HU215389B

HU215389B - Eljárás hatóanyagként IL-4-et tartalmazó tömött tumorok kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására

Info

Publication number: HU215389B
Application number: HU9300624A
Authority: HU
Inventors: Joseph J. Catino; Marian Plunkett
Original assignee: Schering Corp.
Priority date: 1990-09-06
Filing date: 1991-09-03
Publication date: 1998-12-28
Also published as: ATE145556T1; GR3022321T3; US5382427A; DK0552243T3; HU9300624D0; CA2091170A1; EP0552243A1; DE69123361D1; JPH06501017A; DE69123361T2; AU661979B2; WO1992004044A1; AU8850591A; HUT63769A; EP0552243B1; KR100229974B1

Description

A találmány tárgya eljárás hatóanyagként interleukin-4et („IL-4”-et) tartalmazó olyan új gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek szisztémásán beadva emlősök tömött tumorainak kezelésére használhatók.

Az interleukin-4-et - a továbbiakban „IL-4”, más néven 1-es B-sejt-serkentő faktor, „B Cell Stimulatory Factor 1” vagy (BSF-1) - eredetileg M. Howard és munkatársai írták le [J. Exp. Med., 155, 914-923 (1982)], mint olyan T-sejt-eredetű növekedési faktort, amely különbözik az IL-2-től, és amely lehetővé teszi normál egér-B-limfociták hosszan tartó szövettenyészetének létrehozását, és amely kölcsönhatásba lép az aktivált B-limfocitákkal, és ily módon proliferációjukat akár 4 hónapon keresztül is fenntartja. Bár a tenyésztés beindítására kevert B-limfocita-explantátumokat használnak, úgy tűnik, hogy az éretlen fenotípusú B-limfocitákat az IL-4 különösen serkenti szövettenyészetben. [Lásd például: C. Perchel és munkatársai, J. Immunoi. 142, 1558-1568 (1989)]. G. Trenn és munkatársai [J. Immunoi. 140, 1101-1106 (1988)] arról számoltak be továbbá, hogy az IL-4 serkenti citotoxikus T-sejteknek nyugvó egér-Tlimfociták Lyt-2⁺ szubpopulációjából való kifejlődését.

Az egér IL-4 gént COS-7 sejtekben klónozták és fejezték ki [T. Otsuka és munkatársai, Nuc. Acids Rés. 15, 333-334 (1987)]. A klónozott faktor minden olyan tulajdonsággal (aktivitással) rendelkezett szövettenyészetben, melyeket a T-sejttenyészet felülúszójából tisztított faktor esetében láthatunk. A humán IL—4 gén klónozását és kifejezését N. Arai és munkatársai [J. Immunoi. 142, 274—282 (1989)] és T. Yokota és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 5844—5848 (1986)] ismertették, azzal a faktorral, melyet az eredeti molekuláéhoz hasonló aktivitású COS-7 sejtek termelnek, szövettenyészetben vizsgálva. Mivel az IL—4-et mind emberi, mind pedig egér-sejtrendszerekben tanulmányozták, az alábbi in vitro jellegzetességeket sikerült még a molekulával kapcsolatban felfedezni: i) az IL-4 fontos szerepet játszik az IgE-szintézis kiváltásában (indukciójában) és szabályozásában, abban a folyamatban, amely akkor megy végbe, amikor a B-limfociták szubpopulációinak proliferációját előidézzük (indukáljuk) [S. Romagnani et al., Clin. Immunoi. Immunpathol. 50, 513-523 (1989)]; ii) az IL-4 alacsony affinitású FcEreceptorokat (CD23) indukál szövettenyészetben, normál emberi B-limfocitákon [T. DeFrance et al., J. Exp. Med. 165, 1459-1467 (1987)]; iii) az IL-4 rendkívül világosan meghatározható módon lép kölcsönhatásba egyéb limfokinekkel, nevezetesen a γ-interferonnal [R. L. Coffman et al., Immunoi. Rés. 102, 5-27 (1988) és S. Romagnani et al., lásd fent] és T-sejtekkel [R. L. Coffman et al., lásd fent; S. Romagnani et al., lásd fent és M. D. Widmer et al. Natúré 326, 795-798 (1987)], B-sejt-proliferáció és -alteráció (módosítás) létrehozása céljából: és végül iv) az IL-4 fokozza a 11 la (osztályba tartozó) antigén kifejeződését nyugvó B-sejteken [R. Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6149—6153 (1984)]. T. R. Mosmann és munkatársai [J. Immunoi. 138, 1813-1816 (1987)] arról számolnak be, hogy az

1-90 és 129-149 aminosav-szekvencia tekintetében 50%-ban homológ humán és egér IL-4 fajspecifíkus.

Embereknél végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az IL-4 befolyásolja a monoklonális B-sejt-tumorokat. S. Karray és munkatársai [J. Exp. Med. 168, 85-94 (1988)] arról számolnak be, hogy a humán IL-4 gátolja in vitro körülmények között a B-típusú krónikus limfociták leukémia (B-CLL) sejtjeinek IL-2-függő proliferációját. C. M. Higuchi és munkatársai [Can. Rés. 49, 6487-6492 (1989)] arról számolnak be, hogy az IL-2-vel előzetesen aktivált humán perifériás vérből származó limfocitákban az IL-4 limfokin által aktivált sejtölő aktivitást (LAK - lymphokine-activated killer activity) vált ki. J. J. Mule és munkatársai [J. Exp. Med. 166, 792-797 (1987)] egér eredetű rendszer esetében és önmagában alkalmazott IL-4-gyel vagy IL-2-vel való kombinációjával kezelt, nyugvó splenociták LAK aktivitást hoznak létre - in vitro körülmények között - friss, szingenetikus tumorsejtekkel szemben. G. Fomi és munkatársai [Int. J. Can. Sup. 4, 62-65 (1989)] arról számolnak be, hogy a tumorellenes aktivitás oly módon váltható ki, ha egér eredetű IL—4-et injektálunk a tumorral összeköttetésben álló nyirokcsomó köré, továbbá arról, hogy amikor az IL-4-et humán IL-1 β-ból származó nonapeptiddel kombináljuk, igen erőteljes limfokin által aktivált tumorgátlás (LATI - lymphokine-aktivated tumor inhibition) figyelhető meg. J. J. Mule és munkatársai [J. Immunoi. 142, 726-733 (1984)] úgy vélik, hogy az egér eredetű IL-4 által indukált sejtek legfontosabb fenotípusára az aszialo-GM], Thy⁺, Lyt²⁺, T³⁺ felületi kifejezése jellemző, és hogy IL-2 és IL-4 kombinációjával létrehozott LAK sejtekben növekszik a szemcsékhez kötődő szerin-észteráz koncentrációja. D. J. Peace és munkatársai [J. Immunoi. 140, 3679-3685 (1988)] arról számolnak be, hogy az IL-4 által kiváltott LAK aktivitás két különböző sejttípussal áll összefüggésben, ezek egyike NK-szerű (NK1.1⁺, Lyt2~), a másik pedig T-sejt-szerű (NK1.1-, Lyt2⁺). R. I. Tepper és munkatársai [Cell 57, 503-512 (1989. május 5.)] leírják, hogy egér IL-4-gyel transzfektált egér-tumorsejtvonalak szaporodása in vivő körülmények között gátolható, de amennyiben az IL—4gyel transzfektált tumorsejteket összekeverjük az IL-4gyel nem transzfektált tumorsejtekkel, in vivő körülmények között a nem transzfektált tumor növekedésének gátlása jön létre, amikor a kétféle tumorsejttípus együttesen fordult elő. R. I. Tepper és munkatársai arról is beszámolnak, hogy amikor a nem transzfektált tumor az IL—4-gyel transzfektált tumortól disztálisan helyezkedett el, gátlás nem volt megfigyelhető. R. I. Tepper végül azt is ismerteti, hogy valamely citokin - például IL—2 vagy IL—4 - parenterális adagolása a tumort hordozó állatnak nehéz, mert a faktor felezési ideje rövid (ez a helyzet az IL-2 esetében), továbbá a citokint olyan nagy mennyiségben kell nyerni, mely elég ahhoz, hogy hatékony dózisszinteket érhessünk el. G. D’Orazi és munkatársai [Proceedings of the American Association fór Cancer Research 31, 252 (1990. március), Abstract No. 1490] leírják, hogy az IL-4 tumorellenes válaszreakciót váltott ki egy szőrtelenegér-modell esetében.

HU 215 389 Β

G. Fomi és munkatársai [Lymphokine Rés., 9 (4), 571 (1990. április)] leírják, hogy egerekben kémiailag indukált fibroszarkómákba, illetve közvetlen közelükben levő nyirokcsomókba 10 napon át perilimfatikusan kis mennyiségű rekombináns IL-4-et injektáltak, és ez enyhén gátolta a tumorok növekedését, továbbá specifikus immunreakciókat váltott ki.

M. C. Bosca és munkatársai a G. Batteriol. Virol. Immunoi., 81 (1-12), 3-9 (1988)-ban közölt cikkükben olyan kísérleteket ismertetnek, amelyekben tumoros egerekbe kis adagokban perilimfatikusan (a tumorok közelében levő nyirokerekbe) naponta injektált IL-4 erős immunreakciót váltott ki, ami gátolta a tumorok növekedését.

G. Fomi és munkatársai az Amszterdamban 1989. március 7. és 10. között tartott „Sixth NCT-EORTC Symposium on New Drugs in Cancer Therapy” rendezvényen elhangzott előadásban ismertették, hogy IL-1, IL-2 és IL—4 kombinációit tumorok közelében levő és a tumorokkal összeköttetésben levő nyirokcsomókba injektálva a tumorok növekedésének gátlását tapasztalták. Külön-külön alkalmazva azonban nem tapasztaltak ilyen hatást.

W. Q. Li és munkatársai [Mól. Immunoi., 27 (12), 1331-7 (1990)] arról számolnak be, hogy autokrin növekedésű mielóma sejtvonal sejtjeinek IL-4 gént tartalmazó retrovírus vektorral való fertőzése gátolta a sejtek növekedését.

Megállapíthatjuk, hogy az ismert irodalmi hivatkozások egyike sem tárgyalja, vajon az IL—4 szisztémás adagolása olyan emlősöknek, amelyek szervezetében tömött tumor található, klinikai szempontból hatékony lenne-e emberek esetében, és a hozzáférhető in vitro és in vivő adatok arra sem adnak felvilágosítást, vajon az ilyen betegségben szenvedő emlősöknek adott IL—4nek van-e szisztémás tumorellenes hatása.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a tömött tumorok széles skálája kezelhető oly módon, hogy szisztémás injekció formájában az IL-4 hatékony mennyiségét adjuk be a tömött tumoroktól disztálisan olyan emlősöknek - például embereknek -, akik ilyen betegségben szenvednek.

A fentiekre alapozva a találmány gyógyszerkészítményt biztosít olyan emlősök tömött tumorainak kezelésére, melyek ezen betegségben szenvednek, és amely gyógyszerkészítménnyel az illető emlősnek a tömött tumor helyétől disztálisan, szisztémás injekció formájában adható be az IL-4 hatásos mennyisége.

A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmények tömött tumorok növekedésének gátlására alkalmasak olyan emlősök esetében, melyek ilyen betegségben szenvednek, és a gyógyszerkészítménnyel az illető emlősnek a tömött tumor helyétől disztálisan, szisztémás injekció formájában az IL—4 hatékony mennyiségét adhatjuk be.

A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények alkalmasak hatékony immunválasz kiváltására tömött tumorok növekedésének gátlása céljából, illetve a tömött tumorok regressziójának (visszafejlődésének) befolyásolása érdekében, ilyenfajta tömött tumorokban szenvedő emlősök esetében, amikor egy találmány szerint előállított gyógyszerkészítménnyel az illető emlősnek a tömött tumor helyétől disztálisan, szisztémás injekció formájában az IL—4 hatékony mennyiségét adjuk be.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmény alkalmas továbbá hatékony immunválasz fokozására, tömött tumorok növekedésének gátlása, illetve visszafejlődésük befolyásolása céljából, ilyenfajta tömött tumorokban szenvedő emlősök esetében, melyeknél - IL-^1 hiányában - az immunválasz nem elég erős vagy nem elég gyors ahhoz, hogy kiválthassa a tumor növekedésének gátlását, illetve a tömött tumor visszafejlődését (regresszióját), amikor a találmány szerinti gyógyszerkészítménnyel az illető emlősnek a tömött tumor helyétől disztálisan, szisztémás injekció formájában az IL-4 hatékony mennyiségét adjuk be.

A találmány szerinti eljárás tehát olyan gyógyszerkészítményt bocsát rendelkezésünkre, amely a tömött tumorok növekedésének gátlására, illetve az ilyen tumorok kezelésére vagy hatékony immunválasz kiváltására alkalmas, miáltal meggátolható a tömött tumorok növekedése, illetve visszafejlődésük idézhető elő ilyenfajta tömött tumorokban szenvedő emlősök esetében, amelyeknél - IL—4 hiányában - az immunválasz nem elég erős vagy nem elég gyors ahhoz, hogy kiválthassa a tumor növekedésének gátlását, illetve a tömött tumor visszafejlődését. A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmény az IL—4-nek az ilyen cél szempontjából hatékony mennyiségét tartalmazza valamilyen gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal és adott esetben segédanyagokkal együtt.

A találmány tárgya tehát eljárás hatóanyagként az ismert módon előállított IL-4-et tartalmazó olyan gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek tömött tumorok kezelésére használhatók ilyenfajta betegségben szenvedő emlősök esetében, melyek alkalmazásával az IL-4-et szisztémás injekció formájában adjuk be az illető emlősnek, a tömött tumor helyétől disztálisan.

Az „ismert módon előállított” kifejezés az elsőbbség napja előtt publikált eljárásokat öleli fel.

Az alábbiakban a találmányt az ábrák segítségével ismertetjük részletesebben, melyek közül:

az 1A-C. ábrák tömött tumor növekedésének oly módon kiváltott gátlását szemléltetik, hogy egér IL—4et adtunk be a találmány szerinti intraperitoneális injekció formájában olyan atimiás egér-modell esetében, ahol az állatoknak SÍ80-as szarkómájuk (1A. ábra), B 16-os melanómájuk (1B. ábra), illetve Lewis-féle tüdőkarcinómájuk (IC. ábra) volt;

a 2A. és 2B. ábrák a tömött tumor növekedésének oly módon kiváltott gátlását szemléltetik, hogy egér IL—4-et adtunk be a találmány szerinti interperitoneális injekció formájában olyan, szingenerikus C57BI1/6 egér-modell esetében, ahol az állatoknak B 16-os tumoruk (2A. ábra) vagy Lewis-féle tüdőkarcinómájuk (2B. ábra) volt;

a 3. ábra a tömött tumorok visszafejlődésének és növekedésének oly módon kiváltott gátlását szemlélteti, hogy IL—4-et adtunk be a találmány szerinti intraperitoneális injekció formájában olyan allogenetikus

HU 215 389 Β

CDI egereknek, melyek SÍ80-as szarkómában szenvednek;

a 4. ábra egér IL-4 szisztémás adagolásának hatását szemlélteti az egér immunrendszerének erősítésére és ily módon a specifikus tumor növekedésének gátlása érdekében.

A továbbiakban a találmány szerinti gyógyszerkészítmény előnyös alkalmazásait ismertetjük részletesebben.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy tömött tumort hordozó egereknek adott, egér IL-4-et tartalmazó szisztémás injekciók - a tömött tumor helyétől disztálisan alkalmazva - oly módon gátolják az ilyenfajta tömött tumorok növekedését, hogy módosítják a tumor növekedésével kapcsolatos immunrendszeri válaszreakciót. Ezen eredmények ellentétben állnak Tepper és munkatársainak eredményeivel [Cell 57, 503-512 (1989)], melyek szerint az egér IL—4 autokrin/parakrin módon gátolja a helyi tumomövekedést - azaz a tumor helyén fejti ki hatását -, nem gátolja azonban a tömött tumor növekedését abban az esetben, ha azt a tumor helyétől disztálisan alkalmazzuk. Sikerült kimutatnunk az ilyenfajta, a tömött tumorok növekedését gátló hatást olyan in vivő egér-modellben, melyben két epíteliális (felhámból kiinduló) tumort (a Lewis-féle tüdőkarcinómát és a Β16os melanómát), valamint egy kötőszöveti daganatot (az SÍ80-as szarkómát) vizsgáltuk. Adataink azt mutatják, hogy a tömött tumorok visszafejlődése (regressziója) immunkompetens (egészséges immunrendszerű) emlősöknél figyelhető meg, a tömött tumorok növekedésének gátlása pedig citotoxikus T-sejthiányos, atimiás állatoknál észlelhető. Adataink arra utalnak, hogy amennyiben a találmány szerint az IL-4 szisztémás injekcióit adjuk be tömött tumort hordozó emlősöknek, az immunrendszer komponenseinek serkentése révén az IL-4 önmagában vagy az emlős immunrendszerével együttműködve a tömött tumor növekedését gátló válaszreakciót idéz elő. Adataink tehát arra utalnak, hogy az IL-4 szisztémás adagolásának hatására a gazdaszervezet által közvetített, a tömött tumor növekedését gátló hatások bármely olyan tömött tumortípusnál létrehozhatók, melyeknél előnyös lenne az immunválasz fokozása.

A találmányi leírásban a „tömött tumor” kifejezés bármely, IL-4-re érzékeny, epíteliális típusú (felhámeredetű) tömött tumorra vonatkozik (például a melanómákra, valamint a tüdőkarcinómákra), valamint a kötőszöveti típusú tömött tumorokra (például a szarkómára), és ide sorolhatók - nem korlátozó jelleggel - az alábbi daganatok: valamennyi melanóma-típus, a vese sejtjeiből kiinduló karcinómák, az emlőrákok, a tüdőrákok, a limfómák, a mielómák, a bazális sejt-karcinómák és a vastagbél-végbél karcinómák.

A találmányi leírás értelmében a „tömött tumorok kezelése” kifejezés a találmány szerint alkalmazott, szisztémás IL-4 injekciók hatására kialakuló tumorellenes válaszreakciók széles tartományát öleli fel, éspedig a következőket: (1) a tömött tumor visszafejlődésének kiváltása; (2) a tömött tumor növekedésének gátlása; (3) olyan hatékony immunválasz kiváltása, amely gátolja a tumor növekedését, illetve a tömött tumor visszafejlődését váltja ki; és (4) a hatékony immunválasz fokozása a tömött tumorok növekedésének gátlása, illetve visszafejlődésük kiváltása érdekében, emlősök esetében. Szisztémásán alkalmazott IL—4 hiányában az emlősök válaszreakciója nem eléggé erős és nem eléggé gyors ahhoz, hogy kiválthassa a tömött tumor növekedésének gátlását, illetve a tömött tumor visszafejlődését, sikerült azonban olyan hatékony eljárásokat találnunk, melyek során a tömött tumort hordozó emlősöknek szisztémásán olyan mennyiségű - előnyösen rekombináns - IL-4-et adunk be, amely valamennyi említett cél tekintetében hatékonynak bizonyul.

A „disztális” kifejezés a „tömött tumor helyétől disztálisan” kifejezésben azt jelenti, hogy az IL-4 injekció helye a tömött tumortól olyan távolságban van, amelyen túlra normális esetben már nem diffundálnak (jutnak el) az oldható faktorok. Ez a távolság ugyanakkor nagyobb, mint a tumorral összeköttetésben lévő nyirokcsomó távolsága vagy az emberi limfociták szöveteken keresztül történő, normális vándorlási távolsága. Az IL—4 injekció pontos helyét a tömött tumortól disztálisan a beteget kezelő klinikus választja ki azt követően, hogy megvizsgálta a találmány szerint kezelendő beteget, illetve a beteg tömött tumorának/tumorainak elhelyezkedését. Jellegzetes, a tömött tumortól disztálisan található hely lehet például a bal ágyékban elhelyezkedő tömött tumor esetében valamely, a karon vagy a farpofán lévő, bőr alatti (szubkután) vagy izomban lévő (intramuszkuláris) hely, ellentétben Fomi és munkatársainak véleményével [Int. J. Can. Sup. 4; 62-65 (1989) 63. oldalon], akik a baloldali tumorral összeköttetésben álló nyirokcsomó környezetét tekintették a megfelelő helynek.

Az „oldható faktorok” kifejezés bármilyen, oldatban lévő vegyületet, illetve anyagot jelenthet, például az IL—4-et, az IFN-t, a GM-CSF-et, valamint egyéb hatóanyagokat is.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények előállításához bármilyen, ismert módon előállított IL-4 alkalmazható. Nemrégiben sikerült számos laboratóriumban az IL-4 komplementer DNS-ek (cDNS-ek) klónozása és szekvenálása [például Yokoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5894-5898 (1986) (humán); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2061-2065 (1986) (egér); Noma et al., Natúré 319, 640-646 (1986) (egér); Genzyme Corporation, Boston, Massachusetts (humán és egér)]. Nem rekombináns IL—4 tisztítása is sikerült továbbá különböző tenyészetek felülúszóiból [például Sanderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 437-440 (1986) (egér); Grabstein et al., J. Exp. Med. 163, 1405-1413 (1985) (egér); Ohara et al., J. Immunoi. 135, 2518-2523 (1985) (egér BSF-1); Butler et al., J. Immunoi. 133, 251-255 (1984) (humán BCGF); valamint Farrar et al., J. Immunoi., 131, 1838-1842 (1983) (egér BCGF)]. A fenti cikkekben foglaltak a találmány szempontjából referenciaként tekinthetők a DNS- és az aminosav-szekvenciákkal kapcsolatban, valamint azon módszerekre vonatkozó kitanítások tekintetében, amelyek segítségével előnyös, a találmány szerinti eljárásban felhasználható IL—4 hatóanyagok állíthatók elő.

HU 215 389 Β

A találmány szerinti eljárás során felhasznált IL-4 előnyösen humán IL—4, legelőnyösebben pedig az alábbi közlemények által ismertetett szekvenciájú humán változat: Yokoto és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5894-5898 (1986) és a 87/02990 számú, 1987. május 21-én nyilvánosságra hozott PCT szabadalmi bejelentés. Ezen IL-4 kifejezés és izolálása E. coliból történt (079.666 számú, 1987. július 29-én benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és a 194.799 számú, 1988. július 12-én benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés). Az IL-4-nek CHO sejtekből történő előállítását az SN 386.937 számú, 1989. július 28-án benyújtott amerikai egyesült államokbeli, közös tulajdonú szabadalmi bejelentés ismerteti. Az IL-4-nek E. coliból történő előállítását az SN 429.588 számú, 1989. október 31-én benyújtott amerikai egyesült államokbeli közös tulajdonú szabadalmi bejelentés ismerteti. A fenti cikkben, PCT szabadalmi bejelentésben és amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésekben foglaltak referenciaként tekintendők a találmányi leírásunk szempontjából.

A találmány szerint emlősöknek IL-4 hatékony mennyiségét adagoljuk a tömött tumor sejtjei szaporodásának gátlása, a tömött tumor visszafejlődésének előidézése, valamint hatékony immunválasz kiváltása céljából, miáltal a tömött tumor sejtjei szaporodásának gátlása, a tömött tumor visszafejlődése érhető el, illetve a hatékony immunválasz fokozásával is létrehozható a tömött tumor növekedésének gátlása, illetve a tömött tumor visszafejlődése. Körülbelül 0,25 és körülbelül 15 mikrogramm IL-4-et alkalmazunk, előnyösen olyan humán IL-4-et („hIL-4”), melyet E. coliból vagy CHO sejtekből állítunk elő rekombináns eljárással, még előnyösebben E. coliból származó rekombináns hIL-4-et, naponta és testtömeg-kilogrammonként. Még előnyösebben az emlősöknek körülbelül 5 és körülbelül 15 mikrogramm rekokmbináns hIL-4-et adunk testtömeg-kilogrammonként naponta, legelőnyösebben pedig az emlősöknek körülbelül napi 5 és 10 mikrogramm közötti mennyiségű rekombináns hIL—4-et adunk testtömeg-kilogrammonként.

Az adagolás mennyisége, gyakorisága és időtartama különböző tényezőktől függ, például a neutrofil sejtek számától és a monociták számától (például a monocitopénia vagy granulocitopénia súlyosságától), a beteg életkorától, tápláltságától stb. Az IL—4 beadása kezdetben általában naponta történik, és periodikusan a beteg egész élete során folytatódhat. A beadott mennyiség nagysága és az adagolás gyakorisága oly módon határozható meg, hogy kezdetben gyakran ellenőrizzük a neutrofil sejtek számát és az IL-4-nek az antitestszintek növekedésére gyakorolt hatásának nagyságát.

A beadás módja lehet intravénás, parenterális, szubkután, intramuszkuláris vagy pedig bármilyen egyéb elfogadható szisztémás eljárás. Az IL-4 alkalmazása történhet bármilyen hagyományos adagolási formában. A parenterális készítmények közé tartoznak a steril oldatok és a szuszpenziók. Azon dózisok, amelyek meghaladják a körülbelül 10 és körülbelül mikrogramm közötti rekombináns IL-4 mennyiséget testtömeg-kilogrammonként, előnyösen intravénásán adandók be emberek esetében.

A találmány szerint a gyógyszerkészítményeket a gyógyszerkészítési gyakorlatban általánosan használt ismert módszerek alkalmazásával állítjuk elő az ismert módon előállított hatóanyag (IL—4) és a gyógyszerkészítmények előállítása során szokásosan használt vivő-, hordozó-, hígító- és/vagy segédanyagok felhasználásával.

Felhasználás szempontjából előnyösek az IL-4 szisztémásán, legelőnyösebben szubkután vagy intraperitoneális injekció vagy pedig a tömött tumor helyétől disztálisan adott intravénás injekció formájában való beadására alkalmas készítmények. Az alkalmazandó oldatok lehetnek frissen feloldott liofilizált porok, amelyek tartalmazhatnak továbbá tartósítószereket, puffereket, diszpergálószereket stb. is.

Az IL-4 oldatának elkészítése előnyösen 10 millimolos cifrát pufferrel és tartósítószertől mentes steril vízzel történik oly módon, hogy a maximális koncentráció ne lépje túl a 100 mikrogrammot milliliterenként, az adagolás pedig szisztémásán történik szubkután injekció, intraperitoneális injekció vagy folyamatos intravénás infúzió, illetve intravénás injekció formájában. Folyamatos infúzió esetében a napi dózist 5 ml normál sóoldathoz adhatjuk hozzá, az oldat infúziós formában történő bevitelét pedig mechanikus pumpa vagy a gravitáció segítségével biztosíthatjuk.

Az IL-4-nek emlősök tömött tumoraira gyakorolt hatását többek között a tumor térfogata csökkenésének alapján határozhatjuk meg (ennek mérését standard technikák, például mérőkörző, röntgenvizsgálat, mágneses rezonanciavizsgálat - MRI - használatával végezzük), valamint annak alapján, hogy az ilyen emlősök élettartama, illetve túlélése növekszik, amint azt az alábbi kísérleti jegyzőkönyv alapján megállapíthatjuk.

Anyagok és módszerek:

Egerek: 10 hetes, nőstény, atimiás egereket (Harlan Sprague Dawley), 10 hetes, nőstény Nu/Nu Balb/c egereket (Charles River), 10 hetes C57BI/6 egereket és 10 hetes CDI egereket (Charles River) szereztünk be, és a Schering-Plough kutatórészleg (Bloomfield, NJ) állatkísérleti egységében helyeztük el őket.

Sejttenyészetek: A B 16-os melanóma és a Lewis-féle tüdőkarcinóma (ATCC CRL 1642) olyan tumor-sejtvonalak, melyek spontán keletkeztek C57BI/6 egerekben. Közös tulajdonságuk, hogy azonosak a fő hisztokompatibilis antigénjeik. Az SÍ80-as szarkóma (ATCC ΤΠ366) olyan sejtvonal, mely szarkóma 180-as Swiss Webster egerek aszciteszéből származik. A tumoros sejtvonalakat Dulbecco-féle minimális eszenciális táptalajon tenyésztettük, melyet 10%-os fotális szarvasmarha-szérummal, 2 mM L-glutaminnal, 50 egység/ml penicillinnel, 50 pg/ml streptomicinnel, Eagle-féle minimális eszenciális táptalajjal, vitaminokkal és nem eszenciális aminosavakkal egészítettünk ki.

Citokin: A Schering-Plough Corporationtől (Union, NJ) beszerzett, egér eredetű, 0,064 mg/ml-es (6 x 10⁷ U/mg) rIL-4-et és humán, 0,75 mg/ml-es

HU 215 389 Β (1 x 10⁷ U/mg) rIL-4-et használtunk, a megadott koncentrációkban.

Állatkísérletek: Tumorsejteket adtunk be 2 χ 10⁶sejt/0,02 ml koncentrációban, szubkután injekció formájában a hasüreg középvonala mentén. A tumor térfogatát 3 dimenziós mérőkörző segítségével határoztuk meg. Az IL-4-et naponta adtuk - a megadott dózisokban - intraperitoneálisan vagy intravénásán. Antitestadagolást is magában foglaló kísérletek esetében llBll-et (antiIL-A) kiválasztó monoklonális antitestsejtvonalat, illetve egy kontroll monoklonális antitestsejtvonalat - amely ugyanazt a GL 113-as (anti(3-Gal) izotípust szekretálja - alginátba foglaltunk, és intraperitoneális injekció formájában beadtuk. Az alginátos monoklonális sejtvonal injektálását követő 5. napon a monoklonális antitestek szérumban mérhető szintjének értéke 15 pg/ml volt. Az antitestek szintje a keringésben három héten át ezen az értéken maradt.

Krómleadási vizsgálat: Az S. Gillis és K. A. Smith által leírt eljárást alkalmaztuk [J. Exp. Med. 146, 468 (1977)]. B16-os melanómasejteket (2 x 10⁶) injektáltunk atimiás, illetve C57BI/6 egerek hasüregébe. Egér IL-4-et, illetve pufferkontrollt adtunk szubkután injekcióban, a feltüntetett ideig. Ezen egerek citotoxikus effektorsejtjeit oly módon gyűjtöttük össze, hogy leszívtuk őket a hasüregből. A célsejteket, a B16os melanóma- illetve a Lewis-féle tüdőkarcinóma-sejteket radioaktív jelzéssel láttuk el oly módon, hogy

10⁷/ml sejtet 100 pCi Na₂ ⁵¹CrO4-dal (New England

Nuclear) inkubáltunk 1 órán keresztül, 37 °C hőmérsékleten. A célsejteket átmostuk és 50 ml teljes táptalajjal inkubáltuk 1 órán keresztül, mielőtt hozzáadtuk volna a mintához. Az effector (E) és a cél- (T - target) sejteket együtt tenyésztettük 20:1, 10:1, 5:1 és 2,5:1 E/T arányban, 96 üreget tartalmazó lemezen, mintánként 3-3 üregben. Miután 200 g-n 3 percen át végzett centrifugálással a sejteket óvatosan összetömörítettük, a lemezeket 37 °C hőmérsékleten 5% széndioxid jelenlétében inkubáltuk. Minden egyes kísérleti üreg 5X10⁴ célsejtet tartalmazott 100 μΐ teljes táptalajban. 4 óra múlva a lemezeket centrifugáltuk a sejtek tömörítése céljából, és a felülúszó felét összegyűjtöttük, majd LKB 1272-es gammaszámláló berendezéssel mértük.

Meghatároztuk a Cr⁵¹ spontán leadását a teljes táptalajon csak célsejteket tartalmazó üregekből, valamint a maximális leadást azokból az üregekből, melyekben 1%-os Triton-X 100-ban inkubált célsejtek helyezkedtek el.

kísérleti cpm*-hatterleadas cpm x 100% specifikus citotoxicitas (%) =------teljes leadas cpm - hatterleadás cpm *CPM = percenkénti beütésszám (counts per minute)

Szövettani vizsgálat: A tumorsejt beviteli helyéről vett szövetet fixáltuk és paraffinba ágyaztuk, majd 5 pm-es metszeteket készítettünk, és vagy hematoxilinnal és eozinnal vagy Luxol fást blue festékkel megfestettük az eozinofil sejtek kimutatása céljából.

Eredmények:

Először meghatároztuk az egér IL—4 sejtek azon képességét, hogy atimiás egerekben, a tumor helyétől disztálisan befolyásolják számos különböző tumortípus növekedését. Atimiás egerekben a szubkután tumor növekedését gátolta az intraperitoneálisan alkalmazott egér IL-4, olyan egerekkel összehasonlítva, melyek pufferkontrollt (BC) kaptak. Az 5 és 25 pg/kg/nap dózisok statisztikailag szignifikáns (p < 0,5) gátlást hoztak létre a B 16-os melanóma, az SÍ80-as szarkóma és a Lewis-féle tüdőkarcinóma növekedésének esetében, amint azt az 1. ábra szemlélteti. A kísérletek egyik csoportja azt mutatta, hogy az egér IL-4-gyel (25 pg/kg/nap) végzett kezelés által kiváltott, statisztikailag szignifikáns tumomövekedés-gátlás B 16-os melanóma és Lewis-féle tüdőkarcinóma esetében megszüntethető anti-IL-4-et kiválasztó sejtvonal adagolásával. Az egér eredetű és humán IL-4 fajspecifikus a receptorhoz való kötődés tekintetében. [Lásd például L. S. Park et al., J. Exp. Med. 166, 476-480 (1987); J. Ohara et al., Natúré 325, 537-540 (1987); K. Nakajima et al., J. Immunoi 139, ΊΊ4-ΊΎ) (1987)]. A 25 pg/kg/nap dózisban adott humán IL-4 nem fejtett ki kimutatható hatást a B 16-os melanóma, illetve a Lewis-féle tüdőkarcinóma szubkután növekedésére, atimiás szőrtelen egerekben (ábrán nem látható adatok). Ez az IL-4-gyel kapcsolatos, fajspecifikus tumorellenes aktivitás szerepére utal.

Annak érdekében, hogy megállapíthassuk, vajon az egér IL-4 egyik lehetséges hatásmechanizmusa-e az in vivő észlelhető, közvetlen gátló hatás, a tumorsejtek proliferációjának mértékét egér IL-^4 jelenlétében és távollétében vizsgáltuk. Az egér IL-4 nem befolyásolta a jelen kísérletekben felhasznált tumorsejtek in vitro megfigyelhető proliferációját. Amint azt ³H-timidin inkorporációval, illetve a tumorsejtek számának meghatározásával megállapíthatjuk, a 25 pg/ml-es - magas egér IL—4 koncentrációk nem gyakorolnak közvetlenül észlelhető hatást a B 16-os melanóma, az SÍ80-as szarkóma és a Lewis-féle tüdőkarcinóma proliferációjára (nem ábrázolt adatok).

Megvizsgáltuk egér IL-4 intraperitoneális adagolásának hatását a szubkután tumomövekedésre, szingenetikus (syngeneic) gazdaszervezet esetében, Β16-os melanóma és Lewis-féle tüdőkarcinóma esetében,

C57BI/6 egerekben. Amint azt a 2A. és B. ábrákon láthatjuk, az 1 pg/kg/nap értékű - alacsony - dózisok szignifikánsan gátolták a Lewis-féle tüdőkarcinóma növekedését 12 napos kezelést követően (2A. ábra), a 25 pg/kg/nap egér IL-4 dózisok pedig 15 napos kezelés után szignifikánsan gátolták a B 16-os melanóma növekedését (2B. ábra). Mindkét említett tumorfajta esetében alacsonyabb növekedési sebesség volt megfigyelhető, mint a pufferkontrollos (BC) állatok tumorainál.

A szubkután tumomövekedést allogenikus (alloge60 neic) gazdaszervezet esetében is befolyásolta az egér

HU 215 389 Β

IL—4 intraperitoneális adagolása. Amint azt a 3. ábra mutatja, az SÍ80-as tumorok gátlása és visszafejlődése egyaránt megfigyelhető volt CDI egerek esetében az 1 és 25 pg/kg/nap dózistartomány felett, amint azt a 3. ábra mutatja. A pufferkontrollal kezelt, tumort hordozó állatok esetében nem lépett fel a tumor visszafejlődése (regressziója). A fokozott tumomövekedés sebessége azonban egyenletesnek (kiegyenlítettnek) tűnik.

Amikor peritoneális sejteket gyűjtöttünk olyan, tumort hordozó állatokból, melyeket a tumor helyétől disztálisan egér IL—4 injekcióval kezeltünk, azt figyelhettük meg, hogy a peritoneális sejtek szelektív citotoxicitást mutattak az azonos tumorsejtvonalból származó sejtekkel szemben. Amint azt a 4. ábra szemlélteti, egér IL-4 szubkután adagolása olyan C57BI/6 egereknek, melyek peritoneális B 16-os melanómatumorokat hordoznak, azt eredményezte, hogy az ilyen állatoktól nyert peritoneális sejtek ⁵¹Cr-leadást váltottak ki a B 16-os melanómasejtekből, nem fokozták azonban citotoxicitásukat a Lewis-féle tüdőkarcinóma sejtjeivel szemben. A pufferkontrollal kezelt B 16-os melanómát hordozó állatokból nyert peritoneális sejtek nem voltak képesek egyik tumor célsejtjeinek bomlasztására (lízisére) sem. Ezen adatok azt mutatják, hogy az egér IL—4 fokozza az egér immunrendszerének azon képességét, hogy gátolni tudja a specifikus tumomövekedést. Ezen adatok annak előjelzésére is alkalmasak, hogy a humán IL-^1 - előnyösen a rekombináns IL-4 - klinikai felhasználásra kerülhetnek embereknél is tömött tumorok kezelésére, mivel mind az epiteliális (felhám-) típusú tumorok (melanómák és tüdőkarcinómák), mind pedig a kötőszöveti típusú tumorok (szarkóma) növekedése gátolható ily módon. Továbbá a tumomövekedés gátlása a találmány szerint allogenikus egér-gazdaszervezeteknek adott szisztémás egér IL—4 injekciókkal arra utal, hogy a tömött tumorokban szenvedő emlősök normális immunreakciói fokozhatok az IL-4 szisztémás alkalmazásával a találmány szerint.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás hatóanyagként IL-4-et tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított hatóanyagot a gyógyszerkészítmények készítésénél szokásosan használt hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal kombináljuk, és emlősök tömött tumorainak disztálisan beadható szisztémás injekció formájában való kezelésére alkalmas gyógyszerkészítménnyé kiszereljük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot vivőanyaggal keveqük.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként humán IL—4-et tartalmazó gyógyszerkészítményt állítunk elő.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként E. coliban kifejezett rekombináns humán IL-4-et tartalmazó gyógyszerkészítményt állítunk elő.
5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,25-15 pg IL—4/testtömeg-kg beadására alkalmas dózis formájában levő gyógyszerkészítményt állítunk elő.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tüdőkarcinóma kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy szubkután injekcióként beadható gyógyszerkészítményt állítunk elő.