JPH10165196A - 活性キラー単球及び活性キラー単球の殺腫瘍活性の監視方法 - Google Patents

活性キラー単球及び活性キラー単球の殺腫瘍活性の監視方法

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JPH10165196A
JPH10165196A JP9318257A JP31825797A JPH10165196A JP H10165196 A JPH10165196 A JP H10165196A JP 9318257 A JP9318257 A JP 9318257A JP 31825797 A JP31825797 A JP 31825797A JP H10165196 A JPH10165196 A JP H10165196A
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akm
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US Government
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 無血清培地内にて懸濁状態で培養され活性キ
ラー単球に転換された単離され略純粋なヒト単球の殺腫
瘍機能を監視する方法を提供する。 【解決手段】 Ａを試験ウェルから放出される 111Ｉｎ
計数値とし、Ｔをターゲット細胞内に取り込まれた全体
の 111Ｉｎ計数値として式Ａ／Ｔ×１００により活性キ
ラー単球の殺腫瘍活性を判定し、Ｂを賦活剤の存在下又
は非存在下で単球及びターゲット細胞を伴う試験ウェル
から放出される 111Ｉｎ計数値とし、ＣをＢと同一の賦
活剤の存在下又は非存在下でターゲット細胞を伴う試験
ウェルからの 111Ｉｎ計数値として式（Ｂ−Ｃ）／（Ｔ
−Ｃ）×１００で活性キラー単球の比殺腫瘍活性を判定
する段階とを順次行なうことから構成する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般にはガン治療
法に関し、特にガン患者について無血清媒培地内で懸濁
状態で培養される精製ヒト単球の殺腫瘍活性の監視に関
する。
【０００２】
【従来の技術】単核食細胞（単球）は、様々な形式で哺
乳類免疫反応の多くの重要な段階に関与することが知ら
れている。単球及びマクロファージは、抗原を処理しう
るために免疫応答の開始にとり本質的であること（ロー
ゼンタール，ニュー イングランドジャーナル オブ
メディシン，３０３，１１５３，１９８０）また幾つか
の免疫応答の免疫調整機構として働くインターロイキン
１（ＩＬ−１），コロニー刺激因子（ＣＳＦ），インタ
ーフェロン（ＩＦＮ）及びプロスタグランジン（ＰＧ
Ｅ）を分泌するという能力の故に本質的であること（エ
プスタイン，バイオロジー オブ リンフォカインス：
アカデミック プレス，ニューヨーク，１２３−１５２
頁，１９７９；スチーブンソン，ザ リチキュロエンド
テリアル システム，ア コンプリヘンシブ トリーテ
ィス，第VI巻：プレナム プレス，ニューヨーク，７９
−９１頁，１９８８２）が知られている。また単球は、
補体成分を分泌し（ナーサン他，ニュー イングランド
ジャーナル オブ メディシン，３０３，６２３，１
９８０），細胞障害機能を媒介するため体液性免疫にお
ける最終エファクター細胞として重要な役割を果たすこ
とが知られている。抗原依存性細胞障害（ポップラック
他，ブラッド ４８，８９０，１９７６）のほかに、活
性キラー単球（ＡＫＭ）が腫瘍細胞の有力なキラーとし
て知られている（スチーブンソン他，アーチフィシャル
オーガン １１２，１２８，１９８８）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】生体外でのヒト単球及
びＡＫＭの機能を評価は、幾つかの技術的理論的問題点
により阻害される。第１には単球はヒト末梢血液中の細
胞のごく一部でしかない（通常５％未満）ため、多数を
得るのは非常に困難であった。また消極的選択によりヒ
ト単球の精製群を大規模に単離する技術は非常に少なか
った。従来は、概して小数のやや低純度の単球がパーコ
ール等のグラディエント上で単離されるか（ヘスター
他，１９８１），あるいは高純度の細胞が、積極的選択
によりプラスチック又はガラス製の実験器具に付着され
て得られる（ウェーブ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７，
１６９５，１９７８ ）。
【０００４】単球が積極的選択で得られる場合には、さ
らに調べるため単球をはぎ取るのが困難であり、プラス
チック又はガラス表面から付着した細胞をはぎ取るため
ゴム冠ポリスマン（ペンライン，マニュアルオブ マク
ロファージ メソドロジー，６５−７７頁，１９８
１），ＥＤＴＡ（アッカーマン及びダグラス，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１２０，１３７２，１９７９），及びリド
カイン含有溶液（コスキ他，イン ビトロ メソッズ
イン セル−メディエーテッド アンド チュマルイミ
ュニティ，アカデミック プレス ３５９頁，１９７
６），等の様々なやや苛酷な手段が用いられる。細胞が
培養中でＡＫＭに賦活される場合には、大部分の研究者
は単球が容易に付着するポリスチレン製実験器具等を用
いているため付着と積極的選択の潜在的な問題点が複合
化する。
【０００５】付着した単球は勿論ヒト末梢血液での正常
な懸濁（浮遊）状態とは異なる状態にある。従って、機
能も異なっていることがありうる。ヒト単球は通常培養
される培地状態に置かれる場合幾つかの技術的に不適切
な点を示す。これらの問題は主として、ヒト単球と同様
な代謝的活性を有する細胞にとっては大部分の標準的実
験室培養培地の栄養素が制限されていることから生じ、
またさらにヒト単球を別のヒト個体から得られた血清
（ＡＢ血清）又は（ウシ胎児血清等の）他の種から得ら
れた血清で培養することによる潜在的な人為結果にもよ
る。従ってヒト単球を培養してＡＫＭに転換するための
一貫的で一様な条件がバッチ間で確保されない。
【０００６】ヒト単球の処理に関する上記の問題点は、
細胞がガン治療のための活性キラー単球（ａｃｔｉｖａ
ｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ＝ＡＫＭ）
に転換される場合に複合化する。本発明以前において
は、ガン患者の治療のための管理に適切である懸濁状態
でのＡＫＭの調整は不可能であった。また、生体外での
無血清懸濁培養ＡＫＭの細胞障害活性を監視する方法は
存在しなかった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、無血清
培地によりポリプロピレン製器具中にて懸濁状態で製造
される略純粋で臨床的等級の機能性ヒト活性キラー単球
が提供される。また本発明によれば、無血清培地内にて
懸濁状態で培養され活性キラー単球に転換された単離さ
れ略純粋なヒト単球の殺腫瘍機能を監視する効力検定方
法が提供される。
【０００８】さらに本発明によれば、免疫療法的量の無
血清培地内で懸濁し活性キラー単球に転換された単離精
製単球を、適宜の補助薬及び／又は生物学的応答調節剤
とともに、哺乳類に投与することからなる哺乳類のガン
の治療薬が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の目的は、無菌かつ無血清
の培地によりポリプロピレン製器具内にて懸濁状態で製
造され、生物学的応答調節剤及び／又は補助薬で活性キ
ラー単球（ＡＫＭ）に賦活された単離され略純粋では臨
床的等級の機能性ヒト単球を提供し、その殺腫瘍活性を
生体外で監視することで達成される。
【００１０】本発明の重要な特徴としては、ヒト単球に
とり不活性又は無毒であり、ヒト単球が付着又は粘着し
ない材料製の装置，容器，機器，実験器具等を用いるこ
とがある。操作段階を通じてヒト単球の処理に何らかの
関連を有する場合に無毒で非付着性の器具を用いること
が、本発明にとり決定的に重要である。本発明に従って
用いるのに適する不活性，無毒，非付着性かつ殺菌可能
な材料の好ましい例としてはポリプロピレンがある。ポ
リテトラフルオロエチレン以外の他の同様又は等価の材
料も、ヒト単球に対し無毒かつ非付着性であり臨床的等
級のＡＫＭが製造できる限り使用しうるのは勿論であ
る。
【００１１】本発明によれば、容器は剛性のポリプロピ
レンシート製である。かかる容器又は実験器具の例とし
ては、好ましくは０．１乃至２００ｍｌの容量の様々な
形状及び寸法のフラスコ及び微量滴定濃度板がある。勿
論都合上剛性ポリプロピレン容器の形状及び寸法は、試
験，培養又は他の準備作業で日常用いられる他の実験器
具と同様にされる。
【００１２】本明細書における用語「略純粋」又は「略
精製された」は、ヒト単球が本発明の技術分野における
通常の技能を有する者に公知の標準的技術及び方法で得
ることが可能である程度に純粋であることを意味する。
ただし単球が略純粋であるには９０パーセント以上の純
度が必要である。本明細書で用いられる用語「活性キラ
ー単球」つまりＡＫＭとは、単離単球が単球の免疫調整
的，生物学的又は物理化学的性質，本来的特性又は機能
を刺激，変更又は強化する作用物質又は因子にさらさ
れ、あるいはかかる作用物質又は因子により処理されて
いることを意味する。かかる作用物質又は因子として
は、適切な抗原，補助薬、生物学的応答調節剤（ＢＲ
Ｍ）等がある。
【００１３】本明細書で用いられる「不活性」容器と
は、容器の材料が前記容器にて培養される単球の自然
な、あるいは正常な機能に対し有害な毒性の影響を与え
ないことを意味する。ポリプロピレン容器は、臨床的等
級のＡＫＭを得るのに本発明にとり特に好ましい。従来
技術で提案されているテフロンは、本発明によって充分
な量の臨床的等級のＡＫＭを調整するのに適さない（デ
ータは示さない）。
【００１４】ＢＲＭとしては、インターフェロン（ＩＦ
Ｎ）等の天然サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ），イ
ンターロキシン−１等のリンホカイン，ポリリボイノシ
ン酸，ポリリボシチジル酸，ポリＬ−リシン，カルボキ
シメチルセルロース，（ポリＩＣＬＣ）及びレバミゾー
ル等の免疫モジュレート性を有する一定の合成化学物
質；バシル・カルメット・ゲラン（ＢＣＧ），コリネバ
クテリウム パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｐａｒｖｕｍ），ブドウ球菌蛋白物質Ａ，モノクロ
ール抗体，腫瘍抗原製剤等の免疫モジュレート補助薬な
どの様々な化合物がある。コロニー刺激因子（ＣＳＦ）
及びプロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）もＢＲＭとして適
切である。
【００１５】ヒト単球は、周知の技術によって末梢血液
から単離することができる。しかし単体の単離及び精製
で用いるのに好ましい方法及び材料は以下の通りであ
る。他の好ましい方法及び材料についても説明する。以
下に引用する文献は、全て本明細書内に組み入れられる
ものである。ヒトの単球の単離 白血球は白血球搬出法（遠心分離器II白血球搬出装置。
トラベノール ラボラトリーズ，ディアフィールド，イ
リノイ）により得られた。次いで単球は、非分画単核白
血球製剤から向流遠心溶出（ＣＣＥ）により精製される
（スチーブンソン及びフォーン「マニュアル オブ マ
クロファージメソドロジー」（マーセルデッカ，ニュー
ヨーク，７５−８０頁，１９８１）。次いで単球製剤の
純度及び生活能力が、前記のスチーブンソン及びフォー
シの文献に記載されている如く非特異エストラーゼ染色
法，ライト染色法及びラテックスビーズ摂取により判定
される。通常の供血者当りの単球の平均収量は、約５億
５千万細胞であった（スチーブンソン他，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２，３５３，１９８３）。
【００１６】培養技術 特別に開発されたポリプロピレン培養プレートを用いて
精製ヒト単球の単一細胞懸濁状態を維持せしめる新しい
培養技術が開発された。これらの培養プレートは、標準
的な２４ウェルの平底ポリエチレン培養プレートと９６
ウェルの丸底ポリエチレン培養プレートの正確な寸法と
一致する（コスター プラスチックス，ケンブリッジ，
マサチューセッツ）。ヒト単球は自動細胞カウンタ（エ
レクトロゾーン／セロスコープ，パーチクルデータ，エ
ルムハースト，イリノイ）により計数され、無血清培地
又は（ロズウェル パーク メモリアル インスチチュ
ート，バッファロー，ニューヨーク）ＲＰＭＩ １６４
０＋１０％ヒト血清＋Ｌ−グルタミン中に１０6 単球／
ｍｌの濃度で懸濁される。ヒト血清が用いられる場合１
０％を越える濃度が用いられてもＡＫＭ機能は改善され
ないため、ＲＰＭＩ１６４０血清中の１０％ヒトＡＢが
標準的血清含有培地として用いられた。使用された無血
清培地は、生体内で細胞障害のベータ−メルカプトエタ
ノールが省略されていることを除けばスチーブンソン他
（Ｔ．Ｉｍｍｕｒｄ．Ｍｅｔｈ．６５，１２９，１９６
３）により説明されている。細胞培養懸濁には抗生物質
は添加されなかった。ＡＫＭの賦活物質はインターロイ
キン−２（セタス）と、１−１０００単位／ｍｌの範囲
のガンマ・インターフェロン（ＩＳＮＹ）（ジェンテッ
ク）と、１０−２００ｍｇ／ｍｌの範囲のポリリボイノ
シン酸及びポリリボシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）（シグ
マ）とからなる。懸濁単球培養は、ポリプロピレン又は
ポリスチレン製実験器具中に入れられ５％ＣＯ2 恒温器
内で３７℃に保持された。インジウム−１１１標識ヒト
腫瘍ターゲットの致死レベルの極大は４８−７２時間培
養にあったが、その際にプレートは２００×ｇで回転さ
れ、細胞培養の上澄みが採取されてインジウム−１１１
放出が判定された。全ての培養は三重に行なわれた。
【００１７】パーセント（％）放出（ＫＭ腫瘍細胞致
死）は、Ａを試験ウェルから放出されたｃｐｍとし、Ｔ
を細胞内に含まれるｃｐｍ全体として、１００（Ａ／
Ｔ）で計算される。自発放出は、ターゲット細胞のみが
培養された際の％放出である。パーセント比ＡＫＭ媒介
細胞障害は、Ｂを刺激剤の存在下又は非存在下で単球及
びターゲットを収容する試験ウェルから放出されたｃｐ
ｍとし、ＣをＢと同一の刺激剤の存在下又は非存在下で
ターゲットのみを収容する試験ウェルから放出されるｃ
ｐｍとして１００（Ｂ−Ｃ）／（Ｔ−Ｃ）で得られる。
Ｃは自発放出と略一致したが、各実験毎に監視された。
Ｃが２５％を越えることは決してなかった。溶解単位の
計算は、既述の如くに行なわれた（スチーブンソン，Ａ
ｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２２，１２３，１９８６）。
【００１８】統計方法 各実験について、主たる変量（プレートの種類，培地の
種類及び賦活物質）の全てと主たる変量の相互作用を含
む線型統計モデルが用いられた。主たる効果の重要度を
決定するため細胞障害の生データについて変動の分析が
行なわれた。２レベル以上の因子については、対をなす
差の重要度を決定するためダンカン式多重レンジ試験が
行なわれた（スネデカー及びコクラン，「スタチスカル
メソッド」２３３−２３７頁，１９８０）。
【００１９】培養系変量のＡＫＭ殺腫瘍活性への効果 無血清の場合対ＡＢ血清の場合及びポリスチレン培養プ
レートの場合対ポリプロピレン培養プレートの場合の効
果が図１にまとめられている。図示の如く無血清培地
は、付着（ポリスチレン）培養系でも殺腫瘍活性の基底
レベルに大きな影響を与えなかった。これに対し最適量
の賦活剤が用いられた場合（Ｐ＝０．０３），無血清培
地はＡＫＭの殺腫瘍度を大幅に強めた。
【００２０】ＡＫＭは、ＡＢ状態及び無血清状態の両方
でポリスチレンプレートの場合に比べてポリプロピレン
プレート（Ｐ＜０．００１）の場合に大幅に強い殺腫瘍
細胞能力を示した。このことは、ＡＫＭによる腫瘍ター
ゲットへの攻撃がポリスチレン（Ｅ）プレートに比べポ
リプロピレン（Ｃ）プレートにおける方が強力であるこ
とを示し、またＡＫＭによる実際のターゲット致死をポ
リプロピレン（Ｄ）プレートの場合とポリスチレン
（Ｆ）プレートの場合とを対比して示す図２からもわか
る。前述無血清懸濁培養技術で監視されたＡＫＭの強化
された致死能力は、広範囲のヒト腫瘍（ＨＴ−２９，Ｌ
Ｓ １７４，ＳＫＢＲ３及びＫＡＴＯ−３）に適用可能
である（図３）。このＡＫＭの殺腫瘍機能を生成及び監
視する生体外技術により初めて溶解単位法による細胞障
害データの表現が可能となったのであり、以前のデータ
表示技術は、リンパ球による腫瘍細胞の致死にしか適用
しえない。図４に示される如く、これはポリプロピレン
器具中での無血清懸濁培養技術でのみ可能な再現性及び
投与−応答（エフェクター対ターゲット比）曲線データ
の増加によって可能となった。
【００２１】ヒトのガンのＡＫＭ療法 ＡＫＭ療法の目的は、ガン又は免疫機能不全患者の末梢
血液又は骨髄から相当数の白血球を取出し、その後一定
の細胞障害性白血球部分集合の精製を行なうことにあ
る。次いで、かかる精製白血球は、増量され及び／又は
生体外での殺腫瘍的又は免疫療法的活性にまで賦活され
て、その後それらの細胞は患者の腫瘍発生又は免疫機能
不全の部位に再注入される。
【００２２】任意のＡＫＭプロトコルの設計において幾
つかの臨床的に関連する判定基準を考慮しなければなら
ない。下記の表Ｉに示される如く、臨床的設定で使用し
うる単一，純粋，無菌，無毒な細胞障害白血球部分集合
を用いることが重要である（これは無菌ということだけ
でなく如何なる毒性も有さないということである）。純
粋な白血球を用いることにより、細胞型毎に正確な毒性
及び生理上の判定が可能となる。単一の細胞型の投与で
は免疫機能不全の改善又は治療がなされない場合には、
単一細胞型での基底的治療データに基づいて合理的「組
み合わせ活性白血球」プロトコルを設計することができ
る。
【００２３】患者へ注入されると臨床的効果を生じるの
に充分な数（少なくとも５億）の細胞を得ることが重要
である。細胞の凝集塊を注入しようとする際に生じる臨
床上の問題を避けるため細胞を懸濁状態で維持すること
が本質的である。白血球賦活物質は臨床的等級でなけれ
ばならない。移植対受容者疾患の問題が臨床的に最小と
されるまでは、ＥＶＬＡプロトコルは自己由来白血球に
限定されるのが好ましい。生体外の試験で患者の白血球
が患者の腫瘍細胞に対する活性を有することが認められ
たなら、細胞障害白血球を患者の腫瘍発生部位まで送り
とどける機構を考案しなければならない。
【００２４】
【表１】
【００２５】腹膜結腸直腸ガン腫症に対するＡＫＭプロ
トコル 前述の如く、単球／マクロファージ細胞型の多数ある免
疫エフェクター細胞機能としては、抗原呈示（ａｎｔｉ
ｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ），アルファ・イン
ターフェロン，インターロイキン１，コロニー刺激因子
等の一定の免疫調整生物学応答調節物質の生産，及び補
体系の一定の重要成分が特定されている。単球及びマク
ロファージは、肉芽種形式を含む幾つかの細胞媒体免疫
応答における主要な細胞性構成要素と考えられる。単球
及びマクロファージは食細胞であり、また免疫グロブリ
ンＧの受容体を表現するから抗体依存細胞性細胞障害反
応（ＡＤＣＣ）において大きな位置を占める。
【００２６】ヒトＡＫＭは、抗体とは独立し、またイン
ターフェロン及びムラミル・ジペプチド（ｍｕｒａｍｙ
ｌ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）等の物質により増大する腫瘍
ターゲットへの識別致死能力を有する。単球及びマクロ
ファージは、齧歯類の腫瘍及びヒトの腫瘍の両方での細
胞潤滑の主要構成要素である。ヒトの腫瘍及び齧歯類の
腫瘍の両方からの腫瘍附随マクロファージを用いた生体
外研究によれば、細胞は様々な生物学的応答調節物質に
より殺腫瘍活性にまで賦活される。前述の如く懸濁培養
系でのヒト血液単球の再現可能な生体外活性は勿論臨床
的に有用である。
【００２７】本発明によって初めてＡＫＭ療法が臨床的
に実現可能であり有効であることが示された。下記の表
IIに示される如くＡＫＭプロトコル設定におけるヒト血
液単球の処理に関連する幾つかの技術的論理的難点が解
決された。本明細書に記載されている新しい技術は、２
つの血液成分分離技術、つまりサイタフェレーシス（ｃ
ｙｔａｐｈｅｒｅｓｉｓ）（スチーブンソン他，Ｐｌａ
ｓｍａ Ｔｈｅｒ Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ．４：５７−６３，１９８３，フェンワルラボラトリ
ーズ，ディアフィールド，イリノイ）と、向流遠心溶出
（スチーブンソン，「メソッズイン エンチモロジー：
イミューノケミカル テクニックス，パート ジー」ニ
ューヨーク：アカデミック プレス，ベックマン ラボ
ラトリーズ，パロアルト，カリホルニア）とを組み合わ
せることで高度に精製された血液単球を多数単離するも
のである。本発明に従って、これらの技術を組み合わせ
て用いることで、細胞を懸濁状態のままとする消極的選
択処理により９０パーセント以上の濃度で１０9 より多
くのヒト単球を得ることが可能となる。こうして得られ
る細胞は、無菌かつ抗生物質又は有害物質を含まない。
前述の方法を用いることで単一の患者から充分な自己由
来単球が得られて良好な臨床的効果を示す。また腹膜結
腸直腸ガン腫症の患者について、これらの殺腫瘍性細胞
を腫瘍罹患部位に送りとどけることが可能であることが
確かめられている（下記の表III 及び図５）。
【００２８】
【表２】
【００２９】腹膜結腸直腸ガン腫症（ＰＣＣ）は、結腸
ガンの転移形であり、一般的に致命的である。従来有効
な治療法は存在しなかった。この病気は後期に（肺又は
骨等の）異なる器官に転移する傾向があり、直接局部的
に内蔵内へ拡がることでしばしば患者を死に到らしめ
る。この局部にとどまるという傾向のため、転移した病
変を局部的に除去するなら患者の延命及び生活の質が大
幅に改善することができる。テンクホフ（Ｔｅｎｃｋｈ
ｏｆｆ）カテーテルを５フルオロウラシル点滴のため腹
腔空間内へ挿入すること（「５−ＦＵ腹洗浄」プロトコ
ル）による従来の患者の研究（シュガーベーカー「プリ
ンシプルス アンド プラクチス オブオンコロジー」
フィラデルフィア：リッピニコット カンパニー，１９
８２）は殺腫瘍性白血球を患者の腫瘍罹患部位へ直接処
置するための良好な臨床的前提になる。
【００３０】本発明による腹膜結腸直腸ガン腫症に対す
るＡＫＭプロトコルは、メリーランド，ベセスダのナシ
ョナル キャンサー インスチチュートで行なわれた。
図５に示される如く、腹膜結腸直腸ガン腫症の診断を受
けた患者は、ナショナル キャンサー インスチチュー
トに託されて外科的に可能な限り病変を除去されるよう
デバルキング手術（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ ｓｕｒｇｅｒ
ｙ）を受け、あわせて腹腔空間に連通するテンクホフカ
テーテルを挿入される。手術直後に患者は約５億乃至９
億のＡＫＭを腹腔内注入される。これらの細胞は、２時
間のサイタフェレーシス後に向流遠心溶出による単球の
精製を行なって得られる。その後精製単球は、１０００
Ｕ／ｍｌの濃度のガンマ・インターフェロンで一晩懸濁
状態で培養される。一晩（約１２−１８時間）ガンマ・
インターフェロンで賦活後、ＡＫＭはテンクホフカテー
テルを通じて腹腔空間内へ注入される。さらに患者に
は、患者のＡＫＭが腹腔空間全体へ最大限の分布をなす
ようインペルゾール（トラベノール ラボラトリー．デ
ィアフィールド，イリノイ）等の腹腔洗浄液が２リット
ル注入される。患者が正確にこの形式の療法に反応した
かを判定するため、１６週間のＡＫＭ療法の完了時に
「再診」開腹が行なわれる。ＡＫＭ療法に対し完全又は
部分的な応答をしている患者には、６ヶ月間の維持ＡＫ
Ｍ療法が行なわれる。
【００３１】
【表３】
【００３２】ＡＫＭプロトコルについての臨床例 まず２人のＰＣＣ患者が、ナショナル キャンサー イ
ンスチチュートの生物学治療及び手術局で単球ＡＫＭプ
ロトコルによる治療を受けた。２人の患者は、疾患の性
質及びＡＫＭ療法に対する反応が非常に類似していた。
両者は白人女性で、年齢は３８歳と４１歳であり、一方
は腹膜直腸結腸ガン腫瘍の診断を受けて１２ヶ月にな
り、他方は６ヶ月になっていた。２人の患者には遠方転
移の疾患の証拠はなく、またどちらの患者も他の重大な
病気にかかっていなかった。患者の機能的な状態は優良
であった。２人の患者は、腹膜面が重度のガンにおかさ
れており、壁側腹膜で無事な部分は実質上なかった。し
かし２人の患者は、小腸に他の部分より視覚的に少ない
転移疾患を有していた。はっきりと目に見える疾患をで
きる限り除去することは成功した。一方の患者は悪性疾
患の切除のため結腸の相当部分を除去する必要があっ
た。他方の患者は同じ目的のため脾臓を除去する必要が
あった。
【００３３】２人の患者ともＡＫＭ療法に非常によく耐
えた。第２の患者の場合から得られたことだが、この療
法は患者が初めのデバルキング手術から回復した後は外
来患者部で行なわれても安全である。典型的には患者
は、ある日の朝外来患者部のサイタフェレーシスユニッ
トに来て５乃至９×１０9 の白血球を取り出す２時間の
サイタフェレーシス処置を受ける。この処置後患者は帰
宅する。その午後及び晩に患者の単球が溶出により精製
されてガンマ・インターフェロン（１０００Ｕ／ｍｌ）
とともに懸濁培養される。翌朝患者は外来患者部へ戻
り、患者のＡＫＭ及び２リットルの付加的腹腔内インペ
ルゾールを注入される。この注入には通常３０分かか
る。それから患者は経口鎮痛薬及びタイレノールを受け
取って帰宅する。通常ＡＫＭの注入後４乃至６時間以内
に軽度の発熱（一貫して１０１°Ｆ（３８．３℃）未
満）及び軽度の腹痛が開始する。熱はタイレノールで処
理可能であり、痛みも通常経口鎮痛薬で処理可能である
（痛みが激しい場合には患者は外来患者部で非経口麻酔
薬を支給される）。１２時間以内に軽度の発熱及び腹痛
は通常おさまった。２人の患者は週の残りには通常の日
常生活を行なった。２人の患者とも、初めの４乃至７回
のサイタフェレーシス処置後に顆粒球減少症（全白血球
計数が約３５００）となった。これに関連してＡＫＭ治
療の頻度が、末梢白血球計数を正規化して１週間おきに
１度調整される。
【００３４】プロトコルの途中で、腹腔中に注入された
ＡＫＭの流通パターンが 111Ｉｎで予め標識付けること
で分析される。図６は腹腔空間中での 111Ｉｎ標識ＡＫ
Ｍの典型的分布を示す。分布は、再診手術時に手術後癒
着によることが示された取込み減少のまだら領域が数個
あるが一様である。111Ｉｎ標識単球の腹腔内注入後５
日以内にこれらの患者から解釈可能な像が得られる時に
は、これらの細胞が腹腔空間外に流出しないことがわか
る。これらの細胞は腹膜の細胞マトリクスに取り入れら
れて、おそらく組織マクロファージに転換していると思
われる。
【００３５】図６の上方の２つの図はｒインターフェロ
ン賦活単球による１６週間の生体外白血球賦活療法を行
なった場合の患者腹膜の単球浸潤の程度を示す（３６時
間は 111Ｉｎの標識単球の最終的注入が行なわれた）。
この２つの図中左の図は腹膜ライニングでのエステラー
ゼ染色陽性細胞のパーセンテージを示し、右の図は腹膜
組織区画のオートラジオフィック分析が行なわれ 111Ｉ
ｎで標識付けられた腹膜細胞を示す。
【００３６】前記の２人の患者はともに「再診」開腹段
階処置を受けた。２人とも、最初の手術の際は数万の転
移病変により最も重度に潤滑されていた部位を含めて腹
膜の表面の大部分が正常化していた。どちらの患者にも
結腸又は内蔵に大きな病変は見られず、また離間した転
移も発見されなかった。ただし両者とも、単球の接近が
（主として腹膜癒着により）制限された部分に非常に僅
かな進行性疾患（ＰＤ）があった。患者は、癒着を除去
して、これらの領域を露出せしめ、手術（Ｏ）で病変
（全て１ｃｍ未満）を摘出することで疾患から解放され
た。従って疾患は“Ｏ−ＰＤ”状態となった。
【００３７】次いで、２人の患者は、再診開腹処置から
回復後に維持療法を受けた。２人の患者とも３年以上に
わたり疾病の再発をみていない。下記の表にまとめられ
た如く、さらに４人のＰＣＣガン患者がＡＫＭ療法で治
療され、２人が２年以上にわたり局部的再発をこうむら
ずにいる。
【００３８】
【表４】
【００３９】ただし表IVにおいてＡＫＭは活性キラー単
球を、ＰＣＣは腹膜結腸直腸ガン腫症を、ｎＩＦＮγは
天然インターフェロンγを、ＯＰ−Ｄは２度目の手術の
際（単球の接近が制限された領域に）進行性疾患の小さ
い領域が発見されて、外科的に治癒されたことを、Ｉ−
ＰＤは腹膜進行性疾患（外科手術不能）を、ｒＩＦＮγ
は組み換えインターフェロンγを、ＳＤは安定疾患を表
わす。
【００４０】また腹膜刺激の等級は、第０等級はなにも
なく、第１等級は経口鎮痛薬で処理可能であり、第２等
級は非経口麻酔薬が必要であり、第３等級は静脈内液体
及び鼻腔ガス吸入が必要であることを示す。上述の結果
は、ＡＫＭによる腹膜結腸直腸ガン腫症の免疫療法が実
現可能でかつ有効な手続きであることを明示する。抗腫
瘍効果を最大にするため、ＡＫＭを天然キラーリンパ
球、抗原特異的キラーリンパ球、Ｂ細胞等と組み合わせ
てもよい。かかる「組み合わせ活性白血球療法」は本来
の免疫系と代替し、又は免疫系を補完，模範又は再構成
する。
【００４１】勿論生体外で懸濁状態で培養された自己由
来ＡＫＭが利用可能であるということは、免疫調整系が
免疫不全により悪影響を受けた哺乳類における免疫調整
系の免疫療法及び／又は強化及び補完に新しい展望を開
く。以上を要約するに、本発明は無血清培地により生体
外において懸濁状態で培養された単離され略純粋なヒト
ＡＫＭの殺腫瘍性機能の監視技術を開示する。ヒトにお
けるガン及び免疫不全等の状態の治療にヒトＡＫＭを応
用することも開示されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】無血清懸濁培地状態で培養された活性キラー単
球（ＡＫＭ）では殺腫瘍細胞能力が強化されていること
を示す図である。
【図２】ポリプロピレン培地状態（Ｃ及びＤ）とポリス
チレン培地状態（Ｅ及びＦ）とを対比して生体外でのＡ
ＫＭ（▲）と腫瘍ターゲット細胞（↑）の高級致死相互
作用に係る生物の形態を示す走査型電子顕微鏡写真であ
る。
【図３】ポリプロピレン培地状態とポリスチレン培地状
態とを対比して様々なヒト腫瘍ターゲットに対するＡＫ
Ｍによる致死効果の増強を示す図である。
【図４】溶解単位法で表わされた、本発明による無血清
懸濁状態でのみ可能なＡＫＭによる腫瘍細胞致死を示す
図である。
【図５】腹膜結腸ガン腫症に対するＡＫＭプロトコルで
の手続きのフローチャートである。
【図６】111Ｉｎ標識ＡＫＭの腹膜結腸直腸ガン腫症患
者への注入後４時間後の腹膜内での 111Ｉｎ標識ＡＫＭ
の分布に係る生物の形態を示す図である。
【図７】腹腔空間中での 111Ｉｎ標識ＡＫＭの典型分布
を示す図である。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (a) 溶出によりヒト単球を精製する段階
    と、 (b) γ−インターフェロン及び 111Ｉｎ標識ヒト腫瘍タ
    ーゲット細胞とともに無血清にてポリプロピレン器具中
    ３７℃の試験ウェル内で反応が起こるに充分な時間精製
    ヒト単球を培養する段階と、 (c) 約４８乃至７２時間後培養上澄みを採取し、Ａを試
    験ウェルから放出される 111Ｉｎ計数値とし、Ｔをター
    ゲット細胞内に取り込まれた全体の 111Ｉｎ計数値とし
    て式Ａ／Ｔ×１００により活性キラー単球の殺腫瘍活性
    を判定し、Ｂを賦活剤の存在下又は非存在下で単球及び
    ターゲット細胞を伴う試験ウェルから放出される 111Ｉ
    ｎ計数値とし、ＣをＢと同一の賦活剤の存在下又は非存
    在下でターゲット細胞を伴う試験ウェルからの 111Ｉｎ
    計数値として式（Ｂ−Ｃ）／（Ｔ−Ｃ）×１００で活性
    キラー単球の比殺腫瘍活性を判定する段階とを順次行な
    うことからなる活性キラー単球の殺腫瘍活性の監視方
    法。
  2. 【請求項２】 (a) ポリプロピレン容器内の無血清培地
    より精製されたヒト単球を溶出により単離する段階と、 (b) 上記段階(a)で得られた単球をポリプロピレン容器
    内の無血清培地中の有効量のγ−インターフェロンで約
    ４８乃至７２時間培養することにより転換し、臨床グレ
    ードの活性キラー単球を生産する段階とを含む活性キラ
    ー単球の生産方法。
  3. 【請求項３】 請求項２記載の方法により生産された免
    疫療法的有効量の活性キラー単球からなる免疫療法が必
    要な患者に腹膜投与する結腸直腸ガンの治療薬。
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