CN117821550A - 一种富含谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小麦蛋白水解物技术领域，具体涉及一种富含谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物及其制备方法和应用。所述小麦蛋白水解物中谷氨酰胺二肽为10％～20％；所述谷氨酰胺二肽中甘氨酰谷氨酰胺为8％～16％，丙氨酰谷氨酰胺为0.5％～3％；其还含有低聚肽、谷氨酸和蛋白质。小麦蛋白水解物的制备方法包括如下步骤：将谷朊粉加入碱性溶液中，混合匀浆，加热处理，分离收集上清液；然后加入酶进行酶解得到酶解液；将酶解液分离，脱盐，浓缩，干燥，即得。本发明得到的小麦蛋白水解物可广泛应用于细胞培养，以及饮料、保健品等领域，使用面广，生产成本低，安全性高，可以实现药食同源，符合现代的健康理念。

Description

一种富含谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及小麦蛋白水解物技术领域，具体涉及一种富含谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物及其制备方法和应用。

背景技术

谷氨酰胺是体内含量最丰富的非必需氨基酸，人体可以自己合成。但由于在外伤、感染或手术等应激或病理状态下，机体对谷氨酰胺的需求远超过机体自身合成的能力，所以将谷氨酰胺列为条件必需氨基酸。谷氨酰胺由于水溶性差(20℃时仅35g/L)、不稳定及易受抗营养因子的干扰，限制了其应用时的营养性能。因此谷氨酰胺多肽常作为谷氨酰胺的补充剂，谷氨酰胺二肽是谷氨酰胺与其他氨基酸形成的二肽，是谷氨酰胺的供体，具有稳定性好、水溶性强(20℃时，甘氨酰谷氨酰胺溶解度154g/L；丙氨酰谷氨酰胺溶解度586g/L)，热耐受性高、吸收率高等优点，且体内水解转化后具有谷氨酰胺应有的全部理化特征，因此常作为谷氨酰胺的营养补充剂。其中丙氨酰谷氨酰胺和甘氨酰谷氨酰胺是国内外公认的谷氨酰胺有效载体。

在细胞培养过程中，谷氨酰胺是细胞培养常用的能量物质，但是谷氨酰胺常常容易分解而导致营养损失和有害物质积累，严重影响生物制品的生产。谷氨酰胺二肽可以顺利被细胞吸收，通过肽酶降解为谷氨酰胺而被细胞利用，从而最大可能的保证了细胞对能量物质的吸收利用，避免了谷氨酰胺降解的吡咯烷酮羧酸和氨对细胞产生的不利影响。有研究表明，谷氨酰胺二肽不仅可以作为谷氨酰胺的替代品，同时还可以促进细胞生长以及提升抗体产量，对细胞培养生产生物制品有着重要作用。

目前报道的谷氨酰胺二肽的制备方法主要为化学合成法，根据原料和合成路径的差异，细分为DCC藕联法、N-羧基内酸酐法、活性酯法、酰氯法、肼解法等。其中DCC藕联法反应过程复杂，杂质难以除去，提纯难度大，且反应过程需要DCC、钯炭等昂贵原料；N-羧基内酸酐法需低温进行，且需要光气，中间体不稳定，产品纯化难度大；活性酯法反应条件温和，产物杂质少，但工艺繁琐收率低，且原料价格高昂；酰氯法是合成二肽的主要方法，但反应易产生近似产物甘氨酰谷氨酸，纯化难度高；肼解法反应条件温和，产品纯度高，但中间体纯度不稳定，一定程度上限制了该方法的工业化。

发明内容

本发明解决的技术的问题：现有技术中，化学法合成谷氨酰胺二肽的工艺路线往往面临步骤繁琐、技术和设备要求高、原料昂贵、产物不稳定及纯化难度大等问题。且采用化学法合成的物质在食品和药品领域应用时，对杂质或有毒原料的残留量有着极其严苛的要求，对产品纯度要求极高。以上原因导致化学法合成的谷氨酰胺二肽成本高昂，工业化和应用受限。

针对上述技术问题，本发明提供了一种富含谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物及其制备方法和应用。

具体来说，本发明提出了如下技术方案：

本发明中，第一方面提供了一种小麦蛋白水解物，以小麦蛋白水解物干基总质量计，其含有谷氨酰胺二肽含量为10％～20％；其中，所述谷氨酰胺二肽含有甘氨酰谷氨酰胺和丙氨酰谷氨酰胺；以小麦蛋白水解物干基总质量计，甘氨酰谷氨酰胺含量为8％～16％，丙氨酰谷氨酰胺含量为0.5％～3％。

优选地，以小麦蛋白水解物干基总质量计，其含有谷氨酰胺二肽含量为14％～18％。

优选地，以小麦蛋白水解物干基总质量计，所述甘氨酰谷氨酰胺含量为11％～14％。

优选地，以小麦蛋白水解物干基总质量计，所述丙氨酰谷氨酰胺含量为1％～3％。

优选地，以小麦蛋白水解物干基总质量计，小麦蛋白水解物含有低聚肽，其含量为80％以上。

更优选地，以小麦蛋白水解物干基总质量计，所述低聚肽的含量为80％～85％。

优选地，以低聚肽总质量计，分子量在1000Da以下的小分子肽的含量为85％以上。

更优选地，以低聚肽总质量计，分子量在1000Da以下的小分子肽的含量为85％～95％。

优选地，以小麦蛋白水解物干基总质量计，小麦蛋白水解物含有谷氨酸，其含量为30％以上。

更优选地，以小麦蛋白水解物干基总质量计，小麦蛋白水解物中谷氨酸的含量为30％～35％；

优选地，以小麦蛋白水解物干基总质量计，小麦蛋白水解物含有蛋白质，其含量为90％以上。

更优选地，以小麦蛋白水解物干基总质量计，小麦蛋白水解物中蛋白质的含量为90％～95％。

本发明中，第二方面提供了一种小麦蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：

(1)预处理：将谷朊粉加入到碱性溶液中，混合得到匀浆，然后经过加热处理，分离后收集上清液；

(2)酶解：向步骤(1)得到的上清液中加入酶，进行酶解，得到酶解液；

(3)富集：将步骤(2)得到的酶解液分离，脱盐，浓缩，干燥，得到富集谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物。

优选地，步骤(1)中，所述碱性溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液。

优选地，步骤(1)中，所述碱性溶液中氢氧根的浓度为0.02～1mol/L。

优选地，步骤(1)中，所述碱性溶液中氢氧根的浓度为0.02～0.1mol/L。

优选地，步骤(1)中，所述混合溶液的pH为8～10。

优选地，步骤(1)中，所述碱性溶液和谷朊粉的质量比为(5～10):1；

优选地，步骤(1)中，将谷朊粉分散在碱性溶液中，采用胶体磨匀浆，然后进行升温处理。

优选地，采用胶体磨匀浆1～3次。

优选地，将得到的溶液升温至40～50℃；和/或反应时间为1～2h。

优选地，步骤(2)中，所述上清液中干物质的浓度为3％～15％。

优选地，步骤(2)中，所述上清液中干物质的浓度为5％～12％。

优选地，步骤(2)中，以谷朊粉干物质质量计，添加的酶的含量为0.2％～2.5％。

优选地，步骤(2)中，以谷朊粉干物质质量计，添加的酶的含量为1.6％～2.5％。

优选地，步骤(2)中，酶解的条件：温度为45～60℃，pH为4.5～9.5，和/或时间为3～18h。

优选地，步骤(2)酶解结束后进行灭酶处理。

进一步优选地，灭酶的条件为：温度为65～90℃，时间为20～60min。

优选地，步骤(2)中，所述酶包括谷氨酰胺酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶中的一种或两种以上。

优选地，步骤(2)中，所述酶选自谷氨酰胺酶不结合或结合木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶中的任一种或两种以上的组合。

更优选地，步骤(2)中，谷氨酰胺酶占酶的质量比为0.1～1。

更进一步优选地，步骤(2)中，谷氨酰胺酶占酶的质量比为0.3～0.6。

优选地，步骤(3)中，将酶解液过滤，然后将上清液采用膜进行分离。

优选地，所述过滤采用离心过滤或板框过滤。

更优选地，所述膜为陶瓷膜和/或有机膜。

更优选地，所述陶瓷膜孔径为20～200nm；和/或，有机膜膜截留分子量为500～10000Da。

优选地，步骤(3)中，所述脱盐的方法选自大孔树脂吸附法、离子交换吸附法或电渗析法。

优选地，步骤(3)中，所述的干燥的方法选自喷雾干燥、微波真空干燥或真空冷冻干燥。

优选地，一种小麦蛋白水解物，所述麦蛋白水解物通过所述的小麦蛋白水解物的制备方法制备得到。

本发明中，第三方面提供了一种小麦蛋白水解物在食品、饮品或培养基中的应用。

优选地，所述食品包括特医食品或保健食品。

优选地，所述培养基包括发酵培养基或细胞培养基。

本发明取得的有益效果：

本发明采用谷朊粉为原料，属小麦淀粉加工副产物，来源天然，其它辅料也均为食品级，不涉及有毒有害的化学试剂。本发明所制小麦蛋白水解物为农副产物深加工产品，不需对水解物中的目标产物谷氨酰胺二肽进行高度纯化，便可广泛应用于细胞培养，以及饮料、保健品等领域，使用面广，生产成本低，安全性高，可以实现药食同源，符合现代的健康理念。

附图说明

图1是应用例1不同添加物对CHO-K1细胞活细胞密度的影响。

图2是应用例1不同添加物对CHO-K1细胞活率的影响。

图3是应用例1不同添加物对CHO-K1细胞绿色荧光蛋白表达量的影响。

具体实施方式

小麦蛋白水解物采用小麦淀粉加工的副产物谷朊粉为原料，经酶解制成的富含多肽、氨基酸的产物，广泛应用于发酵和细胞培养领域，作为水解物为细胞的生长和代谢提供营养物质，也作为血清替代的一种备选原料。小麦蛋白水解物含有丰富的谷氨酰胺，以多肽和游离态形式存在，其中丙氨酰谷氨酰胺和谷氨酰胺二肽是国内外公认的谷氨酰胺有效载体。但采用酶切法以小麦蛋白等天然原料生产谷氨酰胺二肽的报道较少。

如上所述，本发明的目的在于提供一种富含谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物及其制备方法和应用。

本发明所述的低聚肽是指按照QB/T5298-2018附录A低聚肽含量测定中的第一法氨基酸分析仪法中溶于三氯乙酸的肽，其含有分子量＜1000Da的肽。

本发明所述的谷氨酰胺酶是一种复合蛋白酶，其主要成分为中性蛋白酶，还含有少量的酸性蛋白酶和碱性蛋白酶，是安琪酵母股份有限公司出售的产品，商品名称为安占美谷氨酰胺酶GLU100，简称为谷氨酰胺酶。

第一方面，本发明提供了一种富含谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物，以小麦蛋白水解物干基总质量计，其含有谷氨酰胺二肽10％～20％；其中，所述谷氨酰胺二肽含有甘氨酰谷氨酰胺和丙氨酰谷氨酰胺；以小麦蛋白水解物干基总质量计，甘氨酰谷氨酰胺为8％～16％，丙氨酰谷氨酰胺为0.5％～3％。

优选地，所述小麦蛋白水解物还包括低聚肽为80％～85％(以小麦蛋白水解物干基计)；总谷氨酸为30％～35％(以小麦蛋白水解物干基计)；和/或蛋白质为90％～95％(以小麦蛋白水解物干基计)。本发明所述蛋白质含有大分子多肽、低聚肽和游离氨基酸。

第二方面，本发明提供了一种富含谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，配制碱性溶液溶液，对谷朊粉进行溶解，匀浆，然后将得到的溶液升温至40～50℃，反应时间为1～2h，使其充分溶解后，离心除去不溶沉淀，收集上清液；

步骤2，将收集到的上清液，加入酶制剂进行定向酶解，酶解的条件：温度为45～60℃，pH为4.5～9.5，时间为3～18h，酶解结束后升温灭酶，获得酶解液；其中，所述酶制剂选自谷氨酰胺酶和木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶任一种或两种以上的组合；

步骤3，将酶解液进行粗分离，除去不溶性杂质，获得水解物清液；将清液采用膜过滤设备，除去大分子蛋白和多肽；脱盐后获得富集谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物；

步骤4，将富集后的小麦蛋白水解物进行浓缩和干燥，获得粉体小麦蛋白水解物。

优选地，匀浆后得到一种有不溶性蛋白悬浮的悬浊液，匀浆的目的在于将物料分散，以使谷朊粉中碱溶性蛋白接触碱液并溶入其中。

优选地，所述匀浆处理的设备选自胶体磨、水料混合器或均质乳化泵。

第三方面，本发明提供的所述小麦蛋白水解物在食品、饮料、特医食品、发酵培养基或细胞培养基领域中的应用。

优选地，本发明提供的所述小麦蛋白水解物在提高细胞密度、细胞过滤和/或蛋白表达量中的应用。

下面实施例中所用到的原料及设备来源如表1所示，除非另作说明，所述原料及设备一般均为市面上常规所售的化学纯试剂/常用的设备。

表1本发明实施例中所用原料/设备

本发明中，所述甘氨酰谷氨酰胺与丙氨酰谷氨酰胺均采用高效液相色谱检测，用纯品做标样进行定量检测。检测条件如下：色谱柱为：C18色谱柱；流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(体积比90:10)；检测波长：225nm，采用等度洗脱，洗脱流速为1mL/min。

本发明中，所述蛋白质含量的检测是参照中华人民共和国国家标准GB 5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定中的第一法凯氏定氮法，蛋白换算系数为6.25，结果以干基计。

本发明中，所述低聚肽含量的检测是参照中华人民共和国轻工行业标准QB/T5298-2018小麦低聚肽粉中的附录A(规范性附录)低聚肽含量的测定中的第一法氨基酸分析仪法，蛋白换算系数为6.25，结果以干基计。

本发明中，所述肽分子量＜1000Da占比、总谷氨酸、水分和灰分均参照中华人民共和国轻工行业标准QB/T 5298-2018小麦低聚肽粉中的测试方法。其中，总谷氨酸为游离的谷氨酸和肽链上谷氨酸含量的总和。

下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。

实施例1

(1)小麦蛋白的预处理

配置浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，取氢氧化钠溶液1000kg和谷朊粉100kg混合，混合后的pH为9.8。混合液用胶体磨匀浆3次后，升温至50℃，搅拌保温1h。

(2)小麦蛋白水解物的制备

将反应液进行离心，除去沉淀，保留上清液，测定上清液浓度。用纯水将上清液干物质的质量浓度控制在5％，温度升至45℃后保持恒温，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为9.5，按谷朊粉干物质质量的0.2％添加酶制剂，谷氨酰胺酶和碱性蛋白酶的重量比为1：1，酶解3h，中途用1mol/L的盐酸维持pH恒定。酶解结束后回调pH至6.5-7.0，升温至80℃，保温20min。

(3)谷氨酰胺二肽的富集

将灭酶后的酶解液采用采用板框压滤机压滤，压力0.4～0.5Mpa，获得澄清透亮的透过液。将分离清液进一步采用10000Da有机膜过滤，收集透过液。将透过液采用大孔树脂进行灰分脱除，金属离子(灰分)先流穿，搜集后段物料，即为谷氨酰胺二肽富集原液。

(4)水解物粉体的制备

将富集原液采用三效蒸发器，将干物质含量提升至35％左右，获得浓缩液；浓缩液采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥，进风温度220℃，出风温度90℃。干燥粉体过20目筛网，在温度＜25℃，湿度＜60％的环境中进行包装封存。

实施例2

(1)小麦蛋白的预处理

配置浓度为0.04mol/L的氢氧化钾溶液，取氢氧化钾溶液800kg，谷朊粉100kg混合，混合后的pH为8.6。混合液用胶体磨匀浆3次后，升温至47℃，搅拌保温1h。

(2)小麦蛋白水解物的制备

将反应液进行离心，除去沉淀，保留上清液，测定上清液浓度。用纯水将上清液干物质浓度控制在7％，温度升至50℃后保持恒温，用1mol/L的盐酸溶液调节pH为8.0，按谷朊粉干物质质量的0.8％添加酶制剂，谷氨酰胺酶和木瓜蛋白酶的比例为1：1，酶解6h，中途用1mol/L的氢氧化钾或1mol/L的盐酸维持pH恒定。酶解结束后回调pH至6.5～7.0，升温至90℃，保温30min。

(3)谷氨酰胺二肽的富集

将灭酶后的酶解液采用管式分离机分离，转速12000rpm，收集分离上清液。将分离上清液采用5000Da有机膜过滤，收集透过液。将透过液采用磺酸型阳离子交换树脂H型进行灰分脱除，金属离子(灰分)挂柱，搜集流穿的物料即为谷氨酰胺二肽富集原液。

(4)水解物粉体的制备

将富集原液采用反应釜浓缩，真空度-90±0.5kpa，蒸发温度46～48℃，循环蒸发浓缩，获得干物质含量约30％的浓缩液；将浓缩液放入微波真空干燥机，抽真空度-90±0.5kpa，微波频率2450MHz，获得干燥样品；取出干燥样并进行粉碎，过20目筛网，在温度＜25℃，湿度＜60％的环境中进行包装封存。

实施例3

(1)小麦蛋白的预处理

配置浓度为0.08mol/L的氢氧化钠溶液，取氢氧化钠溶液600kg与谷朊粉100kg混合，混合后的pH为9.1。混合液用胶体磨匀浆2次后，升温至43℃，搅拌保温2h。

(2)小麦蛋白水解物的制备

将反应液进行离心，除去沉淀，保留上清，测定上清浓度。用纯水将上清干物质浓度控制在9％，温度升至55℃后保持恒温，用1mol/L的盐酸溶液调节pH为6.5，按谷朊粉干物质质量的1.5％添加酶制剂，谷氨酰胺酶和中性蛋白酶的比例为1：2，酶解12h，中途用1mol/L的氢氧化钠或1mol/L的盐酸维持pH恒定。酶解结束后升温至70℃，保温40min。

(3)谷氨酰胺二肽的富集

将灭酶后的酶解液采用碟片分离机分离，转速5000rpm，收集分离上清液。将分离清液采用1500Da有机膜过滤，收集透过液。将透过液采用电渗析进行灰分脱除，金属离子透过电渗析膜进入洗脱室，样品室剩余物料即为谷氨酰胺二肽富集原液。

(4)水解物粉体的制备

将富集液采用反渗透膜，除去大部分水分，将干物质提升至25％，获得浓缩液。将浓缩液采用真空冷冻干燥，倾入冻干盘中，降温至-50℃后，抽真空度至8-15pa，升温至-5℃后，保持12h，然后以5℃/h的速度升温，达到55℃停止升温，并保持此温度3h。

取出冻干粉粉碎，过20目筛网，在温度＜25℃，湿度＜60％的环境中进行包装封存。

实施例4

(1)小麦蛋白的预处理

配置浓度为0.02mol/L的氢氧化钾溶液，取氢氧化钾溶液500kg与谷朊粉100kg混合，混合后的pH为8.0。混合液用胶体磨匀浆1次后，升温至40℃，搅拌保温2h。

(2)小麦蛋白水解物的制备

将反应液进行离心，除去沉淀，保留上清，测定上清浓度。用纯水将上清干物质浓度控制在12％，温度升至60℃后保持恒温，用1mol/L的盐酸溶液调节pH为4.5，按谷朊粉干物质质量的2.5％添加酶制剂，谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶的比例为3：2，酶解18h，中途用1mol/L的氢氧化钾或1mol/L的盐酸维持pH恒定。酶解结束后回调pH至6.5-7.0，升温至65℃，保温60min。

(3)谷氨酰胺二肽的富集

将灭酶后的酶解液卧式螺旋分离机分离，转速3500rpm，收集分离上清。将分离上清透过50nm的陶瓷膜，获得澄清透亮的透过液。将陶瓷膜透过液进一步采用500Da有机膜过滤，收集透过液。将透过液采用大孔树脂进行灰分脱除，金属离子(灰分)先流穿，搜集后段物料，即为谷氨酰胺二肽富集原液。

(4)水解物粉体的制备

将富集原液采用四效蒸发器，将干物质含量提升至40％左右，获得浓缩液；浓缩液采用压力式喷雾干燥塔进行喷雾干燥，进风温度200℃，出风温度80℃。干燥粉体过20目筛网，在温度＜25℃，湿度＜60％的环境中进行包装封存。

对比例1

(1)小麦蛋白的预处理

配置浓度为0.1mol/L的氢氧化钠，取氢氧化钠溶液1000kg与谷朊粉100kg混合，混合后的pH为9.8。混合液用胶体磨匀浆3次后，升温至50℃，搅拌保温1h。

(2)小麦蛋白水解物的制备

将反应液进行离心，除去沉淀，保留上清液，测定上清液浓度。用纯水将上清液干物质浓度控制在5％，温度升至45℃后保持恒温，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为9.5，按谷朊粉干物质质量的0.2％添加碱性蛋白酶，酶解3h，中途用1mol/L的盐酸维持pH恒定。酶解结束后回调pH至6.5-7.0，升温至80℃，保温20min。

(3)谷氨酰胺二肽的富集

将灭酶后的酶解液采用采用板框压滤机压滤，压力0.4～0.5Mpa，获得澄清透亮的透过液。将分离清液进一步采用10000Da有机膜过滤，收集透过液。将透过液采用大孔树脂进行灰分脱除，金属离子(灰分)先流穿，搜集后段物料，即为谷氨酰胺二肽富集原液。

(4)水解物粉体的制备

将富集原液采用三效蒸发器，将干物质含量提升至35％左右，获得浓缩液；浓缩液采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥，进风温度220℃，出风温度90℃。干燥粉体过20目筛网，在温度＜25℃，湿度＜60％的环境中进行包装封存。

对比例2

(1)小麦蛋白水解物的制备

用纯水与谷朊粉按10:1的比例混合，谷朊粉质量为100kg。混合液用胶体磨匀浆3次后，升温至50℃，搅拌保温1h。降温至45℃后保持恒温，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为9.5，按谷朊粉干物质质量的0.2％添加酶制剂，谷氨酰胺酶和碱性蛋白酶的比例为1：1，酶解3h，中途用1mol/L的盐酸维持pH恒定。酶解结束后回调pH至6.5-7.0，升温至80℃，保温20min。

(2)谷氨酰胺二肽的富集

将灭酶后的酶解液采用采用板框压滤机压滤，压力0.4～0.5Mpa，获得澄清透亮的透过液。将分离清液进一步采用10000Da有机膜过滤，收集透过液。将透过液采用大孔树脂进行灰分脱除，金属离子(灰分)先流穿，搜集后段物料，即为谷氨酰胺二肽富集原液。

(3)水解物粉体的制备

将富集原液采用三效蒸发器，将干物质含量提升至35％左右，获得浓缩液；浓缩液采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥，进风温度220℃，出风温度90℃。干燥粉体过20目筛网，在温度＜25℃，湿度＜60％的环境中进行包装封存。

将实施例1-4和对比例1-2得到的小麦蛋白水解物进行检测，检测结果如下表2所示：

表2实施例和对比例得到的小麦蛋白水解物的检测结果

由表2可以看出，实施例1-4得到的谷氨酰胺二肽含量较高，且低聚肽以及肽分子量＜1000Da的含量也较高，取得了较好的效果。对比例1制备得到的小麦蛋白水解物中谷氨酰胺二肽含量仅1.58％，而且得到的低聚肽以及肽分子量＜1000Da的含量均低于实施例1-4。对比例2得到的小麦蛋白水解物中谷氨酰胺二肽含量为4.35％，远低于实施例1-4制备得到的小麦蛋白水解物谷氨酰胺二肽含量14.2％～15.8％。

本发明实施例1-4制备得到的小麦蛋白水解物谷氨酰胺二肽含量平均达到15.0％，其它核心指标，如蛋白质大于90％、低聚肽大于75％、低于1000Da分子量的肽含量≥85％等，均可以同时满足小麦低聚肽粉行业标准《QB/T5298-2018》的一级品要求范围。本发明制备的富含谷氨酰胺二肽小麦蛋白水解物应用面极广，可以改善并提升下游诸多产业产品如饮料、特医食品或保健品等的功能性。

应用例1

为确定实施例制备得到的富含谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物的确具有替换谷氨酰胺的作用，选用CHO-K1细胞(生产厂家：艾米能斯的EmCD 104商用培养基，不含L-谷氨酰胺)，设置三组实验，如下：空白培养基组：添加6mM谷氨酰胺(L-谷氨酰胺，GMP，购自Sigam公司)；谷氨酰胺二肽组：添加6mM谷氨酰胺二肽(谷氨酰胺二肽，GMP，购自赢创特种化学(上海)有限公司)，其中，甘氨酰谷氨酰胺：丙氨酰谷氨酰胺的质量比为9:1；实施例1组：添加3g/L实施例1得到的小麦蛋白水解物(每升培养基中添加3g粉状小麦蛋白水解物，约含6mM谷氨酰胺)。对比例1组：添加3g/L对比例1得到的小麦蛋白水解物(每升培养基中添加3g粉状小麦蛋白水解物，约含6mM谷氨酰胺)。采用125mL摇瓶，在温度为37℃，5％二氧化碳，转速为105rpm的条件下，培养至细胞衰亡，每组添加的体积相同，重复测试3次，取平均数进行比对，测试指标包括活细胞数、细胞活率和荧光强度。

从图1中可以看出，前期CHO-K1-GFP细胞利用谷氨酰胺的速率快过利用谷氨酰胺二肽的速度，培养第二天时空白培养基组细胞密度最大。但随着培养的进行，小麦蛋白水解物组表现出明显优势，培养到第六天时达到峰值，而其它组细胞密度已出现衰退趋势。图2也可以看出，第六天时实施例1小麦蛋白水解物组细胞活率仍保持在90％以上。图3显示的是细胞表达绿色荧光蛋白的相对荧光强度，也可看出实施例1小麦蛋白水解物组的表达量显著高于其它组。以上数据可以看出，本发明实施例1制备的富含谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物，对CHO-K1细胞的生长具有显著促进作用，在活细胞密度、细胞活率，以及蛋白表达量上，均显著优于谷氨酰胺、谷氨酰胺二肽组和对比例1组。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (14)

1.一种小麦蛋白水解物，其特征在于，以小麦蛋白水解物干基总质量计，其含有谷氨酰胺二肽含量为10％～20％；

其中，所述谷氨酰胺二肽含有甘氨酰谷氨酰胺和丙氨酰谷氨酰胺；以小麦蛋白水解物干基总质量计，甘氨酰谷氨酰胺含量为8％～16％，丙氨酰谷氨酰胺含量为0.5％～3％。

2.根据权利要求1所述的小麦蛋白水解物，其中，以小麦蛋白水解物干基总质量计，其含有谷氨酰胺二肽含量为14％～18％；

优选地，所述甘氨酰谷氨酰胺含量为11％～14％；

和/或，优选地，所述丙氨酰谷氨酰胺含量为1％～3％。

3.根据权利要求1或2所述的小麦蛋白水解物，其中，以小麦蛋白水解物干基总质量计，小麦蛋白水解物含有低聚肽，其含量为80％以上；

优选地，以小麦蛋白水解物干基总质量计，所述低聚肽的含量为80％～85％；

更优选地，以低聚肽总质量计，分子量在1000Da以下的小分子肽的含量为85％以上；

进一步优选地，以低聚肽总质量计，分子量在1000Da以下的小分子肽的含量为85％～95％。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的小麦蛋白水解物，其中，以小麦蛋白水解物干基总质量计，小麦蛋白水解物含有谷氨酸，其含量为30％以上；

优选地，以小麦蛋白水解物干基总质量计，小麦蛋白水解物中谷氨酸的含量为30％～35％；

和/或，以小麦蛋白水解物干基总质量计，小麦蛋白水解物含有蛋白质，其含量为90％以上；

优选地，以小麦蛋白水解物干基总质量计，小麦蛋白水解物中蛋白质的含量为90％～95％。

5.一种权利要求1-4中任一项所述的小麦蛋白水解物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)预处理：将谷朊粉加入到碱性溶液中，混合得到匀浆，然后经过加热处理，分离后收集上清液；

(2)酶解：向步骤(1)得到的上清液中加入酶，进行酶解，得到酶解液；

(3)富集：将步骤(2)得到的酶解液分离，脱盐，浓缩，干燥，得到富集谷氨酰胺二肽的小麦蛋白水解物。

6.根据权利要求5所述的小麦蛋白水解物的制备方法，其中，步骤(1)中，所述碱性溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液；

优选地，步骤(1)中，所述混合溶液的pH为8～10；

和/或，优选地，步骤(1)中，所述碱性溶液和谷朊粉的质量比为(5～10):1。

7.根据权利要求5或6所述的小麦蛋白水解物的制备方法，其中，步骤(1)中，将谷朊粉分散在碱性溶液中，采用胶体磨匀浆，然后进行升温处理；

优选地，采用胶体磨匀浆1～3次；

更优选地，将得到的溶液升温至40～50℃；和/或反应时间为1～2h。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的小麦蛋白水解物的制备方法，其中，步骤(2)中，所述上清液中干物质的浓度为3％～15％；

优选地，所述上清液中干物质的浓度为5％～12％。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的小麦蛋白水解物的制备方法，其中，步骤(2)中，以谷朊粉干物质质量计，添加的酶的含量为0.2％～2.5％；优选地，添加的酶的含量为1.6％～2.5％；

优选地，步骤(2)中，酶解的条件：温度为45～60℃，pH为4.5～9.5，和/或时间为3～18h；

更优选地，步骤(2)酶解结束后进行灭酶处理；

进一步优选地，灭酶的条件为：温度为65～90℃，时间为20～60min。

10.根据权利要求5-9中任一项所述的小麦蛋白水解物的制备方法，其中，步骤(2)中，所述酶包括谷氨酰胺酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶中的一种或两种以上；

优选地，步骤(2)中，所述酶选自谷氨酰胺酶不结合或结合木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶中的任一种或两种以上的组合；

更优选地，步骤(2)中，谷氨酰胺酶占酶的质量比为0.1～1；

更进一步优选地，步骤(2)中，谷氨酰胺酶占酶的质量比为0.3～0.6。

11.根据权利要求5-10中任一项所述的小麦蛋白水解物的制备方法，其中，步骤(3)中，将酶解液过滤，然后将上清液采用膜进行分离；

优选地，所述过滤采用离心过滤或板框过滤；

更优选地，所述膜为陶瓷膜和/或有机膜；

进一步优选地，所述陶瓷膜孔径为20～200nm；和/或，有机膜膜截留分子量为500～10000Da。

12.根据权利要求5-11中任一项所述的小麦蛋白水解物的制备方法，其中，步骤(3)中，所述脱盐的方法选自大孔树脂吸附法、离子交换吸附法或电渗析法；

和/或，步骤(3)中，所述的干燥的方法选自喷雾干燥、微波真空干燥或真空冷冻干燥。

13.一种小麦蛋白水解物，其特征在于，所述麦蛋白水解物通过权利要求5-12中任一项所述的小麦蛋白水解物的制备方法制备得到。

14.权利要求1-4中任一项所述的小麦蛋白水解物或权利要求13所述的小麦蛋白水解物在食品、饮品或培养基中的应用；

优选地，所述食品包括特医食品或保健食品；

优选地，所述培养基包括发酵培养基或细胞培养基。