EA008536B1

EA008536B1 - СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ ПЕПТИДА ТИМОЗИНА α

Info

Publication number: EA008536B1
Application number: EA200400591A
Authority: EA
Inventors: Алфред Р. Рудолф; Синтия У. Татхилл
Original assignee: Сциклон Фармасьютикалс, Инк.
Priority date: 2001-11-01
Filing date: 2002-11-01
Publication date: 2007-06-29
Also published as: NO20042100D0; NO20042100L; EP1450850A4; CN1582163A; KR20050042229A; BR0213823A; CA2464307A1; DE60237784D1; PL370430A1; UA80957C2; ES2353379T3; IL161665A0; AU2002363248B2; EA200400591A1; EP1450850B1; WO2003037366A1; IL161665A; US20100221274A1; JP2005511563A; NZ532763A

Abstract

Пептид тимозин α(TA1) вводят пациенту, нуждающемуся в иммунной стимуляции, таким образом, чтобы по сути непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида ТА1 у пациента. Способом введения может быть непрерывная инфузия.

Description

Предпосылки создания изобретения Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу введения пептида тимозин α.

Описание предпосылок создания изобретения

Тимозин α,ι (иногда упоминаемый как ТА1) представляет собой состоящий из 28 аминокислот пептид тимуса с иммуномодулирующими свойствами, гомологичный природному продукту, исходно выделенному из тимозиновой фракции 5-вилочковой железы теленка. Его биологические эффекты включают усиление функции Т-лимфоцитов и включают модуляцию интерлейкина-2 (1Ь-2), стимуляцию продукции γ-интерферона, индукцию Т-лимфоцитов, активности природных киллеров (ΝΚ-клеток) и стимуляцию тимопоэза. Показано также, что тимозин α₁ по «верхнему» типу регулирует экспрессию главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I.

Тимозин α₁ ранее предлагался для применения при некоторых видах терапии рака, гепатита В и С, вируса иммунодефицита человека (Ηΐν) и т.д., например, путем подкожной инъекции дважды в неделю. В этой области техники остается необходимость для разработки улучшенных способов введения тимозина α1.

Краткое содержание изобретения

В соответствии с настоящим изобретением способ введения пептида тимозин α₁ (ТА1) пациенту, нуждающемуся в иммунной стимуляции, включает введение пептида ТА1 пациенту таким образом, чтобы, по существу, непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида ТА1 у пациента в течение периода лечения, составляющего по меньшей мере 6 ч.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано на том факте, что поддерживающие иммуностимулирующие эффективные количества пептида ТА1 у пациента в кровеносной системе в период лечения обеспечивают существенное улучшение иммуностимулирующего эффекта пептида ТА1.

Изобретение применимо к пептидам ТА1, включая существующий в природе ТА1, а также синтетический ТА1 и рекомбинантный ТА1, имеющий аминокислотную последовательность природного ТА1, аминокислотную последовательность, в значительной степени подобную ему, или сокращенную форму его последовательности, и их биологически активные аналоги, содержащие замещенную, удаленную, удлиненную, замененную или иным образом модифицированную последовательности, которые обладают биологической активностью, в значительной степени подобную активности ТА1, например родственный ТА1 пептид, имеющий достаточную аминокислотную гомологию с ТА1, так что он функционирует в основном таким же способом и в значительной степени с такой же активностью, как ТА1.

Из-за того, что время полусуществования в плазме подкожно инъецированного ТА1 составляет всего лишь около 2 ч, то в соответствии с одним вариантом воплощения изобретения пептид ТА1, такой как ТА1, вводят пациенту, нуждающемуся в иммунной стимуляции таким образом, чтобы, по существу, непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида ТА1 в кровеносной системе пациента в течение значительно более длительного периода лечения. Хотя намного более длительные периоды лечения предусматриваются в соответствии с настоящим изобретением, варианты воплощения по изобретению включают, по существу, непрерывное поддержание иммуностимулирующего эффективного количества пептида ТА1 в кровеносной системе пациента в течение периодов лечения по меньшей мере около 6, 10, 12 ч и дольше. В других вариантах воплощения изобретения продолжительность лечения составляет по меньшей мере примерно сутки и даже некоторое количество дней, например неделю или дольше. Однако предусматривается, что варианты лечения, как они описаны выше, при которых иммуностимулирующие эффективные количества пептида ТА1, по существу, непрерывно поддерживающиеся у пациента в кровеносной системе, могут прерываться периодами без лечения, имеющими такую же или различную продолжительности.

В соответствии с одним вариантом воплощения изобретения в течение периода лечения пациенту проводят непрерывное вливание пептида ТА1, например, путем внутривенного вливания таким образом, чтобы, по существу, непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида ТА1 в кровеносной системе пациента. Вливание может осуществляться любыми подходящими способами, такими как с помощью мининасоса.

Альтернативно инъекционный режим пептида ТА1 может устанавливаться таким образом, чтобы, по существу, непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида ТА1 в кровеносной системе пациента. Соответствующие инъекционные режимы могут включать вливание каждые 1, 2, 4, 6 и т.д. часов, с тем чтобы непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида тимозин αι в кровеносной системе пациента в течение периода лечения.

Хотя предполагается, что в ходе непрерывной инфузии пептида ТА1 введение будет существенно более длительным, согласно одному варианту воплощения изобретения непрерывная инфузия пептида ТА1 составляет продолжительность лечения по меньшей мере 1 ч. Более предпочтительно непрерывная инфузия проводится в течение более длительных периодов времени, по крайней мере примерно 6, 8, 10, 12 ч или дольше. В других вариантах воплощения изобретения непрерывная инфузия проводится в тече

- 1 008536 ние по меньшей мере одного дня и даже некоторого количества дней, как неделя или более.

Иммуностимулирующие эффективные количества пептида ТА1 в основном могут непрерывно поддерживаться в кровеносной системе пациента введением пептида ТА1 пациенту со скоростью в диапазоне примерно 0,0001-0,1 мг/ч/кг массы тела пациента. Предпочтительные скорости введения находятся в диапазоне примерно 0,0003-0,3 мг/ч/кг массы тела пациента.

В предпочтительных вариантах воплощения изобретения пептид ТА1 находится в фармацевтически приемлемом жидком носителе, таком как вода для инъекций, солевой раствор в физиологических концентрациях или подобное.

Изобретение может быть использовано для лечения любого пациента, нуждающегося в иммунной стимуляции, включая онкологических пациентов, инфицированных человеческим вирусом иммунодефицита пациентов и пациентов, страдающих различными формами гепатита, включая гепатит В и гепатит

С. Например, изобретение может быть использовано, чтобы способствовать регенерации костного мозга у онкологических больных после химиотерапии. Изобретение может быть особенно полезным при добавлении ТА1 к химиоиммунотерапии для повышения выживаемости пациентов при меланоме и гепатоцеллюлярной карциноме (НСС) и для уменьшения гематологической токсичности при раке легкого.

В следующих примерах, которые не претендуют на то, чтобы быть ограничивающими, непрерывную инфузию ТА1 оценивали на модели терапии злокачественной опухоли с применением имплантированных хирургическим методом осмотических мининасосов, которые доставляли жидкости с постоянной скоростью потока в течение 5 дней. Крысам давали 5-фторурацил (5-РИ), чтобы вызвать подавление иммунитета, и затем с помощью инъекции или инфузии подвергали действию ТА1 в течение последующих 8 дней (самый низкий уровень счета лейкоцитов после введения 5-РИ). Группами обработки, по 8 крыс в каждой, были контрольная (мининасосы с физиологическим раствором); получавшая низкую дозу ТА1 (0,2 мг/кг, подкожная инъекция; пустые мининасосы); получавшая высокую дозу ТА1 (3,5 мг/кг, подкожная инъекция; пустые мининасосы); и получавшая высокую дозу ТА1 путем инфузии (3,5 мг/кг, инфузированные с помощью мининасосов). Иммунные параметры определяли относительно базисной линии через 8 дней после обработки 5-РИ (день 1 обработки ТА1), а также в дни 5, 12, 20 и 27 после обработки ТА1.

Пример 1.

Крысы десятинедельного возраста, массой 250-300 г получали 100 мг/кг 5-фторурацила (5-РИ) для подавления иммунитета.

Через 8 дней после обработки 5-РИ крыс рандомизированно определяли в одну из следующих групп (п=8).

Контроль (физиологический раствор в мининасосе).

Низкая доза ТА1, инъецированная подкожно при 0,2 мг/кг (с пустыми мининасосами).

Высокая доза ТА1, инъецированная подкожно при 3,5 мг/кг (с пустыми мининасосами). Непрерывная инфузия ТА1, обеспеченная с помощью мининасосов при 3,5 мг/кг/5 дней.

Иммунные параметры определяли относительно базисной линии через 8 дней после обработки 5-РИ (день 1 обработки ТА1), а также в дни 5, 12, 20 и 27 после обработки ТА1.

Оценки включали активность природных киллеров (ΝΚ-клеток) [лактатдегидрогеназа (ЬИН), высвобожденная из клеток линии ΥΑ^1 после экспозиции в течение 4 ч с моноядерными клетками периферической крови (РВМС) человека], общее количество лейкоцитов (подтвержденное с помощью цитофлуориметрических параметров после проверки специфичности с помощью моноклонального антитела), общее количество лимфоцитов (С.П3+ с помощью проточной цитометрии) и активированные лимфоциты (ί.Ό25+/ί.Ό3+ с помощью проточной цитометрии).

Активность ΝΚ-клеток составила 42±5% относительно базисной линии и была снижена до 9±2% после 5-РИ. Обработка низкой дозой ТА1 привела к значительному восстановлению активности ΝΚклеток через 12 дней, тогда как при высокой дозе ТА1 достигалось значительное восстановление всего за 5 дней. Однако непрерывная инфузия ТА1 была способна удвоить ответ за 5 дней до 32±4% (по сравнению с 16±2% для инъецированной высокой дозы, 12±3% для инъецированной низкой дозы и 11±1% для контроля). Только у животных, обработанных ТА1 путем непрерывной инфузии, проявлялось полное восстановление активности ΝΚ-клеток до уровней базисной линии.

Общее число лейкоцитов, определенное морфологически, снижалось от 14590±2071 клеток/мм³ до 2597±582 после обработки с 5-РИ. Обработка низкой или высокой дозой ТА1 путем инъекции имела тенденцию скорее к усилению восстановления по сравнению с необработанными животными. Однако непрерывная инфузия ТА1 обеспечивала статистически значимое и полное восстановление до уровней базисной линии только через 5 дней.

Количество активированных лейкоцитов (ί.Ό3+/ί.Ό25+) снижалось незначительно при обработке 5Ри (от 65±21 клетка/мм³ до 37±10), однако, их уровни резко повышались в дни 12 и 20 после обработки высокой дозой ТА1 (297±136 и 321±75 клеток/мм³ по сравнению с 166±70 и 212±77 клеток/мм³ соответственно). Непрерывная инфузия ТА1 приводила даже к большему повышению, до 422±105 и 446±73 клетки/мм³.

- 2 008536

Пример 2.

Крысы десятинедельного возраста, массой 250-300 г получали 100 мкг/кг 5-фторурацила (5-ЕИ) для подавления иммунитета.

Через 8 дней после обработки 5-ЕИ крыс рандомизированно определяли в одну из следующих групп (п=15).

Высокая доза ТА1, инъецированная подкожно при 3,5 мг/кг (с пустыми мининасосами).

Непрерывная инфузия ТА1, обеспеченная с помощью мининасосов при 3,5 мг/кг/5 дней.

Иммунные параметры определяли относительно базисной линии через 8 дней после обработки 5-ЕИ (день 1 обработки ТА1), а также в дни 5 и 14 после обработки ТА1.

Оценки включали общее количество лейкоцитов (подтвержденное с помощью физических цитофлуориметрических параметров после проверки специфичности с помощью моноклонального антитела), гранулоциты (проточная цитометрия с использованием меченого флуоресцеинизотиоцианатом (Е1ТС) антикрысиного гранулоцита ΗΙ8-48), общее количество лимфоцитов (С.П3+ с помощью проточной цитометрии), Т-хелперы (С.П4+ с помощью проточной цитометрии), активированные лимфоциты (СЭ25+/СЭ3+ с помощью проточной цитометрии) и экспрессию цитокинов в плазме [интерлейкина-2 (1Ь-2) и γ-интерферона (ΙΕΝ-γ) с помощью иммуноферментного анализа ЕЫ8А].

После определения в примере 1, что ТА1, доставляемый непрерывной инфузией, по сравнению с подкожной инъекцией проявляет резкое воздействие на общее число лейкоцитов, представляло интерес определить, какой тип лейкоцитов ответствен за увеличение. По-видимому, гранулоциты являются подгруппой лейкоцитов, которая наиболее подвержена действию ТА1, доставляемого непрерывной инфузией. Количество гранулоцитов снижалось после 5-ЕИ от 4485±1116 до 1249±432. Обработка с ТА1 приводила к увеличению до 14652±2463 в течение 5 дней (по сравнению с 9924±3218 при инъекции ТА1 или 6954±1519 без ТА1), и данный уровень был еще выше через 14 дней.

Интересно, что в данном исследовании было одно животное, которое получало ТА1 как инъекцией (3,5 мг/кг), так и непрерывной инфузией (еще 3,5 мг/кг). Это животное было не только здоровым и бодрым, без очевидных неблагоприятных явлений, но и измеренные воздействия ТА1 на иммунные параметры были даже больше таковых у других животных. Что касается гранулоцитов, это исследуемое животное имело значительно повышенный уровень, 19376 клеток/мм³ через 5 дней, по сравнению со средним значением 14652±2463 у других животных, подвергавшихся инфузии.

Количество общих лимфоцитов (СЭ3+) было чрезвычайно повышенным после обработки с 5-ЕИ (от 10904±1973 клетки/мм³ до 1740±560). Обработка с ТА1 привела к восстановлению уровней базисной линии, которое проявлялось только через 5 дней, когда ТА1 доставлялся непрерывной инфузией, но не было заметным до 14 дней в случае инъецированного ТА1.

Животное, которое получало ТА1 как инъекцией, так и инфузией, имело уровни лимфоцитов, не намного отличавшиеся от других животных (9765 клеток/мм³ по сравнению со средним значением 9644±961), но процент тех лимфоцитов, которые оставались активированными, был значительно повышен (от 428±89 клеток/мм³ или 4% лимфоцитов для животных, получавших инфузию ТА1, до 976 клеток/мм³ или 10% лимфоцитов для животного, которое получало ТА1 в высокой дозе инъекцией, сопровождающейся инфузией).

Т-хелперы (СЭ3+/СЭ4+) были также сниженными при обработке с 5-ЕИ: от 5411±1084 клеток/мм³до 1710±449 клеток/мм³. Эти пониженные уровни Т-клеток не увеличивались без обработки с ТА1 в течение 14 дней эксперимента. В противоположность результатам, полученным для гранулоцитов, при которых ТА1, доставленный непрерывной инфузией, превосходил ТА1, доставленный инъекцией для восстановления количества клеток, доставленного одним из способов ТА1 было достаточно для возвращения уровней Т-хелперов к базисной линии.

Поскольку ТА1, доставляемый или путем инъекции, или путем непрерывной инфузии, приводил к увеличению Т-хелперов СЭ4+. представлялось интересным определить, происходит ли это увеличение из-за воздействия на подгруппу Т-хелперов - на ТЫ или Т112. Прежние данные ίη νίίτο и ίη νίνο демонстрировали, что ТА1 увеличивает подгруппу ТЫ Т-хелперов, и в данном исследовании был обнаружен тот же эффект. Доставка ТА1 непрерывной инфузией приводила даже к большему увеличению в плазме уровня цитокина интерлейкина-2 (1Ь-2) подгруппы ТЫ, чем наблюдалось после подкожной инъекции (42±7 пг/мл через 14 дней после доставки ТА1 путем непрерывной инфузии по сравнению с 21±16 пг/мл для инъецированного ТА1 и 10±16 пг/мл для контрольных животных).

Обработка с помощью ТА1 приводила к увеличению цитокина 1Ь-2 подгруппы ТЫ и делала возможным увеличение другого цитокина подгруппы ТЫ - γ-интерферона (IΕN-γ). И хотя уровни цитокина были низкими, на день 5 после обработки подкожно инъецированный ТА1 приводил к более высоким уровням 1Е№у в плазме. На день 14 после обработки животные, получившие ТА1 путем непрерывной инфузии, имели самые высокие уровни (14±5 пг/мл по сравнению с 10±1 пг/мл при инъекции или 8±8 пг/мл для контроля).

Животные, которые получали ТА1 как инъекцией, так и непрерывной инфузией, имели даже более

- 3 008536 высокие измеренные уровни обоих цитокинов подгруппы ТЫ, особенно ΙΡΝ-γ, который составил 45 пг/мл после 14 дней, по сравнению с 14±5 пг/мл для других животных.

Выводы

Поддержание постоянного уровня ТА1 в кровеносной системе в течение некоторого количества дней повышает измеряемые иммунологические эффекты.

Этот дозовый режим приводит к неожиданным положительным воздействиям на гранулоциты, а также к положительным воздействиям на моноциты, проявляемым после инъекции ТА1.

Не наблюдалось никаких неблагоприятных явлений, даже при дозах ТА1 в 15 раз выше обычных (а у одного животного при дозах в 30 раз выше обычных).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ введения пептида тимозина α₁ (ТА1) пациенту, нуждающемуся в иммунной стимуляции, включающий введение указанному пациенту указанного пептида ТА1 таким образом, чтобы, по существу, непрерывно поддерживать иммуностимулирующее эффективное количество пептида ТА1 у пациента в период лечения по меньшей мере около 6 ч.
2. Способ по п.1, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере около 8 ч.
3. Способ по п.1, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере около 10 ч.
4. Способ по п.1, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере около 12 ч.
5. Способ по п.1, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере примерно 1 день.
6. Способ по п.1, где осуществляют непрерывное введение указанного пептида в течение всего периода лечения.
7. Способ по п.1, где указанный пептид ТА1 представляет собой природный ТА1, рекомбинантный ТА1 или синтетический ТА1.
8. Способ по п.1, где указанный пептид ТА1 находится в фармацевтически приемлемом жидком носителе, и его непрерывно вводят указанному пациенту в течение упомянутого периода лечения путем инфузии.
9. Способ по п.8, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере около 8 ч.
10. Способ по п.8, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере около 10 ч.
11. Способ по п.8, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере около 12 ч.
12. Способ по п.8, где упомянутый период лечения составляет по меньшей мере примерно 1 день.
13. Способ по п.8, где введение осуществляют в течение всего периода лечения.
14. Способ по п.8, где указанный пептид ТА1 представляет собой природный ТА1, рекомбинантный ТА1 или синтетический ТА1.
15. Способ по п.14, где указанный ТА1 вводят указанному пациенту со скоростью примерно 0,00010,1 мг/ч/кг массы тела пациента.
16. Способ по п.14, где скорость введения составляет примерно 0,0003-0,03 мг/ч/кг массы тела пациента.
17. Способ введения пептида тимозина α₁ (ТА1) пациенту, нуждающемуся в иммунной стимуляции, включающий, по существу, непрерывную инфузию иммуностимулирующего эффективного количества указанного пептида ТА1 пациенту в течение периода лечения по меньшей мере около 1 ч.
18. Способ по п.17, где указанный пептид ТА1 представляет собой природный ТА1, рекомбинантный или синтетический ТА1, причем осуществляют непрерывную инфузию указанного ТА1 указанному пациенту в течение периода лечения по меньшей мере около 6 ч.
19. Способ по п.17, где осуществляют непрерывную инфузию указанного ТА1 указанному пациенту в течение периода лечения, составляющего по меньшей мере примерно 1 день.
20. Способ по п.17, где осуществляют непрерывную инфузию указанного ТА1 указанному пациенту в течение всего периода лечения.