JPH04299983A - 付着リンホカイン活性化キラー細胞の産生・増加方法 - Google Patents
付着リンホカイン活性化キラー細胞の産生・増加方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本願発明は付着リンホカイン活性
化キラー（Ａ−ＬＡＫ）細胞を調製する改良方法、該方
法によって調製され単離されたＡ−ＬＡＫ細胞を含有す
る組成物、および該組成物をインターロイキン−２（Ｉ
Ｌ−２）と共に投与して哺乳動物の腫瘍を治療する方法
に関するものである。 【０００２】 【従来の技術】［クロスレファレンス］本願と同時に出
願された下記出願は参照として本願明細書に組み入れる
： カムエイチ． リュング（Ｋａｍ Ｈ． Ｌｅｕｎ
ｇ）、「Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル処理ヒト
末梢血液細胞からインターロイキン−２（ＩＬ−２）お
よびインターロイキン−４（ＩＬ−４）によるＣＤ４＋
ヘルパーＴ細胞の産生」；米国特許出願第０７／６４８
６７２号。 【０００３】ナチュレルキラー（ＮＫ）細胞およびリン
ホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞は腫瘍細胞に対す
る免疫監視に密接に係わっている［Ｂａｒｌｏｚｚａｎ
ｉ等（１９８３）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３１、
１０２４； Ｒａｙｎｅｒ等（１９８５）、Ｃａｎｃｅ
ｒ、５５： １３２７］。進行した癌患者への自己由来
ＬＡＫの全身投与が有益であることが報告されている［
Ｍｕｌｅ等（１９８６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４
６： ６７６］。この方法は多数の細胞が各患者に必要
である点で面倒である。更に、ＬＡＫおよびインターロ
イキン−２（ＩＬ−２）を使用して癌患者を治療するこ
ともかなりの毒性を伴っている［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等
（１９８７）、Ｎ． Ｅｎｇｌ．Ｊ． Ｍｅｄ． ３１
６： ８８９］。 【０００４】単球はＩＬ−２によるＬＡＫ活性の活性化
を妨害することが示されている［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等
（１９８７）、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３
１６： ８８９］。Ｌ−ロイシンメチルエステル（ＬＭ
Ｅ）およびＬ−フェニルアラニンメチルエステル（ＰＭ
Ｅ）はヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）から単球を除
去させることが示された［ＴｈｉｅｌｅおよびＬｉｐｓ
ｋｙ（１９８５）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４：
７８６； Ｈｏｙｅｒ等（１９８６）、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．、４６： ２８３４］。しかし乍ら、ＬＭＥ
はＮＫ活性およびＮＫ細胞も激減させた［Ｔｈｉｅｌｅ
およびＬｉｐｓｋｙ（１９８５）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．、１３４： ７８６； Ｈｏｙｅｒ等（１９８６）
、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４６： ２８３４］。本発
明者はＰＭＥで単球を枯渇させるとＩＬ−２によってＬ
ＡＫ細胞を５×１０６個の細胞／ｍｌまたはそれ以上の
密度で産生できることを示した［Ｌｅｕｎｇ（１９８７
）、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６、Ａ
ｂｓｔｒａｃｔ ＃１７１８； Ｌｅｕｎｇ およびＲ
ｉｎｅｈａｒｔに発行された米国特許４，８４９，３２
９］。 【０００５】付着ＬＡＫ（Ａ−ＬＡＫ）細胞は２４時間
ＩＬ−２で活性化し、単球を枯渇させたＰＢＭＣのプラ
スチックへの付着によって産生されることが報告されて
いる［Ｍｅｌｄｅｒ等（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．、４８、３４６］。これらの細胞は非常に増殖性
で且つ細胞障害性（細胞障害活性）であり、そしてＬＡ
Ｋ細胞（Ｌｅｕ１９＋、ＬＡＫフェノタイプ）が濃厚化
されている。Ａ−ＬＡＫ細胞にはヒトでの養子免疫療法
で有効な重大な利点がある。Ａ−ＬＡＫ細胞は抗腫瘍活
性がより大きいＬＡＫ細胞に富んでいるので、Ａ−ＬＡ
Ｋ細胞は慣用のＬＡＫ細胞療法より少ない細胞を使用し
て有効であると思われる。更に、患者にＡ−ＬＡＫ細胞
と同時投与するＩＬ−２がより少なくて良く、それ故該
療法の毒性が減少する。 【０００６】以前の報告では、Ａ−ＬＡＫ細胞を産生さ
せるために、単球はナイロンウールカラムへの付着によ
ってまたは遠心分離によって除去された［Ｍｅｌｄｅｒ
等、（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８：３
４６］。単球を除去するこれらの方法は時間を要し複雑
である。ＬＡＫ細胞前駆体もナイロンウールカラムに付
着するものがある。それ故、本発明者は単球を枯渇させ
る単一工程としてＰＭＥ（５ｍＭ）を使用した。本発明
者はＰＭＥ処理細胞からＡ−ＬＡＫを産生させることが
できた（係属中で、共同して譲渡された、１９８９年
７月２１日に出願された米国特許出願第０７／３８４，
１３４号）。 低濃度（１〜２．５ｍＭ）のＰＭＥを使用する単球の部
分的枯渇は高濃度のＰＭＥを使用する単球の完全枯渇に
比べてＡ−ＬＡＫ細胞の細胞数の増加をより大きくする
ことができた。ここでいう、細胞数の増加とは、細胞集
団の拡大を意味する。本発明者の結果は、ＰＢＭＣ集団
中の単球が余りにも多い（＞１０％）とＡ−ＬＡＫの産
生を妨げ、そして単球が少ない（＜１０％）とＡ−ＬＡ
Ｋの産生を増大化させたことを示唆している。 【０００７】ＩＬ−２はＮＫ細胞およびＴ細胞の有効な
刺激剤である。他方、ＩＬ−４は初めはＢ細胞増殖因子
として記載された［Ｈｏｗａｒｄ等（１９８２）、Ｊ．
Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１５５： ９１４］。ＩＬ−４
はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および単球に対して多数の
影響を有するリンホカインと考えられる［Ｗｉｄｍｅｒ
等（１９８７）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１６６：
１４４７； Ｍｉｔｃｈｅｌｌ等（１９８９）、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２： １５４８； Ｓｐｉｔ
ｓ等（１９８７）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９：
１１４２；Ｎａｇｌｅｒ等、（１９８８）、Ｊ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．、１４１： ２３４９； ｔｅ Ｖｅｌ
ｄｅ等（１９８９）、Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｃｔｉ
ｏｎｓ、２６： １； Ｓｐｉｔｓ等（１９８８）、Ｊ
． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１： ２９； Ｓｐｉｔｓ
等（１９８８）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１：
２９； ＢｒｏｏｋｓおよびＲｅｅｓ（１９８８）、Ｃ
ｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７４： １６
２； Ｋａｗａｋａｍｉ等（１９８９）、Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．、１４２： ３４５２］。ＩＬ−４単独では
ＰＢＭＣからＬＡＫ活性を生じさせることはできないが
、特定のＣＴＬ生成を高めることができる。ＩＬ−４は
ＩＬ−２によるＬＡＫ誘導を阻止したが、ＩＬ−２によ
るＣＴＬ誘導を高めた［Ｓｐｉｔｓ等（１９８８）、Ｊ
． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１： ２９； Ｂｒｏｏｋ
ｓおよびＲｅｅｓ（１９８８）、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７４： １６２］。最近では、Ｉ
Ｌ−４がＩＬ−２活性化細胞の細胞増殖を高めることが
報告された［Ｋａｗａｋａｍｉ等（１９８９）、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２： ３４５２］。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題およびそれを解決するた
めの手段】本発明は付着リンホカイン活性化キラー（Ａ
−ＬＡＫ）細胞を調製する改良法を提供する。この方法
は、（ａ）低級アルキルアミノ酸エステル、好ましくは
ＰＭＥでＰＢＭＣを処理して単球を枯渇させ、（ｂ）残
余細胞を、ＬＡＫ細胞の１部が付着しているプラスチッ
ク容器内でＩＬ−２を含有する培地中で５×１０６〜１
×１０７個細胞／ｍｌで培養し、（ｃ）非付着細胞を除
去し、そして（ｄ）ＩＬ−２およびＩＬ−４を含有する
培地中でＡ−ＬＡＫ細胞を培養してＡ−ＬＡＫ細胞数を
増加させる、ことからなっている。改良点は、細胞が容
器のプラスチック表面に付着した後にＩＬ−４を添加し
てＡ−ＬＡＫ細胞の増殖および細胞溶解活性を増大化さ
せる最終段階にある。 【０００９】本発明はまた上記方法で調製され単離され
たＡ−ＬＡＫ細胞の組成物、およびこの組成物をＩＬ−
２と共に投与して哺乳動物の腫瘍を治療する方法も特徴
とする。 【００１０】末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）または末梢
血液リンパ球（ＰＢＬ）の懸濁液を約４〜７％のＣＯ２
の存在下３５℃〜３９℃、好ましくは３７℃で約２〜２
１日のインキュベーション期間中培養する。培養は約１
×１０６〜２×１０７、好ましくは５×１０６〜１×１
０７個の細胞／ｍｌの範囲の細胞濃度で約１５０〜２０
００ｐＭ、好ましくは１０００〜２０００ｐＭの濃度の
ＩＬ−２を含有する培地中で実施する。培養は慣用の容
器、例えばＴ型フラスコで行うこともできるが、好まし
くは密閉された気体透過性滅菌バッグ、例えばステリセ
ル（Ｓｔｅｒｉｃｅｌｌ）（商標）細胞培養バッグ（デ
ラウエア州ウィルミントンのＥ． Ｉ． Ｄｕ Ｐｏｎ
ｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏ．）内で実施する
ことができる。上記条件下での培養によってＬＡＫ細胞
、即ちＮＫ細胞による溶解に抵抗性の腫瘍細胞を溶解し
得る細胞溶解細胞の集団が産生される。 【００１１】本発明によって調製されたＬＡＫ細胞はリ
ュングおよびラインハート（Ｒｉｎｅｈａｒｔ）に対し
て１９８９年２月３日に発行された米国特許４，８４９
，３２９（これは参照として本願明細書に組み入れる）
に記載された方法で養子免疫療法で使用される。 【００１２】好ましいＬ−アミノ酸はフェニルアラニン
またはチロシンであり、そして最も好ましいものはフェ
ニルアラニンである。エステルの低級アルキル基はメチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブ
チルまたはｔ−ブチルであるが、好ましくはメチルまた
はエチルであり、そして最も好ましくはメチルである。 製薬的に許容される好ましい塩は塩酸塩および臭化水素
酸塩である。 【００１３】ＬＡＫ細胞を調製する方法にＰＭＥおよび
他の低級アルキルアミノ酸エステルを使用することは米
国特許４，８４９，３２９に開示されている。更に、１
９８９年２月２１日に出願した米国特許出願第０７／３
１３，４２１号も参照として本願明細書に組み入れる。 【００１４】本発明者は以前に、Ａ−ＬＡＫ細胞を産生
させる方法で単球枯渇の単一工程として約１から５ｍＭ
の濃度のＰＭＥを使用した。この方法は１９８９年７月
２１日に出願され共同して譲渡された米国特許出願第０
７／３８４１３４号（これは参照として本願明細書に組
み入れる）に開示されている。ＰＭＥ処理ＰＢＭＣから
Ａ−ＬＡＫを産生させることが可能でありそしてＡ−Ｌ
ＡＫ細胞をプラスチック容器内で培養する前にＰＢＭＣ
をＰＭＥで処理すると、ＰＭＥ処理をしないで得られた
細胞数の増加に比べて、Ａ−ＬＡＫ細胞数の増加値がか
なり上昇することが見いだされた。ＰＭＥで処理した後
、Ａ−ＬＡＫ細胞数の増加中においてはＬＡＫ細胞の機
能的な細胞溶解活性は高いまま維持される。 【００１５】本願発明は、ＬＡＫ細胞溶解活性値が高い
Ｌｅｕ１９＋リンパ球の増加および濃厚化の改良方法に
係わるものである。ＰＢＭＣは先ずＰＭＥで処理して単
球および他のＰＭＥ感受性細胞を枯渇させる。次いで、
得られたリンパ球はプラスチックフラスコ内でＩＬ−２
と共に１乃至２日間インキュベートする。次いで、付着
細胞をＩＬ−４と共に８乃至２１日間培養して細胞数お
よびＬＡＫ活性の増加を得る。Ａ−ＬＡＫ調製方法中に
使用した細胞密度は、単球枯渇段階を含めて、好ましく
は約５×１０６〜２×１０７個の細胞／ｍｌ、更に好ま
しくは約１×１０７個の細胞／ｍｌである。 【００１６】 【発明の効果】ＩＬ−４を使用する本発明者の方法は、
Ａ−ＬＡＫ細胞を調製するために以前に使用された方法
［Ｍｅｌｄｅｒ等（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ、４９： １４４； 本発明者の特許出願、
ＵＳＳＮ ０７／３８４１３４］を超える幾つかのかな
りの差異および重要な利点を提供する。第１に、化学薬
剤としてＰＭＥを使用してＰＢＭＣから単球を枯渇させ
ると、ＰＭＥ濃度およびインキュベーション時間によっ
て、本方法はナイロン−ウール方法を使用して達成でき
るより良好に制御できる。ＰＢＭＣのＰＭＥ処理はまた
、骨の折れる組み立て、滅菌法および分離実施を必要と
する遠心分離よりはるかに簡便でもあり使用する消費時
間も少ない。第２に、本発明の方法では、リンパ球は、
これまでに使用されてきた２×１０６／ｍｌと比べて約
１乃至２×１０７／ｍｌの細胞密度でプラスチック容器
内で培養される。かくして、本方法は使用される培地の
総容量を、Ａ−ＬＡＫ細胞を調製する以前の方法と比べ
て５分の１乃至１０分の１に減少させる。第３に、高細
胞密度（１×１０７／ｍｌ）は一般に低細胞密度（１×
１０６／ｍｌ）より確かな増加を生じさせた。第４に、
濃厚化されたＡ−ＬＡＫ細胞は単球が完全に枯渇された
ＰＢＭＣから産生させることができるが、それらは同様
に増殖性ではない。単球枯渇量はＰＢＭＣを処理するた
めに使用したＰＭＥ濃度によって正確に制御することが
できる。上記したように、単球枯渇値は単球を枯渇させ
る分離および／またはナイロン−ウールカラムを使用し
ては容易には制御できない。第５に、ＩＬ−４を含有さ
せるとＡ−ＬＡＫ細胞数の増加および増殖並びにＬＡＫ
の細胞溶解活性が更に高められる。 【００１７】ＩＬ−４の使用を含む本発明のＡ−ＬＡＫ
方法は、慣用のＬＡＫ細胞産生方法、例えばカワカミ（
Ｋａｗａｋａｍｉ）等（１９８９）、ジェイ． イミュ
ノル．（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１４２： ３４５
２、と比べて改良を提供する。高細胞密度の付着および
ＩＬ−４を使用する本発明者の方法は、Ａ−ＬＡＫ細胞
の良好な濃厚化および細胞の拡大を与えた。 【００１８】以下の実施例では、腫瘍細胞に対するＬＡ
Ｋ細胞の細胞障害活性を測定するために３時間の５１Ｃ
ｒ放出アッセイを使用した。約２×１０６〜１０×１０
６の濃度の腫瘍細胞は０．４ｍｌのトリス−りん酸緩衝
生理食塩液中５０μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４と共に３
７℃で１時間インキュベートした。細胞は１０％のウシ
胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ １６４０で４
回洗浄し、そしてＲＰＭＩ １０％ＦＣＳ中で１０５個
の細胞／ｍｌに再懸濁した。エフェクター細胞（ＬＡＫ
細胞）は種々の濃度に懸濁し、そして０．１ｍｌを丸底
微量滴定プレート内のウエルに加えた。５１Ｃｒで標識
した標的細胞（０．１ｍｌ）を全てのウエルに加え、プ
レートは２００×ｇで５分間遠心した。３７℃でのイン
キュベーション４時間後に、プレートを再び遠心し、そ
して得られた上清液０．１ｍｌを各ウエルから取り出し
てガンマカウンターで計数した。 細胞障害活性パーセントは次式から計算した：細胞障害
活性（％）＝｛（実験ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）／（総
ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）｝×１００ 【００１９】各変数は３回重複して試験し、得られたデ
ータを細胞障害活性または溶解パーセント％として示し
た。この細胞障害活性試験は、セレクテッド メソッズ
インセルラー イムノロジー（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ）、ミッシェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびシ−
ギ（Ｓｈｉｉｇｉ）編、１２４〜１３７、サンフランシ
スコのダブリュ．エム．フリーマン アンド コ．（Ｗ
． Ｍ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．）（１９８
０）に更に詳細に記載されている。 【００２０】細胞表面マーカー分析用に、冷却した染色
緩衝溶液（ＰＢＳ、１５％のＢＳＡおよび０．１％のア
ジ化ナトリウム）０．１ｍｌ中２×１０５個の細胞を９
６ウエルの丸底プレートに入れた。種々の蛍光標識抗体
を４℃で３０分間上記細胞に加えた。細胞は２回洗浄し
、フローサイトメーター（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅ
ｒ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォル
ニア州マウンテンビュー）で蛍光を分析する前に１％の
パラホルムアルデヒドに再懸濁した。表１はこの試験で
使用した抗体の反応性／特異性を要約して示す。 【００２１】 【表１】 この試験のモノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）で同定される分化抗原 ＣＤクラスター ｍＡｂ
細胞の反応性／特異性 ＣＤ３
Ｌｅｕ４
Ｔ細胞 ＣＤ４
Ｌｅｕ３ ヘルパー／インデューサー
Ｔ細胞 ＣＤ８
Ｌｅｕ２ サプレッサー／細胞障害性
Ｔ細胞 ＣＤ５６
Ｌｅｕ１９ ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞 【００２２】 【実施例】 《実施例 １》［Ａ−ＬＡＫ細胞産生に与えるＩＬ−
４の影響］ＰＢＭＣは５ｍＭのＰＭＥで処理して単球を
枯渇させ、そして１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２またはＩＬ
−２およびＩＬ−４と共にプラスチックフラスコ内で２
０時間５×１０６個の細胞／ｍｌで培養した。 非付着（ＮＡ）細胞は除去し、そしてフラスコに付着し
た細胞はＩＬ−２またはＩＬ−２およびＩＬ−４を含有
する培地を用いて培養した。ＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ
、マサチューセッツ州ボストン）を、ＩＬ−２だけを有
する培地中で産生した付着細胞に加えた。ＮＡ細胞を同
様にして培養した。表２に示されるようにＩＬ−２だけ
を用いて１４日間培養したとき、Ａ−ＬＡＫ細胞は１２
３倍増加した。 【００２３】 【表２】 Ａ−ＬＡＫ細胞数の増加、細胞障害活性及びフェ
ノタイプに与えるＩＬ−４の影響
ＩＬ−４ 増加
溶解 Ｌｅｕ ２ Ｌｅ
ｕ ３ Ｌｅｕ ４ Ｌｅｕ １
９ （ｍｌ） 倍率 （％）
（％） （％）
（％） （％） 付着後 ０ １２３ ８０
５８ ４
８ ９９ １０
１４６ ７８
５７ ３ ５
９９ ５０ ４１
２ ７６ ５７
２ ７
９９ ２００ ５４７
８２ ５０ ２
４ ９９ 付着
中 ０ １２３ ８０
５８ ４
８ ９９ １０
４６ ６９
４９ ２１ ２７
７６ ５０ ４
０ ５６ ３５
６５ ７７
２７ ２００ ３０
４３ ３０ ７７
８８ １７
【００２４】ＰＢＭＣは５ｍＭのＰＭＥで処理して単球
を枯渇させ、そして１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２またはＩ
Ｌ−２およびＩＬ−４と共に５×１０６個の細胞／ｍｌ
でプラスチックフラスコ内で２０時間培養した。非付着
細胞を除きフラスコに付着した細胞はＩＬ−２またはＩ
Ｌ−２およびＩＬ−４を含有する培地で培養した。ＩＬ
−４を、ＩＬ−２だけを有する培地中で産生させた付着
細胞に加えた。示したデータは１４日間培養したときの
ものであった。示した細胞毒性は３時間アッセイにおけ
る５１Ｃｒで標識したラジ（Ｒａｊｉ）標的細胞に対し
５：１のＥ：Ｔ比のものであった。細胞が付着した後に
ＩＬ−４を加えるとＩＬ−２単独より４倍多い細胞数の
増加が得られた。 他方、ＩＬ−４が付着段階で存在すると、依然として３
０倍から４６倍の細胞数の増加があったけれども、細胞
数の増加はＩＬ−４によって抑制された。 【００２５】ＩＬ−２で産生したＡ−ＬＡＫ細胞は３時
間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて５：１のエフェクタ
ー対標的比で８０％のラジ標的細胞の特異的溶解を有し
ていた。ＩＬ−４は付着段階後に加えられると、ＬＡＫ
活性に対し阻止効果を有していなかった。しかし乍ら、
ＩＬ−４が付着段階中に存在するとＩＬ−２で誘導され
るＬＡＫ活性を阻止した。 【００２６】ＩＬ−２およびＩＬ−４を含有する培地中
で増殖させた細胞の表現型発現によってＩＬ−４が表２
に示されるようにＬｅｕ１９＋細胞のパーセントを９８
％から１７％に阻止したことが明らかにされた。同時に
、Ｌｅｕ３およびＬｅｕ４細胞はＩＬ−４不存在下、即
ちＩＬ−２単独での約４〜８％から７７〜８５％に増加
した。それ故、ＩＬ−４が本方法の付着段階中に存在す
ると、ＩＬ−２で誘導されるＬｅｕ１９＋細胞の活性化
および増殖が優先的に阻止された。Ｌｅｕ１９＋細胞は
Ｌｅｕ３＋細胞の増殖にマイナスの効果を有しており、
その結果ＩＬ−４によってＬｅｕ１９＋細胞が阻止され
るとＬｅｕ３＋細胞がＩＬ−２および／またはＩＬ−４
に応答して増殖できたとも考えられる。付着段階後にＩ
Ｌ−４を添加すると、表２に示されるようにＬｅｕ１９
＋細胞パーセントに対する阻止効果は有さなかった。 【００２７】要約すると、ＩＬ−４が本方法の付着段階
中に存在するとき、ＩＬ−４はＡ−ＬＡＫ産生を阻止し
、ＣＤ４（Ｌｅｕ４＋）が濃厚化した細胞集団を増加さ
せた。他方、ＩＬ−４がＡ−ＬＡＫ産生法の付着段階後
に存在するとき、ＩＬ−４はＡ−ＬＡＫ細胞の細胞数の
増加および細胞障害活性を高めた。 【００２８】《実施例 ２》ＰＢＭＣを５ｍＭのＰＭ
Ｅで４０分間処理して単球を枯渇させ、そして１０ Ｕ
／ｍｌのＩＬ−２と共に１日間培養した。プラスチック
に付着した細胞はＩＬ−２またはＩＬ−２プラスＩＬ−
４と共に培養した。Ａ−ＬＡＫ細胞は８、１１、１５日
の培養期間中培養した。表３に示されるように、ＩＬ−
４はＡ−ＬＡＫ細胞の細胞増加を高めた。ラジ標的細胞
に対するＬｅｕ１９＋細胞および細胞障害活性のパーセ
ントはＩＬ−４の存在下で低下しなかった。 【００２９】 【表３】 ＩＬ−４を付着段階後に加えたときにＡ
−ＬＡＫ細胞に与えるＩＬ−４の影響
溶解％
総細胞
Ｌｅｕ３％ Ｌｅｕ１９％ Ｅ：
Ｔ比率 （×１０
６） （ＣＤ４） （ＣＤ５６）
２．５：１ １．２５：１ ０日
対照 １．９ ＩＬ−４
１．８ ８日 対照 ４２
８ ９５
８５ ７５
ＩＬ−４ ７８
８ ９８
８５ ６８ １１日 対照
９０ ＮＤ
ＮＤ ９４
８４ ＩＬ−４ ３２４
ＮＤ ＮＤ
８９ ９０ １５日
対照 ２５２ ４
９８ ７０
５６ ＩＬ−４ １２
００ ２
９９ ７０ ６５
【００３０】付着細胞は１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共
に５×１０５個の細胞／ｍｌでＰＭＥ処理ＰＢＭＣから
１日間産生させた。次いで、この付着細胞をＩＬ−２（
対照）またはＩＬ−２およびＩＬ−４（２００ Ｕ／ｍ
ｌ）と共に種々の期間培養した。 【００３１】《実施例 ３》ＩＬ−４を添加する前に
０．１、１、または１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に１
日間付着細胞を産生させた。付着細胞は更に７日間培養
した。ＩＬ−４は細胞数の増加およびラジ標的細胞に対
するＬＡＫの溶解活性を高めた（表４）。 【００３２】 【表４】 ＩＬ−４によるＡ−ＬＡＫ細胞の調
整に与えるＩＬ−２の投与量の影響
総細胞 Ｌｅｕ３
Ｌｅｕ１９ 溶解
（×１０６）
（％） （％） （
％） ＩＬ−２ Ｕ／ｍｌ ８ 日 ０．１ 対照 ６
２０ ６８
１６．３
ＩＬ−４ ６ ２７
４８ １６．
０ １ 対照 ２６
７ ８８
７４．８
ＩＬ−４ ２４ １
２ ７９ ７３
．８ １０ 対照 ４０
８ ８７
８５．２
ＩＬ−４ ５１
８ ９３ ７
６．７ １３ 日 ０．１ 対照 １２
５９ ３７
１７．１
ＩＬ−４ １９ ７９
１８ １２．
０ １ 対照 １１０
５５ ４４
４３．５
ＩＬ−４ １８０ ３
２ ５８ ８７
．４ １０ 対照 ４００
５ ９３
８６．１
ＩＬ−４ ５１６
５ ９３ ９
４．６
【００３３】付着細胞は、０．１、１または１０ Ｕ／
ｍｌのＩＬ−２と共に１日間ＰＭＥ処理ＰＢＭＣから１
×１０７個の細胞／ｍｌで産生させた。次いでこの付着
細胞をＩＬ−２単独（対照）またはＩＬ−２およびＩＬ
−４（２００ Ｕ／ｍｌ）と共に種々の期間培養した。 ３Ｈ−チミジン取り込みも表５で示されるようにＩＬ−
４群で高められた。 【００３４】 【表５】 Ａ−ＬＡＫの細胞
増殖に与えるＩＬ−４の影響
ＩＬ−２（Ｕ／ｍｌ）
０．１
１ １０
８ 日 対照 １５４
７ ６９２４
２０７３０ ＩＬ−４
１８８４ ８９５７
２７５０２ １３ 日 対照 １４７
０ １１３４０
２１３０７ ＩＬ−４
４６７０ ２２１３５
３３４６９
【００３５】付着細胞は、０．１、１または１０ Ｕ／
ｍｌのＩＬ−２と共に１日間ＰＭＥ処理ＰＢＭＣから５
×１０６個の細胞／ｍｌで産生させた。次いでこの付着
細胞をＩＬ−２単独（対照）またはＩＬ−２およびＩＬ
−４（２００ Ｕ／ｍｌ）と共に種々の期間培養した。 【００３６】《実施例 ４》非付着ＬＡＫ（ＮＡ−Ｌ
ＡＫ）細胞数の増加は、ＩＬ−４をＩＬ−２活性化後そ
してＡ−ＬＡＫ集団の付着後に加えたとき表６に示され
るようにＩＬ−４によって幾らか高められた。ＬＡＫ活
性はＩＬ−２単独の使用と比べて同一のままであった。 しかし乍ら、ＩＬ−４がＩＬ−２と同時に（Ａ−ＬＡＫ
細胞の付着段階中に）存在したとき、ＬＡＫ活性は表６
に示されるように阻止された。細胞数の増加は、ＩＬ−
４が付着段階中に存在したとき、ＩＬ−２単独ではＩＬ
−２プラスＩＬ−４と比べてほぼ同一であった。ＩＬ−
４がＩＬ−２活性化中に存在したとき、細胞の表面マー
カーの分析は、表６に示されるようにＣＤ４＋細胞が僅
かしか増加しないことを示した。 【００３７】 【表６】 ＮＡ−ＬＡＫ細胞増加、細胞障害活性及びフェ
ノタイプに与えるＩＬ−４の影響
ＩＬ−４ 増加
溶解 Ｌｅｕ２ Ｌｅｕ３
Ｌｅｕ４ Ｌｅｕ１９ （ｍｌ）
倍率 （％） （％）
（％） （％） （％）
付着後 ０ ２．８
７３ ５８ ２３
３２ ７２ １０
４．２ ７８ ５４
１８ ２９ ７
６ ５０ ５．２
７１ ４９ １８
２５ ７８ ２００
５．２ ６８ ５６
１７ ２４
８２ 付着中 ０ ２．８
７３ ５８ ２３
３２ ７２ １０
２．３ ６４ ６２
２２ ３４ ７
０ ５０ ２．１
５４ ５９ ３２
４６ ５６ ２００
２．０ ５６ ５３
３４ ４７
５５
【００３８】それ故、細胞数のＬＡＫ増加またはＣＤ４
＋細胞数の増加に与えるＩＬ−４の影響はＮＡ−ＬＡＫ
細胞培養物でも観察できたけれども、細胞増殖の増加は
付着細胞（Ａ−ＬＡＫ）培養物に比べてかなり低下した
。
化キラー（Ａ−ＬＡＫ）細胞を調製する改良方法、該方
法によって調製され単離されたＡ−ＬＡＫ細胞を含有す
る組成物、および該組成物をインターロイキン−２（Ｉ
Ｌ−２）と共に投与して哺乳動物の腫瘍を治療する方法
に関するものである。 【０００２】 【従来の技術】［クロスレファレンス］本願と同時に出
願された下記出願は参照として本願明細書に組み入れる
： カムエイチ． リュング（Ｋａｍ Ｈ． Ｌｅｕｎ
ｇ）、「Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル処理ヒト
末梢血液細胞からインターロイキン−２（ＩＬ−２）お
よびインターロイキン−４（ＩＬ−４）によるＣＤ４＋
ヘルパーＴ細胞の産生」；米国特許出願第０７／６４８
６７２号。 【０００３】ナチュレルキラー（ＮＫ）細胞およびリン
ホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞は腫瘍細胞に対す
る免疫監視に密接に係わっている［Ｂａｒｌｏｚｚａｎ
ｉ等（１９８３）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３１、
１０２４； Ｒａｙｎｅｒ等（１９８５）、Ｃａｎｃｅ
ｒ、５５： １３２７］。進行した癌患者への自己由来
ＬＡＫの全身投与が有益であることが報告されている［
Ｍｕｌｅ等（１９８６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４
６： ６７６］。この方法は多数の細胞が各患者に必要
である点で面倒である。更に、ＬＡＫおよびインターロ
イキン−２（ＩＬ−２）を使用して癌患者を治療するこ
ともかなりの毒性を伴っている［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等
（１９８７）、Ｎ． Ｅｎｇｌ．Ｊ． Ｍｅｄ． ３１
６： ８８９］。 【０００４】単球はＩＬ−２によるＬＡＫ活性の活性化
を妨害することが示されている［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等
（１９８７）、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３
１６： ８８９］。Ｌ−ロイシンメチルエステル（ＬＭ
Ｅ）およびＬ−フェニルアラニンメチルエステル（ＰＭ
Ｅ）はヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）から単球を除
去させることが示された［ＴｈｉｅｌｅおよびＬｉｐｓ
ｋｙ（１９８５）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４：
７８６； Ｈｏｙｅｒ等（１９８６）、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．、４６： ２８３４］。しかし乍ら、ＬＭＥ
はＮＫ活性およびＮＫ細胞も激減させた［Ｔｈｉｅｌｅ
およびＬｉｐｓｋｙ（１９８５）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．、１３４： ７８６； Ｈｏｙｅｒ等（１９８６）
、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４６： ２８３４］。本発
明者はＰＭＥで単球を枯渇させるとＩＬ−２によってＬ
ＡＫ細胞を５×１０６個の細胞／ｍｌまたはそれ以上の
密度で産生できることを示した［Ｌｅｕｎｇ（１９８７
）、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６、Ａ
ｂｓｔｒａｃｔ ＃１７１８； Ｌｅｕｎｇ およびＲ
ｉｎｅｈａｒｔに発行された米国特許４，８４９，３２
９］。 【０００５】付着ＬＡＫ（Ａ−ＬＡＫ）細胞は２４時間
ＩＬ−２で活性化し、単球を枯渇させたＰＢＭＣのプラ
スチックへの付着によって産生されることが報告されて
いる［Ｍｅｌｄｅｒ等（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．、４８、３４６］。これらの細胞は非常に増殖性
で且つ細胞障害性（細胞障害活性）であり、そしてＬＡ
Ｋ細胞（Ｌｅｕ１９＋、ＬＡＫフェノタイプ）が濃厚化
されている。Ａ−ＬＡＫ細胞にはヒトでの養子免疫療法
で有効な重大な利点がある。Ａ−ＬＡＫ細胞は抗腫瘍活
性がより大きいＬＡＫ細胞に富んでいるので、Ａ−ＬＡ
Ｋ細胞は慣用のＬＡＫ細胞療法より少ない細胞を使用し
て有効であると思われる。更に、患者にＡ−ＬＡＫ細胞
と同時投与するＩＬ−２がより少なくて良く、それ故該
療法の毒性が減少する。 【０００６】以前の報告では、Ａ−ＬＡＫ細胞を産生さ
せるために、単球はナイロンウールカラムへの付着によ
ってまたは遠心分離によって除去された［Ｍｅｌｄｅｒ
等、（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８：３
４６］。単球を除去するこれらの方法は時間を要し複雑
である。ＬＡＫ細胞前駆体もナイロンウールカラムに付
着するものがある。それ故、本発明者は単球を枯渇させ
る単一工程としてＰＭＥ（５ｍＭ）を使用した。本発明
者はＰＭＥ処理細胞からＡ−ＬＡＫを産生させることが
できた（係属中で、共同して譲渡された、１９８９年
７月２１日に出願された米国特許出願第０７／３８４，
１３４号）。 低濃度（１〜２．５ｍＭ）のＰＭＥを使用する単球の部
分的枯渇は高濃度のＰＭＥを使用する単球の完全枯渇に
比べてＡ−ＬＡＫ細胞の細胞数の増加をより大きくする
ことができた。ここでいう、細胞数の増加とは、細胞集
団の拡大を意味する。本発明者の結果は、ＰＢＭＣ集団
中の単球が余りにも多い（＞１０％）とＡ−ＬＡＫの産
生を妨げ、そして単球が少ない（＜１０％）とＡ−ＬＡ
Ｋの産生を増大化させたことを示唆している。 【０００７】ＩＬ−２はＮＫ細胞およびＴ細胞の有効な
刺激剤である。他方、ＩＬ−４は初めはＢ細胞増殖因子
として記載された［Ｈｏｗａｒｄ等（１９８２）、Ｊ．
Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１５５： ９１４］。ＩＬ−４
はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞および単球に対して多数の
影響を有するリンホカインと考えられる［Ｗｉｄｍｅｒ
等（１９８７）、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１６６：
１４４７； Ｍｉｔｃｈｅｌｌ等（１９８９）、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２： １５４８； Ｓｐｉｔ
ｓ等（１９８７）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９：
１１４２；Ｎａｇｌｅｒ等、（１９８８）、Ｊ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．、１４１： ２３４９； ｔｅ Ｖｅｌ
ｄｅ等（１９８９）、Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｃｔｉ
ｏｎｓ、２６： １； Ｓｐｉｔｓ等（１９８８）、Ｊ
． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１： ２９； Ｓｐｉｔｓ
等（１９８８）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１：
２９； ＢｒｏｏｋｓおよびＲｅｅｓ（１９８８）、Ｃ
ｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７４： １６
２； Ｋａｗａｋａｍｉ等（１９８９）、Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．、１４２： ３４５２］。ＩＬ−４単独では
ＰＢＭＣからＬＡＫ活性を生じさせることはできないが
、特定のＣＴＬ生成を高めることができる。ＩＬ−４は
ＩＬ−２によるＬＡＫ誘導を阻止したが、ＩＬ−２によ
るＣＴＬ誘導を高めた［Ｓｐｉｔｓ等（１９８８）、Ｊ
． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１： ２９； Ｂｒｏｏｋ
ｓおよびＲｅｅｓ（１９８８）、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７４： １６２］。最近では、Ｉ
Ｌ−４がＩＬ−２活性化細胞の細胞増殖を高めることが
報告された［Ｋａｗａｋａｍｉ等（１９８９）、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２： ３４５２］。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題およびそれを解決するた
めの手段】本発明は付着リンホカイン活性化キラー（Ａ
−ＬＡＫ）細胞を調製する改良法を提供する。この方法
は、（ａ）低級アルキルアミノ酸エステル、好ましくは
ＰＭＥでＰＢＭＣを処理して単球を枯渇させ、（ｂ）残
余細胞を、ＬＡＫ細胞の１部が付着しているプラスチッ
ク容器内でＩＬ−２を含有する培地中で５×１０６〜１
×１０７個細胞／ｍｌで培養し、（ｃ）非付着細胞を除
去し、そして（ｄ）ＩＬ−２およびＩＬ−４を含有する
培地中でＡ−ＬＡＫ細胞を培養してＡ−ＬＡＫ細胞数を
増加させる、ことからなっている。改良点は、細胞が容
器のプラスチック表面に付着した後にＩＬ−４を添加し
てＡ−ＬＡＫ細胞の増殖および細胞溶解活性を増大化さ
せる最終段階にある。 【０００９】本発明はまた上記方法で調製され単離され
たＡ−ＬＡＫ細胞の組成物、およびこの組成物をＩＬ−
２と共に投与して哺乳動物の腫瘍を治療する方法も特徴
とする。 【００１０】末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）または末梢
血液リンパ球（ＰＢＬ）の懸濁液を約４〜７％のＣＯ２
の存在下３５℃〜３９℃、好ましくは３７℃で約２〜２
１日のインキュベーション期間中培養する。培養は約１
×１０６〜２×１０７、好ましくは５×１０６〜１×１
０７個の細胞／ｍｌの範囲の細胞濃度で約１５０〜２０
００ｐＭ、好ましくは１０００〜２０００ｐＭの濃度の
ＩＬ−２を含有する培地中で実施する。培養は慣用の容
器、例えばＴ型フラスコで行うこともできるが、好まし
くは密閉された気体透過性滅菌バッグ、例えばステリセ
ル（Ｓｔｅｒｉｃｅｌｌ）（商標）細胞培養バッグ（デ
ラウエア州ウィルミントンのＥ． Ｉ． Ｄｕ Ｐｏｎ
ｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏ．）内で実施する
ことができる。上記条件下での培養によってＬＡＫ細胞
、即ちＮＫ細胞による溶解に抵抗性の腫瘍細胞を溶解し
得る細胞溶解細胞の集団が産生される。 【００１１】本発明によって調製されたＬＡＫ細胞はリ
ュングおよびラインハート（Ｒｉｎｅｈａｒｔ）に対し
て１９８９年２月３日に発行された米国特許４，８４９
，３２９（これは参照として本願明細書に組み入れる）
に記載された方法で養子免疫療法で使用される。 【００１２】好ましいＬ−アミノ酸はフェニルアラニン
またはチロシンであり、そして最も好ましいものはフェ
ニルアラニンである。エステルの低級アルキル基はメチ
ル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブ
チルまたはｔ−ブチルであるが、好ましくはメチルまた
はエチルであり、そして最も好ましくはメチルである。 製薬的に許容される好ましい塩は塩酸塩および臭化水素
酸塩である。 【００１３】ＬＡＫ細胞を調製する方法にＰＭＥおよび
他の低級アルキルアミノ酸エステルを使用することは米
国特許４，８４９，３２９に開示されている。更に、１
９８９年２月２１日に出願した米国特許出願第０７／３
１３，４２１号も参照として本願明細書に組み入れる。 【００１４】本発明者は以前に、Ａ−ＬＡＫ細胞を産生
させる方法で単球枯渇の単一工程として約１から５ｍＭ
の濃度のＰＭＥを使用した。この方法は１９８９年７月
２１日に出願され共同して譲渡された米国特許出願第０
７／３８４１３４号（これは参照として本願明細書に組
み入れる）に開示されている。ＰＭＥ処理ＰＢＭＣから
Ａ−ＬＡＫを産生させることが可能でありそしてＡ−Ｌ
ＡＫ細胞をプラスチック容器内で培養する前にＰＢＭＣ
をＰＭＥで処理すると、ＰＭＥ処理をしないで得られた
細胞数の増加に比べて、Ａ−ＬＡＫ細胞数の増加値がか
なり上昇することが見いだされた。ＰＭＥで処理した後
、Ａ−ＬＡＫ細胞数の増加中においてはＬＡＫ細胞の機
能的な細胞溶解活性は高いまま維持される。 【００１５】本願発明は、ＬＡＫ細胞溶解活性値が高い
Ｌｅｕ１９＋リンパ球の増加および濃厚化の改良方法に
係わるものである。ＰＢＭＣは先ずＰＭＥで処理して単
球および他のＰＭＥ感受性細胞を枯渇させる。次いで、
得られたリンパ球はプラスチックフラスコ内でＩＬ−２
と共に１乃至２日間インキュベートする。次いで、付着
細胞をＩＬ−４と共に８乃至２１日間培養して細胞数お
よびＬＡＫ活性の増加を得る。Ａ−ＬＡＫ調製方法中に
使用した細胞密度は、単球枯渇段階を含めて、好ましく
は約５×１０６〜２×１０７個の細胞／ｍｌ、更に好ま
しくは約１×１０７個の細胞／ｍｌである。 【００１６】 【発明の効果】ＩＬ−４を使用する本発明者の方法は、
Ａ−ＬＡＫ細胞を調製するために以前に使用された方法
［Ｍｅｌｄｅｒ等（１９８８）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ、４９： １４４； 本発明者の特許出願、
ＵＳＳＮ ０７／３８４１３４］を超える幾つかのかな
りの差異および重要な利点を提供する。第１に、化学薬
剤としてＰＭＥを使用してＰＢＭＣから単球を枯渇させ
ると、ＰＭＥ濃度およびインキュベーション時間によっ
て、本方法はナイロン−ウール方法を使用して達成でき
るより良好に制御できる。ＰＢＭＣのＰＭＥ処理はまた
、骨の折れる組み立て、滅菌法および分離実施を必要と
する遠心分離よりはるかに簡便でもあり使用する消費時
間も少ない。第２に、本発明の方法では、リンパ球は、
これまでに使用されてきた２×１０６／ｍｌと比べて約
１乃至２×１０７／ｍｌの細胞密度でプラスチック容器
内で培養される。かくして、本方法は使用される培地の
総容量を、Ａ−ＬＡＫ細胞を調製する以前の方法と比べ
て５分の１乃至１０分の１に減少させる。第３に、高細
胞密度（１×１０７／ｍｌ）は一般に低細胞密度（１×
１０６／ｍｌ）より確かな増加を生じさせた。第４に、
濃厚化されたＡ−ＬＡＫ細胞は単球が完全に枯渇された
ＰＢＭＣから産生させることができるが、それらは同様
に増殖性ではない。単球枯渇量はＰＢＭＣを処理するた
めに使用したＰＭＥ濃度によって正確に制御することが
できる。上記したように、単球枯渇値は単球を枯渇させ
る分離および／またはナイロン−ウールカラムを使用し
ては容易には制御できない。第５に、ＩＬ−４を含有さ
せるとＡ−ＬＡＫ細胞数の増加および増殖並びにＬＡＫ
の細胞溶解活性が更に高められる。 【００１７】ＩＬ−４の使用を含む本発明のＡ−ＬＡＫ
方法は、慣用のＬＡＫ細胞産生方法、例えばカワカミ（
Ｋａｗａｋａｍｉ）等（１９８９）、ジェイ． イミュ
ノル．（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１４２： ３４５
２、と比べて改良を提供する。高細胞密度の付着および
ＩＬ−４を使用する本発明者の方法は、Ａ−ＬＡＫ細胞
の良好な濃厚化および細胞の拡大を与えた。 【００１８】以下の実施例では、腫瘍細胞に対するＬＡ
Ｋ細胞の細胞障害活性を測定するために３時間の５１Ｃ
ｒ放出アッセイを使用した。約２×１０６〜１０×１０
６の濃度の腫瘍細胞は０．４ｍｌのトリス−りん酸緩衝
生理食塩液中５０μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４と共に３
７℃で１時間インキュベートした。細胞は１０％のウシ
胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ １６４０で４
回洗浄し、そしてＲＰＭＩ １０％ＦＣＳ中で１０５個
の細胞／ｍｌに再懸濁した。エフェクター細胞（ＬＡＫ
細胞）は種々の濃度に懸濁し、そして０．１ｍｌを丸底
微量滴定プレート内のウエルに加えた。５１Ｃｒで標識
した標的細胞（０．１ｍｌ）を全てのウエルに加え、プ
レートは２００×ｇで５分間遠心した。３７℃でのイン
キュベーション４時間後に、プレートを再び遠心し、そ
して得られた上清液０．１ｍｌを各ウエルから取り出し
てガンマカウンターで計数した。 細胞障害活性パーセントは次式から計算した：細胞障害
活性（％）＝｛（実験ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）／（総
ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）｝×１００ 【００１９】各変数は３回重複して試験し、得られたデ
ータを細胞障害活性または溶解パーセント％として示し
た。この細胞障害活性試験は、セレクテッド メソッズ
インセルラー イムノロジー（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ）、ミッシェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびシ−
ギ（Ｓｈｉｉｇｉ）編、１２４〜１３７、サンフランシ
スコのダブリュ．エム．フリーマン アンド コ．（Ｗ
． Ｍ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．）（１９８
０）に更に詳細に記載されている。 【００２０】細胞表面マーカー分析用に、冷却した染色
緩衝溶液（ＰＢＳ、１５％のＢＳＡおよび０．１％のア
ジ化ナトリウム）０．１ｍｌ中２×１０５個の細胞を９
６ウエルの丸底プレートに入れた。種々の蛍光標識抗体
を４℃で３０分間上記細胞に加えた。細胞は２回洗浄し
、フローサイトメーター（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅ
ｒ）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォル
ニア州マウンテンビュー）で蛍光を分析する前に１％の
パラホルムアルデヒドに再懸濁した。表１はこの試験で
使用した抗体の反応性／特異性を要約して示す。 【００２１】 【表１】 この試験のモノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）で同定される分化抗原 ＣＤクラスター ｍＡｂ
細胞の反応性／特異性 ＣＤ３
Ｌｅｕ４
Ｔ細胞 ＣＤ４
Ｌｅｕ３ ヘルパー／インデューサー
Ｔ細胞 ＣＤ８
Ｌｅｕ２ サプレッサー／細胞障害性
Ｔ細胞 ＣＤ５６
Ｌｅｕ１９ ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞 【００２２】 【実施例】 《実施例 １》［Ａ−ＬＡＫ細胞産生に与えるＩＬ−
４の影響］ＰＢＭＣは５ｍＭのＰＭＥで処理して単球を
枯渇させ、そして１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２またはＩＬ
−２およびＩＬ−４と共にプラスチックフラスコ内で２
０時間５×１０６個の細胞／ｍｌで培養した。 非付着（ＮＡ）細胞は除去し、そしてフラスコに付着し
た細胞はＩＬ−２またはＩＬ−２およびＩＬ−４を含有
する培地を用いて培養した。ＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ
、マサチューセッツ州ボストン）を、ＩＬ−２だけを有
する培地中で産生した付着細胞に加えた。ＮＡ細胞を同
様にして培養した。表２に示されるようにＩＬ−２だけ
を用いて１４日間培養したとき、Ａ−ＬＡＫ細胞は１２
３倍増加した。 【００２３】 【表２】 Ａ−ＬＡＫ細胞数の増加、細胞障害活性及びフェ
ノタイプに与えるＩＬ−４の影響
ＩＬ−４ 増加
溶解 Ｌｅｕ ２ Ｌｅ
ｕ ３ Ｌｅｕ ４ Ｌｅｕ １
９ （ｍｌ） 倍率 （％）
（％） （％）
（％） （％） 付着後 ０ １２３ ８０
５８ ４
８ ９９ １０
１４６ ７８
５７ ３ ５
９９ ５０ ４１
２ ７６ ５７
２ ７
９９ ２００ ５４７
８２ ５０ ２
４ ９９ 付着
中 ０ １２３ ８０
５８ ４
８ ９９ １０
４６ ６９
４９ ２１ ２７
７６ ５０ ４
０ ５６ ３５
６５ ７７
２７ ２００ ３０
４３ ３０ ７７
８８ １７
【００２４】ＰＢＭＣは５ｍＭのＰＭＥで処理して単球
を枯渇させ、そして１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２またはＩ
Ｌ−２およびＩＬ−４と共に５×１０６個の細胞／ｍｌ
でプラスチックフラスコ内で２０時間培養した。非付着
細胞を除きフラスコに付着した細胞はＩＬ−２またはＩ
Ｌ−２およびＩＬ−４を含有する培地で培養した。ＩＬ
−４を、ＩＬ−２だけを有する培地中で産生させた付着
細胞に加えた。示したデータは１４日間培養したときの
ものであった。示した細胞毒性は３時間アッセイにおけ
る５１Ｃｒで標識したラジ（Ｒａｊｉ）標的細胞に対し
５：１のＥ：Ｔ比のものであった。細胞が付着した後に
ＩＬ−４を加えるとＩＬ−２単独より４倍多い細胞数の
増加が得られた。 他方、ＩＬ−４が付着段階で存在すると、依然として３
０倍から４６倍の細胞数の増加があったけれども、細胞
数の増加はＩＬ−４によって抑制された。 【００２５】ＩＬ−２で産生したＡ−ＬＡＫ細胞は３時
間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて５：１のエフェクタ
ー対標的比で８０％のラジ標的細胞の特異的溶解を有し
ていた。ＩＬ−４は付着段階後に加えられると、ＬＡＫ
活性に対し阻止効果を有していなかった。しかし乍ら、
ＩＬ−４が付着段階中に存在するとＩＬ−２で誘導され
るＬＡＫ活性を阻止した。 【００２６】ＩＬ−２およびＩＬ−４を含有する培地中
で増殖させた細胞の表現型発現によってＩＬ−４が表２
に示されるようにＬｅｕ１９＋細胞のパーセントを９８
％から１７％に阻止したことが明らかにされた。同時に
、Ｌｅｕ３およびＬｅｕ４細胞はＩＬ−４不存在下、即
ちＩＬ−２単独での約４〜８％から７７〜８５％に増加
した。それ故、ＩＬ−４が本方法の付着段階中に存在す
ると、ＩＬ−２で誘導されるＬｅｕ１９＋細胞の活性化
および増殖が優先的に阻止された。Ｌｅｕ１９＋細胞は
Ｌｅｕ３＋細胞の増殖にマイナスの効果を有しており、
その結果ＩＬ−４によってＬｅｕ１９＋細胞が阻止され
るとＬｅｕ３＋細胞がＩＬ−２および／またはＩＬ−４
に応答して増殖できたとも考えられる。付着段階後にＩ
Ｌ−４を添加すると、表２に示されるようにＬｅｕ１９
＋細胞パーセントに対する阻止効果は有さなかった。 【００２７】要約すると、ＩＬ−４が本方法の付着段階
中に存在するとき、ＩＬ−４はＡ−ＬＡＫ産生を阻止し
、ＣＤ４（Ｌｅｕ４＋）が濃厚化した細胞集団を増加さ
せた。他方、ＩＬ−４がＡ−ＬＡＫ産生法の付着段階後
に存在するとき、ＩＬ−４はＡ−ＬＡＫ細胞の細胞数の
増加および細胞障害活性を高めた。 【００２８】《実施例 ２》ＰＢＭＣを５ｍＭのＰＭ
Ｅで４０分間処理して単球を枯渇させ、そして１０ Ｕ
／ｍｌのＩＬ−２と共に１日間培養した。プラスチック
に付着した細胞はＩＬ−２またはＩＬ−２プラスＩＬ−
４と共に培養した。Ａ−ＬＡＫ細胞は８、１１、１５日
の培養期間中培養した。表３に示されるように、ＩＬ−
４はＡ−ＬＡＫ細胞の細胞増加を高めた。ラジ標的細胞
に対するＬｅｕ１９＋細胞および細胞障害活性のパーセ
ントはＩＬ−４の存在下で低下しなかった。 【００２９】 【表３】 ＩＬ−４を付着段階後に加えたときにＡ
−ＬＡＫ細胞に与えるＩＬ−４の影響
溶解％
総細胞
Ｌｅｕ３％ Ｌｅｕ１９％ Ｅ：
Ｔ比率 （×１０
６） （ＣＤ４） （ＣＤ５６）
２．５：１ １．２５：１ ０日
対照 １．９ ＩＬ−４
１．８ ８日 対照 ４２
８ ９５
８５ ７５
ＩＬ−４ ７８
８ ９８
８５ ６８ １１日 対照
９０ ＮＤ
ＮＤ ９４
８４ ＩＬ−４ ３２４
ＮＤ ＮＤ
８９ ９０ １５日
対照 ２５２ ４
９８ ７０
５６ ＩＬ−４ １２
００ ２
９９ ７０ ６５
【００３０】付着細胞は１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共
に５×１０５個の細胞／ｍｌでＰＭＥ処理ＰＢＭＣから
１日間産生させた。次いで、この付着細胞をＩＬ−２（
対照）またはＩＬ−２およびＩＬ−４（２００ Ｕ／ｍ
ｌ）と共に種々の期間培養した。 【００３１】《実施例 ３》ＩＬ−４を添加する前に
０．１、１、または１０ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に１
日間付着細胞を産生させた。付着細胞は更に７日間培養
した。ＩＬ−４は細胞数の増加およびラジ標的細胞に対
するＬＡＫの溶解活性を高めた（表４）。 【００３２】 【表４】 ＩＬ−４によるＡ−ＬＡＫ細胞の調
整に与えるＩＬ−２の投与量の影響
総細胞 Ｌｅｕ３
Ｌｅｕ１９ 溶解
（×１０６）
（％） （％） （
％） ＩＬ−２ Ｕ／ｍｌ ８ 日 ０．１ 対照 ６
２０ ６８
１６．３
ＩＬ−４ ６ ２７
４８ １６．
０ １ 対照 ２６
７ ８８
７４．８
ＩＬ−４ ２４ １
２ ７９ ７３
．８ １０ 対照 ４０
８ ８７
８５．２
ＩＬ−４ ５１
８ ９３ ７
６．７ １３ 日 ０．１ 対照 １２
５９ ３７
１７．１
ＩＬ−４ １９ ７９
１８ １２．
０ １ 対照 １１０
５５ ４４
４３．５
ＩＬ−４ １８０ ３
２ ５８ ８７
．４ １０ 対照 ４００
５ ９３
８６．１
ＩＬ−４ ５１６
５ ９３ ９
４．６
【００３３】付着細胞は、０．１、１または１０ Ｕ／
ｍｌのＩＬ−２と共に１日間ＰＭＥ処理ＰＢＭＣから１
×１０７個の細胞／ｍｌで産生させた。次いでこの付着
細胞をＩＬ−２単独（対照）またはＩＬ−２およびＩＬ
−４（２００ Ｕ／ｍｌ）と共に種々の期間培養した。 ３Ｈ−チミジン取り込みも表５で示されるようにＩＬ−
４群で高められた。 【００３４】 【表５】 Ａ−ＬＡＫの細胞
増殖に与えるＩＬ−４の影響
ＩＬ−２（Ｕ／ｍｌ）
０．１
１ １０
８ 日 対照 １５４
７ ６９２４
２０７３０ ＩＬ−４
１８８４ ８９５７
２７５０２ １３ 日 対照 １４７
０ １１３４０
２１３０７ ＩＬ−４
４６７０ ２２１３５
３３４６９
【００３５】付着細胞は、０．１、１または１０ Ｕ／
ｍｌのＩＬ−２と共に１日間ＰＭＥ処理ＰＢＭＣから５
×１０６個の細胞／ｍｌで産生させた。次いでこの付着
細胞をＩＬ−２単独（対照）またはＩＬ−２およびＩＬ
−４（２００ Ｕ／ｍｌ）と共に種々の期間培養した。 【００３６】《実施例 ４》非付着ＬＡＫ（ＮＡ−Ｌ
ＡＫ）細胞数の増加は、ＩＬ−４をＩＬ−２活性化後そ
してＡ−ＬＡＫ集団の付着後に加えたとき表６に示され
るようにＩＬ−４によって幾らか高められた。ＬＡＫ活
性はＩＬ−２単独の使用と比べて同一のままであった。 しかし乍ら、ＩＬ−４がＩＬ−２と同時に（Ａ−ＬＡＫ
細胞の付着段階中に）存在したとき、ＬＡＫ活性は表６
に示されるように阻止された。細胞数の増加は、ＩＬ−
４が付着段階中に存在したとき、ＩＬ−２単独ではＩＬ
−２プラスＩＬ−４と比べてほぼ同一であった。ＩＬ−
４がＩＬ−２活性化中に存在したとき、細胞の表面マー
カーの分析は、表６に示されるようにＣＤ４＋細胞が僅
かしか増加しないことを示した。 【００３７】 【表６】 ＮＡ−ＬＡＫ細胞増加、細胞障害活性及びフェ
ノタイプに与えるＩＬ−４の影響
ＩＬ−４ 増加
溶解 Ｌｅｕ２ Ｌｅｕ３
Ｌｅｕ４ Ｌｅｕ１９ （ｍｌ）
倍率 （％） （％）
（％） （％） （％）
付着後 ０ ２．８
７３ ５８ ２３
３２ ７２ １０
４．２ ７８ ５４
１８ ２９ ７
６ ５０ ５．２
７１ ４９ １８
２５ ７８ ２００
５．２ ６８ ５６
１７ ２４
８２ 付着中 ０ ２．８
７３ ５８ ２３
３２ ７２ １０
２．３ ６４ ６２
２２ ３４ ７
０ ５０ ２．１
５４ ５９ ３２
４６ ５６ ２００
２．０ ５６ ５３
３４ ４７
５５
【００３８】それ故、細胞数のＬＡＫ増加またはＣＤ４
＋細胞数の増加に与えるＩＬ−４の影響はＮＡ−ＬＡＫ
細胞培養物でも観察できたけれども、細胞増殖の増加は
付着細胞（Ａ−ＬＡＫ）培養物に比べてかなり低下した
。
Claims (3)
- 【請求項１】 ａ）末梢血液単核細胞を低級アルキル
アミノ酸エステルで処理して単球を枯渇させ、ｂ）残余
細胞を、リンホカイン活性化キラー細胞の１部が付着し
ているプラスチック容器内でインターロイキン−２を含
有する培地中５×１０６〜１×１０７個細胞／ｍｌで培
養し、 ｃ）非付着細胞を除去し、そして ｄ）インターロイキン−２およびインターロイキン−４
を含有する培地中で付着リンホカイン活性化キラー細胞
を培養して、付着リンホカイン活性化キラー細胞数を増
加させる、ことを特徴とする付着リンホカイン活性化キ
ラー細胞の調製方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の方法によって調製さ
れ単離された付着リンホカイン活性化キラー細胞を含有
する組成物であって、該付着リンホカイン活性化キラー
細胞が製薬的に許容可能な担体中に存在し、そして腫瘍
に苦しんでいる哺乳動物にインターロイキン−２と共に
投与するとき該腫瘍に反応性である組成物。 - 【請求項３】 インターロイキン−２および請求項２
に記載の組成物の腫瘍阻止量を哺乳動物に投与すること
からなる哺乳動物の腫瘍を治療する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64867691A | 1991-01-31 | 1991-01-31 | |
| US07/648676 | 1991-01-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04299983A true JPH04299983A (ja) | 1992-10-23 |
Family
ID=24601763
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3276128A Pending JPH04299983A (ja) | 1991-01-31 | 1991-09-30 | 付着リンホカイン活性化キラー細胞の産生・増加方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0497274A3 (ja) |
| JP (1) | JPH04299983A (ja) |
| CA (1) | CA2060278A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102011106914A1 (de) | 2011-07-08 | 2013-01-10 | Zellwerk Gmbh | Mäander- Bioreaktor und Verfahren zu dynamischen Expansion, Differenzierung und Ernte von hämatopoetischen Zellen |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4849329A (en) * | 1986-05-30 | 1989-07-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for preparing lymphokine activated killer cells |
| CA2015294A1 (en) * | 1989-04-28 | 1990-10-28 | John J. Rinehart | Generation and expansion of lak cells |
-
1991
- 1991-09-30 JP JP3276128A patent/JPH04299983A/ja active Pending
-
1992
- 1992-01-28 EP EP19920101350 patent/EP0497274A3/en not_active Withdrawn
- 1992-01-29 CA CA002060278A patent/CA2060278A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102011106914A1 (de) | 2011-07-08 | 2013-01-10 | Zellwerk Gmbh | Mäander- Bioreaktor und Verfahren zu dynamischen Expansion, Differenzierung und Ernte von hämatopoetischen Zellen |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2060278A1 (en) | 1992-08-01 |
| EP0497274A3 (en) | 1993-02-10 |
| EP0497274A2 (en) | 1992-08-05 |
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