JP6667763B1 - イヌのリンパ球由来のがん殺傷性細胞集団の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
備える。本願発明では上市されたものを用いることができ、例えばニプロ社製の商品名ニプロカルチャーバッグやタカラバイオ社製の商品名CultiLife 215 Culture bagを用いることができる。
抗CD3抗体を固相化した培養バッグを用いて活性化リンパ球療法に用いられ得るがん殺傷能力を有する細胞を製造した。なお、以下において、試薬の濃度は全て最終濃度である。
イヌリコンビナント抗CD3抗体を0.3Mのリン酸水素二ナトリウム溶液に溶解し、0.09ng/mlとなるように抗CD3抗体溶液を調製した。一方端に3つの入出用ポートを有するガス透過性培養バッグ(商品名、ニプロカルチャーバッグ350mL容:ニプロ社製)を用いた。当該培養バッグの1つのポートを使って、調製した抗CD3抗体溶液20mlを入れ、抗体(溶液)を培養バッグ内室全体に行きわたらせた後、平らにセットとして4℃で48時間放置した。放置後、抗CD3抗体溶液を全量回収し、その後、生理食塩水約20mlをバック内に注入し、左右に往復10回程度バックを揺することで洗浄し、抗CD3抗体が固相化された培養バッグを得た。
イヌ(ラブラドール・レトリバー種、オス10才)の橈側皮静脈から末梢血10mlを採血した。末梢血を密度勾配遠心法によりPBMCを取得した後、リンパ球用培養液(KBM570−OK培地:コージンオ株式会社製)100mlに懸濁して、PBMC懸濁液とした。
1)初代培養
培養バッグのポート側から約3分の1容となる箇所にストッパー(エニーロック2号:三宝社製)をセットして、培養バッグの内室を2つ分割した。ポート側の分室に1つのポートから、前記2.で作製したPBMC懸濁液の全量を注入した。そこに700IU/mlとなるようにヒトIL−2(PeproTech社製)を添加した。
初代培養開始後5日を経過すると培養液の色が変化しはじめ、リンパ球の増殖が確認できた。7日経過後にストッパーを外して、培養バッグ全体を1つの閉鎖空間として、引き続き培養を行った。培養開始時に、2000IU/mlのIL−2を含むリンパ球用培養液約200mlを追加し、37℃、5%のCO2の存在下でさらに7日間静置培養した。この間、適宜、軽く揺すった。
拡大培養により得られた細胞を遠心分離により培地を取り除き、細胞を回収した。回収した細胞を生理食塩水で洗浄し、さらに遠心分離することで細胞を回収した。
1)細胞集団のがん殺傷能力
回収された細胞集団ががん細胞を殺傷するのかを確認するために、イヌ甲状腺がん細胞株(CTAC)との共培養試験を行った。96穴プレートを用いて予め1ウェルあたり1×104個となるようにCTACを播種し、37℃、5%CO2の条件下でオーバーナイトインキュベートさせた。前記3.で回収された細胞を、CTACに対して5倍、10倍、20倍の細胞数となるように播種して18時間共培養を行った。細胞傷害活性は、Cell Counting Kit-8(Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, JAPAN)の手順に従って算出した。
回収された細胞集団についてフローサイトメトリーによる細胞表面マーカーの解析を行った。細胞集団をFCM bufferに希釈し、抗CD3抗体(clone CA17.2A12, Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, U.S.A.)、抗CD5抗体 (clone YKIX322.3, Thermo Fisher Scientific Inc., MA, U.S.A.)、抗CD8抗体 (clone YCATE55.9, Thermo Fisher Scientific Inc., MA, U.S.A.)を加えて30分間氷上で反応させた。染色後の反応性を、FACS Aria (Becton Dickinson, NJ, USA)を用いて測定して表面マーカーの発現強度を求めた。ネガティブコントロールにはそれぞれのIsotype controlを用いた。
細胞数の多かった培養バッグから6つの培養バッグを選び、回収された細胞集団をセルソーティングした後、CTACと共培養を行った際の細胞傷害活性の解析結果を図4に示した。同図(A)は全細胞、(B)はCD3+CD5lowCD8+細胞、(C)はCD3−細胞の細胞傷害活性を示す。培養細胞とCTACを20:1の割合で共培養を行ったとき、CD3+CD5lowCD8+細胞の細胞傷害活性は18〜36%(平均28%)、CD3−細胞の細胞傷害活性は34〜80%(平均57%)であった。このことから、本願発明に係る方法で培養された細胞集団はCD3−細胞が主であり、細胞集団のがん殺傷能力もCD3−細胞が主体であると言える。
参考実験として非特許文献3に準じた方法で実施した場合との比較を行った。抗CD3抗体を(A)5000ng/mlの濃度でフラスコに固相化して初代培養を行い、次いで拡大培養時には抗CD3抗体を添加しない場合と、(B)0.09ng/mlの濃度で固相化して初代培養を行い、次いで拡大培養時には0.05ng/mlの抗CD3抗体を培養液に添加して培養して得られた細胞集団、(C)上記実施例と同様に培養バッグを用いて培養して得られた細胞集団で比較を行った。なお、培養液の量は上記実施例と等量になるように調整し、IL−2も等量となるように加えた。がん殺傷能力の比較は上記の方法と同様にして行ったが、それに加えてCTACに対して50倍の細胞数を加えた場合についても行った。その結果を図5に示した。また、回収された細胞数を図6に示した。
犬口腔内悪性黒色腫ステージIVのイヌ(フラットコーテット・レトリバー種、オス12才)に対して、低用量カルボプラチン療法と活性化リンパ球療法の併用を行った。実施例1で得られた細胞集団50mlとカルボプラチンの標準量をそれぞれ2週間間隔で投与した。ステージIII及びIVの非外科的切除群41例の中央生存期間は61日であるところ、本症例では投与開始後150日生存した。
Claims (5)
- イヌの末梢血からリンパ球由来のがん殺傷能力を有する細胞集団を作製する方法であって、
内面全体に、0.01ng/ml以上0.1ng/ml以下の抗CD3抗体の濃度の溶液を用いて固相化された培養バッグを用いて、前記末梢血から分離されたリンパ球を培養する工程を含み、
前記培養バッグをクリッピングにより2以上に分割されたバッグ内室の一つに前記末梢血から分離されたリンパ球を培養する第1の工程と、
前記第1の工程後に前記クリッピングを解いて、前記培養バッグの拡張されたバッグ内室でさらに培養する第2の工程を有する方法。 - 前記第1の工程及び/又は前記第2の工程において、抗CD3抗体以外の増殖因子を含む培養液で拡大培養する請求項1に記載の方法。
- 前記第1の工程及び/又は前記第2の工程において、少なくともインターロイキン−2を含む培養液で培養する請求項1に記載の方法。
- 前記第1の工程及び/又は前記第2の工程において、自己血漿を含む培養液で培養する請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
- 内面全体に抗CD3抗体が固相化された培養バッグの製造方法であって、
0.01ng/ml以上0.1ng/ml以下の抗CD3抗体の溶液を培養バッグの内面と接触させる方法。
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