HUT78097A

HUT78097A - IL-10 alkalmazása perifériás vér mononukleáris sejt citolitikus aktivitás stimulálására

Info

Publication number: HUT78097A
Application number: HU9601989A
Authority: HU
Inventors: Martin A. Schwarz
Original assignee: Schering Corp.
Priority date: 1994-01-20
Filing date: 1994-01-20
Publication date: 1999-10-28
Also published as: HU9601989D0

Description

A találmány az interleukin-10 (IL-10) — azaz citokin szintézis gátló faktor (cytokine synthesis inhibitory factor = CSIF) — daganatos betegségek (rák) kezelésében való felhasználására vonatkozik, mégpedig adoptiv immunterápiában a perifériás vér mononukleáris sejtek (peripheral blood mononuclear cell = PBMC) citolitikus aktivitásának stimulálása révén.

A rák terápiájának immunológiai úton való megoldása azon az elgondoláson alapul, hogy a rákos sejtek valahogyan kitérnek a szervezetben lévő rendellenes vagy idegen sejtekkel és molekulákkal szembeni védekező mechanizmus elől és hogy ezek a védekező mechanizmusok terápiásán stimulálhatok a rákos sejtek ölésére vagy növekedésének gátlására. Lásd például Klein erre vonatkozó fejtegetését [ Immunology, Wiley-Interscience, New York (1982)

623-648 old.] . Az a legújabb megfigyelés, miszerint az immuneffektorok közvetlenül vagy közvetve gátolják a tumor-növekedést, a rák terápiájának ilyenfajta megközelítése iránt újabb érdeklődéshez vezetett [ Heberman, Concepts Immunpath., _1, 96 (1985) (a természetes ölő sejtek akadályozzák a tumor növekedést) ; Rosenberg et al., Ann . Rév. Immunoi. , _4, 681 (1988) (IL-2-aktivált ölősejtek használata rák kezelésére); Ralf et al. , J.Exp.Med., 167, 712 (1988) (limfkinekkel stimulált makrofágok tumoricid aktivitása); Tepper et al. , Cell, 57, 503 (1989) (az

IL-4 tumoricid aktivitású); M.Cohen, „Lymphokines and Tumor

Immunity S.Cohen (szerk.) Lymphokines and the Immuné Response,

237-253 old. (CRC Press, Boca Raton, 1990) .

A daganatos betegségekkel szembeni immunválaszadási készséget különböző sejttípusok szabályozzák és a válaszadásban T sejt hatások és monocita eredetű citokinek vesznek részt. Az egyik immunológiai megközelítés, amely klinikailag sokat ígérőnek mutatkozott, az úgynevezett „adoptív immunterápia, amely IL-2-vel aktivált ölő sejteket használ (Rosenberg, lásd fentebb;

Rosenberg, Sci. Am., 62-69 old. 1990. május). Jóllehet az IL-2 egyedül, vagy több hagyományos kemoterápiás szerrel kombinálva, hatásosnak tűnik a rosszindulatú megbetegedések (például vesesejt karcinóma) kezelésében, azonban a sajnálatos toxikus mellékhatások, mint az érrendszer szivárgása és az ödéma, amelyek az IL-2 hatásos dózisainak az alkalmazásához társulnak, ahhoz a feltételezéshez vezettek, hogy ezek a veszélyek ellensúlyozhatják a jótékony hatásokat [Cotran et al., J.Immunoi., 139, 1882 (1987); Edwards et al. , Cancer Rés., 52, 3425 (1992)] .

A humán vaszkuláris endoteliális sejtek, úgy tűnik, különösen érzékenyek az IL-2 toxicitásra, amit a megnövekedett vaszkuláris permeabilitás (azaz vaszkuláris szivárgási szindróma) és az ödéma is bizonyít. Az egyik tényező, ami ehhez a kóros jelenséghez hozzájárul, az az IL-2 által aktivált T sejteknek és neutrofileknek az endoteliális egysejtréteghez való megnövekedett adhéziósa lehet, amelyet in vitro már előzőleg megfigyeltek [Edwards et al., lásd fentebb; Damle et al., J.Immunoi., 138,

1779 (1987)] .

A daganatos betegségek immunológiai kezeléséhez alternatív megoldást jelent az immunsejtek adoptiv átvitele. Adoptiv immunterápia alatt azt értjük, hogy ha egy tumor-hordozó gazdára aktív immunológiai reagenseket, például olyan anti-tumor aktivitású sejteket viszünk át, amelyek vagy közvetlenül vagy közvetve közvetíthetik az anti-tumor hatásokat. Az adoptiv immunterápia a daganatos betegségek terápiájában egy vonzó megoldást képvisel. Meg kell jegyezni, hogy mivel aktív immunológiai reagenseket viszünk át a gazdára, nincs szükség a gazda teljes immunkompetenciájára. Ennélfogva, az immunszuppresszió, amely általában a tumor-hordozó állapothoz társul, ennél a terápiás alternatívánál nem jelent nagyobb problémát. Minthogy a gazda immunkompetenciája nem követelmény, ez a körülmény ténylegesen jótékonyan járul hozzá az immunsejtek adoptiv átvitelének a hatásaihoz. Az adoptiv immunterápiát könnyen kombinálhatjuk más terápiákkal, így kemoterápiával vagy sugárterápiával. Más terápiákkal ellentétben, nem valószínű, hogy ez a kezelés immunszuppressziót eredményezne.

A kemoterápián vagy sugárterápián átesett betegek immunológiailag veszélyeztetettekké válhatnak és általában kimerül az utánpótlásuk az aktiváláshoz rendelkezésre álló perifériás vér mononukleáris effektor sejtekből. Ennélfogva egy olyan terápia, amely alacsony effektor sejt : célsejt arány mellett hatásos, különösen előnyös az ilyen betegek számára.

A daganatok elleni immunválaszadási készséget különböző sejttípusok szabályozzák és ebben szerepük van a T-sejt hatásoknak és a monocita eredetű citokineknek. A rekombináns humán citokineket használó adoptiv immunterápia estrakorporálisan stimulált perifériás mononukleáris sejtek bevitelét (PBMC-k) alkalmazását [Phillips et al. , J.Clin.Oncol., _5, 1933 (1987); Perussia, Curr.

Opin. Immunoi., 3_, 49 (1991)] , majd ezt követően IL-2 adását [ Rosenber et al., J.Immunoi., 138, 1779 (1985)] tartalmazza. A

PBMC-k extrakorporális kezelése olyan aktivált limfokin-aktivált killer (LAK) sejteket és aktivált természetes ölősejteket (natural killer = NK) eredményez, amelyek citolitikus aktivitást fejtenek ki a különböző tumorsejtekkel szemben.

A rekombináns humán IL-5-ről [ Nagasawa et al., Cell.Immunoi., 133, 317 (1991)], IL-7-ről [ Stotter and Lotze, Arch.Surgery,

6, 1525 (1991)] és IL-12-ről [ Gately et al., J.Immunoi., 147,

874 (1991)] közölték, hogy humán PBMC-kben stimulálják a citolitikus aktivitást. Úgy tűnik, hogy az interleukin-10 (IL-10), amelyet eredetileg egerekben, mint specifikus helper T sejtek által szekretált citokin szintézis gátló faktort írtak le, az egérfélék citotoxikus T sejtjeinek differenciálódását modulálja [Chen és Zlotnik, J.Immunoi., 147, 528 (1991)] . Azt is megállapították, hogy azok a humán PBMC-k, amelyeket humán

IL-10-zel transzfektált COS sejtekből nyert felülúszókkal inkubáltak, in vitro lizálják a tumor-célsejteket. Megállapították, hogy azok a T sejtek, amelyek megnövekedett citolitikus potenciállal válaszolnak IL-10-re, CD56+ fenotípusúak, s ez NK sejtekre utal.

Bizonyos körülmények között az IL-4 ellenkező hatással lehet az IL-2 által létrehozott LAK aktivitásra [ Nagler et al., J. Immunoi., 141, 2349 (1988)] . Például, ha humán PBMC-ket mind IL-2, mind IL-4 jelenlétében tenyésztünk, a LAK-szenzitiv célsejtek lízise nagymértékben csökken [ Spits et al. , J.Immunoi., 141, 29 (1988)] . Azonban, ha PBMC-ket IL-2-vel kiegészített táptalajban napig előtenyésztjük IL-4 hozzáadása előtt, ennek eredménye megnövekedett citolitikus aktivitás lesz [Spits et al. , lásd fentebb] . Ezenkívül, az IL-2-indukált citotoxicitás IL-4 hatására létrejött blokádját úgy hatálytalaníthatjuk, ha alfa-interferont (α-IFN) vagy alfa-tumor nektózis faktort (TNF-α) viszünk be a kezdeti inkubációs keverékbe [ Swisher et al., Cell.

Immunoi., 128, 450 (1990)].

Kedar és munkatársai [Cancer Immunoi.Immunother., 35, 63 (1992)] legújabban rámutattak, hogy az IL-2 és az α-IFN egymás utáni alkalmazása hatásos immunterápiás módozatnak bizonyult egér tumor modellekben, az MCA-105 szarkómák és M109 karcinómák kezeléséhez. Ennek a tanulmánynak a fő megállapítása az volt, hogy a citokinek egymást követő alkalmazása nagyobb hatékonyságot mutatott, mint a két citokin együttes alkalmazása.

A 4,690,915 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Rosenberg az adoptiv immunterápia használhatóságát és hatékonyságát ismerteti, és megállapítja hogy különböző betegségek esetén, főképpen embereknél, a daganatos betegségek kezelésére, mint kezelési módozat jön számításba. Azonban, mint fent már megjegyeztük, igény merült fel olyan módszerek iránt, amelyekkel az ilyen kezeléseket végre lehet hajtani és amelyek nem olyan toxikusak, mint a csak IL-2-t alkalmazó kezelések. Ugyancsak szükség van olyan terápiára is, amely alacsony effektor sejt : célsejt arányok mellett is hatékony.

A találmány ezeket az igényeket azzal teljesíti, hogy módszereket bocsát rendelkezésre az IL-10 egyedüli használatára, vagy az IL-2-vel és/vagy az α-IFN-nal kombinációban való felhasználására, a PBMC-k, különösen a LAK és NK sejtek citolítikus aktivitásának a növelése céljából.

Pontosabban, a találmányban módszert ismertetünk a rák kezelésére, amely abból áll, hogy egy rákbetegségben szenvedő betegnek IL-10-aktivált PBMC-k hatékony mennyiségét adjuk be, amely a rák regresszióját idézi elő. Előnyös, ha az aktivált PBMC-k alkalmazását IL-10 beadása kíséri és/vagy követi.

Egy kiviteli alakban az IL-10-et annyi IL-2-vel kombináltan alkalmazzuk, amennyi elégséges a LAK sejt aktiválás növeléséhez, de nem okoz olyan toxikus mellékhatásokat, mint amelyek az IL-2 egyedüli használatával járnak együtt.

Egy másik kiviteli alakban az IL-10-et annyi α-IFN-nal kombináltan alkalmazzuk, amennyi elégséges a LAK sejt aktiválás növeléséhez .

Egy további kiviteli alakban az IL-10-et (a) annyi IL-2-vel kombinálva alkalmazzuk, amennyi elégséges a LAK sejt aktiválás növeléséhez, de nem okozza az IL-2 egyedüli adásával járó toxikus mellékhatásokat és (b) annyi oc-IFN-nal kombinálva alkalmazzuk, amennyi a LAK sejt aktiválás növeléséhez elégséges.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan módszer, amelynek a segítségével az IL-2-indukált citotoxicitás endogén IL-4 által létesített blokádját meggátoljuk, mégpedig úgy, hogy egy betegnek, akinek ilyen kezelésre szüksége van, az IL-10 hatékony mennyiségét adjuk be.

A találmány olyan gyógyszerkészítményekre is vonatkozik, amelyek az IL-10-et IL-2-vel és/vagy α-IFN-nal, továbbá egy gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal kombinálva tartalmazza.

Előnyösen humán IL-10-et, IL-2-t és α-IFN-t használunk az előzőleg említett módszerekben és készítményekben, de legelőnyösebben rekombináns humán IL-10-et, IL-2-t és a-IFN-t.

A találmányi leírásban idézett szakirodalmi közleményeket referenciának tekintjük.

A találmány egy tökéletesített formája az eddig használt azon módszereknek, amelyekben IL-2-t alkalmaztak NK és LAK sejtekben a citolitikus aktivitás indukálásához. A találmány nagymértékben csökkenti a toxikus mellékhatásokat, amelyeket ilyen módszerekben az IL-2 használata általában okozott, mégpedig azáltal, hogy teljesen kiküszöböli az IL-2-t vagy pedig nagymértékben csökkenti a szükséges IL-2 mennyiségét.

Ha másként nem jelezzük, a leírásban használt különböző kifejezések jelentése megegyezik azon kifejezésekével, amelyek azon a szakterületen, amelyre ez a találmány vonatkozik, jól ismertek .

A leírásban használt „adoptiv immunterápia kifejezés egy olyan terápiára vonatkozik, amelyben egy betegbe aktivált, működőképes immunsejteket viszünk át. Előnyös, ha ezek a sejtek ténylegesen a kezelés alatt álló betegből származó LAK és NK sejteket tartalmazzák.

A „regresszió kifejezéssel olyan esetet írunk le, amikor egy vagy több tumor méretében — a szakterületen általában használt mérési módszer szerint — mérhető csökkenés következik be.

Az itt használt „interleukin-10 vagy „IL-10 kifejezés egy olyan proteinre vonatkozik, amelynek (a) az aminosavszekvenciája megegyezik az 1992. július 20-án benyújtott, 07/917,806 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (amely a WO 91/00349 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésnek felel meg) szereplő érett (azaz szekréciós vezérszekvencia nélküli) IL-10 szekvenciájával, és (b) biológiai aktivitása is az érett IL-10-ével azonos. A találmány szempontjából mind a glikozilált (például az eukarióta sejtekben — ilyenek a CHO sejtek — előállított), mind a nem glikozilált (például a kémiailag szintetizált vagy E.coli-ban előállított) IL-10 azonos értékű és a találmány céljára egymással felcserélve használhatók. A muteinek és más analógok, beleértve a BCRF1 (Epstein Barr vírus eredetű virális IL-10) proteint, amely IL-10 biológiai aktivitással rendelkezik, szintén ide sorolhatók.

A találmány szerinti felhasználásra alkalmas IL-10-et számos forrásból izolálhatjuk. Izolálhatjuk például az ezen proteint szekretáló aktivált sejtek táptalajából. Ezenkívül az IL-10, vagy aktív fragmentumai kémiai szintézissel is előállíthatok a szakterületen ismert standard technikák alkalmazásával [Lásd:

Merrifield, Science, 233, 341 (1986) és Atherton et al . , Solid

Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, (1989)] .

A proteint vagy a polipeptidet előnyösen rekombináns technikákkal, az IL-10 polipeptidet kódoló izolált nukleinsav használatával állítjuk elő. Az általánosan használt molekuláris biológiai eljárások leírását a következő kiadványok tartalmazzák:

Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor, New York, 2. kiadás (1989) és Ausubel et al .

(szerk.), Current Protocols in Molecular Biology, Green/Woley,

New York (1987 és időszakos kiegészítések). A megfelelő szekvenciákat — standard technikák segítségével — vagy genomiális vagy cDNS gyűjteményekből kaphatjuk meg. Használhatók a polimeráz láncreakció (PCR) technikák is. Lásd például: Innis et al.

(szerk.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,

Academic Press, New York (1990).

A gyűjteményeket a megfelelő sejtekből kivont nukleinsavakból képezhetjük, lásd például a WO 91/00349 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben, amely rekombináns módszereket ismertet az IL-10 előállítására. Használható génszekvenciák találhatók például a különböző szekvencia adatbázisokban, ilyenek például a GenBank és BMPL nuj kleinsavra és a PÍR és Swiss-Prot proteinre, továbbá az Intelligenetics cég (Mountain View,

California) vagy a Genetics Computer Group, University of

Wisconsin Biotechnology Center (Madison, Wisconsin). A találmányi leírásban ezeket referenciáknak tekintjük.

Humán IL-10-et kódoló szekvenciákat tartalmazó kiónok 68191 és 68192 letéti szám alatt vannak letétben az American Type

Culture Collection (ATCC) intézménynél (Rockville, Maryland,

USA). IL-10-et kódoló szekvenciákat tartalmazó további kiónokat, vagy nukleinsav hibridizálással, vagy a kódolt protein immunológiai kimutatásával azonosíthatunk, amennyiben expressziós vektort használunk. Különösen hasznosak a WO 91/00349 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben szereplő, letétbe helyezett szekvenciákon alapuló oligonukleotid szondák. Oligonukleotid szonda szekvenciákat más fajokban lévő rokon gének állandó szakaszai alapján is előállíthatunk, vagy pedig az IL-10 aminosav-szekvenciákon alapuló degenerált szondákat használhatjuk .

» . ···· · • » 4 9 4 » « · 4 · · · » • · · * »·· ··«·*·« · ·

Standard módszereket használhatunk olyan transzformált prokarióta, emlős, élesztő vagy rovar sejtvonalak előállítására, amelyek nagymennyiségű polipeptidet fejeznek ki. A következő

E.coli törzsek például mind expresszióra, mind klónozásra alkalmasak: W3110 (ATCC Bi, 27325), X1776 (ATCC 31244), X2282, RR1 (ATCC Mp/31343). Ilyenek például a következő emlős sejtvonalak:

COS-7 sejtek, egér L sejtek és CHP sejtek. [Lásd: Sambrook (1989) és Ausubel et al. (1987, kiegészítések).]

Az IL-10-et kódoló DNS kifejezésére különböző expressziós vektorok használhatók. Használhatjuk a rekombináns proteinek prokarióta vagy eukarióta sejtekben való kifejezésére szolgáló szokásos vektorokat is. Az előnyös vektorok közé tartoznak az Okayama és munkatársai [ Mól. Cell. Bioi., 3_, 280 (1983)] és Takabe és munkatársai [ Mól.Cell.Bioi. , 8^, 466 (1988)] által leírt pcD vektorok. Egyéb SV40-alapú emlős expressziós vektorokat ismertettek Kaufman és munkatársai [ Mól.Cell.Bioi., 2, 1304 (1982)] és ilyeneket ír le a 4,675,285 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Ezen SV40-alapú vektorok különösen COS-7 majom sejtekben (ATCC CRL 1651) használhatók, valamint más emlős sejtekben, például egér L sejtekben. [ Lásd még: Pouwels et al., (1989 és kiegészítések) Cloning Vectors: A Laboratory Manual,

Elsevier, New York] .

Az IL-10 termelhető oldható formában, ilyen a transzformált vagy transzfektált élesztő vagy emlős sejtek által szekretált termék. A peptidek ezután a szakterület jól ismert standard módszereivel tisztíthatok. A tisztítási lépések tartalmazhatnak például ammónium-szulfátos kicsapást, ioncserés kromatográfiát, • · és hasonlókat. [Lásd: Methods in Enzymology, Purification Principles and Practices (Springer Verlag, New York, 1982) .]

Az IL-10 oldhatatlan formában, például aggregátumok vagy zárványtestek formájában is előállítható. Az ilyen formában kapott IL-10-et a szakterületen jól ismert standard módszerekkel tisztítjuk. A tisztítás a következő lépésekből áll: a zárványtesteket centrifugálással választjuk el a feltárt gazdasejtektől, ezután a zárványtesteket kaotróp szerekkel és redukáló szerekkel tesszük oldhatóvá úgy, hogy a peptid biológiailag aktív konformációt vegyen fel. Ezen eljárások részletezése végett lásd például: Winkler et al. , Biochemistry, 25, 4041 (1986), Winkler et al. , Bio/Tecvhnology, 3_, 9923 (1986), Koths et al, és 4,569,790 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.

A gazdasejtek transzfektálásához használt nukleotid szekvenciák standard technikák szerint módosíthatók az IL-10 vagy ennek különböző kívánt tulajdonságokkal rendelkező fragmentumai előállítása céljából. Az így módosított IL-10 — primér szerkezete szintjén — eltérhet a természetben előforduló szekvenciáktól, például aminosav inszerciók, szubsztitúciók, deléciók és fúziók révén. Ezeket a módosításokat számos kombinációban használhatjuk a végső, módosított protein-lánc előállítása céljából.

Különböző célkitűzések érdekében is készíthetünk aminosavszekvencia változatokat, többek között a szérum felezési idő növelése, a tisztítás vagy előállítás megkönnyítése, a terápiás hatékonyság javítása és a terápiás felhasználás folyamán a mellékhatások súlyosságának vagy előfordulásának a csökkentése végett. Az aminosavszekvencia változatok rendszerint előre mégha13 tározott olyan variánsok, amelyek a természetben nem fordulnak elő. Mások lehetnek poszt-transzlációs variánsok, például glikozilált variánsok, vagy olyan proteinek, amelyeket polietiénglikollal (PEG) konjugáltunk, stb. Ezek a változatok a találmányban felhasználhatók, amennyiben megtartották az IL-10 biológiai aktivitását .

A polipeptideket kódoló szekvenciák módosításai könnyen kivitelezhetők a különböző technikák használatával, például helyre irányuló mutagenezissel [ Gillman et al., Gene, 8., 81 (1987)] . A legtöbb módosítás rutin szűréssel, a kívánt jellemzők megfelelő vizsgálatával, megállapítható. A WO 91/00349 számú nemzetközi szabadalmi leírás például számos in vitro vizsgálatot ír le az

IL-10 aktivitás mérésére.

Előnyös, ha emberek kezeléséhez humán IL-10-et használunk, ámbár virális IL-10-et, vagy néhány más emlős fajból származó

IL-10-et is használhatunk. A legelőnyösebben használható IL-10 a rekombináns humán IL-10. A humán és az egér IL-10 előállításának a leírását a WO 91/00349 számú nemzetközi szabadalmi leírás tartalmazza. Az Epstein-Barr vírus eredetű virális IL-10 (BCRF1 protein) klónozását és expresszióját Moore és munkatársai közölték [ Science, 248, 1230 (1990)] . A rekombináns IL-10 árucikk, beszerezhető például a PreproTech Inc. cégtől (Rocky Hill, NJ.,

USA) .

A találmány szerinti módszerekkel való kezelésre olyan daganatos betegségben szenvedő egyének alkalmasak, akiknél jótékony hatás érhető el a PBMC citolitikus aktivitás stimulálása, főképpen a LAK és NK sejtek aktiválása révén. Ilyen rákos betegeket ír le például Rosenberg (lásd fentebb) a Scientific American című folyóiratban. A találmány szerinti módszerekkel való kezelésre azok az egyének is alkalmasak, akiknél hajlam mutatkozik az endogén IL-4 szintek olyan fokú emelkedésére, amikoris az IL-4 az IL-2 által aktivált citolitikus aktivitást blokkolja. Ilyen egyéneknél egy előnyös kezelés az IL-2 alkalmazása előtt IL-10zel való előkezelést tartalmaz.

A találmányban használt IL-10 előállítására leírt standard módszerek és technikák az IL-2 és α-IFN előállítására is alkalmazhatók. A találmányban használt IL-2 és α-IFN szintén kapható a kereskedelemben [például: az IL-2 a Cetus Corporation-tói (Emeryville, CA., USA) és az oc-IFN a Schering Corporat ion-tói (Kanilworth, NJ., USA) szerezhető be] .

A PBMC-k (előnyösen a kezelendő betegtől, standard módszerekkel nyerhető) szervezeten kívüli aktiválását és az ilyen sejtek alkalmazását lényegében úgy végezzük, ahogyan a fent említett

Rosenberg féle közlemények leírják, kivéve, hogy az IL-10-et csökkentett mennyiségű IL-2-vel és/vagy α-IFN-nal használjuk, ahogyan itt leírjuk. A beadott aktivált PBMC-k száma a körülbelül 10⁶-tól körülbelül 10¹² sejt tartományon belül van. Előnyös — bár nem szükséges — ha az ilyen aktivált sejtek alkamazását IL-10 alkalmazása kíséri és/vagy követi, ahogyan itt leírjuk.

Egy kiviteli alakban a PBMC-ket IL-10-zel való előkezeléssel aktiváljuk [például 3 napon át 37 °C-on 4 ng/ml (100 egység/ml) vagy 40 ng/ml humán IL-10-zel inkubáljuk] . A sejteket ezután mossuk, hogy a szabad IL-10-et eltávolítsuk, majd kis mennyiségben IL-2-t (általában 2 egység/ml) adunk hozzá.

Előnyös, ha az IL-10-zel aktivált citolitikus sejtek egyedüli alkalmazása vagy más citokinekkel kombináltan való alkalmazása intravénás infúzióval történik. Az infundálást vagy egy nagy perifériás vénába centrális vénás katéterrel, vagy a máj artériába perkután katéterrel végezzük.

Az IL-10-et általában olyan gyógyszerkészítmény formájában alkalmazzuk, amely egy gyógyszerészeti vivőanyagot és vagy egyedül az IL-10 hatékony mennyiségét tartalmazza vagy az IL-10 hatékony mennyiségét IL-2-vel és/vagy α-IFN-nal kombinálva tartalmazza. A gyógyszerészeti vivőanyag bármilyen olyan kompatibilis nem-toxikus anyag lehet, amely alkalmas arra, hogy egy betegnek a találmány szerinti készítményt beadjuk. Az ilyen hatóanyagok parenterális alkalmazásához megfelelő készítmények jól ismertek. Lásd például: Remington' s Pharmaceutical Science, 15.

kiadás (Mack Publishing Company, Easton, PA., USA, 1980) . A találmány szerinti készítményt implantálható vagy injektálható gyógyszeradagolási rendszer révén is bejuttathatjuk egy betegbe.

Lásd például: Urquhart et al., Ann.Rév.Pharmacol.Toxicol., 24 ,

199 (1984); Lewis (szerk.): Controlled Release of Pesticides and

Pharmaceuticals (Plenum Press, NY, 1981); U.S. 3,270,960 számú szabadalmi leírás, és hasonlók.

A citokin beadására bármilyen jól ismert alkalmazási formát, vagyis intravénás, intraperitoneális és szubkután alkalmazási formát használhatunk. Előnyben részesítjük az intravénás alkalmazást .

Amennyiben a készítményeket parenterálisan alkalmazzuk, azokat egyadagos injekciós formában (oldat, szuszpenzió, emulzió) formulázzuk, gyógyszer vivőanyaggal együtt. Ilyen vivőanyag például a normál sóoldat, a Ringer oldat, a glükóz oldat és a Hank oldat. Nem vizes vivőanyagként használhatunk stabil olajokat és etiloleátot. A vivőanyag kis mennyiségű adalékokat is tartalmazhat, például olyan anyagokat, amelyek biztosítják az izotonicitást és fokozzák a kémiai stabilitás, mint például a pufferek és a konzerválószerek. Az IL-10-et előnyösen tisztított formában, lényegében aggregátumoktól és más proteinektől mentesen formulázzuk, körülbelül 5-20 pg/ml koncentráció tartományban.

A találmány szerinti készítményeket standard génterápiás technikákkal is bevihetjük, ilyen például a szövetekbe való közvetlen DNS injekció, a rekombináns virális vektorok használata és a transzfektált sejtek implantációja. Lásd például:

Rosenberg, J.Clin.Oncol., 10, 180 (1992).

Az itt leírt egy vagy több terápiás szer együttes alkalmazása lehet egyidejű (az IL-10 alkalmazásával együtt), vagy egymás utáni. Előnyös, ha az IL-10-et az IL-2 beadását megelőzően alkalmazzuk. Az α-IFN-t az IL-10-zel és/vagy az IL-2-vel együtt adhatjuk be, vagy ezek után. Kívánatos, hogy a beadott szerekből megfelelő szinteket kapjunk a betegben ahhoz, hogy terápiás hatékonyságot érjünk el a tumor regresszió előidézéséhez.

A leírásban használt „hatékony mennyiség kifejezés azt az

IL-10 mennyiséget jelenti, amennyi az adoptív immunterápiában a mellékhatások csökkentéséhez vagy megelőzéséhez szükséges, ugyanakkor stimulálja a LAK és NK sejt citolitikus aktivitást.

Egy adott beteg számára szükséges citokin(ek) hatékony mennyisége számos faktortól függhet, például a kezelendő daganatos be• · • · tegség státusától és típusától, a beteg általános egészségi állapotától, az alkalmazás módszereitől, a mellékhatások súlyosságától, az egyidejűleg használt egyéb gyógyszerek mennyiségétől és hasonlóktól.

Egy citokin azon mennyisége, amely „elégséges a LAK sejt aktiválás növeléséhez egy olyan citokin mennyiséget jelent, amely legalább 25 %-os növekedést hoz létre a csak IL-10 által indukált citolitikus aktivitási szinthez képest egy Daudi sejteken alapuló citolitikus vizsgálatban. Előnyös, ha a növekedés legalább 50 %-os, a legelőnyösebb, ha legalább 100 %-os.

Az IL-10-et előnyösen a maximálisan elviselhető adagban, napi θ

körülbelül 10 E/kg testtömegtől napi körülbelül 10 E/kg testtömeg adagban alkalmazzuk. Ehhez hasonlóan az IL-2-t és az a-IFN-t is a maximálisan elviselhető adagban alkalmazzuk (például IL-2ből 10⁵ E/kg testtömeg adagot adunk intravénásán 8 óránként 50 ml 0,9 %-os sóoldatban, amely vivőanyagként 5% albumint tartalmaz; α-IFN-ból 10⁶ E/kg testtömeg adagot adunk intravénásán minden 8 órában, vivőanyagként 5% albumint tartalmazó 0,9 %-os sóoldatban) . Mint előzőleg említettük, az adagolást a kezelő orvosnak kell úgy beállítania, hogy az a betegek által individuálisan elviselhető határokon belül legyen.

A találmány szerinti módszereket a rák kezelésének hagyományos megoldásaihoz kapcsolódva is használhatjuk. Ilyen a sugárterápia és a kemoterápia, amelyben hagyományos kemoterápiás szereket használnak, például Vinca alkaloidákat, platina vegyületeket és 5-fluor-uracilt.

A humán perifériás vér mononukleáris sejtek kezelése egyedül

IL-10-zel vagy más citokinekkel kombinálva, megnöveli a citolitikus aktivitást a humán tumor targetsejtekkel szemben. Minthogy az immunterápia hatásossága nagyrészt a tumor terheléstől függ, különösen jó hatással járna, ha az itt leírt kezelési módszerek a primer tumor zömének kimetszése után kerülnének alkalmazásra.

Egy gyulladásos reakció, amely az operáció helyén általában előfordul, szintén kedvező lenne a terápia eredményessége szempontj ából.

Az alábbi példák a találmány szemléltetését szolgálják, de nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

Az IL-10 hatása a citolitikus aktivitásra humán perifériás vér mononukleáris sejtekben.

Tanulmányoztuk az IL-10 hatását a citolitikus aktivitás in vitro képződésére humán perifériás vér mononukleáris sejtekben.

Az eredményeket a következőképpen foglalhatjuk össze:

1) Az IL-10 stimulálja a limfokin aktivált ölő (LAK=lymphokine activated killing) és természetes ölő (NK=natural killer) aktivitásokat humán perifériás vér mononukleáris sejtekben. Az

IL-10 által indukált citolitikus aktivitás IL-10 ekleni patkány monoklonális antitestekkel neutralizálható.

2) A CHO és E.coli expressziós rendszerekből származó

IL-10 hasonló összetételű válasz-képet mutat a LAK és NK aktivitások stimulálásában, tehát biológiai értékük azonos.

3) Az IL-10-zel és az IL-2 alacsony koncentrációival kezelt PBMC-k nagyobb LAK aktivitást mutatnak, mint ami csak az egyik citokinnel való kezelésnél figyelhető meg.

4) Az IL-10-zel 2 napig előkezelt PBMC-k IL-2 hozzáadására nagyobb citolitikus aktivitást fejtenek ki.

5) Az IL-10 akadályozza az IL-4 IL-2-indukált LAK aktivitást gátló képességét.

6) Az IL-10 plusz IL-2 fokozott LAK citolitikus aktivitást idéz elő alacsony effektor sejt : célsejt arány mellett.

A PBMC-ken megfigyelt hatásokon kívül, úgy találtuk, hogy az IL-10 jelenlétében tenyésztett endoteliális sejtek exogén faktorokkal szemben (azaz γ-IFN-nel és ZNF-a-val szemben) változatlan választ adtak, míg az IL-2 jelenlétében inkubált endoteliális sejtek nem tudtak válaszolni, ami az IL-2 toxicitásának tudható be .

Anyagok és módszerek

Rekombináns humán citokinek és anti-IL-10 antitestek.

A rekombináns humán IL-10-et (E.coli és CHO segítségével) standard módszerekkel állítottuk elő. Standard módszerekkel való tisztítás után a specifikus aktivitás 4,1 χ 10⁷ (E.coli-ból), illetve 2,1 χ 10⁷ (CHO-ból) egység/mg volt. A meghatározást MC-9 sejt-proliferációs vizsgálattal végeztük [ Thompson-Snipes et al., J.Exp.Med., 17 3, 507 (1991)] . Körülbelül 4 ng, lényegében homogén IL-10 mutatott 100 egység biológiai aktivitást.

Dr. John Abrams (DNAX Institut of Molecular Biology, Palo

Alto, CA., USA) bocsátotta rendelkezésünkre a patkány anti-humán

IL-10 monoklonális antitestet, jele: 19F1.

Humán perifériás vér mononukleáris sejtek (PMBC-k) izolálása.

Egészséges felnőtt donoroktól vénapunkcióval veszünk le perifériás vért, antikoagulánsként heparint vagy EDTA-t használva. A

PBMC-ket kétlépéses technikával választjuk el, először dextrános ülepítést, majd 30 percig 1250 ford/perc mellett FICOLL PAQUE centrifugálást végzünk. A két fázis közötti réteget, amely főként limfocitákból és monocitákból áll, összegyűjtjük és legalább kétszer mossuk 10% fetális borjúszérumot tartalmazó RPMI táptalajjal (teljes táptalaj) (JRH Biosciences).

Citotoxicitási vizsgálatok.

A Daudi (LAK-szenzitiv) és K562 (NK-szenzitiv) célsejteket (target = T) az American Type Tissue Collection intézménytől szereztük be (a sejtek letéti száma: CCL 213, illetve CCL 243) . A Daudi és K562 sejteket [ ⁵¹Cr] -mai jeleztük [ Spits et al. , J. Immunoi., 141, 29 (1998)] . A tenyésztés után a PBMC-ket learattuk, kétszer mostuk és effektor sejtekként használtuk egy [ Cr] -felszabadulási vizsgalatban (Spits et al., lásd fentebb) . 96 tartályos lemezeken — a tartályok feneke V-alakú — 5 χ 10³[ ⁵¹Cr] -jelzett célsejtet (T) kevertünk különböző mennyiségű effektor (E) sejthez (E/T = 20:1, 5:1 és 2:1) 100 μΙ-ben. A lemezeket 5 percig 1000 ford/perc mellett centrifugáltuk, majd 4 órán át 37 °C-on 5% széndioxid tartalmú nedves atmoszférában inkubáltuk. Négy óra múlva a lemezeket 5 percig 500 g mellett centrifugáltuk. A felülúszókat SKATRON harvestor-ral (Skatron Instruments) gyűjtöttük össze és gamma-számlálóval (LKB-Pharmacia) számláltunk. A teljes lízist úgy határoztuk meg, hogy az [ ⁵¹Cr] ···· • · » ···

-jelzett célsejteket 1% SDS-sel inkubáltuk. Az eredményeket három párhuzamos meghatározás középértékeként fejeztük ki.

A lízis százalékát a következőképpen számítottuk ki:

mért felszabadulás cpm - spontán cpm

Lízis % = x 100 ossz lízis cpm - spontán cpm

Humán PBMC-k inkubálása citokinekkel.

a) Inkubálás egyedül IL-10-zel.

A fentiek szerint izolált PBMC-ket 1 χ 10⁶ sejt/ml koncentrációban IL-10-zel vagy humán IL-10-zel (CHO) kiegészített 10% fetális borjú szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápoldatban tartottuk 37 °C-on 3 napig, ha másként nem jelezzük. A citolítikus aktivitást a fentiek szerint határoztuk meg.

b) Inkubálás egyidejűleg IL-10-zel és IL-2-vel.

A PBMC-ket 4 ng/ml IL-10-zel teljes táptalajban indukábáltuk napig. Ezután humán IL-2-t adtunk hozzá 2 vagy 20 E/ml végső koncentrációig. Egy éjszakás inkubálás után meghatároztuk a LAK és NK citolítikus aktivitást.

c) Inkubálás egymás után IL-10-zel és IL-2-vel.

A PBMC-ket 4 ng/ml IL-10-zel teljes táptalajban inkubáltuk 2 napig. Ezután humán IL-2-t adtunk hozzá 2 vagy 20 E/ml végső koncentrációig. Egy éjszakás inkubálás után meghatároztuk a LAK és NK citolítikus aktivitást.

Anti-IL-10 monoklonális antitestek hatása a LAK és NK sejtek

IL-10-zel való aktiválására.

PBMC-ket inkubáltunk 40 ng/ml IL-10-zel 3 napig 2 pg/ml anti-IL-10 monoklonális antitest (19F1) vagy egy izotipus kontroll (patkány IgG2a) jelenlétében.

IL-10 hatása limfokin-aktivált ölősejt és természetes ölősejt citolitikus aktivitásra humán perifériás vér mononukleáris sejtekben.

A LAK és NK sejtek citolitikus aktivitását a használt tumor célsejtek alapján különböztethetjük meg. A humán Burkitt limfómából származó Daudi sejtek az aktivált LAK sejt citolitikus aktivitás hagyományos célsejtjei. A K562 sejtvonal — humán eritroleukémiás sejtvonal — sejtjeit az aktivált NK sejt citolitikus aktivitás specifikus célsejtjeiként használják. Ezekben a kísérletekben a humán PBMC-ket különböző IL-10 koncentrációkkal kezeltük 3 napon at. A citolitikus aktivitást standard [ Cr] felszabadulási vizsgálattal határoztuk meg, mint fent leírtuk.

A LAK aktivitáson alapuló eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be. A standard eltérések a középértékek alatt láthatók.

• ·

1. táblázat

Limfokin-aktivált PBMC-k stimulálása IL-10-zel (a lizis %-ában kifejezve³)

IL-10 koncentráció (ng/ml)^b

Donor	0	0,04	0,4	4	40	100
1	0	4,25	18,3	44	26,2	67,5
2	0	5,5	7,2	10	31,5	27, 6
3	18	17,7	29,2	39,1	29,7	55,1
4	0	8,8	10,2	22,2	35, 8	35, 9
5	4, 6	8,1	15, 6	20,6	20,1	12,1
6	14, 6	19,7	40,7	54,4	42,9	43,4
Középérték:	6, 2	10,6	20,2^C	31,7^C	31,0^c	40,2^C
	±3,3	±2,6	±5,1	±6,8	±3,2	±8,0
^a [ ⁵¹Cr] Daudi	céls	ejtek	lizise %-ban	standard	króm fels	zabadulási

vizsgálatban, 20:1 effektor:target arány mellett. Az adatok három párhuzamos vizsgálat középértékét jelentik.

A normál donoroktól kapott humán PBMC-ket 3 napon át IL-10zelkezeltük a citolitikus aktivitás meghatározása előtt.

Az IL-10 kezelés és a kontroll táptalaj között szignifikáns a különbség: p< 0,05 Student t-teszt-tel meghatározva.

Az 1. táblázat az IL-10 LAK aktivitásra gyakorolt hatását mutatja be hat humán donortól levett PBMC-ken. Bár a donorok közötti különbség nyilvánvaló, az IL-10 mind a hat donorban a citolitikus kapacitás koncentráció függő növekedését idézi elő.

0,4 ng/ml-es vagy ennél nagyobb IL-10 koncentrációknál statisz24 tikusan szignifikáns aktivitás (p< 0,05) volt megfigyelhető. Megfigyelhető volt még, hogy azoknál a donor PBMC-knél, amelyeknél 5% vagy ennél kisebb volt a citolitikus aktivitás alap-szintje (azaz citokin nélkül), sokkal nagyobb volt a válaszadási készség minden vizsgált effektor sejt : célsejt arány mellett (ezeket az adatokat nem mutattuk be).

Hasonló eredményeket kaptunk más tumor célsejtekkel, beleértve a humán vesesejt karcinóma sejtvonalat, két különböző humán melanóma sejtvonalat és egy humán vastagbél karcinóma sejtvonalat. A vese karcinóma és melanóma sejtvonalakat Rosenberg is használta és ilyen tumorokat in vivő adoptiv immunterápia alkalmazásával IL-2-vel kezelt Rosenberg. A célsejtek lizise mindegyik esetben az IL-10 koncentrációtól függött.

További kísérletekben úgy találtuk, hogy az IL-10 egyedül, vagy IL-2-vel kombinálva megnöveli a citolitikus aktivitást U937 sejtekkel (humán hisztiocitóma) szemben, SW620 (humán vastagbél karcinóma) és SKBR3 sejtekkel (humán emlő karcinóma) szemben.

Azokban a kísérletekben, amelyekben HS294T sejteket (humán melanóma) használtunk célsejtekként, úgy tűnt, hogy az IL-10 nem vált ki választ a vizsgált dózisokkal.

Az alap NK citolitikus aktivitás (azaz a K562 target sejtek lizise citokin nélkül) magasabb, mint az alap LAK aktivitás. Az

NK aktivitás tovább növelhető citokinekkel, például IL-2-vel [ Perussia, lásd fentebb; Phillips and Lanier, J.Exp.Med., 164,

814 (1986)] .

Az IL-10 NK aktivitásra kifejtett hatását a fent említett 6 donortól származó PBMC-ken határoztuk meg, a LAK vizsgálatokkal • · · · • · · ♦·· ·· • · · · · ·♦· ♦· • ·« ···*·· · ·····«· ·· * · * párhuzamosan futtatott kísérletekben. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze; a standard eltéréseket a középértékek alá írtuk.

2. táblázat

NK aktivitás stimulálása (a lizis %-ában kifejezve³) IL-10-zel

PBMC-kben

IL-10 koncentráció (ng/ml)^b

Donor	0	0,04	0,4	4	40	100
1	22,2	30, 6	25,2	57,2	51,5	49, 7
2	20,4	24,7	31,3	56,7	65, 6	71,5
3	61,4	55, 6	37, 9	81,1	80, 0	81,5
4	13, 8	25,2	23,2	37,5	52,2	54,2
5	13, 0	19, 9	20,2	25, 1	23, 5	20,3
6	15, 9	25, 3	45,4	6 6,6	43, 7	56, 1
Középérték:	24, 4	30,2	30,5	54,0	52,75	55, 5
	±7,5	±5,2	±3, 9	±8,2	±7,8	±8, 5
^a [ ⁵¹Cr]	Daudi	célsej tek	lizise %	-bán standard króm	félsz

si vizsgálatban, 20:1 effektor:target arány mellett. Az adatok három párhuzamos vizsgálat középértékét jelentik.

^b A normál donoroktól kapott humán PBMC-ket 3 napon át IL-10-zel kezeltük a citolitikus aktivitás meghatározása előtt.

^c Az IL-10 kezelés és a táptalaj kontroll között szignifikáns a különbség: p< 0,05 Student t-teszt-tel meghatározva.

A 2. táblázatból kitűnik, hogy az IL-10 az NK sejt közvetí26 tett citotoxicitás szignifikáns dózis-függő fokozódását idézi elő a donorokból származó PBMC-kben. A 4 ng/ml-es vagy ennél nagyobb IL-10 koncentrációknál a litikus aktivitásban statisztikailag szignifikáns növekedés következett be. Az IL-10 hatása az

NK aktivitásra donorról donorra változott itt is, mint a LAK aktivitás esetében.

IL-2 és IL-10 hatások összehasonlítása endoteliális sejteken.

Kísérleteket végeztünk annak megállapítására, hogy IL-10 expozíció után hogyan alakul az endoteliális egysejtréteg életképessége. Az IL-10 jelenlétében tenyésztett endoteliális sejtek változatlan választ adtak exogén citokinekkel (α-IFN és TNF-a) szemben, míg a párhuzamos tenyészetek, amelyeket azonos értékű

IL-2 dózisok hatásának tettünk ki azonos inkubációs időtartamra, elvesztették válaszadási készségüket az IL-2 toxicitása következtében .

Anti-IL-10 monoklonális antitestek hatása a LAK és NK sejtek

IL-10-zel való aktiválására.

A 3. és 4. táblázatból — amelyek a középértékeket a standard eltérésekkel tartalmazzák — kitűnik, hogy a 40 ng/ml IL-10-zel stimulált LAK, illetve NK citolitikus aktivitás harmadára csökken (p< 0,05) 2 pg/ml 19F1 anti-IL-10 monoklonális antitest jelenlétében. A 2 pg/ml patkány IgG2a izotípus kontroll antitest használatával kapott eredmények statisztikailag nem különböztek a 40 ng/ml IL-10 egyedüli használatával kapott citolitikus aktivitási szintektől.

3. táblázat

IL-10-indukált limfokin-aktivált ölősejt citolitikus aktivitás (a lizis %-ában kifejezve³) gátlása anti-IL-10 monoklonális antitesttel .

Inkubációs feltételek¹³

Donor	Táptalaj	40 ng/ml IL-10	IL-10 + 19F1	IL-10 +IgG2a
1	5, 6	23,5	15, 7	28,2
2	4,7	21,3	11,0	17,5
3	5,4	42,5	0,0	35, 8
4	2,1	42,0	12, 8	26,5
5	4,7	19,1	0,0	11,65
Középérték:	4,5±0,6	29,6±5,3	7,9^C±3,3	23,9±4,

a 51 [ Cr] Daudi célsejtek lizise %-ban standard króm felszabadulási vizsgálatban, 20:1 effektor:target arány mellett. Az adatok három párhuzamos vizsgálat középértékét jelentik.

^b A normál donoroktól kapott humán perifériás mononukleáris sejteket 40 ng/ml IL-10-zel kezeltük 3 napig 2 mg/ml 19F1 (anti-humán IL-10) vagy patkány IgG2a (izotipus kontroll) jelenlétében citolitikus aktivitás meghatározása előtt.

^c A csak IL-10-zel végzett kezelés és az anti-IL-10 antitestek jelenlétében végzett IL-10-zel való kezelés között szignifikáns a különbség: p< 0,05 Student t-teszt-tel meghatározva.

4. táblázat

IL-10-indukált természetes ölősejt aktivitás neutralizálása (a lizis %-ában kifejezve³) anti-IL-10 monoklonális antitestekkel.

Inkubációs feltételek¹³

Donor	Táptalaj	40 ng/ml IL-10	IL-10 + 19F1	IL-10 +IgG2a
1	21,1	38,3	20, 6	27,2
2	28, 0	71,0	22,2	53,2
3	22,2	51,5	0,0	70,5
4	18, 0	25,4	12,3	20,8
5	23,2	53,2	54,5	84,9
Középérték:	22,5±1,6	47,9±7,6	19, l^c±6, 6	51,3±12,7

a 51 [ Cr] Daudi célsejtek lizise %-ban standard króm felszabadulási vizsgálatban, 20:1 effektor:target sejt arány mellett. Az adatok három párhuzamos vizsgálat középértékét jelentik. ^b A normál donoroktól levett humán perifériás mononukleáris sejteket 40 ng/ml IL-10-zel 3 napig kezeltük 2 mg/ml 19F1 anti-humán IL-10 vagy patkány IgG2a (izotipus kontroll) jelenlétében kezeltük a citolitikus aktivitás meghatározása előtt.

^c Az egyedül IL-10-zel végzett kezelés és az anti-IL-10 antitestek jelenlétében végzett IL-10-zel való kezelés között szignifikáns a különbség: p< 0,05 Student t-teszt-tel meghatározva.

«««· «· < · « ··· · • · • ··· ·» • ·»

Az IL-10 más citokinekkel való kombinációival indukált citolitikus aktivitás.

a) Egyidejű inkubálás IL-10-zel és IL-2-vel.

Humán PBMC-ket inkubáltunk az IL-2 szubmaximális stimuláló koncentrációival (2 vagy 20 E/ml) IL-10 jelenlétében, 5:1 effektor : target arány mellett. Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be. A standard eltéréseket a középértékek alatt tüntettük fel.

5. táblázat

Limfokin-aktivált citolitikus aktivitás (a lizis %-ában kifejezve³) indukálása humán perifériás vér mononukleáris sejtekben IL-10-zel és IL-2-vel való koinkubálás segítségével.

Inkubációs feltételek¹³

Donor Táptalaj 2E IL-2 40 ng IL-10 IL-10 20E IL-2 + IL-2

1	0,0	3,3	3,7	15, 9	24, 6
2	2, 6	7,6	3,8	23, 5	41, 0
3	6,1	5, 0	13,3	17,7	11,4
4	3,3	50,1	51, 6	68,7	80,0
5	2,4	9,4	12,8	29, 3	45,7
6	9, 9	28, 9	16,0	38,8	67,1

4,1 17,4 16,8 32,3 44,9^C ±1,42 ±7,6 ±7,2 ±7,2 ±10,4

Középérték:

^a [ ⁵¹Cr] Daudi célsejtek lizise %-ban standard króm felszabadulási vizsgálatban, 5:1 effektor:target sejt arány mellett. Az adatok három párhuzamos vizsgálat középértékét jelentik.

^b A normál donoroktól kapott humán perifériás vér mononukleáris sejteket 4 ng/ml IL-10-zel és 2 E/ml IL-2-vel kezeltük 3 napon át a citolitikus aktivitás meghatározása előtt.

^c Az IL-10-zel és IL-2-vel kezelt, valamint egyedül 20 E/ml IL-2vel kezelt donor PBMC-k citolitikus aktivitása között nincs szignifikáns a különbség: p< 0,05 Student t-teszt-tel meghatározva .

Az 5. táblázatból látható, hogy 2 E/ml IL-2-vel és 4 ng/ml

IL-10-zel való koinkubálás után additív növekedés következett be a LAK aktivitásban (effektor sejt : célsejt arány = 5:1) . Ez az aktivitás szint, amely szignifikánsan magasabb volt, mint amelyet az egyik citokin egyedüli használata esetén láttunk, megközelíti azt a szintet, amelyet tízszer magasabb IL-2 koncentráció esetén kaptunk. Az eredmény statisztikailag szignifikáns volt p< 0,05 mellett, Student t-teszt-tel meghatározva.

b) Egyidejű inkubálás IL-10-zel és a-IFN-nal.

A PBMC-k IL-10-zel és ot-IFN-nal való koinkubálása a Daudi sejtekkel szembeni litikus aktivitásban hasonló additív növekedéshez vezetett, de az NK célsejtekkel szemben nem. Ezt a 6.

táblázatban mutatjuk be. A standard eltéréseket a középértékek alatt tüntettük fel.

6. táblázat

Limfokin-aktivált ölősejt aktivitás (a lizis %-ában kifejezve³)

indukálása humán	perifériás vér mononukleáris sejtekben IL-10 IFN-nal való koinkubálás segítségével.
	zel	és a-
Inkubációs	feltételek¹³
Donor		Táptalaj a-IFN	IL-10	IL-10+ot-IFN
1		4,4	7,9	17,8	35, 7
2		1,0	11,7	15, 4	32, 0
3		1, 6	12,3	5, 5	26,4
Középérték:	2,3 ±1,0	10, 6 ±1,4	12,6 ±3,8	31,4 ±2,7

[ ⁵¹Cr] Daudi célsejtek lizise %-ban standard króm felszabadulási vizsgálatban, 10:1 effektor:target sejt arány mellett. Az adatok három párhuzamos vizsgálat középértékét jelentik.

A normál donoroktól vett humán perifériás vér mononukleáris sejteket 4 ng/ml IL-10-zel és 100 E/ml α-IFN-nal kezeltük 3 napon át a citolitikus aktivitás meghatározása előtt.

A donor PBMC-kben az IL-10-zel és α-IFN-nal indukált citolitikus aktivitás és a csak IL-10-zel vagy csak α-IFN-nal indukált citolitikus aktivitások összehasonlításánál megfigyelt különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak p< 0,05 mellett,

Student t-teszt-tel meghatározva.

Ezzel szemben, az IL-10-nek IL-4-gyel, IL-5-tel, GMCSF-fel vagy γ-IFN-nal való együttes inkubációi nem voltak hatásosabbak, mint a csak IL-10-zel egyedül végzett inkubáció (ezeket az ada32 tokát nem mutatjuk be).

c) Egymást követő inkubálás IL-10-zel és IL-2-vel.

A fenti eljárásokat használva, a PBMC-ket csak táptalajban, vagy IL-10-zel kiegészített táptalajban tartottuk fenn. Két nap múlva IL-2-t adtunk a sejtekhez 2 vagy 20 E/ml végső koncentrációig. A Daudi sejtekkel szembeni citolitikus aktivitást egy további egy éjszakás inkubálás után határoztuk meg. Egy öt-donoros kísérlet eredményeit a 7. táblázatban foglaljuk össze. A standard eltéréseket a középértékek alatt tüntettük fel.

7. táblázat

Limfokin-aktivált citolitikus aktivitás (a lizis %-ában kifejezve³) indukálása humán perifériás vér mononukleáris sejtekben

IL-10-zel való előinkubálást követően IL-2-vel.

Előinkubációs feltételek¹³

Donor Táptalaj IL-10^c IL-2^d IL-10+IL-2^e

1	29, 7	21,1	44,8	116
2	5,5	18,3	12,2	20,7
3	14,7	58,1	74,5	100
4	26,2	59, 5	54,3	81,9
5	CO	28,2	22,5	40,6
Középérték:	16,2	37,0	41,7	71,8
	±5,1	±9, 0	±11,4	±17,9

^a [ ⁵¹Cr] Daudi célsejtek lizise %-ban standard króm felszabadítási vizsgálatban, 5:1 effektor:target sejt arány mellett. Az adatok három párhuzamos meghatározás középértékének felelnek meg.

^b A normál donoroktól vett humán perifériás vér mononukleáris sejteket 4 ng/ml IL-10-zel kiegészített táptalajban tartottuk 2 napon át, mielőtt a 2 E/ml IL-2-t hozzáadtuk. A citolitikus aktivitást további egy éjszakás inkubálás után határoztuk meg.

^c A donor PBMC-ket IL-10-zel inkubáltuk 3 napon át.

^d A donor PBMC-ket csak táptalajban inkubáltuk, mielőtt az IL-2-t hozzáadtuk.

^e A donor PBMC-ket IL-10-zel 2 napig inkubáltuk 20 E/ml IL-2 hozzáadása előtt

A 7 . táblázatból látható, hogy azokban a csoportokban, amelyekben a donor PBMC-ket az IL-2 hozzáadása előtt IL-10-zel előkezeltük, körülbelül kétszer magasabb citolitikus aktivitás volt megfigyelhető (71,8 ± 17,9%), mint azokban a tenyészetekben, amelyeket az IL-2 hozzáadása előtt csak teljes táptalajban tartottunk fenn (41,7 ± 11,4%). Az IL-10-zel előkezelt minták és az IL10-zel nem kezelt minták közötti különbség statisztikailag szignifikáns volt p< 0,14 mellett.

Hasonlóképpen fokozott citolitikus aktivitást kaptunk, amikor egymás utáni inkubációkat végeztünk IL-10-zel és ezt követően α-IFN-nal (az adatokat nem mutattuk be).

Az IL-10 és az IL-4-gyel blokkolt IL-2-indukált citotoxicitás.

Hat humán donortól származó PBMC-ket tenyésztettünk egyedül 20 E/ml IL-2-t, 20 E/ml IL-2 plusz 1000 E/ml IL-4-et vagy 20 E/ml IL-2 plusz 1000 E/ml IL-4 plusz 4 ng/ml IL-10-et tartalmazó táptalajban. Az eredményeket a 8. táblázatban mutatjuk be. A standard eltéréseket a középértékek alá írtuk.

8. táblázat

Az IL-2-indukált limfokin-indukált citolitikus aktivitás (a lizis %-ában kifejezve³) IL-4-gyel megvalósított blokádjának gátlása IL-10-zel humán perifériás vér mononukleáris sejtekben.

Inkubációs feltételek

Donor	Táptalaj	IL-2^b	IL-2^C+	IL-2^d+IL-4+
			IL-4	IL-10
1	12, 7	27,6	35, 0	45,7
2	5,4	26,3	17,5	33,7
3	1,7	25,1	14, 1	36,0
4	3, 8	29, 6	14,1	22,1
5	3, 3	47,1	17,1	63,8
6	6, 6	49, 5	20, 6	40,8
Középérték: 5,5	34,2	19, 7	40,3
	±1, 6	±4,5	±3,2	±5,7
^a [ ⁵¹Cr]	Daudi célsejtek	lizise %-	bán standard króm-	fels zabadítá-
si VÍZ	;sgálatban, 20:1	effektor	’.target sejt arány	mellett. Az

adatok három párhuzamos meghatározás középértékének felelnek meg.

^b a normál donorokból izolált humán perifériás vér mononukleáris sejteket 3 napon át 20 E/ml IL-2-vel kezelünk.

^c A donor PBMC-ket 20 E/ml IL-2-vel és 100 E/ml humán IL-4-gyel inkubáltuk.

^d A donor PBMC-ket 20 E/ml IL-2-vel, 1000 E/ml humán IL-4-gyel és ng/ml IL-10-zel inkubáltuk.

A 8. táblázat adataiból látható, hogy egyedül 20 E/ml IL-2vel való kezelés esetén a LAK-szenzitiv célsejteknél kürülbelül

34,2 %-os lízis következett be. Amikor 1000 E/ml IL-4-et vittünk be az inkubációs időtartam kezdetén, a citolitikus kapacitás megközelítőleg felére csökkent. Az IL-4 ezen szuppresszív hatása azonban nem volt megfigyelhető, amikor az inkubálás első 24 órája folyamán 4 ng/ml IL-10-et adagoltunk.

Nem volt szignifikáns különbség az egyedül IL-2-vel kapott eredmények és a három citokinnel együtt kapott eredmények között (p< 0,05, Student t-teszt-tel meghatározva), s ez azt mutatta, hogy a blokád IL-10-zel való felszámolása lényegében teljes volt.

Azok számára, akik ezen a szakterületen gyakorlattal rendelkeznek, nyilvánvaló, hogy a találmányban számos változtatást és módosítást végezhetnek anélkül, hogy annak szellemétől és tartalmától eltérnének. A leírt kiviteli alakokat csupán példáknak tekintjük és a találmányt csak a csatolt igénypontokban megfogalmazott feltételek korlátozzák.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1) Eljárás rák kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy rákbetegségben szenvedő egyének IL-10-aktivált perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC-k) hatásos mennyiségét adjuk be a rák regressziójának elérése céljából.
2) Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett egyénnek egyidejűleg vagy később hatásos menynyiségű IL-10-et adunk be.
3) Eljárás rák kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az IL-10-aktivált PBMC-ket egy gyógyszerészetileg elfogadott vivőanyaggal keverve tartalmazza .
4) Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az IL-10-et a) annyi IL-2-vel kombináltan alkalmazzuk, amennyi elégséges a LAK sejt aktiválás növeléséhez, de nem okoz toxikus mellékhatásokat és/vagy b) annyi a-IFN-nal kombináltan alkalmazzuk, amennyi a LAK sejt aktiválás növeléséhez elégséges.
5) Rák kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy IL-10-aktivált PBMC-ket és egy gyógyszerészetileg elfogadott vivőanyagot tartalmaz.
6) Az 5. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy még IL-10-et is tartalmaz vagy egyedül, vagy

IL-2-vel és/vagy α-IFN-nal kombinálva.
7) IL-10-aktivált PBMC-k felhasználása rák kezelésére.

IL-10-aktivált PBMC-k felhasználása rák kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására.
9) A 7. vagy a 8. igénypont szerinti felhasználás, azzal jellemezve, hogy az IL-10-aktivált PBMC-ket vagy csak IL-10-zel, vagy IL-2-vel és/vagy α-IFN-nal kombinálva használjuk.
10) Eljárás az IL-2-indukált citotoxicitás endogén IL-4 hatására kialakult blokádjának gátlására, azzal jellemezve, hogy egy betegnek, akinek szüksége van ilyen kezelésre, az IL-10 hatásos mennyiségét adjuk be.
11) Az IL-10 felhasználása olyan gyógyszer előállítására, amely gátolja az IL-2-indukált citotoxicitás endogén IL-4 hatására létrejött blokádját.
12) Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, gyógyszerkészítmény vagy felhasználás, azzal jellemezve, hogy az ezekben lévő IL-10 humán IL-10.