JPH04170965A

JPH04170965A - リンパ球の活性化方法

Info

Publication number: JPH04170965A
Application number: JP2296850A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Adachi; 正一足立
Original assignee: NIPPON KOUTAI KENKYUSHO KK
Current assignee: NIPPON KOUTAI KENKYUSHO KK
Priority date: 1990-11-01
Filing date: 1990-11-01
Publication date: 1992-06-18
Also published as: EP0483765A3; EP0483765A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は血液中のリンパ球の活性化方法及びこれに用い
る装置に関し、更に詳細には血液中から、顆粒球を除去
することにより顆粒球／リンパ球の比率を低くした状態
でサイトカインを添加することにより血液中のリンパ球
を活性化する方法及び装置に関する〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕癌治療
と免疫の研究は１９８０年代に入り、免疫学の分野にお
いてサイトカインが注目され、その研究が著しく進歩し
た。サイトカインにより刺激を受けたリンパ球や単球、
マクロファージが生物学的な活性を有する様々な蛋白活
性因子を産生じ、それを介して免疫系の応答が調節され
修飾されていくことが明らかになってきた。加えて、５
！ｉ患者の病態と免疫系との係わりも近年、多くの臨床
試験から分かってきた。従来、単球、マクロファージか
ら産生される蛋白因子をモノカインと称し、リンパ球か
ら主に産生される蛋白因子をリンホカインと呼んでいた
が、近年様々な細胞から種々の蛋白因子が産生されるこ
とが判明し、これらはサイトカインと総称されるように
なり、多くのことが分かってきた。すなわち、サイトカ
インはある特定の種類の細胞によって産生されるのでは
なく、さまざまな細胞によって産生されている。すイト
力インの産生細胞は一般に常時サイトカインを作ってい
るのではなく、刺激が加わることにより産生を開始する
。また、同一種類の細胞から複数のサイトカインが産生
され、その作用も局所にとどまらず全身的にも作用する
こと、更にはその作用も共通の作用を示すものが少なく
ないことも分かってきた。例えば、インターロイキン−
１（ＩＬ−１）　、インターロイキン−２（ＩＬ−２）
、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ
）はいずれも抗腫瘍活性や発熱性があり、ＩＬ−１、Ｉ
Ｌ−２、Ｉ　Ｌ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＴＮＦ、Ｇ
Ｍ−Ｃ３Ｆ　（顆粒球・マクロファージ−コロニー刺激
因子）にはＴ細胞の分裂を促進させる作用がある。また
、サイトカインとサイトカイン産生細胞や標的細胞の間
には、さまざまなネットワークが形成されており、その
ネットワークを介して、サイトカインの産生や作用の発
現が調節されている。例えばマクロファージにＴＮＦを
作用させれば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦなど
の産生が誘導され、ＩＬ−４を作用させればＩＬ−１や
ＴＮＦの産生は抑制される。ＩＬ−２やＩＦＮ−γはＬ
ＡＫ細胞（リンホカインーアクチベーテイドーキラー細
胞：　Ｌｙｍｐｈｏ−ｋｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｋ
ｉｌｌｅｒ　ｃｅｌｌ　）の活性を高めるが、ＩＦＮ−
αおよびＩＦＮ−β、ＩＬ−３はその活性を阻害する。

上記のようにサイトカインは直接あるいは間接に抗腫瘍
活性をもつことから癌治療を目的として多くの臨床試験
が試みられてきた。しかし、当初期待された程、治療効
果は認められていない。例えば、ＩＬ−２は、Ｍｏｒｇ
ａｎらにより１９７６年にＰ）ＩＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍ
ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　）で刺激を受けたヒト末梢血白
血球培養上清より、ヒトＴＩＩ胞を選択的に増殖する因
子として発見されたサイトカインで（Ｍｏｒｇａｎ　、
　０．Ａ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　、１９２．
１００７（１９７６））　、当初Ｔ細胞増殖因子と呼ば
れた。ＩＬ−２の抗腫瘍活性はＬＡＫ細胞、ｃｙｔｏｔ
ｏｘｉｃＴ−ｃｅｌｌ　（ＣＴＬ）　、Ｂ細胞、ｎａｔ
ｕｒａｌ　ｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）細胞などの増殖および
活性増強、ＩＦＮ−Ｔの産生増強などによると考えられ
、（田口鑵男、癌と化学療法、　１３．１（１９８６）
）　、臨床試験が行われた。しかし、ＩＬ−２単独療法
では当初予想された程治療効果は認められず、副作用と
しての発熱、悪寒戦慄、食欲不振などが高頻度に出現し
た（佐野舌部、癌と化学療法、旦、　９０３（１９８６
））。

さらに、ＲｏｓｅｎｂｅｒｇらがＩ　Ｌ−２とＩＬ−２
によって活性化されたＬＡＫ細胞の併用療法を報告した
（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、＾、、ｅｔ　ａｌ、、　
Ｎ、Ｂｎｇｌ、ＪｏＭｅｄ、。

３１６、８８９　（１９８７））。その後、該方法につ
いて、多くの研究がされたが腎癌やメラノーマなどの一
部の癌において有効性が示されたにすぎず、副作用も発
熱、消化器症状などが高頻度に出現し、費用もかかるこ
とから当初期待された程の効果は得られなかった（Ｒｏ
ｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、＾、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ、
　Ｂｎｇｌ、　Ｊ。

Ｍｅｄ、、　３１３．１４８５（１９８５）　：田ロ鐵
男、最新医学。

４２、３２５（１９８７）：　Ｆｉｓｈｅｒ　、　Ｒｏ
ｌ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄ−ｉｎｇ　ｏｆ　
ＡＳＣＯ，、旦、２４６（１９８７））　。また、抗腫
瘍活性を持つ他のサイトカインとの併用も試みられたが
奏効率はあがっていない（西條長宏ら。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　　Ｊａｐａｎｅｓｅ　
Ｃａｎｃｅｒ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ、。

４６、　２８９　　（１９ｇ？））　　。

上記のようにＩＬ−２の抗腫瘍効果が予想されたほど認
められないのは、ＬＡＫ細胞の絶対数が腫瘍細胞に対し
て少ないとか、ＬＡＫ細胞が腫瘍へ集積していないので
はないか、あるいは担癌生体では抑制性Ｔ細胞の活性化
や免疫複合体の形成等により癌細胞が抗腫瘍免疫機構か
らエスケープする状態になっていること等が予測された
。事実、小倉らの報告によればアイソトープで標識した
ＬＡＫ細胞の体内動態の検討では腫瘍への局在化が認め
られていなかった（小倉側、内科、　６６（４）。

７７７　（１９９０）　）。これらの問題点を解決する
ためにＬＡＫ細胞の培養法や装置の開発、ＩＬ−２の投
与量及び投与時期、他の薬剤や他のサイトカインとの併
用療法など様々な研究がなされているが依然として満足
する結果が得られていないのが現状である。

〔課題を解決するための手段〕

かかる実状において、本発明者らはＩＬ−２等のサイト
カインが本来的に有しているリンパ球活性化能を充分に
発揮させる手段を開発すべく鋭意研究した結果、血液中
より顆粒球を除き、血液中のリンパ球数に対する顆粒球
数の比率（以下、「ＧＺＬ比」という）を低下させた後
、この血液にサイトカインを添加すれば血液中のリンパ
球が効果的に活性化されること、さらにこの血液を癌患
者の体内に還流すれば優れた腫瘍増殖抑制効果が得られ
ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は血液を、リンパ球に比し顆粒球への
親和性の高い担体に接触させて血液中のリンパ球数に対
する顆粒球数の比率を低下させた後、当該血液にサイト
カインを添加することを特徴とする血液中のリンパ球の
活性化方法を提供するものである。

また、本発明はリンパ球に比し顆粒球への親和性の高い
担体を収容した顆粒球吸着部と、当該吸着部より流出し
た血液にサイトカインを添加するためのサイトカイン注
入部とを備えていることを特徴とする血液中のリンパ球
活性化装置をも提供するものである。

本発明の方法及び装置において用いられるリンパ球に比
し顆粒球への親和性の高い担体（以下、単に「担体」と
略す）及びこれを収容した顆粒球吸着部は、例えば特開
平２−１９３０６９号公報に記載のものを使用できる。

すなわち、担体としては接触する血液に有害なものでな
ければその材質を問わずに利用することができるが、好
ましくは、水に対する接触角が５５°〜９５°の間にあ
る担体がよい。

具体的には、特にポリスチレン、酢酸セルロース、６−
ナイロンや１１−ナイロンなどのナイロン、ポリトリプ
ルオロエチレン、ポリエチレンテレフタレートが好適で
ある。尚、上記担体は２種以上混合してもよいことはも
ちろんである。該担体の形状及び大きさは、特に限定は
なく、接触する血液との接触効率が良ければよい。例え
ば、直径が０．１〜１０ｍｍ程度のビーズ状担体などと
することができる。

顆粒球吸着部としては、より具体的には内容積が５０ｄ
のカラムを用い、この中に射出成形後、研摩することに
よって製造した酢酸セルロースビーズ（粒径２．Ｏｍｍ
：種水化学工業■製）約４０００個を界面活性剤５　％
　５ＣＡＴ２０Ｘ−Ｎ　（第−工ｉ［１ｍ１）５００　
ｍｌ！に３０分間浸し、次いで脱イオン水で５回洗浄し
、さらに９９．５％のエタノールで２回洗浄した後風乾
し、最後に総量２．５メガラツドのガンマ線を照射した
ビーズを充填したものが好ましい。ビーズ充填カラム内
の血液容量は、約５０ｒｎｌのものを用いるのが良い。

このような担体に血液を接触させれば、血液中の顆粒球
が選択的に吸着除去され、当該血液中のＧ／Ｌ比が低下
する。特開平２−１９３０６９号公報に記載の如く、癌
患者の血液中のＧ／Ｌ比は健常者のＧ／Ｌ比に比べて高
く、このＧ／Ｌ比は癌患者の予後と高い相関性を有して
いる。従って、癌患者の血液中のＧ／Ｌ比を低下させれ
ば、特開平２−１９３０６９号公報のように患者の予後
はよくなるものの腫瘍そのものを消失させるものではな
い。本発明においては、このＧ／Ｌ比の低下に続いて、
当該血液にサイトカインを添加することにより、血液中
のリンパ球が顕著に活性化され、優れた腫瘍増殖抑制効
果が得られることを見出したものである。

Ｇ／Ｌ比を低下せしめた血液に添加されるサイトカイン
としては、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β
、ＩＦＮ−ｒ等の他、抗腫瘍活性をもつとされているＩ
Ｌ−１α、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βなど、
また、Ｔ細胞増殖作用をもつとされるＩＬ−４、ＩＬ−
６、ＩＬ−７、Ｂ細胞分化増殖作用をもつＩＬ−５、Ｔ
ＧＦ（Ｔ細胞成長因子）が挙げられる。これらのサイト
カインは、天然型、遺伝子組換え型のいずれでもよい。

就中、ＩＬ−２が特に好ましく、当該ＩＬ−２としては
、既に公知のインビトロで誘導されたＩＬ−２を含有す
る培養上清、その精製標品、遺伝子組換技術に従い製造
されたＩＬ−２及びその同効物（ｒＩＬ−２）、例えば
特開昭６０−２４６３２２号公報に記載の天然型ＩＬ−
２の一部アミノ酸配列からなる合成ペプチド等のいずれ
でもよい。これらのうちで特に、遺伝子組換え技術によ
って得られたりコンビナンドヒトＩＬ−２が好ましい。

次に本発明の一実施例を示す図面とともに本発明のリン
パ球活性化装置について説明する。

第１ｒＸｉ中、１は上記した顆粒球吸着部であり、ガラ
スピーズの担体２が充填されている。かかる顆粒球吸着
部の一端部には、被処理血液（患者の動脈又は静脈から
の血液）を採血部８から該顆粒球吸着部内に流入させる
ための血液流入部３が備えられ、他端部には、該顆粒球
吸着部内に流入され、担体との接触により顆粒球を除去
されＧ／Ｌ比の低下した血液を該顆粒球吸着部外に流出
させるための血液流出部４が備えられている。次に血液
流出部４より送出された処理血液（Ｇ／Ｌ比の低下した
血液）にサイトカインを添加するためのサイトカイン注
入口５をもつザイトカイン注入部６を備えている。さら
にリンパ球が活性化された血液を体内に戻すための循環
ポンプ７を備えている。そして当該血液を返血部９に返
血する。

ここで本発明装置は、通常の血漿交換療法に準じて、体
外循環により連続的に顆粒球を除去しＧ／Ｌを低下させ
、かつリンパ球を活性化するように使用でき、輸送材料
としての、例えばシリコーンゴムチューブ、ポリ塩化ビ
ニル等の無害からなる配管を備えることもできる。また
、循環中に低下する血液温度を上昇させるための加温器
や循環中の血液像を検出するための通常の検出器及び本
発明に起因する顆粒球以外の血液成分の不足を補うため
の血液成分補給器を設置することもできる。かかる補給
のための血液成分は、例えば、成分輸血が利用し得る。

体外循環の方法は、ウサギの場合、−週間に１〜３回の
割合で５〜２０回行い、−分間に１〜２ｍ１ｉ！／ｍｉ
ｎの速度で循環し、１〜２時間循糞した後、サイトカイ
ン、例えば、ＩＬ−２は１０Ｕ／ｒｎｌ〜ｌＸｌ０’　
Ｕ／−の濃度にしたものを注入部６より１、〇−加える
。かかる体外循環を１〜２時間行ない１クールとし、当
該クールを２〜２０回施行することによりリンパ球を十
分に活性化することができ、癌細胞に対する、活性化リ
ンパ球による抗腫瘍効果を増強することができる。

ヒトの場合の体外循環の方法は、−週間に１〜３回の割
合で５〜２０回行い、−分間に５０〜１５０　ｍｇ／ｍ
ｉｎの速度で循環し、１〜２時間循環した後、サイトカ
イン、例えばＩＬ−２はＩＯＵ／Ｗｄｌ〜Ｉ　Ｘｌ０Ｓ
Ｕ／ｍｌ’の濃度にしたものを注入部６より１．０／　
１０．０ｄ加える。かかる体外循環′を１〜２時間行い
、１クールとし、当該クールを２〜２０回施行すればよ
い。

〔発明の効果〕

本発明によれば、癌患者の血液中のＧ／Ｌ比を低下させ
ることができ、これに続くサイトカインの投与によりリ
ンパ球を活性化し、活性化リンパ球の抗腫瘍効果を増強
させることができる。

〔実施例〕

以下に、実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に何ら制限されるものではな
い。

以下の実施例において、頴岐球数（Ｇ）及びリンパ球数
（Ｌ）は、特記しないかぎり、自動分析装置（Ｓｙｓｍ
ｅｘ　Ｂ−４０００東亜医用電子■）により測定し、Ｇ
／Ｌ比を算出した。

参考例−１：癌患者の予後とＧ／Ｌ比Ｇ／Ｌ比が２．０以下の進行癌患者３７例のＡ群と、Ｇ
／Ｌ比が２．０を超え、３．０以下の進行癌患者３７例
のＢ群と、Ｇ／Ｌ比が３．０を超え、４．０以下の進行
癌患者２４例の０群、及びＧ／Ｌ比が４．０を超える進
行癌患者１６例のＤ群の４群合計１１４例の予後につき
検討した。尚、対象とした腫瘍は胃癌、乳癌、肺癌、大
腸癌、子宮頚部癌、食道癌、膵臓癌でＰ、Ｓ、（０〜４
）のいずれの背景因子にも、有意差（Ｘ’−ｔｅｓｔ）
は認められなかった。

生存率曲線（にａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法：「治療効果
判定のための実用統計学」富永祐民、蟹書房、昭和５７
年８月２０日発行）による比較の結果を第２図に示す。

第２図中、縦軸は生存率（％）を、横軸は時間経過（日
）を示す。

第２図より、Ａ群がＢ群より、Ｂ群が０群より、０群が
Ｄ群より有意差（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ−ｗｉｌｃｏ
ｘｏｎｔｅｓｔ　）をもって生存率が高く、予後の良い
ことが分かる。即ち、Ａ群では５０％生存期間が４７４
日と最も長く、次いでＢ群は５０％生存期間が３１１日
、０群では５０％生存期間が１６６日、そしてＤ群では
５０％生存期間が１２３日と最も短かった。

また、上記各種進行癌１１４例の癌種およびＧ／Ｌ比別
の内訳及び患者の生死について第１表に示す。

以下余白実施例−１：移植腫瘍ウサギに対するリンパ球活性化法
の効果体重３．Ｏｋｇの日本白色家兎（雌）（実験動物株式会
社）の背部皮下にｖｘ２（ショープ乳頭腫ウィルス由来
）ＩＩ瘍をＩ×１０７個移植した。腫瘍生着確認後、移
植１６６回目り体外循環による顆粒球除去及びＩＬ−２
の投与を行った。体外循還は一週間に２回の割合で合計
９回行った。循還方法はエクステンションチューブ（Ｘ
２−５．　　）ツブ社製）にサーフロー留置針（耳静脈
用、Ｃ型２２ＧＸ１／４゜テルモ社製）を接続し、ウサ
ギの一側の耳静脈に挿入し採血部とした。これを内容積
５０−のカラムに直径２．０ＩＥ１１の酢酸セルロース
樹脂ビーズを約４０００個充填したもの（種水化学・日
本抗体研究新製）を顆粒球除去のための顆粒球吸着ビー
ズ充填カラムとして用いて通過させ、１分間に１ｍｆ！
の流速で循環した。体外循環用の循環ポンプはＡＴＴＯ
社製：　５Ｊ−１２１１を用いた。循環ポンプより上記
カテーテルチューブを片側のウサギ耳静脈に挿入して返
血し、体外循環路を作成した。ＩＬ−２はりコンビナン
ドヒトＩＬ−２（ｒ　ＩＬ−２：ジエンザイム社製；　
　（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を用い、１００Ｕ／ｒｎｌの
濃度に調整したものを、体外循環の１時間後にカラムの
血液流出部のサイトカイン注入部より１−を加え、その
まま、ウサギの体内に戻し、さらに循環を１時間継続し
た。尚、コントロールとして同様に腫瘍を移植した家兎
を放置し、移植後１６６回目り、−週間に２回の割合で
、同様に調整したｒＩＬ−２を耳静脈より投与したもの
を用いた。

上記の結果を第２表に示す。

第２表の移植後の日数は、それぞれ上から１６日は１回
目の体外循還を示し、４８日が９回目を示す。

また、表左側が本発明の方法を用いた試験結果である。

即ち、体外循還による顆粒球除去後のＩＬ−２投与後の
腫瘍の大きさとカラム流出部でのＧ／Ｌ比を表す。表布
側はコントロールとして顆粒球を除去しない癌細胞を移
植したウサギにＩＬ−２のみを耳静脈より投与したもの
を表し、Ｇ／Ｌ比はウサギの耳末梢静脈より採血した血
液を用いた。ここで腫瘍の大きさは腫瘍の長径と短径を
かけた面積で表す。

以下余白第２表から明らかなように本発明方法、即ち、体外循還
により顆粒球を除去し、かつＩＬ−２を投与した群は４
８日目には腫瘍が消失した。この結果、体外循環により
顆粒球を除去したカラム流出部の血液のＧ／Ｌ比が非常
に低くなり、かつＩＬ＝２により活性化されたリンパ球
の抗腫瘍効果が認められた。

一方、顆粒球を除去しないでＩＬ−２を単独投与したウ
サギでは血液中のＧ／Ｌ比が高い為、ＩＬ−２により活
性化されたリンパ球が充分抗腫瘍効果を発揮していない
ものと考えられる。

実施例−２上記実施例−２と同様の実験系で体外循環を行なわず、
ＩＬ−２も投与しない群をコントロール群（８例）とし
、体外循環のみを行った群を循環群（８例）とした。ま
た、本発明の方法をもちいた体外循環によりＧ／Ｌ比を
低下させた後、ＩＬ−２を投与した群を（循環＋ＩＬ−
２）群（２例）とした３群に分けて実験開始時の腫瘍の
大きさ（腫瘍の長径Ｘ短経）を１として経時的に腫瘍の
大きさを比較した。その結果を第３図に示す。

第３１！ｌの縦軸は腫瘍の増殖率を示し、横軸は循環の
回数を示す。

第３図から明らかなように、コトロール群の腫瘍は経時
的に増殖し腫瘍移植ウサギは死亡していったが、循環群
は一時的に腫瘍は増殖したものの体外循環の回数と共に
腫瘍の増殖は抑制された。

また、本発明方法を用いた（循環＋ＩＬ−２）群は体外
循１＋ＩＬ−２投与の回数と共に腫瘍の増殖は抑制され
、本発明方法施行７回目に腫瘍は消失した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のリンパ球活性化装置の一例を示す図
面である。第２！！Ｉは、Ｇ／Ｌ比と癌患者の予後の関連性を示す
図面である。第３１！Ｉは、実施例２における体外循環の回数と腫瘍
の増殖率との関係を示す図面である。以上第１図１、顆粒球吸着部　　　　　　　６．サイトカイン注入
器２、担体　　　　　　　　　　　　７．循環ポンプ３
、血液流入部　　　　　　　　８．採血部４、血液流出
部　　　　　　　　９．返血部５、サイトカイン注入口０］０１０１１０１ ★１１±Ｈ）≧く

Claims

【特許請求の範囲】１、血液を、リンパ球に比し顆粒球への親和性の高い担
体に接触させて血液中のリンパ球数に対する顆粒球数の
比率を低下させた後、当該血液にサイトカインを添加す
ることを特徴とする血液中のリンパ球の活性化方法。２、リンパ球に比し顆粒球への親和性の高い担体を収容
した顆粒球吸着部と、当該吸着部より流出した血液にサ
イトカインを添加するためのサイトカイン注入部とを備
えていることを特徴とする血液中のリンパ球活性化装置
。