalten. Die Mäuse erhielten Wasser und Futter ad libitum und die Raumtemperatur betrug 21–22°C.
Immunsuppressive Arzneimittel für die Immunsuppression (IS). Prednisolonacetat (Pr) wurde von FLUKA Inc., Buchs, Schweiz, bezogen. Es wurde einmal i. p. als eine 1 : 10 Ethanolwassersuspension unmittelbar nach der Herstellung injiziert. Cyclophosphamid (Cy) wurde von FLUKA bezogen und kurz vor der i. p.-Injektion in Wasser gelöst. Die Dosierungen und der Injektionsplan waren wie in den einzelnen Experimenten angegeben.
Herstellung und Reinigung von Transferrin (Tf). Eisensulphat und Nitrilotriessigsäure (Reinheit 99,5%), verwendet für die Herstellung von Eisen-Nitrilotriacetat, waren von SIGMA. Natriumhydrogencarbonat wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Die für die Puffer verwendeten Salze wurden von Carlo Erba (Mailand, Italien, pharmazeutische Qualität) bezogen. Die Diafiltration und Konzentrationen wurden in einen Tangentialfließsystem durchgeführt, mit Ultrafiltrationsmembranen mit einem cut-off = 30.000. DEAE-Sepharose und CM-Sepharose wurden von Pharmacia (Uppsala, Schweden) bezogen. Das chromatographische System basierte auf präparativen Chromatographiesäulen, die mit einer peristaltischen Pumpe P1, einem UV-Monitor und Rekorder von Pharmacia verbunden waren. Die Virusinaktivierung wurde in einem thermostatisch-kontrollierten Wasserbad durchgeführt. Gesamtproteine wurden mittels der Methode von Lowry et al gegen den Standard von bovinem Serumalbumin gemessen (Pierce, Amsterdam, Niederlande). Antigenprotein wurde mittels radialer Immundiffusion mit Nor-Partigen Tf und Serumproteinstandard von Behring (Marburg, Deutschland) bestimmt. Die Agarosegelelektrophorese wurde mit einem Helena-Millipor (Milford, USA) 625 LC Chromatographen durchgeführt; die Bedingungen waren wie folgt: Säule TSK3000SW (75 mm × 600 mm); Fließgeschwindigkeit 0,8 ml/Min; mobile Phase Phosphat 0,05 M, Natriumchlorid 0,15 M, Na N3 0,05%, pH 7; UV-Detektor Merck-Hitachi L-4200 (Wellenlänge 280 nm); Integrator-Rekorder Perkin Elmer LCl-100 (Norwolk, USA). Das Reinigungsverfahren war wie folgt: Das Plasma wurde anfangs mit Eisen durch Addition von Natriumhydrogencarbonat und Eisen-nitrilotriacetat (ferric-nitrilotriacetat, FENTA) gemäß Bates & Schlabach gesättigt. Das Plasma wurde anschließend verdünnt und vor der Beladung auf eine Säule mit DEAE-Sepharose gegen einen Phosphatpuffer 10 mM diafiltriert. Die Säule wurde mit Phosphatpuffer 50 mM eluiert, wobei eine Tf-Fraktion erhalten wurde, die mit Immunglobulinen verunreinigt war. Diese Fraktion wurde gegen Phosphatpuffer mit einem anderen pH diafiltriert und auf eine Säule mit CM-Sepharose geladen. Der Durchfluss war eine Tf-Fraktion mit a ≥ 95% Reinheit. Die Tf-Lösung wurde konzentriert und mit einem Pasteurisierungsschritt bei 60°C für 10 Stunden in Gegenwart von geeigneten Stabilisierungsmitteln virusinaktiviert. Nach Diafiltration zur Eliminierung der Stabilisierungsmittel, die für Wärmebehandlung zugefügt worden waren, wurde das Tf-Konzentrat steril filtriert, in Röhrchen aufgeteilt, gefriergetrocknet und bei 4°C gelagert. Das bei diesem Reinigungsverfahren erhaltene Tf war Apo-Tf. Um Eisen-Tf zu erhalten, wurde ein zusätzlicher Sättungsschritt mit Eisen-nitrilotriacetat und einer Diafiltration zur Eliminierung der freien Eisenionen angewendet. Die akzeptablen Endotoxinwerte in den Tf-Präparationen lagen unter 0,7 ng/mg (Limulus Assay).
a) Arzneimittel-induzierte Immunsuppression und Evaluierung von deren Wirksamkeit und Dauer
Die unserem Model zugrunde liegende Grundidee bestand darin, dass die Präsentation von Tf oder Tf-Glykanen von einem Spender einer anderen Art oder eines anderen Stammes in einem Zustand von vollständiger oder sehr starker Dezimierung von reifen Immunozyten vor oder am Anfang des endogenen Wiederaufbaus oder der Repopulation von Immunzellen-produzierenden Organen (z. B. dem Thymus oder dem Knochenmark) stattfinden muss, kombiniert mit der Präsentation von Spender-Antigenen und Tf-matched oder Tf-Glykan-matched Antigenen im Laufe der Regenerierung und Reifung von Immunozyten in dem BM und den thymolymphatischen Geweben (siehe 1: das „leere-Maus"-Model). Wir dachten, dass die Verabreichung von Tf oder Tf-Glykanen zur Zeit und nach der Immunisierung weitergeführt werden muss, bis alle mutmaßlichen antigenreaktiven Zellen zu einem Stadium herangereift sind, das zu einer spezifischen Toleranz oder zu einer areaktiven Nichtantwort führt. Zu diesem Zweck wurden anfänglich zahlreiche Experimente mit Mäusen durchgeführt, um die geeigneteste Art für die immunsuppressive Behandlung und den Injektionsplan zu finden, die eine dauerhafte und tiefgreifende cytolytische und cytotoxische Wirkung auf thymische und BM-Zellpopulationen aufweisen würden und folglich eine temporäre Aufhebung der Antikörperproduktion und der Zell-vermittelten Immunreaktionen ergeben würden. Es wurden mehrere Arzneimittel einzeln oder als Mischungen auf ihre Fähigkeit hin untersucht, eine temporäre, jedoch tiefgreifende Immunschwächung zu ergeben wie z. B. Busulphan, Azathioprin, Cyclosporin, Methotrexat, Cyclophosphamid, Prednisolon. Am Ende unserer Langzeitstudien wurde eine Kombination von Prednisolonacetat (Pr) und Cyclophosphamid (Cy) ausgewählt, die eine tiefgreifende und dauerhafte Immunsuppression (IS) für zwei bis drei Wochen ohne schwere Nebenwirkungen und erhöhte Mortalität ergab. Wie der Tabelle 1 entnommen werden kann, führt die IS mit einer Kombination von Pr und Cy zu einer fast vollständigen BM-Zellendepletion am Tag 3 und 4 des Experiments. Diese Depletion wurde verlängert, wenn die Mäuse 200 mg/kg Cy erhielten. In diesem Fall begann der Wiederaufbau am Tag 5 (Tabelle 1). Es kann auch festgestellt werden, dass die IS eine drastische Verminderung der Leukozyten des peripheren Bluts erzeugte, die am Tag 4 und Tag 5 des Experiments am niedrigsten waren.
b) Wirkungen von den Tf-Glykanen auf die Antikörperproduktion gegen humane Zellantigene in IS-Mäusen
Dem in der 1 dargestelltem Schlussmodel gingen im Laufe der 4 Jahre viele Experimente und Versuche voraus. Um das vorliegend angewendete Model für die Induktion von xeno-Toleranz (Mensch-zu-Maus) zu entwickeln, wurden humane Tf-Glykane eingesetzt.
Die folgenden Assays, die zum Ziel haben, die Wirkung von Tf-Glykanen auf die sekundäre Immunantwort von Mäusen auf humane rote Blutrellen zu bestimmen (auch aus dem Spender erhalten, dessen „buffy coat" Leukozyten für die Immunisierung verwendet wurden), wurden in chemisch immunsupprimierten Mäusen durchgeführt.
Balb/c-Mäuse wurden chemisch immunsupprimiert durch Injektion mit 90 mg/kg Prednisolon (Pr) und 100 mg/kg Cyclophosphamid (Cy) i. p. am Tag 0. Am Tag 1 wurde wiederum 100 mg/kg Cy i. p. injiziert. Die immunsupprimierten Mäuse wurden täglich i. p. vom Tag 3 bis Tag 9 und vom Tag 16 bis Tag 18 mit 200 mg Tf-pool injiziert, gereinigt aus humanem Blutplasmapool in 0,5 ml (Gruppe 2), oder mit 5 μg Tf-Glykanen injiziert, gereinigt aus humanem Tf-pool (Gruppe 3), oder erhielten 0,5 ml Salzlösung i. p. (Gruppe 4). Alle Mäuse, einschließlich der Nicht-IS-Gruppe 1, wurden zweimal i. p. mit humanen Antigenen immunisiert, d. h. 1,0 × 10⁶ humanen peripherem Blut „buffy coat" Leukozyten in 0,3 ml am Tag 3 und am Tag 16. Die Blutentnahme wurde am Tag 31 des Experiments durchgeführt, die Serumproben wurden gesammelt und bei –70°C bis zum Assay gelagert.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2A und 2B im folgenden angegeben. TABELLEN 2A und 2B TABELLE 2A INDUKTION VON SPENDERSPEZIFISCHER TOLERANZ MIT GLYKANEN WIRKUNG VON GLYKANEN AUF DIE SEKUNDÄRE IMMUNANTWORT GEGEN HUMANE ROTE BLUTZELLEN (HRBC)° IN CHEMISCH IMMUNSUPPRIMIERTEN MÄUSEN. (Exp. 36, Tag 31)

IS: Immunsuppression;
Tf: Transferrin;
n: Anzahl Mäuse pro Gruppe;

IS: Immunsuppression;
Tf: Transferrin;
n: Anzahl Mäuse pro Gruppe;

Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Injektion von Tf-Glykanen aus humanem Plasmapool in IS-Mäuse zu einer deutlich anhaltenden Nichtantwort oder einem deutlichen Abfall der Produktion von Antikörpern gegen zufällig ausgewählte Spender von humanen peripheren Blutzellen-Antigenen in den meisten Mäusen führte. Es kann festgestellt werden (Tabellen 2A und 2B), dass die Injektion von lebensfähigen humanen peripheren Blutrellen in die mit IS und humanen Tf-Glykanen behandelten Mäuse in einer anhaltenden Inhibierung der Immunantwort gegen humane Antigene resultierte. Es konnte kein Abbruch oder anhaltende Verminderung der Antikörperantwort festgestellt werden, wenn die mit IS und humanen Antigenen immunisierten Mäuse im Laufe des Wiederaufbaus des Immunsystems nach der IS mit Salzlösungen injiziert worden waren.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass diese Vorbefunde nur dazu dienten, festzustellen, dass die Präsentation von sowohl humanem Tf als auch humanen Transferrin-Glykanen aus Plasmapool und individuell-spezifischen humanen Zellantigenen in dem IS-murinem Wirt zu einer dauerhaften Unfähigkeit der meisten Mäuse führte, eine normale Immunantwort gegen humane Antigene aufzubauen.
c) Humane Tf-Glykane allein üben in Mäusen keine immunsuppressive Wirkung aus
Wiederholte Injektionen von humanem Glykanen in Mäuse beeinträchtigten oder verminderten nicht deren primäre oder sekundäre (Gedächtnis) Antwort gegen humane Erythrozyten und es konnte keine Wirkung auf die Anzahl peripherer Blutleukozyten und auf die Hypersensitivitätsantwort vom verzögerten Typ (Oxazolontest) festgestellt werden. Die humanen Tf-Glykane selbst üben keine immunsuppressive Aktivität in Mäusen aus (die Daten werden in der vorliegenden Beschreibung nicht vorgelegt).
Die Abwesenheit von direkten immunsuppressiven Wirkungen, die durch Tf-Glykan induziert werden, wie auch deren Unfähigkeit, sowohl die Antikörperantwort als auch die Zell-vermittelte Immunität in normalen Mäusen zu beeinträchtigen, werden durch die in den folgenden Tabellen 3 und 4 dargestellten Ergebnisse reflektiert, als ein Ergebnis der Assays, die wie folgt ausgeführt wurden.
10% humane Erythrozyten in 0,2 ml i. p. am Tag 3 und Tag 9.
Balb/c-Mäuse (3 Tiere/Gruppe) wird täglich intraperitoneal (i. p.) für 10 Tage mit 5 μg Glykanen in 0,5 ml (Gruppe 1) injiziert. Gruppe 2 wurde analog mit Salzlösung injiziert, während Gruppe 3 nicht behandelt wurde. Am Tag 3 und wiederum am Tag 9 wurden alle Mäuse mit 10% humane Erythrozytensuspension in 0,2 ml immunisiert.
Die Blutentnahme wurde am Tag 9 und am Tag 14 des Experiments durchgeführt. Die primäre und sekundäre Immunantwort wurden gemessen, indem der direkte Hämagglutination-Assay verwendet wurde.
Aus den in Tabelle 4 dargestellten Ergebnissen geht hervor, dass die Glykane aus Transferrin keine immunsuppressiven Wirkungen aufweisen und die Antikörperantwort in Mäusen nicht beeinträchtigen.
Die Wirkungen von Glykanen auf die primäre und sekundäre Immunantwort (IR) gegen humane rote Blutzellen (HRBC) in normalen Mäusen wurde nach dem folgenden Protokoll untersucht.
HRBC – 10% humane Erythrozyten in 0,2 ml i. p. am Tag 3 und am Tag 9. Balb/c-Mäuse (3 Tiere/Gruppe) wurden täglich intraperitoneal (i. p.) für 10 Tage mit 5 μg Glykanen in 0,5 ml (Gruppe 1) injiziert. Gruppe 2 wurde analog mit Salzlösung injiziert, während Gruppe 3 nicht behandelt wurde. Am Tag 3 und wiederum am Tag 9 wurden alle Mäuse mit 10% humane Erythrozytensuspension in 0,2 ml immunisiert.
TABELLE 3 Wirkungen von Glykanen auf die primäre und sekundäre Immunantwort (IR) gegen humane rote Blutzellen (HRBC) in normalen Mäusen
Ähnliche Ergebnisse treten in Tabelle 4 auf, die zeigt, dass Glykane, die aus einzelnen Transferrinchargen stammen und Glykane aus humanem Transferrin-pool weder immunsuppressive Wirkungen aufweisen noch die Zell-vermittelte Immunität in normalen Mäusen beeinträchtigen.
Weitere Assays, d. h. der Assay mit gemischter Lymphozytenkultur (mixed lymphocytes culture, MTT assay) und der Trypanblau-Ausschluss-Assay (Trypan blue exclusion) zur Messung von Komplement-vermittelter Cytolyse wie auch die erhaltenen Ergebnisse werden im folgenden dargestellt. Als erstes werden die allgemeinen Verfahren erklärt.
Gemischte Lymphozytenkultur (mixed lymphocyte culture, MTT assay)
a) Kulturmedium
Milzzellen aus den experimentellen Mäusen wurden in einem Medium mit der folgenden Zusammensetzung kultiviert: 50% RPMI 1640 (SIGMA); 30% Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (Dulbecco's modification of Eagle's medium, DMEM, Seromed, Berlin, Deutschland); 10% Iscove's modifiziertes Dulbecco's Medium (Iscove's modification of Dulbecco's medium, IMDM, Seromed); 10% fetales Kalbsserum (fetal calf serum, FCS, Seromed); 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (SIGMA); 29 μM 2-Mercaptoethanol (FLUKA).
b) Isolierung von Mäusesplenozyten
Die Mäuse wurden durch Zervixdisclokation getötet, die Milzen wurden unter aseptischen Bedingungen entfernt und im RPMI 1640 Medium eingetaucht. Jede Milz aus den experimentellen Mäusen wurde separat in einem Potterglas mit einem Teflonstößel zerfasert und die Splenozytensuspensionen aus den verschiedenen Mäusen wurden in dem Kulturmedium hergestellt. Die Erythrozyten wurden mittels einem osmotischen Schock eliminiert: die Splenozytensuspension wurde zu dem gleichen Volumen von bidestilliertem Wasser zugegeben. Nach 5 Minuten wurde die Mischung mit dem Kulturmedium, das die doppelte NaCl-Konzentration enthielt, verdünnt. Nach Zentrifugation (1.500 UpM, 10 Min., Raumtemperatur) wurde der Überstand entfernt und die Zellen wurden wieder in dem Kulturmedium suspendiert, mit einer Endkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml. Diese Suspension wurde auf 96-Wellplatten mit flachem Boden verteilt (Falcon, Oxnard, USA) mit 100 μl (2 × 10⁵ Zellen) pro Well.
c) Isolierung von humanen Ziel-Lymphozyten, Ziel-Zellbestrahlung und Herstellung der Proben
Humane Lymphozyten aus heparinisiertem Blut von individuellen Spendern wurden durch Dichte-Gradientenzentrifugation (2.000 UpM für 20 Min. bei Raumtemperatur) isoliert, indem ein Accuspin-System Hisopaque 1077 (SIGMA) verwendet wurde. Nach Zentrifugation wurde der Überstand entfernt, die Zellen wurden dreimal mit dem Kulturmedium gewaschen und in diesem Medium in einer Endkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert. Die humanen Lymphozyten wie auch ein Teil der Mäusesplenozyten wurden mit einer Gesamtdosis von 2.500 Rad mittels einer Gammacell 3000 Elaninstallation (Nordion Intern. Inc., Kanada) bestrahlt. Die bestrahlten Zellen wurden zu den Mäusesplenozyten in einem 100 μl Volumen (2 × 10⁵ Zellen/Well) zugegeben. Der finale Kulturwell enthielt 2 × 10⁵ Mäusesplenozyten und 2 × 10⁵ bestrahlte Zellen (humane Lymphozyten oder Mäusesplenozyten) in einem Volumen von 200 μl.
Die folgenden Zellkombinationen wurden für die gemischten Lymphozytenkultur verwendet: A – Splenozyten aus den experimentellen Mäusen (antwortende Zellen, responding cells); A* – bestrahlte Mäusesplenozyten aus intakten Mäusen des gleichen Stamms, Geschlechts und Alters; B* – bestrahlte humane Lymphozyten (stimulierende Zellen). Die folgenden Kombinationen sind umfasst: 1. A + B* (Stimulation von Mäusesplenozyten durch humane Antigene); 2. A + A* (Hintergrund oder nichtspezifische Aktivität); 3. A + ConA (Fähigkeit der Mäusesplenozyten zur Antwort). In dem letzteren Fall wurden 10 μl (10 μl/ml) ConA (Sigma) zu jedem Well zugegeben, der A-Zellen enthielt, so dass das Endvolumen dieser Kombination 110 μl pro Well betrug. A + B und A + A*-Kombinationen wurden in 4–5 parallelen Wells für jede individuelle Zellmischungssuspension untersucht, die A + ConA-Kombination wurde in 2 parallelen Wells für jede Splenozytensuspension bewertet.
Die Zellkombinationen wurden in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ – 95% Luft bei 37°C für 5 Tage gehalten. Am Tag 2 der Kultur wurden 100 μl Medium aus allen Wells außer der (A + ConA)-Kombination entfernt, und 100 μl frisches Kulturmedium wurde zu allen Wells gegeben.
Der MTT-Assay
Dieser Assay hängt von der zellulären Reduktion von MTT in ein blaues Formazanprodukt durch die mitochondriale Dehydrogenase von lebensfähigen Zellen ab, wobei das blaue Formazanprodukt spektrophotometrisch gemessen werden kann.
Der MTT-Assay wurde nach Mossman mit einigen Modifikationen durchgeführt. MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrasoliumbromid) (SIGMA) wurde in Phenolrot-freiem RPMI 1640 (SIGMA) in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml (MTT Stammlösung) gelöst, durch einen 0,22 μm-Filter filtriert und am gleichen Tag eingesetzt. Nach 5 Tagen Kultur wurde das Medium von den Platten durch Absaugen entfernt und ein 100 μl Aliquot der MTT Stammlösung wurde zu jedem Well in den Assayplatten zugegeben, die anschließend für weitere 4 Stunden bei 37°C in dem CO₂-Inkubator inkubiert wurden. Anschließend wurde der Überstand aus den Wells durch Absaugen entfernt. Säure-Isopropanol (100 μl von 0,04 N HCl in Isopropanol) wurde zu allen Wells gegeben und kräftig vermischt, um die dunkelblauen Kristalle zu lösen. Zehn bis fünfzehn Minuten später wurden die Platten mit einem Microelisa Reader (SRAT automatic, 90139, Österreich) abgelesen, wobei eine Testwellenlänge von 570 nm und eine Referenzwellenlänge von 690 nm verwendet wurden.
Die optische Dichte (OD) der A + B* -Kombination entspricht der Intensität von zwei Komponenten: Hindergrundsaktivität von Mäusesplenozyten und deren proliferative Reaktion gegen humane Antigene, während die OD der A + A* -Kombination die Hintergrundsaktivität der untersuchten Mäusesplenozyten darstellt. Der Unterschied zwischen OD_A+B und OD_A+A* wurde als die eigentliche Reaktion von Mäusesplenozyten gegen humane Antigene angesehen. Um die Ergebnisse von ähnlichen Experimenten zu kombinieren, wurde die Größenordnung dieser Reaktion in Prozent angegeben. Der Mittelwert der Reaktion in nicht-immunsupprimierten und immunisierten Mäusen wurde auf 100% gesetzt.
Trypanblau-Ausschluss-Assay zur Messung von Komplement-vermittelter Cytolyse
Die Lymphozyten wurden aus heparinisiertem Blut von humanem Spender isoliert, wobei ein Accuspin System Histopaque 1077 (SIGMA, St. Louis, USA) eingesetzt wurde. Die Zellen wurden dreimal mit isotoner Salzlösung gewaschen und in einer Konzentration von 4–6 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert. Proben von Mäuseserum (wärmeinaktiviert bei 56°C für 30 Min.) wurden in 25 μl Volumen zubereitet. Ein gleiches Volumen der humanen Lymphozytensuspension wurden zu jedem Röhrchen gegeben und die Mischung wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde 50 μl Kaninchenkomplement (rabbit complement, Rabbit NLA-ABC, SIGMA) zu jeder Probe gegeben, und die Inkubierung wurde für 10 Min. bei 37°C ausgeführt. Es wurden Kontrollen hergestellt, wobei normales Mausserum oder Salzlösung verwendet wurden, um sicherzustellen, dass das Komplement nicht toxisch ist. Nach der Zentrifugation (2.000 UpM für 5 Minuten) wurde die Überstandsflüssigkeit aus jedem Röhrchen entfernt, wodurch der Zellpellet am Boden übrig blieb und die Röhrchen wurden auf Eis gelegt. Vor dem Ablesen wurde zu jedem Röhrchen 25 μl Trypanblau-Lösung (SIGMA) gegeben und der Anteil an angefärbten (nicht-lebensfähigen) Zellen wurde gezählt.
Gemischte Lymphozytenkultur (mixed lymphocyte culture, MTT assay)
Die im Zusammenhang mit diesem Assay angegebenen Daten zeigen, dass die kombinierte Verabreichung von einem humanen Tf-Glykan-pool und, als Antigen, individuellen humanen Leukozyten an die IS-Mäuse eine tiefgreifende oder vollständige Areaktivität der Effektor-Mäusemilzlymphozyten gegen die Ziellymphozyten aus dem humanen Spender induzierte. In der Tat sind die in vitro Aktivierungswerte mit jenen von normalen, nicht-IS und nicht-immunisierten Mäusen vergleichbar.
Die Bedingungen, unter denen die Assays durchgeführt wurden (die Legende folgt) und die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5A dargestellt.
Legende zu Tabelle 5A. Gemischte Lymphozytenkultur (mixed lymphoc es culture MTT assay) am Tag 65 des Experiments
Balb/c-Mäuse wurden chemisch immunsupprimiert durch Injektion von 90 mg/kg Prednisolon (Pr) und 100 mg/kg Cyclophosphamid (Cy) i. p. am Tag 0. Am Tag 1 wurden 100 mg/kg Cy wiederum i. p. injiziert. Die immunsupprimierten Mäuse wurden täglich i. p. von Tag 3 bis Tag 9 und von Tag 16 bis Tag 18 mit 200 μg Tf-pool injiziert, gereinigt aus humanem Tf-pool in 0,5 ml (Gruppe 1), oder mit 5 μg Glykanen injiziert, gereinigt aus humanem Tf-pool (Gruppe 2), oder erhielten 0,5 ml Salzlösung i. p. (Gruppe 3). Alle Mäuse einschließlich der nicht-IS-Gruppe 4 wurden zweimal i. p. mit humanen Antigenen immunisiert, d. h. mit 1 × 10⁶ humanen peripherem Blut „buffy coat" Leukozyten in 0,3 ml am Tag 3 und am Tag 16. Die Mäuse wurden am Tag 65 des Experiments getötet und die Reaktion der gemischten Lymphozytenkultur von Mäusesplenozyten gegen humane Lymphozyten (von dem gleichen Spender, dessen „buffy coat" Leukozyten für die Immunisierung eingesetzt worden waren) wurde durchgeführt und mittels dem MTT-Assay untersucht (siehe gemischte Lymphozytenkultur, MTT assay). Tabelle 5A Induktion von Transplantationstoleranz mit Tf-pool und Glykanen Gemischte Lymphozytenkulturreaktion (MTT-Test) Tag 65 von dem Experiment 37

A: Splenozyten aus einzelnen experimentellen Mäusen (2 × 10⁵ Zellen/Well), fünf Wells für jede Maus parallel.
B*: bestrahlte (2.500 Rad) Lymphozyten von V. L. (2 × 10⁵ Zellen/Well).
A*: bestrahlte (2.500 Rad) syngenen Splenozyten von intakten Balb/c-Mäusen (2 × 10⁵ Zellen/Well).
OD: optische Dichte mit einer 570 nm Testwellenlänge und einer 690 nm Referenzwellenlänge.
Δ: die Differenz zwischen OD_{experimentell} und OD_Grundlinie.

Die Zellmischung wurde für 5 Tage in CO₂ (5%-Inkubator) kultiviert.
Am Tag 103 des Experiments wurden Ergebnisse der gleichen Art erhalten. Die Bedingungen, unter denen der Assay durchgeführt wurde, sind im Folgenden wieder aufgeführt.
Gemischte Lymphozytenkultur (MTT assay) am Tag 103 des Experiments
Balb/c-Mäuse wurden chemisch immunsupprimiert durch Injektion von 90 mg/kg Prednisolon (Pr) und 100 mg/kg Cyclophosphamid (Cy) i. p. am Tag 0. Am Tag 1 wurden 100 mg/kg Cy wiederum i. p. injiziert. Die immunsupprimierten Mäuse wurden täglich i. p. von Tag 3 bis Tag 9 und von Tag 16 bis Tag 18 mit 200 μg Tf-pool injiziert, gereinigt aus humanem Blutplasma-pool in 0,5 ml (Gruppe 1) oder mit 5 μg Glykanen injiziert, gereinigt aus humanem Tf-pool (Gruppe 2), oder mit 200 μg HSA (Gruppe 3) injiziert, oder erhielten 0,5 ml Salzlösung i. p. (Gruppe 4). Alle Mäuse einschließlich der nicht-IS-Gruppe 3 wurden zweimal i. p. mit humanen Antigenen immunisiert, d. h. mit 1 × 10⁶ humanen peripherem Blut „buffy coat" Leukozyten in 0,3 ml am Tag 3 und am Tag 16. Die Mäuse wurden am Tag 103 des Experiments getötet und die gemischte Lymphozytenkulturreaktion von Mäusesplenozyten gegen humane Lymphozyten wurde durchgeführt und mittels dem MTT Assay untersucht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5B dargestellt. TABELLE 5B Induktion von Transplantationstoleranz mit Glykanen Gemischte Lymphozytenkulturreaktion (MTT-Test) Tag 103 von dem Experiment 37

A: Splenozyten aus einzelnen experimentellen Mäusen (2 × 10⁵ Zellen/Well), fünf Wells für jede Maus parallel.
B*: bestrahlte (2.500 rad) Lymphozyten von W. P. (2 × 10⁵ Zellen/Well).
A*: bestrahlte (2.500 rad) syngene Splenozyten von intakten Balb/c-Mäusen (2 × 10⁵ Zellen/Well).
OD: optische Dichte mit einer 570 nm Testwellenlänge und einer 690 nm Referenzwellenlänge.
Δ: die Differenz zwischen OD_{experimentell} und OD_Grundlinie.

Die Zellmischung wurde für 5 Tage in CO₂ (5%-Inkubator) kultiviert.
Trypanblau-Ausschluss-Assay (Trypan-blue exclusion assay)
Dieser Assay ermöglicht die Untersuchung der Permeabilität von Zellen nach deren Inkubation mit Antikörpern und Komplement. Wenn cytotoxische Antikörper an die Membranen von Zielzellen binden, wird das Komplement fixiert und die Zellpermeabilität erhöht sich. Der Assay wird eingesetzt, um die Zellpermeabilität oder das „Absterben" zu testen, indem eine Lösung von Trypanblau zugegeben wird, die in tote Zellen penetriert, lebensfähige Zellen jedoch nicht anfärbt.
Die Assays wurden durchgeführt, indem Antigene von verschiedenen Personen (WP und VL) verwendet wurden.
Der Assay wurde nach dem folgenden Protokoll durchgeführt:
Komplementabhängige Cytotoxizität von Mäuseserum (Trypanblau-Ausschluss-Assay am Tag 31 und am Tag 61 des Experiments)
Balb/c-Mäuse wurden chemisch immunsupprimiert durch Injektion von 90 mg/kg Prednisolon (Pr) und 100 mg/kg Cyclophosphamid (Cy) i. p. am Tag 0. Am Tag 1 wurden 100 mg/kg Cy wiederum i. p. injiziert. Die immunsupprimierten Mäuse wurden täglich i. p. von Tag 3 bis Tag 9 und von Tag 16 bis Tag 18 mit 200 μg Tf-pool injiziert, gereinigt aus humanem Blutplasma-pool in 0,5 ml (Gruppe 1), oder mit 5 μg Glykanen injiziert, gereinigt aus humanem Tf-pool (Gruppe 2), oder erhielten 0,5 ml Salzlösung i. p. (Gruppe 3). Alle Mäuse einschließlich der nicht-IS-Gruppe 4 wurden zweimal i. p. mit humanen Antigenen immunisiert (Ag.WP und Ag.VL), d. h. mit 1 × 10⁶ humanen peripherem Blut „buffy coat" Leukozyten in 0,3 ml am Tag 3 und am Tag 16. Die Blutentnahme wurde am Tag 31 und am Tag 61 des Experiments durchgeführt, die Serumproben wurden gesammelt und bei –70°C bis zum Assay gelagert.
Es wurden zwei Reihen von Experimenten durchgeführt, deren Ergebnisse in den Tabellen 6A und 6B im folgenden angegeben sind.
Die Zubereitungen gemäß der Erfindung sind für eine Anwendung in vielen Bereichen geeignet, auf manche davon wurde bereits vorstehend Bezug genommen. Diese Zubereitungen sind insbesondere zur Behandlung von Patienten mit den folgenden Klassen von Erkrankungen geeignet, die alle von allogenen oder xenogenen Knochenmarktransplantationen einen Vorteil haben würden:
aplastische Anämie; Agranulocytose;
Thalassämie;
Immunschwäche-Erkrankungen (AIDS, Agammaglobulinemie, usw.);
Leukämien (myeloblastisch, lymphoblastisch, erythroblastisch, usw.) Myelome;
metastasierende feste Tumore, Karzinome, Adenokarzinome;
genetische Erkrankungen;
Organtransplantation.
Eine weitere große Gruppe von Patienten kann die vorliegende Erfindung verwenden, z. B. Patienten, bei denen eine Transplantation von Organen aus dem Menschen oder Tieren durchgeführt wird (Schweine, Affen etc). (Verträglichkeit von Leber, Herz, Nieren, Langerhans'schen Inselzellen ohne Abstoßungsreaktion.)
Wann immer erforderlich, kann der Patient für die Immunakzeptanz von einem Organ oder von Geweben aus einem anderen Wirt prekonditioniert werden, durch vorherige Tf-Glykan-Verabreichung und Transplantation von Knochenmark oder Knochenmarksstammzellen aus dem Wirt, der auch das Organ oder das Gewebe bereitstellt.
Siehe auch die allgemeinen Angaben, die Gluckmann E. in seinem Artikel mit der Überschrift „Bilan actuel de la greffe de moelle osseuse allogénique" (Allgemeiner Überblick über die Transplantation von allogenem Knochenmark), publiziert in Path. Biol. 1980, 28, Nr. 1, 5–7, aufgezählt hat. Diese Angaben sind auch im Rahmen der vorliegenden Beschreibung anwendbar.
Die Erfindung findet beispielsweise bei allogenem (histoinkompatiblem, nicht-HLA-matched) BMT Anwendung, wobei die Schwierigkeiten, die mit dem Auffinden eines Spenders verknüpft sind, zu einem Großteil umgangen werden sollten. Die Erfindung ist nicht nur auf Zubereitungen zur Verwendung bei der Transplantation von allogenem und xenogenem BMT beschränkt. Deren Verwendung ist in jedem System vor stellbar, das darauf abzielt, die Transplantation von jeder Art von Zellen, Geweben oder Organen in jede Art von Säuger einschließlich dem Menschen zu erleichtern.
Wenn auch der Verabreichungsweg der Zubereitung gemäß der Erfindung und dessen Kombination mit den Schritten, die die Schwächung oder Suppression des endogenen Immunsystems in dem mit allogenen oder xenogenen Zellen zu transplantierendem Wirt zur Folge haben, der Kontrolle der Kliniker vorbehalten bleiben sollte, bleibt jedoch, dass die vorstehend genannte Schwächung oder Suppression üblicherweise derart verursacht werden sollte, dass sie vor der Verabreichung der Tf-Glykane und der Transplantation stattfindet.
Bemerkenswert ist der Befund, dass die chemischen Immunsuppression des Empfängerwirts vor der Knochenmarktransplantation oder der Transplantation von anderen Zellgeweben oder Organen im Allgemeinen ausreichen sollte. Die vollständige vorhergehende Zerstörung des eigenen Immunsystems des Empfängerwirts scheint nicht notwendig zu sein. Jedoch können die Systeme, die zur Induzierung einer Immunsuppression in dem Wirt eingesetzt werden, auch eine chemischen Immunsuppression mit einer mehr oder weniger limitierten Bestrahlung verbinden, z. B. nur der lymphoiden Organe, um einen weitreichenden Bestrahlungsschaden (Lunge, Eingeweide usw.) zu vermeiden. Jedes cytostatische Arzneimittel oder immunsuppressives Arzneimittel wie z. B. Cyclosporin, Prednisolon, FK-506 kann einzeln oder in Kombination mit einer Bestrahlung eingesetzt werden, um den Empfänger auf den Transfer von fremden Zellen oder Geweben einzustellen.
Die Anwendungen der Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind jedoch auch nicht auf die Transplantation von Knochenmark allein beschränkt. Sie können angewendet werden, wenn immer eine Übertragung eines neuen immunologischen Systems in einen vorbehandelten Wirt erforderlich ist, z. B. zur Induktion der Abstoßung des Wirtes von Leukämiezellen oder festen Tumoren. Eine weitere wichtige Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die xenogene (Inter-Spezies) Transplantation, z. B. wenn der Spender des Knochenmarks oder der Organe (z. B. Leber, Herz, Nieren) ein Schwein oder einer Primat (Affe) ist und der Empfänger ein Mensch ist.
Ferner werden Alternativen im Hinblick auf die Zeitpunkte, zu welchen die Tf-Glykane dem Empfänger zu verabreichen sind, in Betracht gezogen. Sie können auch dem Spender vor der Übertragung seiner Zellen auf den Empfänger verabreicht werden. Wiederholte nachfolgende Verabreichungen des Glykan-pools werden wahrscheinlich die Transplantationsfähigkeit des Knochenmarks oder weiterer Organe oder Gewebe in den Empfänger begünstigen, um die gegenüber dem transplantierten Knochenmark und Organen oder Geweben allogenen oder xenogenen Ursprungs induzierte Toleranz zu verstärken.
Gepoolte Tf-Glykane können ferner den Knochenmarkkulturen zugefügt werden, um das Knochenmark des Spenders in vitro über variable Zeiträume (Stunden bis Tage) vor dessen Inokulierung in dem Empfänger zu präinkubieren. Dieses Verfahren kann die Transplantationsfähigkeit des Knochenmarks des Spenders verändern und/oder verbessern und die Induktion von GvHD-freien Chimärismus verstärken.
Die Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung können über jede Route verabreicht werden, die üblicherweise angewendet wird, um die Nicht-Antwort des Wirts gegen fremdes (allogenes oder xenogenes) Knochenmark und/oder Organe zu verstärken. Auch wenn orale oder rektale Verabreichungswege in Betracht zu ziehen sind, bleiben die parenteralen Wege bevorzugt (intravenös oder intramuskuläre Injektionen).
Auch wenn dies in keinster Weise als Beschränkung auszulegen ist, sollten die täglichen Dosierungen von gepoolten Tf-Glykanen für den Wirt, nachdem die Transplantation von Knochenmark und/oder Organen, die transplantiert werden sollten, durchgeführt worden ist, beispielsweise in dem Bereich von etwa 20 Mikrogramm bis bis 500 Mikrogramm liegen, z. B. von etwa 50 Mikrogramm bis etwa 200 Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht des Wirts. Behandlungen dieser Art können 10 bis 30 Tage nach der Transplantation andauern.
Jedoch kann die Behandlung mit gepoolten Tf-Glykanen auch für Tage, Wochen oder Monate nach der Transplantation, allein oder in Kombination mit immunsuppressiven Arzneimitteln wie z. B. Cyclophosphamid, Cyclosporin, FK-506, Methotrexat in all jenen Fällen durchgeführt werden, in denen die transplantierten Individuen Anzeichen oder Symptome eines fehlfunktionierenden hämopoietischen Systems zeigen (Anämie, Leukopenie, Thrombocytopenie) oder einer Transplantation-gegen-Wirt-Erkrankung (graft versus host disease) und/oder immunologischen Mangelfunktionen.

Claims

Eine biologisch-aktive Zubereitung, die wirksam die Immunreaktion eines immungeschwächten Empfängerwirts gegen Spender-Antigene (Zellen, Gewebe und Organe) kontrolliert, dadurch gekennzeichnet, dass ihr Wirkstoff aus einem oder mehreren Transferrin-abgeleiteten Glykanen ohne Transferrin-Polypeptid-Teilen besteht, wobei der Wirkstoff ausreichend phenotypische Information umfasst, die benötigt wird, um eine Toleranzinduktion in einem bestimmten immungeschwächten Empfängerwirt sicherzustellen, der mit der biologischen Zubereitung behandelt wird und anschließend mit Antigenen eines bestimmten Spenders transplantiert wird, wobei der Spender der gleichen Säugerart wie der, aus dem die Transferrin-abgeleiteten Glykane erhalten wurden, angehört.
Die Zubereitung gemäß Anspruch 1, worin die Transferrin-abgeleiteten Glykane aus einem einzigen Säuger stammen.
Die Zubereitung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ihr Wirkstoff aus gepoolten Transferrin-abgeleiteten Glykanen besteht, die von einer ausreichenden Anzahl Spendern erhalten wurden, um zu ermöglichen, dass die gepoolten Transferrin-abgeleiteten Glykane alle phenotypischen Informationen enthalten, die benötigt werden, um eine immunspezifische Toleranzinduktion gegen Antigene eines bestimmten Spenders in einem immungeschwächten Empfängerwirt, der mit den Antigenen transplantiert wurde, sicherzustellen, nachdem dem Wirt eine Menge solcher gepoolten Transferrin-abgeleiteten Glykane verabreicht wurde, die wirksam die immunspezifische Toleranz induziert.
Die Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Transferrin-abgeleiteten Glykane menschliche Transferrin-abgeleitete Glykane sind.
Die Zubereitung gemäß Anspruch 3 und 4, miteinander kombiniert, dadurch gekennzeichnet, dass die gepoolten Transferrin-abgeleiteten Glykane aus einem Plasmapool erhalten wurden, der mindestens vier serologisch bestimmbare Antigene von jeder der sogenannten HLA-A-, HLA-B-, HLA-C-, HLA-D- und HLA-DR-Serien enthielt.
Eine Assoziation von Wirkstoffen, bestehend einerseits aus den Transferrin-abgeleiteten Glykanen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, und andererseits aus einem immunsuppressiven Arzneimittel wie Prednisolon, Cyclophosphamid, Cyclosporin, Methotrexat oder FK-506.
Die Verwendung von Transferrin-abgeleiteten Glykanen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Kontrolle in einem Empfängersäugerwirt, insbesondere Mensch, von Immunreaktionen des Typs, die an der Transplantation von fremdem Gewebe oder Zellen, insbesondere Knochenmarkzellen oder Organen allogener oder xenogener Herkunft, beteiligt sind, um in dem Empfängerwirt eine Toleranz gegenüber dem transplantierten fremden Gewebe oder Zellen zu erzielen.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7, worin die Transferrin-abgeleiteten Glykane gepoolte Transferrin-abgeleitete Glykane sind.
Die Verwendung gemäß Anspruch 7 oder 8, worin die gepoolten Transferrin-abgeleiteten Glykane menschliche gepoolte Transferrin-abgeleitete Glykane sind.
Die Verwendung gemäß Anspruch 9, in denen die Transferrin-abgeleiteten Glykane aus einem Plasmapool erhalten wurden, der mindestens vier serologisch bestimmbare Antigene von jeder der sogenannten HLA-A-, HLA-B-, HLA-C-, HLA-D- und HLA-DR-Serien enthielt.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10 zur Herstellung einer Assoziation von Arzneimitteln, umfassend einerseits die gepoolten Transferrin-abgeleiteten Glykane und andererseits ein immunsuppressives Arzneimittel wie Prednisolon, Cyclophosphamid, Cyclosporin, Methotrexat oder FK-506.
Die Kombination der Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder der Assoziation gemäß Anspruch 6 mit Antigenen, die von einem Spendersäugerwirt erhalten wurden und für die Transplantation in einen Säugerempfängerwirt hergerichtet wurden.
Die Kombination gemäß Anspruch 12, worin der Empfängerwirt und der Spenderwirt zueinander allogen sind.
Die Kombination gemäß Anspruch 12, worin der Empfängerwirt und der Spenderwirt zueinander xenogen sind.