JPH0367585A - 活性キラー単球及び活性キラー単球の殺腫瘍活性の監視方法 - Google Patents

活性キラー単球及び活性キラー単球の殺腫瘍活性の監視方法

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JPH0367585A
JPH0367585A JP1158120A JP15812089A JPH0367585A JP H0367585 A JPH0367585 A JP H0367585A JP 1158120 A JP1158120 A JP 1158120A JP 15812089 A JP15812089 A JP 15812089A JP H0367585 A JPH0367585 A JP H0367585A
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monocyte
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US Government
US Department of Commerce
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、一般にはガン治療法に関し、特にガン患者に
ついて無血清媒培地内で懸濁状態で培養される精製ヒト
単球の殺腫瘍活性の監視に関する。
従来の技術 単核食細ｍ（単Ｍ）は、様々な形式で哺乳類免疫反応の
多くの重要な段階に関与することが知られている。単球
及びマクロファージは、抗原を処理しうるために免疫応
答の開始にとり本質的であること（ローゼンタール、ニ
ュー　イングランドジャーナル　オブ　メデイシン、　
　３Ｇ３，１１５３．１９８０）また幾つかの免疫応答
の免疫調整機構として働くインターロイキン１　（ＩＬ
−１＞、コロニー刺激因子（ｃ８Ｆ）、インターフェロ
ン（ＩＦＮ）及びプロスタグランジン（ＰＧＥ）を分泌
するという能力の故に本質的であること（エプスタイン
。
バイオロジー　オプ　リンフオカインス：アカデミック
　プレス、ニューヨーク、　　１２３−１５２頁。
１９７９　：スチーブンソン、ザ　リチキュロエンドテ
リアル　システム、ア　コンプリヘンシブ　トリーティ
ス、第■巻：プレナム　プレス、ニューヨーク、７９−
９１頁、　　１９８８２）が知られている。
また単球は、補体成分を分泌しくナーサン他、ニュー　
イングランド　ジャーナル　オブ　メデイシン、　３０
３，６２３，１９８０）　、細胞障害機能を媒介するた
め体液性免疫における最終エフアクタ−細胞として重要
な役割を果たすことが知られている。抗原依存性細胞障
害（ポツプラック他、ブラッド４８　、８９０．１９７
６）のほかに、活性キラー単球（ＡＫＭ）が腫瘍細胞の
有力なキラーとして知られている（スチーブンソン他、
アーチフィシャル　オーガン　１１２．　ｉ２８．１９
８８）。
発明が解決しようとする問題点 生体外でのヒト単球及びＡＫＭの機能を評価は、幾つか
の技術的理論的問題点により阻害される。
第１には単球はヒト末梢血液中の細胞のごく一部でしか
ない（通常５％未満〉ため、多数を得るのは非常に困難
であった。またｍ極内選択によりヒト単球の精製群を大
規模に単離する技術は非常に少なかった。従来は、慨し
て小数のやや低純度の単球がパーコール等のグラデイエ
ンド上で単離されるか（ヘスター他、　１９８１）　、
あるいは高純度の［ｌ胞が、ＨＡ積極的選択よりプラス
チック又はガラス製の実験器具に付着されて得られる（
ウェーブ。
Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　　１４７，１６９５．１９
７８）。
単球が積極的選択で得られる場合には、さらに調べるた
め単球をはぎ取るのが困難であり、プラスチック又はガ
ラス表面から付着した細胞をはぎ取るためゴム冠ポリス
マン（ペンライン、マニュアルオブ　マクロファージ　
メソドロジー、６５−７７頁、　１９８１）　、　ＥＤ
ＴＡ　（アッカーマン及びダグラス、　Ｊ、　　Ｉｕｕ
ｎｏｌ、１２Ｇ、１３７２．１９７９）、及びライドカ
イン含有溶液（コスキ他、イン　ビトロメソッズ　イン
　セル−メゾイエ−テッド　アンド　チュマル　イミユ
ニティ、アカデミツク　プレス３５９頁、　１９７６）
　、等の様々なやや苛酷な手段が用いられる。細胞が培
養中でＡＫＭに賦活される場合には、大部分の研究者は
単球が容易に付着するポリスチレン製実験器具等を用い
ているため付着と積極的選択の潜在的な問題点が複合化
する。
ｔｊ着した単球は勿論ヒト末梢血液での正常な懸濁（浮
遊）状態とは異なる状態にある。従って、機能も異なっ
ていることがありうる。ヒト単球は通常培養される培地
状態に置かれる場合幾つかの技術的に不適切な点を示す
。これらの問題は主として、ヒト単球と同様な代謝的活
性を有する細胞にとっては大部分の標準的実験室培養培
地の栄養素がＩＩＪ服されていることから生じ、またさ
らにヒト単球を別のヒト個体から得られた血清（ＡＢ血
清）又は（ウシ胎児血清等の）他の種から得られた血清
で培養することによる潜在的な人為結果にもよる。従っ
てヒト単球を培養してＡＫＭに転換するための一貫的で
−様な条件がバッチ間で確保されない。
ヒト単球の処理に関する上記の問題点は、細胞がガン治
療のための活性キラー単球（ａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｌ
ｌｅｒ　ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ＝　Ａ　Ｋ　Ｍ　＞に転換
される場合に複合化する。本発明以前においては、ガン
患者の治療のための管理に適切ある懸濁状態でのＡＫＭ
の調整は不可能であった。また、生体外での無血清懸濁
培養ＡＫＭの細胞障害活性を監視する方法は存在しなか
った。
ｒ／４題点を解決するための手段 本発明によれば、無血清培地によりポリプロピレン製器
具中にて懸濁状態で製造される略純粋で臨床的等級の機
能性ヒト活性キラー単球が提供される。
また本発明によれば、無血清培地内にて懸濁状態で培養
され活性キラー単球に転換された単離され略純粋なヒト
単球の殺腫瘍機能を監視する効力検定方法が提供される
。
ざらに本発明によれば、免疫療法的量の無血清培地内で
懸濁し活性キラー単球に転換された単離精製単球を、適
宜の補助薬及び／又は生物学的応答調節剤とともに、哺
乳類に投与することからなる哺乳類のガンの治療方法が
提供される。
実施例 本発明の目的は、無菌かつ無血清の培地によりポリプロ
ピレン製器具内にて懸濁状態でＩＩ造され、生物学的応
答調節剤及び／又は補助薬で活性キラー単球（ＡＫＭ）
に賦活された単離され略純粋では臨床的等級の機能性ヒ
ト単球を提供し、その殺腫ｌｓ活性を生体外で監視する
ことで達成される。
本発明の重要な特徴としては、ヒト単球にとり不活性又
は無毒であり、ヒト単球が付着又は粘着しない材料製の
装置、容器２機器、実験器具等を用いることがある。操
作段階を通じてヒト中球の処理に何らかの関連を有する
場合に無毒で非付着性の器具を用いることが、本発明に
とり決定的に重要である。本発明に従って用いるのに適
する不活性、無毒、非ｔ４着性かつ殺菌可能な材料の好
ましい例としてはポリプロピレンがある。ポリテトフフ
ルオロエチレン以外の他の同様又は等価の材料も、ヒト
単球に対し無毒かつ非付着性であり臨床的等級のＡＫＭ
が製造できる限り使用しうるのは勿論である。
本発明によれば、容器は剛性のポリプロピレンシート製
である。かかる容器又は実験器具の例としては、好まし
くは０．１乃至２００Ｉｄの容量の様々な形状及び寸法
のフラスコ及び微量滴定濃度板がある。勿論都合上剛性
ポリプロピレン容器の形状及び寸法は、試験、培養又は
他の準備作業で日常用いられる他の実験器具と同様にさ
れる。
本明細書における用語「略純粋」又は「略精製された」
は、ヒト単球が本発明の技術分野における通常の技能を
有する者に公知の標準的技術及び方法で得ることが可能
である程度に純粋であることを意味する。ただし単球が
略純粋であるには９０パ一セント以上の純度が必要であ
る。
本明細１で用いられる用語「活性キラー単球」つまりＡ
ＫＭとは、単離単球が単球の免疫調整的。
生物学的又は物理化学的性質９本来的特性又は機能を刺
激、変更又は強化する作用物質又は因子にさらされ、あ
るいはかかる作用物質又は因子により処理されているこ
とを意味する。かかる作用物質又は因子としては、適切
な抗原、補助薬、生物学的応答調節剤（ＢＲＭ）等があ
る。
本明細書で用いられる「不活性」容器とは、容器の材料
が前記容器にて培養される単球の自然な、あるいは正常
な機能に対し有害な毒性の影響を与えないことを意味す
る。ポリプロピレン容器は、臨床的等級のＡＫＭを得る
のに本発明にとり特に好ましい。従来技術で提案されて
いるテフロンは、本発明によって充分な量の臨床的等級
のＡＫＭをａ！ｉＪするには適さない（データは示さな
い）。
ＢＲＭとしては、インターフェロン（ＩＦＮ＞等の天然
サイト力イン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、インクーロキシ
ン−１等のリンボカイン、ポリリボイノシン酸、ポリリ
ボシチジル酸、ポリＬ−リシン、カルボキシメチルセル
ロース、（ポリＩＣＬＣ）及びレバミゾール等の免疫モ
ジュレート性を有する一定の合成化学物質；バシル・カ
ルメット・ゲラン（ＢＣＧ）、コリネバクテリウム　パ
ルブム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｓ　ｐａｒｖｕ
ｍ　）　、ブドウ球薗蛋白物質Ａ、モノクロール抗体、
腫瘍抗原製剤等の免疫モジュレート補助薬などの様々な
化合物がある。
コロニー刺激因子（ｃ８Ｆ）及びプロスタグランジンＥ
　（ＰＧＥ）もＢＲＭとして適切である。
ヒト−単球は、周知の技術によって末梢血液から単離す
ることができる。かし単体の単離及び精製で用いるのに
好ましい方法及び材料は以下の通りである。他の好まし
い方法及び材料についても説明する。以下に引用する文
献は、全て本明細書内に組み入れられるものである。
（五立皇且及１１ 白血球は白血球搬出法〈遠心分離器■白血球搬出装置。
トラベノール　ラボラトリーズ、ディアフィールド、イ
リノイ）により得られた。次いで単球は、非分画単核白
血球製剤から向流遠心溶出（ｃＣＥ）により精製される
（スチープンソン及びフォーン「マニュアル　オブ　マ
クロファージメソドロジー」　（マーセル　デツカ、ニ
ュヨーク。
７５−８０頁、　１９８１）。９次いで単球製剤の純度
及び生活能力が、前記のスチープンソン及びフォーンの
文献に記載されている如く非特異エストラ−ぜ染色法、
ライト染色法及びラテックスビーズ摂取により判定され
る。通常の供血者当りの単球の平均収量は、約５億５千
万細胞であった〈スチーブンソン他、　Ｊ　、　　Ｉ　
ｍ５ｕｎｏｆ、　Ｍｅｔｈ　、　６２　、３５３゜１９
８３）。
乳棗反亘 特別に開発されたポリプロピレン培養プレートを用いて
ｖＪ製ヒト単球の単一細胞懸濁状態を緒持せしめる新し
い培養技術が開発された。これらの培養プレートは、標
準的な２４ウエルの平底ポリエチレン培養プレートと９
６ウエルの丸底ポリエチレン培養プレートの正確な寸法
と一致する（コスタ−プラスチックス、ケンブリッジ、
マサチューセッツ）。ヒト単球は自動細胞カウンタ（エ
レクトロゾーン／セロスコープ、パーチクルデータ、エ
ルムハースト、イリノイ）により計数され、無血清培地
又は（ロズウエル　バーク　メモリアル　インスチチュ
ート、バッファロー、ニューヨーク）ＲＰＭｌ　　１６
４０＋１０％ヒト血清＋Ｌ−グルタミン中に１０６単球
／ｄのｍ度で懸濁される。ヒト血清が用いられる場合１
０％を越える濃度が用いられてもＡＫＭＩｍ能は改善さ
れないため、ＲＰＭ　ｌ　１６４０血清中の１０％ヒト
ＡＢが標準的血清含有培地として用いられた。使用され
た無血清培地は、生体内で細胞障害のベーターメルカプ
トエタノールが省略されていることを除けばスチーブン
ソン他（Ｔ、　　Ｉａ＋ｍｕｒｄ、Ｍｅｔｈ、６５，１
２９．１９６３）ニより説明されている。細胞培ｍｓ濁
には抗生物質は添加されなかった。ＡＫＭの賦活物質は
インターロイキン−２（セタス）と、１−ｉｏｏｏ単位
／Ｉ１１の範囲のガンマ・インターフェロン（ＩＳＮＹ
）（ジエンチック）と、１０−２００１１１１／ｄの範
囲のポリリボイノシン酸及びポリリボシチジル酸（ポリ
に〇）（シグマ〉とからなる。懸濁単球培養は、ポリプ
ロピレン又はポリスチレン製実験器具中に入れられ５％
ＣＯ２恒温器内で３７℃に保持された。
インジウム−１１１標識ヒト１ｌａｉターゲツトの致死
レベルの極大は４８−７２時間培養にあったが、その際
にプレートは２００Ｘ　９で回転され、細胞培養の上澄
みが採取されてインジウム−１１１放出が判定された。
全ての培養は三重に行なわれた。
パーセント（％）放出（ＡＫＭＩＩＩ！細胞致死）は、
八を試験ウェルから放出されたＣｐｌとし、Ｔを細胞内
に含まれるＣｐｌ全体として、１００　（Ａ　／Ｔ〉で
計算される。自発放出は、ターゲット細胞のみが培養さ
れた際の％放出である。パーセント比ＡＫＭ媒介細胞障
害は、Ｂを刺激剤の存在下又は非存在下で単球及びター
ゲットを収容する試験ウェルから放出されたｃｐ−とじ
、Ｃを８と同一の刺激剤の存在下又は非存在下でターゲ
ットのみを収容する試験ウェルから放出されるＣｐｌと
して１０Ｇ（Ｂ−Ｃ）／　（Ｔ−Ｃ）で得られる。Ｃは
自発放出と略一致したが、各実験毎に監視された。
Ｃが２５％を越えることは決してなかった。溶解単位の
引算は、既述の如くに行なわれた（スチーブンソン、　
Ａｓ、Ｊ、　Ｈｅｇｉａｔｏｌ、２２，１２３．１９８
６）。
腹且五五 各実験について、主たる変量（プレートの種類。
培地の種類及び賦活物質）の全てと主たる変量の相互作
用を含む線型統計モデルが用いられた。主たる効果の重
要度を決定するため細胞障害の生データについて変動の
分析が行なわれた。２レベル以上の因子については、対
をなす差の重要度を決定するためダンカン式多重レンジ
試験が行なわれた（スネデカー及びコクラン、「スタチ
スカルメソッドＪ　　２３３−２３７頁、　１９８０）
。
無血清の場合対ＡＳ血清の場合及びポリスチレン培養プ
レートの場合対ポリプロピレン培養プレートの場合の効
果が第１図にまとめられている。
図示の如く無血清培地は、付着（ポリスチレン〉培養系
でも殺Ｓ瘍活性の基底レベルに大きな影響を与えなかっ
た。これに対し最適量の賦活剤が用いられた場合（ｐ＝
　０．０３）、無血清培地はＡＫＭの殺腫瘍度を大幅に
強めた。
ＡＫＭは、ＡＢ状態及び無血清状態の両方でポリスチレ
ンプレートの場合に比べてポリプロピレンプレート（ｐ
＜　０．００１）の場合に大幅に強い殺腫瘍細胞能力を
示した。このことは、ＡＫＭによる腫瘍ターゲットへの
攻撃がポリスチレン（Ｅ）プレートに比ベボリプＯピレ
ン（ｃ）プレートにおける方が強力であることを示し、
またＡＫＭによる実際のターゲット致死をポリプロピレ
ン（Ｄ）プレートの場合とポリスチレン（Ｆ）プレート
の場合とを対比して示す第２図からもわかる。前述無血
清懸濁培養技術で監視されたＡＫＭの強化された致死能
力は、広範囲のヒト［４１！（ＨＴ−２９゜ＬＳ　１７
４，５ＫＢＲ３及びＫＡＴＯ−３）に適用可能である〈
第３図〉。このＡＫＭの殺ｌｌ瘍機能を生成及び監視す
る生体外技術により初めて溶解単位法による細胞障害デ
ータの表現が可能となったのであり、以前のデータ表示
技術は、リンパ球による１ｒｉｓ細胞の致死にしか適用
しえない。第４図に示される如く、これはポリプロピレ
ン器具中での無血清懸濁培養技術でのみ可能な再現性及
び投与一応答（エフェクタ一対ターゲット比〉曲線デー
タの増加によって可能となった。
ヒ　　の　　゛　の　　ＬＭＪＵ ＡＫＭｌｌ［法の目的は、ガン又は免疫機能不全患者の
末梢血液又は骨間から相当数の白血球を取出し、その後
一定の細胞障害性白血球部分集合の精製を行なうことに
ある。次いで、かかる精製白血球は、増量され及び／又
は生体外での殺腫瘍的又は免疫療法的活性にまで賦活さ
れて、その後それらの細胞は患者の腫瘍発生又は免疫機
能不全の部位に再注入される。
任意のＡＫＭプロトコルの設計において幾つかの臨床的
に関連する判定基準を考慮しなければならない。下記の
表Ｉに示される如く、臨床的設定で使用しつる単一、純
粋、無菌、無毒な細胞障害白血球部分集合を用いること
が重要である（これは無菌ということだけでなく如何な
る毒性も有さないということである）。純粋な白血球を
用いることにより、細胞型毎に正確な毒性及び生理上の
判定が可能となる。単一の細胞型の投与では免疫機能不
全の改善又は治療がなされない場合には、単一細胞型で
の基底的治療データに基づいて合理的］°組み合わせ活
性白血球」プロトコルを段重することができる。
患者へ注入されると臨床的効果を生じるのに充分な数（
少なくとも１ｍ）の細胞を得ることが重要である。細胞
の凝集塊を注入しようとする際に生じる臨床上の問題を
避けるため細胞を懸濁状態で維持することが本質的であ
る。白血球賦活物質は臨床的等級でなければない。移植
対受容者疾患の問題が臨床的に最小とされるまでは、Ｅ
ＶＬＡプロトコルは自己由来白血球に限定されるのが好
ましい。生体外の試験で患者の白血球が患者の腫瘍細胞
に対する活性を有することが認められたなら、細胞障害
白血球を患者の腫瘍発生部位まで送りとどける機構を考
案しなければならない。
生 前述の如く、単球／マクロファージ細胞型の多数ある免
疫エフェクター細胞機能としては、抗原呈示（ａｎｔｉ
ｇｅｎ　ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）　、アルフ７’イ
ンターフェロン、インターロイキン１．コ〇ニー刺激因
子等の一定の免疫調整生物学応答１ｌｌｉ５ＩＩＪ質の
生産、及び補体系の一定の重要成分が特定されている。
単球及びマクロファージは、肉芽種形式を含む幾つかの
細胞媒体免疫応答における主要な細胞性構成要素と考え
られる。単球及びマクロファージは食細胞であり、また
免疫グロブリンＧの受容体を表現するから抗体依存細胞
性細胞障害反応（ＡＤＣＣ＞において大きな位置を占め
る。
ヒトＡＫＭは、抗体とは独立し、またインターフェロン
及びムラミル・ジペプチド（膳ｕｒａｍｙｌｄｉＥｌｅ
ｌ）ｔｉｄｅ）等の物質により増大する腫瘍ターゲット
への識別致死能力を有する。単球及びマクロファージは
、誓歯類の腫瘍及びヒトのｉｌ！！の両方での細胞潤滑
の主要構成要素である。ヒトの腫瘍及びＭｔｌｊＪ類の
腫瘍の両方からの腫瘍附随マクロファージを用いた生体
外研究によれば、細胞は様々な生物学的応答調節物質に
より殺腫瘍活性にまで賦活される。前述の如く懸濁培養
系でのヒト血液単球の再現可能な生体外活性は勿論臨床
的に有用である。
本発明によって初めてＡＫＭ療法が臨床的に実現可能で
あり有効であることが示された。
下記の表■に示される如＜ＡＫＭプロトコル設定におけ
るヒト血液単球の処理に関連する幾つかの技術的論理的
難点が解決された。水田１１８１に記載されている新し
い技術は、２つの血液成分分離技術、つまりサイタフニ
レ−シス（ｃｙｔａｐｈｅｒｅｓｉｓ）（スチープンソ
ン他、　Ｐｌａｓｍａ　Ｔｈｅｒ　Ｔｒａｎｓｆｕｓ。
Ｔｅｃｈｎｏｌ、４：５７−６３．１９８３　、）Ｉン
ワルラボラトリーズ、ディアフィールド、イリノイ）と
、向流遠心溶出（スチーブンソン、「メソツズイン　エ
ンチモ口ジ一二イミューノケミカル　テクニックス。
パート　ジー」ニュヨーク：アカデミック　プレス、ベ
ックマン　ラボラトリーズ、パロ　アルド。
カリホルニア）とを組み合わせることで高度に精製され
た血液単球を多数単離するものである。本発明に従って
、これらの技術を組み合わせて用いることで、細胞を懸
濁状態のままとする消極的選択処理により９０パ一セン
ト以上の濃度で１０９より多くのヒト単球を得ることが
可能となる。こうして得られる細胞は、無菌かつ抗生物
質又は有害物質を含まない。前述の方法を用いることで
単一の患者から充分な自己由来単球が得られて良好な臨
床的効果を示す。また腹膜結腸直腸ガン鰻症の患者につ
いて、これらの殺腫瘍性細胞を腫ｓ！Ｉ患部位に送りと
どけることが可能であることが確められている（下記の
表■及び第５図）。
ｍ膜結腸直腸ガン腫症（ＦＣＣ）は、結腸ガンの転移形
であり、−殻内に致命的である。従来有効な治療法は存
在しなかった。この病気は後期に（肺又は骨等の）異な
る器管に転移する傾向があり、直接局部的に内蔵内へ拡
がることでしばしば患者を死に敗らしめる。この局部に
とどまるという傾向のため、転移した病変を局部的に除
去するなら患者の延命及び生活の質が大幅に改善するこ
とができる。テンクホフ（Ｔ　ｅｎｃｋｈｏｆｆ）カテ
ーテルを５フルオロウラシル点滴のため腹腔空間内へ挿
入すること（ｒ５−ＦＵＩＩｕ洗浄」プロトコル）によ
る従来の患者の研究（シュガーベーカー「プリンシプル
ス　アンド　プラクチス　オブ　オンコロジー」フィラ
デルフィア：リッピニコットカンパニー、　１９８２）
は殺！ｓ瘍性白血球を患者の腫瘍羅患部位へ直接処置す
るための良好な賜床的前提になる。
本発明による腹膜結腸直腸ガン腫症に対するＡＫＭプロ
トコルは、メリーランド、ベセダのナショナル　キャン
サー　インスチチュートで行なわれた。第５図に示され
る如く、腹膜結腸直腸ガン腫症の診断を受けた患者は、
ナショナル　キャンサー　インスチチュートに託されて
外科的に可能な限り病変を除去されるようデバルキング
手術（ｄｅｂｕｌｋｉｎｕ　５ｕｒｏｅｒｙ）を受け、
あわせて腹腔空間に連通するテンクホフカテーテルを挿
入される。
手術直後に患者は約５ｍ乃至９ｍのＡＫＭを腹腔的注入
される。これらの細胞は、２時間のサイタフニレ−シス
後に向流遠心溶出による単球の精製を行なって得られる
。その後Ｍ製単球は、１００ＯＬＩ／ｊ１１！の濃度の
ガンマ・インターフェロンで一晩懸濁状態で培養される
。−晩（約１２−１８時間）ガンマ・インターフェロン
で賦活後、ＡＫＭはテンクホフカテーテルを通じて腹腔
空間内へ注入される。さらに患者には、患者のＡＫＭが
腹腔空間全体へ最大限の分布をなすようインベルゾール
（トラベノール　ラボラトリ−、ディアフィールド、イ
リノイ）等の腹腔洗浄液が２リツトル注入される。患者
が正確にこの形式の療法に反応したかを判定するため、
１６週間のＡＫＭ１１法の完了時に「再診」開腹が行な
われる。ＡＫＭ療法に対し完全又は部分的な応答をして
いる患者には、６まｆ２人のＦＣＣ患者が、ナショナル
　キャンサー　インスチチュートの生物学治療及び手術
局で単球ＡＫＭプロトコルによる治療を受けた。２人の
患者番ユ、疾患の性質及びＡＫＭ療法に対する反応が非
常に類似していた。両者は白人女性で、年齢番１３８１
と４１ｒ４であり、−万は腹膜直腸結腸ガン腫瘍の診断
を受けて１２ケ月になり、他方は６ケ月になっていた。
２人の患者には遠方転移の疾患の証拠はなく、またどち
らの患者も他の重大な病気にかかっていなかった。患者
の機能的な状態は優良であった。２人の患者は、腹膜面
が重度のガンにおかされており、壁側腹膜で無事な部分
は実質上なかった。しかし２人の患者は、小腸に他の部
分より視覚的に少ない転移疾患を有していた。はっきり
と目に見える疾患をできる限り除去することは成功した
。一方の患者は、悪性疾患の１７Ｊ除のため結腸の相当
部分を除去する必要があった。他方の患者は同じ目的の
ため牌蔵を除去する必要があった。
２人の患者ともＡＫＭ療法に非常によく耐えた。
第２の患者の場合から得られたことだが、この療法は患
者が初めのデバルｔング手術から回復した後は外来患者
部で行なわれても安全である。典型的には患者は、ある
日の朝外来患者部のサイタフニレ−シスユニットに来て
５乃至９Ｘ１０’の白血球を取り出す２時間のサイタフ
ニレ−シス処置を受ける。この処置後患者は帰宅する。
その午後及び晩に患者の単球が溶出によりｌｉ！ｌＪさ
れてガンマ・インターフェロン（１０００ｔＪ　／　ｍ
ｅ　）とともに懸濁培養される。翌朝患者は外来患者部
へ戻り、患者のＡＫＭ及び２リツトルの付加的腹腔内イ
ンベルゾールを注入される。この注入には通常３０分か
かる。それから患者は経口鎮痛薬及びタイレノールを受
は取って帰宅する。通常ＡＫＭの注入後４乃至６時間以
内に軽度の発熱（−員して１０１゜Ｆ（３８，３℃〉未
′ａ）及び軽度の腹痛が開始する。
熱はタイレノールで処理可能であり、痛みも通常経口鎮
痛薬で処理可能である（痛みが激しい場合には患者は外
来患者部で非経口麻酔薬を支給される）。１２時間以内
に軽度の発熱及び腹痛は通常おさまった。２人の患者は
週の残りには通常の日常生活を行なった。２人の患者と
も、初めの４乃至７回のサイタフニーシス処置後に顆粒
球減少症（全白血球６敗が約３５００）となった。これ
に関連してＡＫＭ治療の頻度が、末梢白血球調教を正規
化して１３！１問おきに１度調整される。
プロトコルの途中で、腹腔中に注入されたＡＫＭの流通
パターンが１１１．ｎで予め標識付けることで分析され
る。第６図は腹腔空間中での１１１ｉｎ標識ＡＫＭの典
型的分布を示す。分布は、再診ｆ術時に手術後ｍ着によ
ることが示された取込み減少のまだら領域が数個あるが
一様である。
１１１Ｉｎ４１識単球の腹腔的注入後５日以内にこれら
の患者から解釈可能な像が得られる時には、これらの細
胞が腹腔空間外に流出しないことがわかる。これらの細
胞は腹膜の細胞マトリクスに取り入れられて、おそらく
組織マクロファージに転換していると思われる。
第６図の上方の２つの図はｒインターフェロン賦活単球
による１６週間の生体外白血球賦活療法を行なった場合
の患者腹膜の単球浸潤の程度を示す（３６ｒＩ間は１１
１．ｎ標識単球の最終的注入が行なわれた）。この２つ
の図中左の図は腹膜ライニングでのエステラーゼ染色陽
性細胞のパーセンテージを示し、右の図は腹膜組織区画
のオートラジオフィック分析が行なわれ１１１１ｎで標
識付けられたｍ膜［ｌ胞を示す。
前記の２人の患者はともに「再診」開腹段階処置を受け
た。２人とも、最初の手術の際は数行の転移病変により
最も重度に１１１滑されていた部位を含めてｍ膜の表面
の大部分が正常化していた。どちらの患者にも結腸又は
内蔵に大きな病変は見られず、また離間した転移も発見
されなかった。ただし両者とも、単球の接近が（主とし
てＷＩ膜癒着により）ｔ１１１限された部分に非常に僅
かな進行性疾ｊ！１（ＰＤ）があった。患者は、ｍ着を
除去して、これらの領域を露出せしめ、手術（０）で病
変（全てｌｏｔ未満）を摘出することで疾患から解放さ
れた。従って疾患は゛’０−ＰＤ″状態となった。
次いで、２人の患者は、再診ｒＩａｒＩ！５１！ｌｉｔ
から回復後に維持療法を受けた。２人の患者とも３年以
上にわたり疾病の再発をみていない。下記の表にまとめ
られた如く、さらに４人のＰＣＣガン患者がＡＫＭ療法
で治療され、２人が２年以上にわたり局部的再発をこう
むらずにいる。
え−■ ＡＫＭプロトコルで治緻された ７人のｐｃｃｉ者についての結果 年　　齢　　刺　Ｗ！ｉ　　　毒　　　性　　　結果　
　局部的ＩＴｉＴｉ発成４歳１ＦＮ　７　　Ｔｍａｘ＝
１０１　　０−ＰＤ　　治療後女性　　　　　　ｍ膜刺
激　　　　　　３．５年〈第２等級） ４１歳　　ｎ１ＦＮγ 女性 Ａｆｅｂ：ＩＩＱ　　　ｏ−ｐｏ　　治ｍ後膜刹激　　
　　　　　　３．０年 （第１等級） エピソード− 細菌性 腹膜炎 ５２歳　ｎ１ＦＮ７　　Ａｆｅｂ：段 々性　　　　　　膜刺激： （第１等級〉 エピソード− 細菌性 ｒｍ膜炎 ４２歳　ｎ１ＦＮ７　　Ａｆｅｂ：段 々性　　　　　　ｍ：刺激 （第１等級〉 −ＰＤ ８サイクル −ＰＤ ８サイクル ４６　ｆａ　　ｎ１ＦＮ７　　Ｔｍａｘ＝１００：　　
　１肺転移　治療後男性　　　　　　腹膜刺激　　治療
後　　２．５年（第１等級〉　臨床的な エピソード−腹膜疾患 細菌性　　　なし 腹膜炎 ３１歳　ｒｌＦＮ７　　Ｔｍａｘ＝１００：　　０−Ｐ
Ｄ　　　　治療後女性　　　　　　腹膜刺激　　　　　
　　２．０年（第２等級） ３８！　　ｒｒＦＮ７　　＾Ｆｅｂ：１１ｙＳＤ男性　
　　　　　膜刺！ＩＩ　　　　１６サイクル（第Ｏ等級
） ただし表■においてＡＫＭは活性キラー単球を、Ｐ　Ｃ
ＣＧ、Ｌ腹膜結腸直腸ガン腫症を、ｎ１ＦＮγは天然イ
ンターフェロンγを、０Ｐ−Ｄは２度目の手術の際（単
球の接近が制限された領域に）進行性疾患の小さい領域
が発見されて、外科的に治癒されたことを、１−ＰＯは
腹膜進行性疾患（外科手術不能〉を、ｒｌＦＮγは組み
換えインターフェロンγを、ＳＯは安定疾患を表わす。
また腹膜刺激の等級は、第０等級はなにもなく、第１等
級は経口鎮痛薬で処理可能であり、第２等級は非経口麻
酔薬が必要であり、第３等級は静脈内液体及び鼻腔ガス
吸入が必要であることを示す。
上述の結果は、ＡＫＭによる腹膜結腸直腸ガン腫症の免
疫療法が実現可能でかつ有効な手続きであることを明示
する。抗腫瘍効果を最大にするため、ＡＫＭを天然キラ
ーリンパ球、抗原特異的キラーリンパ球、Ｂ細胞等と組
み合わせてもよい。
かかる「組み合わせ活性白血球療法、１は本来の免疫系
と代替し、又は免疫系を補完、模範又は再構成する。
動輪生体外で懸濁状態で培養された自己由来ＡＫＭが利
用可能であるということは、免疫調整系が免疫不全によ
り悪影響を受けた哺乳類における免疫調整系の免疫療法
及び／又は強化及び補完に新しい展望を開く。
以上を要約するに、本発明は無血清培地により生体外に
おいて懸濁状態で培養された単離され略純粋なヒトＡＫ
Ｍの殺ｌ１ｌｓ＋９機能の監視技術を開示する。ヒトに
おけるガン及び免疫不全等の状態の治療にヒトＡＫＭを
応用することも開示されている。
【図面の簡単な説明】
第１図は、無血清懸濁培地状態で培養された活性キラー
単球（ＡＫＭ）では殺Ｍ瘍細胞能力が強化されているこ
とを示す図、第２図はポリプロピレン培地状態（ｃ及び
Ｄ）とポリスチレン培地状ｆｌ！（Ｅ及びＦ）とを対比
して生体外でのＡＫＭ（ム）とＭｌｌツタ−ゲット細胞
↑）の高級致死相互作用を示す走査型電子顕微鏡写真、
第３図はポリプロピレン培地状態とポリスチレン培地状
態とを対比して様々なヒトｌｌ瘍ターゲットに対するＡ
ＫＭによる致死効果の増強を示す図、第４図は、溶解単
位法で表わされた、本発明による無血清懸濁状態でのみ
可能なＡＫＭによる腫瘍細胞致死を示す図、第５図は１
！膜結腸ガン腫症に対するＡＫＭプロトコルでの手続き
のフローチャート、第６図は１１１ｔｎｌｘ識ＡＫＭの
腹膜結腸直腸ガン腫症患者への注入後４時間後の腹膜内
での１１１．ｎ標識ＡＫＭの分布を示す図である。 ′吠光 １ 浦違１ ２４蒔朗

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）無血清培地によりポリプロピレン製器具中にて懸
    濁状態で製造される略純粋で機能性のヒトの臨床的等級
    活性キラー単球。
  2. （２）免疫療法的量の請求項１記載の活性キラー単球と
    無菌の薬剤上許容しうる担体とからなるヒトの免疫治療
    用薬剤成分。
  3. （３）活性キラー単球の影響を受けるガン細胞を、細胞
    致死量の活性キラー単球に接触せしめることからなるガ
    ン細胞致死方法。
  4. （４）該ガン細胞は腹膜結腸直腸ガン腫症からなること
    を特徴とする請求項３記載のガン細胞致死方法。
  5. （５）（ａ）溶出によりヒト単球を精製する段階と、（
    ｂ）生物学的又は科学的賦活剤及び＾１＾１＾１Ｉｎ標
    識ヒト腫瘍ターゲット細胞とともに無血清にてポリプロ
    ピレン器具中３７℃の試験ウェル内で反応が起こるに充
    分な時間精製ヒト単球を培養する段階と、 （ｃ）約４８乃至７２時間後培養上澄みを採取し、Ａを
    試験ウェルから放出される＾１＾１＾１Ｉｎ計数値とし
    、Ｔをターゲット細胞内に取り込まれた全体の＾１＾１
    ＾１Ｉｎ計数値として式Ａ／Ｔ×１００により活性キラ
    ー単球の殺腫瘍活性を判定し、Ｂを賦活剤の存在下又は
    非存在下で単球及びターゲット細胞を伴う試験ウェルか
    ら放出される＾１＾１＾１Ｉｎ計数値とし、ＣをＢと同
    一の賦活剤の存在下又は非存在下でターゲット細胞を伴
    う試験ウェルからの＾１＾１＾１Ｉｎ計数値として式（
    Ｂ−Ｃ）／（Ｔ−Ｃ）×１００で活性キラー単球の比殺
    腫瘍活性を判定する段階とを順次行なうことからなる活
    性キラー単球の殺腫瘍活性の監視方法。
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