JP2529321B2

JP2529321B2 - 白血球を培養する方法

Info

Publication number: JP2529321B2
Application number: JP62503008A
Authority: JP
Inventors: ジョージアンビーメリンク; ラジエイシェンカー
Original assignee: エンドトロニックスインコーポレーテッド
Priority date: 1986-04-28
Filing date: 1987-04-27
Publication date: 1996-08-28
Anticipated expiration: 2011-08-28
Also published as: US5631006A; US5541105A; DE3782736D1; JPH01502315A; DE3782736T2; EP0302894A4; EP0302894A1; WO1987006610A1; EP0302894B1; ATE82588T1

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景 1.発明の分野本発明は精製ヒト白血球の試験管内培養に関し、詳し
くは本発明は潅流培養系における精製ヒト白血球の培養
方法に関する。

2.従来技術の説明免疫系を養子免疫療法または他の手段により処置する
試みは長い歴史を有している。非常に多くの実験プロト
コルが試みられ、免疫性を増強および（または）増加す
ると思われた物質が患者に与えられた。これらの試験の
多くは十分でなく、成功が報告された若干の場合に試験
の成功観点を再現することが困難であった。

本出願の主題中の養子免疫療法は固体に対する免疫活
性（免疫担当）細胞の投与を含む。これらの免疫担当細
胞は処置される固体または他の固体からとられる。固体
に対する免疫担当細胞の投与の目的は患者に有益な効果
を与えることである。例えば、癌の場合に細胞が癌性腫
瘍の退行および（または）破壊の目的で与えられる。

養子免疫療法は免疫担当細胞を健康動物から癌性腫瘍
を有する動物に移入することにより試みられた。それ自
体、動物実験は抗腫瘍効果が一定腫瘍モデル中に高度の
抗原特異性で得ることができることを示唆した。抗腫瘍
効果が一定腫瘍に限定されることが認められ、抗原特異
性の効果が与えられた場合（抗体が効果または効果の重
要な媒体として除外された）にリンパ球を含む白血球が
包含されたと考えられた。

より最近、これらの白血球がそれらの抗腫瘍活性に関
して記載され、ナチユラルキラー（NK）およびリンホカ
イン活性化キラー（LAK）細胞として示された。〔抗腫
瘍免疫性に関して種々の程度に活性であることができる
免疫系の他の細胞系にはまた細胞毒性Ｔリンパ球（CT
L）が含まれる。〕 NKおよびLAK細胞は、ウイルス感染および腫瘍細胞を
含め標的細胞を優先的に溶解または殺す免疫系の部分で
ある。ロゼンベルグ（Rosenberg）ほかは動物モデル並
びにヒトにおいて、ヒトの末梢血液またはマウスの脾臓
から得られたリンパ球が組換えインターロイキン−２
（rIL−２）、即ち、一定のリンパ球例えばLAK細胞に活
性化する因子、で非常にわずかの日数内またはその間に
活性化できることを示した。ロゼンベルグ（Rosenber
g）ほかはLAK細胞が試験管内および生体内の両方で腫瘍
に対する退行性効果を有することを示した。この方法は
ヒトにおける癌の治療に適用され、有望な結果が有意数
の患者、殊に副腎腫、黒色腫および結腸の腫瘍をする患
者、で得られた。

しかし、ロゼンベルグ（Rosenberg）ほかのプロトコ
ルにおける主要困難は治療効果を得るために必要な多数
の細胞の増殖であった。腫瘍に対する退行性効果が生じ
る患者に治療効果を得るためには１×10¹⁰〜１×10¹¹LA
K細胞の細胞用量が感染された。普通の組織培養（静止
培養）中の細胞が最大100万細胞/mlに増殖できるにすぎ
ないので、これらの細胞の増殖に必要な組織培地、フラ
スコ、インキュベーターなどの量の莫大であった。さら
に、フイーデイング、培地からの廃物の除去および収集
に関して非常に労働集約的であった。この問題は、患者
の治療に準備できる細胞調製物の数を制限し、患者にそ
のような治療を与えることができる治療センターの数を
潜在的に制限する。さらに、より多量の細胞が一層有益
な治療を与え、患者に良好な結果を生ずれば、十分な数
の細胞を培養する問題が一層深刻になる。

発明の概要本発明は白血球が潅流系で培養される白血球の培養方
法を指向する。好ましくは、白血球は潅流培養系を用い
る中空繊細カートリッジの細管外空間中で培養される。
少くとも100〜5900％回収率の収穫可能収量を与え、少
くとも静置培養系中で培養された白血球と等しい溶菌活
性を有する白血球が少くとも４日間、19日まで（最適に
は12〜16日間）培養される。細胞はrIL−２単独またはr
IL−２および抗CD3単クローン性抗体とともに培養され
る。〔最近のデータは抗CD3単クローン性抗体プラスrIL
−２が、細胞数をrILB−２単独より10倍大きく拡大する
ことが認められたこと示唆する。オチヨア（A.Ochoa）
ほか。〕図面の簡単な説明第１図は本発明の方法に使用される細胞培養系の線図
である。

好ましい態様の詳細な説明本発明は溶菌活性を有する白血球の少くとも100〜590
0％回収率の収穫可能収量が達成されるように潅流系中
で白血球を培養する方法を含む。

白血球という語は感染と戦う白色血球小体（細胞）を
意味する。

リンパ球という語は細胞質顆粒のない白血球を意味す
る。リンパ球は通常全リンパ球の20〜50％になり、直径
は平均10〜12ミクロメートルであるが、しかし20ミクロ
メートル程度であることができる。リンパ球は暗青色を
とる濃染色コンパクト核により確認される。核は細胞の
全部または大部分を中心または１側で占める。細胞質は
通常透明であるが、しかし若干の細胞で鮮紅−円板−紫
色顆粒がみられる。

単球という語はリンパ球よりも多く原形質を有する大
単核白血球を意味する。

リンホカインという語により、リンパ球に与えられる
と、リンパ球をリンホカイン活性化細胞が腫瘍細胞を溶
解および（または）殺す溶菌活性に活性化する因子を示
す。リンホカインの例は組換えインターロイキン−２
（rIL−２）、β−インターロイキン−１、β−インタ
ーフエロン、α−インターフエロン、および抗CD3単ク
ローン性抗体である。

溶菌活性という語は、標的細胞または腫瘍を破壊する
細胞の能力を意味する。

中空繊維カートリッジ中の細胞の培養はナゼク（Knaz
ek）ほか、米国特許第3,821,087号および第3,883,393号
に記載されている。しかし、ナゼク（Knazek）ほかの中
空繊維カートリッジの使用において、中空繊維カートリ
ッジの細胞外空間中の最大細胞密度の達成に関して限界
が認められた。多数の白血球が養子免疫療法処置に要求
されるので、白血球の高い細胞密度を生存で維持し、そ
のような処置における使用に準備されねばならない。

本発明には、例えば1984年10月９日に提出され、本出
願と同じ譲受人に譲渡された「改良中空繊維細胞培養装
置および運転法」と題する特許出願第658,549号に記載
され、ここに参照されるような中空繊維カートリッジ潅
流培養系におけるリンパ球の培養および維持が含まれ
る。

市販中空繊維カートリッジ細胞培養系は、エンドトロ
ニクス社（Endotronics,Inc.,Coon Rapids,Minnesota,U
SA）により商標アクシスト（ACUSYST）−Ｐおよびアク
シスト−JRのものとで製造、販売される。この培養系は
本出願の提出日前１年以上の間売り出されている。

アクシスト−Ｐ細胞培養系は第１図に線図的に示され
る。アクシスト−JRはアクシスト−Ｐの縮小モデルであ
り、２〜６よりはむしろ１中空繊維カートリッジからな
る。10で一般に示される系は、中空繊維カートリッジ16
内の培地を循環するために１次培地循環系12および２次
培地循環系14を含む。循環系12は１次培地供給装置18お
よび、配管22により連結されたポンプ20、好ましくはベ
ロー形ポンプ、を含む。ポンプ20は配管24により中空繊
維カートリッジ16に流体連結される。配管22および24は
培地を中空繊維カートリッジ16に供給する循環系20の供
給側として設計される。培地は配管26により循環され供
給源18へ戻される。循環系12はよく知られた方法で中空
繊維カートリッジ16の中空繊維28の内腔に流体連結され
る。

循環系14は培地を中空繊維カートリッジ16の細管外空
間30へ供給し、その空間は中空繊維の外壁面と中空繊維
カートリッジのシエル32との間の空間として示される。
循環系14は配管36を通して細管外空間30に培地を供給す
る培地の供給源（膨張窒34）を含む。培地は配管38を通
して供給源34へ戻される。配管36および38は各ライン中
に単方向（monodirectional）弁を有し、培地は矢40お
よび42により示される方向に流れる。

供給源34はガスを源34に供給されることにより定圧に
保たれる。典型的にはガス圧は大気の上約100mmHgに一
定に保される。同様に供給源18もまたガスにより昇圧さ
れる。しかし、ガス圧は供給源18中に大気の上９〜100m
mHgでサイクルされる。ガス圧のサイクリングは中空繊
維の膜壁を横切る変動圧力降下を生じ、従って中空繊維
カートリッジの細管外空間内の培地の循環を与える。中
空繊維カートリッジの細管外空間内の培地の循環は栄養
素はおよび廃生成物の勾配の最少化並びに小生息区およ
び無酸素ポケットの最少化および（または）排除を与え
る。

系10はポンプ20並びに両供給源18および34中のガス
圧、並びに供給源18中のガス圧のサイクリングを制御す
るデジタルコンピューター系（図示なし）により制御さ
れる。

上記潅流系を用いて100％以上、5900％までの白血球
の収率を生じた。収率という語は中空繊維カートリッジ
中に初めに置かれた細胞の数を患者中への注入に用いる
無菌条件で収穫された細胞の数で除した値を意味する。
本発明の前に、静置培養技術を用いて約38〜82％程度の
収率が得られた。〔ロゼンベルグ（Rosenberg）ほ
か〕。従って、白血球搬出法により患者から除去された
より少い量の細胞が患者に体する注入に利用できた。容
易に理解されるように、既に衰弱した患者例えば癌を患
う患者を長い白血球搬出法にかけることは望ましくな
い。細胞の培養を通し等量またはそれ以上の量の細胞を
得ることにより白血球搬出を最少にすることが非常に望
ましい。

養子免疫療法は始めに血液を白血球搬出法にかけるこ
とにより患者の血液から白血球を得ることにより開始さ
れる。白血球搬出細胞懸濁液を次いで遠心分離し、次い
で分離された白血球を収集し、洗浄し、中空繊維カート
リッジの細管外空間中へ接種する。カートリッジ（１〜
６）は平均0.7×10⁹細胞／カートリッジ（0.25〜2.2×1
0⁹/カートリッジ）で接種され、細胞培養系が細胞の培
養に活性化される。

細胞をセタス社（Cetus Corporation,Emeryville,Cal
ifornia）から入手される組換えインターロイキン−２
（rIL−２）とともに培養してリンホカイン活性化キラ
ー（LAK）細胞を生成させる。これらの実験の多くにお
いては、細胞は抗CD3〔OKT3、オルト・フマルマシュー
テイカル（Ortho Pharmaceutical,New Jersey）〕単ク
ローン性抗体プラスrIL−２とともに培養した。

LAK細胞は培養および活性化（４〜19日）後、カート
リッジから取り出され、次いで静脈カテーテルを通して
静脈内に、または経皮カテーテルにより動脈中への直接
注入により投与される。そのような注入の効果はよく知
られた方法により癌性腫瘍で観察することができる。LA
K細胞の投与は、腫瘍が全く消えるまで、または努力が
それ以上腫瘍の退行を示さなくなるまで続けることがで
きる。rIL−２もまた、腫瘍の退行およびLAK細胞の患者
中への注入の効果に関して観察される結果により、LAK
細胞の注入とともに投与することができる。

以下の実施例は単に例示であり、本発明を限定する意
図ではない。実施例は本発明の方法を一層明瞭に示すた
めに提出される。

実施例１中空繊維の内腔に培地を与える循環ループ中に用いる
培地は2.4mM−Ｌーグルタミン（200mM溶液12ml/L）およ
び50μg/mlゲンタマイシン（100g/L溶液、0.5ml/L）
〔シグマ（Sigma,MO）製〕を含むRPMI−1640〔キブコ
（Gibco,New York）製〕であった。

細管外空間に培地を与える循環ループに対する循環培
地はRPMI−1640培地〔キブト（Gibco,New York）、また
はメデイアテク（Mediatech,VA）製〕454ml、40mlヒト
血清（0.45Umフィルターに通して濾過）、0.25mlゲンタ
マイシン、6mlL−グルタミン、および組換えインターロ
イキン−２（rIL−２）、3000U/ml、全単位＝1.5×10⁶
単位〔セタス社（Cetus Corporation,Emeryville,Calif
ornia）製〕を含有した。この再循環培地は48時間毎に
新再循環培地で交換して栄養素およびrIL−２を補給し
た。再循環培地と同じ組成を有する培地500mlを用いて
白血球の接種に対する中空繊維の細管外空間をコートし
た。

血液の単位（約200ml）を白血球搬出により得た。赤
血球細胞をフイコールハイパック勾配プロトコルを用い
て白血球から分離した。分離はV50ヘモネティクス（Hae
monetics）装置で行なった。

白血球を、８％ヒト血清および3,000U/ml rIL−２を
含む完全RPMI−1640培地〔ギブコ（Gibco,New York）ま
たはメデイアテク（Mediatech,VA）製〕中に再懸濁し
た。細胞の濃度を0.5〜4.4×10⁷細胞毎mlに調製し、細
胞を、各約50mlの溶液を含む２つの60ml注射器中に入れ
る。細胞をバイオリアクターの細管外空間中へ注入す
る。

アクシスト−Ｐフィード速度は50ml毎時に設定した。
中空繊維カートリッジを、接種前にコーティング培地50
0mlで２〜24時間コートした。アクシスト−JRはアクシ
スト−Ｐと同様に運転されるが、しかし培地の容積およ
び用いる細胞は用いるカートリッジの数に比例する。

１〜６カートリッジを、バイパスラインおよび膨張室
試料口を経て２つの60ml注射器から各25mlの細胞を接種
した。各カートリッジは95％より少くない生存度を有す
る0.25〜2.2×10⁹細胞を接種した。細胞の生存度はトリ
パンプル−排除により試験した。多くの実験において、
抗CD3（OKT3）をコーティング緩衝液並びに接種前の白
血球に加えた（10〜100ng/ml）。接種48時間後に抗CD3
抗体を系から除いた。その後細胞をrIL−２との細胞培
養に確立されたものと同様に培養した。

１次循環系中の圧力を大気圧より高い０〜100mmHgの
間でサイクルし、膨張室中の圧力を大気圧より約100mmH
g上に保つことにより細胞を通常の方法で培養した。試
料を毎日系からとり、pH、溶解酸素、グルコースおよび
乳酸塩濃度をモニターした。これらのパラメーターはIC
回路（循環系12）を通る培地フィード速度の調整により
最適設定点に維持した。

細胞を12〜16日培養した後、細胞をカートリッジの細
管外空間から、細胞濃縮器としてV50へモネテイクス装
置〔ブライントリー（Braintree,MA）製〕を用いて抜出
した。細胞を、１％ヒト血清アルブミンを補足した正常
食塩水約２で系からフラッシュし、次いで約350（250
〜500）mlに濃縮した。細胞を600mlIVバッグ〔トラベノ
ル（Travenol,IL）製〕に移した。全操作を無菌的に行
なった。

35の培養試験から、rIL−２単独またはrIL−２および
OKT3と一緒の培養の平均14日後に平均収率が2,000％
（範囲100〜5900）であったことが認められた。細胞を
除去した後の総括生存度は88％（63〜94％）である。

細胞をrIL−２単独とともに培養した１典型的実験に
おいて2400％の収率が得られた（試験＃１参照）。細胞
をOKT3プラスrIL−２とともに培養した他の試験（試験
＃２）で4500％の収率が得られた。両系は14日間培養し
た。

収率数字はカートリッジ中に接種した細胞の数および
カートリッジから取出された細胞の全数を基にして計算
される。細胞培養操作中いくらかの細胞が、細胞を培養
する細管外空間を通る培地の循環のために失なわれる。

試験ＩおよびIIから得られた細胞を溶菌活性について
試験し、静置培養系で培養された細胞と比較した。静止
細胞はアクシスト−Ｐ培養細胞と同型の培地中で14日間
培養し、継代培養により１×10⁶細胞/ml未満に維持し
た。溶菌活性の測定に用いた標的細胞はよく知られたHL
−60、K562、ドージ（Daudi）および新腫瘍であった。
これらの比較の結果は表１および２に示される。

表１および２の結果は本発明により培養された細胞
が、静置培養系中で培養された細胞に匹敵する溶菌活性
を有したことを示した。（若干の値が10％以上の標準偏
差を有し、これらの値でなされた結論に注意すべきであ
ることに注意すべきである。）本発明は好ましい態様、すなわち、アクシストＰまた
はアクシスト−JR中で培養され、OKT3および（または）
rIL−２で平均14日間活性化された白血球、に関して記
載されたけれども、当業者は本発明の精神および範囲か
ら逸脱することなく形態および細目において変更しうる
ことを認めるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭56−42584（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−137284（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−280270（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】白血球を培養する方法であって、組換えイ
ンターロイキン−２を使用して、前記白血球を中空繊維
カートリッジ中で少なくとも４日間培養して、少なくと
も100％の収率を有する活性化された細胞を得ることを
特徴とする方法。
【請求項２】前記白血球が約４〜19日間培養される、請
求項１に記載の方法。