JP2609462B2 - ソマトメジンｃの生産方法 - Google Patents
ソマトメジンｃの生産方法Info
- Publication number
- JP2609462B2 JP2609462B2 JP63082404A JP8240488A JP2609462B2 JP 2609462 B2 JP2609462 B2 JP 2609462B2 JP 63082404 A JP63082404 A JP 63082404A JP 8240488 A JP8240488 A JP 8240488A JP 2609462 B2 JP2609462 B2 JP 2609462B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- somatomedin
- medium
- temperature
- fermentation medium
- transformed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 title claims abstract description 98
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 title claims abstract description 94
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 22
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 51
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 51
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 37
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 29
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 29
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 20
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 14
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 14
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 12
- 101150106872 rpoH gene Proteins 0.000 claims description 12
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 10
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 7
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 26
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 101150043276 Lon gene Proteins 0.000 description 10
- 101100235786 Rattus norvegicus Lonp1 gene Proteins 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- 206010061765 Chromosomal mutation Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 この発明は広く言えば組換え微生物を用いたソマトメ
ジンＣの生産方法に関し、特にソマトメジンＣをコード
（符号づけ）するDNAを含むプラスミドを有する形質転
換された大腸菌細胞を用いた高力価発酵法に関する。
ジンＣの生産方法に関し、特にソマトメジンＣをコード
（符号づけ）するDNAを含むプラスミドを有する形質転
換された大腸菌細胞を用いた高力価発酵法に関する。
インシュリン様成長因子１（IFG−１）としても知ら
れるソマトメジンＣ（SmC）は血漿および血清において
天然に存在する、70個のアミノ酸から成るポリペプチド
である。ソマトメジンＣはソマトトロピンの媒介物とし
て、成長過程において基本的な役割を果たす。ソマトメ
ジンＣは大量の血漿又は血清から少量のこのタンパク質
を抽出することによって（フィリップス等、New Englan
d J.Med.,302:371−80（1980）、ハイブリドーマ技術を
用いてモノクローナル抗体にこのタンパク質を結合させ
ることによって（ラウブリ等、F.E.B.S.Ltters,49:109
−112（1982））、又はこのタンパク質を化学的に合成
することによって（リー等、PNAS（USA）80:2216−20
（1983））生産されている。全てのこれらの技術は、少
量の、非商業的な量でしかこのタンパク質を生産でき
ず、しかも生産されるタンパク質は純粋ではない。
れるソマトメジンＣ（SmC）は血漿および血清において
天然に存在する、70個のアミノ酸から成るポリペプチド
である。ソマトメジンＣはソマトトロピンの媒介物とし
て、成長過程において基本的な役割を果たす。ソマトメ
ジンＣは大量の血漿又は血清から少量のこのタンパク質
を抽出することによって（フィリップス等、New Englan
d J.Med.,302:371−80（1980）、ハイブリドーマ技術を
用いてモノクローナル抗体にこのタンパク質を結合させ
ることによって（ラウブリ等、F.E.B.S.Ltters,49:109
−112（1982））、又はこのタンパク質を化学的に合成
することによって（リー等、PNAS（USA）80:2216−20
（1983））生産されている。全てのこれらの技術は、少
量の、非商業的な量でしかこのタンパク質を生産でき
ず、しかも生産されるタンパク質は純粋ではない。
ソマトメジンＣのような貴重な多くのタンパク質を組
換えDNA技術を用いて商業的な量生産することはこの分
野において広く知られている。これらのタンパク質の発
現は、そのタンパク質をコードするDNA配列を、強力な
プロモーター及び外来性タンパク質の発現を容易にする
他の配列を有する他コピープラスミドに組込んでクロー
ニングすることにより達成される。組換えDNA技術を用
いてソマトメジンＣのような所望のタンパク質を商業的
に大量生産することはしばしば、いくつかの宿主細胞株
を形質転換し、どの菌株が所望のタンパク質を最も高い
収率で発現しているかを決定することを包含する。さら
に、温度、圧力、栄養、発酵培地、酸素供給等の発酵プ
ロセス条件を種々変えて商業的に行ない得るレベルにま
で収率を向上させることが試みられる。
換えDNA技術を用いて商業的な量生産することはこの分
野において広く知られている。これらのタンパク質の発
現は、そのタンパク質をコードするDNA配列を、強力な
プロモーター及び外来性タンパク質の発現を容易にする
他の配列を有する他コピープラスミドに組込んでクロー
ニングすることにより達成される。組換えDNA技術を用
いてソマトメジンＣのような所望のタンパク質を商業的
に大量生産することはしばしば、いくつかの宿主細胞株
を形質転換し、どの菌株が所望のタンパク質を最も高い
収率で発現しているかを決定することを包含する。さら
に、温度、圧力、栄養、発酵培地、酸素供給等の発酵プ
ロセス条件を種々変えて商業的に行ない得るレベルにま
で収率を向上させることが試みられる。
ソマトメジンＣは組換えDNA技術を用いて生産されて
いる。しかしながら、採用されたプラスミドベクターは
一般的に融合タンパク質をコードするものであり、精製
された、活性なソマトメジンＣの収率は低かった。WO 8
5/00831は天然及び突然変異体ソマトメジンＣをコード
する人工遺伝子、β−ガラクロシダーゼ遺伝子に融合さ
れたソマトメジンＣ遺伝子を含むベクターで形質転換さ
れた微生物及びこの形質転換された微生物を用いたソマ
トメジンＣを産生する方法を開示している。しかしなが
ら、この方法により生産されるソマトメジンＣの量は少
なすぎてさらなる研究及び商業的開発のために必要な量
を提供することができない。ブエル等、Nucleic Acids
Rcsearch、13（６）:1923（1985）は、ソマトメジンＣ
をコードするDNAを含むいくつかの大腸菌株（E-coli）
を開示している。ソマトメジンＣの発現はバクテリオフ
ァージP1プロモーター及びc1857遺伝子によってコード
される温度感受性リプッレッサーによって制御される。
また、lon及びhtpR「熱ショック遺伝子」に突然変異を
有する大腸菌株を開示している。一般に、形質転換され
た細胞は28℃で一夜培養され、タンパク質の発現は培養
温度を42℃に上げることによって誘導される。
いる。しかしながら、採用されたプラスミドベクターは
一般的に融合タンパク質をコードするものであり、精製
された、活性なソマトメジンＣの収率は低かった。WO 8
5/00831は天然及び突然変異体ソマトメジンＣをコード
する人工遺伝子、β−ガラクロシダーゼ遺伝子に融合さ
れたソマトメジンＣ遺伝子を含むベクターで形質転換さ
れた微生物及びこの形質転換された微生物を用いたソマ
トメジンＣを産生する方法を開示している。しかしなが
ら、この方法により生産されるソマトメジンＣの量は少
なすぎてさらなる研究及び商業的開発のために必要な量
を提供することができない。ブエル等、Nucleic Acids
Rcsearch、13（６）:1923（1985）は、ソマトメジンＣ
をコードするDNAを含むいくつかの大腸菌株（E-coli）
を開示している。ソマトメジンＣの発現はバクテリオフ
ァージP1プロモーター及びc1857遺伝子によってコード
される温度感受性リプッレッサーによって制御される。
また、lon及びhtpR「熱ショック遺伝子」に突然変異を
有する大腸菌株を開示している。一般に、形質転換され
た細胞は28℃で一夜培養され、タンパク質の発現は培養
温度を42℃に上げることによって誘導される。
これらの方法を用いることによって、振とうフラスコ
中の100ml未満の培養液中に約300ないし500mg/1の力価
を得ることができる。
中の100ml未満の培養液中に約300ないし500mg/1の力価
を得ることができる。
これらの技術は、ソマトメジンＣを生産することに成
功したが、力価を上げ、従って発酵法により回収される
ソマトメジンＣの量を増やすことができる、組換え微生
物を用いた発酵法の必要が存在し続けている。
功したが、力価を上げ、従って発酵法により回収される
ソマトメジンＣの量を増やすことができる、組換え微生
物を用いた発酵法の必要が存在し続けている。
従って、この発明の目的は、組換え微生物からソマト
メジンＣを生産するための、高力価発酵法を提供するこ
とである。
メジンＣを生産するための、高力価発酵法を提供するこ
とである。
この発明のもう１つの目的は、ソマトメジンＣ及び温
度感受性リプレッサータンパク質をコードする遺伝子を
含む発現ベクターで形質転換された組換え微生物からソ
マトメジンＣを生産する高力価発酵法を提供することで
ある。
度感受性リプレッサータンパク質をコードする遺伝子を
含む発現ベクターで形質転換された組換え微生物からソ
マトメジンＣを生産する高力価発酵法を提供することで
ある。
これらの及びこれら以外の目的は、ソマトメジンＣを
コードするDNAを含むベクターで形質転換された組換え
大腸菌細胞からソマトメジンＣを生産する高力価発酵法
を用いることによって達成される。ソマトメジンＣの発
現は、大腸菌細胞を形質転換した第２のプラスミド上に
コードされた温度感受性リプレッサーによって制御され
る。この発明を用いることによって、約900ないし1000m
g/1の力価を得ることができ、これは従来の方法におけ
る力価の約２倍である。この発酵法は、300リットルと
いう商業的な体積にまでスケールアップすることに成功
した。
コードするDNAを含むベクターで形質転換された組換え
大腸菌細胞からソマトメジンＣを生産する高力価発酵法
を用いることによって達成される。ソマトメジンＣの発
現は、大腸菌細胞を形質転換した第２のプラスミド上に
コードされた温度感受性リプレッサーによって制御され
る。この発明を用いることによって、約900ないし1000m
g/1の力価を得ることができ、これは従来の方法におけ
る力価の約２倍である。この発酵法は、300リットルと
いう商業的な体積にまでスケールアップすることに成功
した。
この発明のソマトメジンＣの生産方法は、λファージ
プロモーターの制御下においてソマトメジンＣの発現を
司る発現ベクターと、cl857温度感受性リプレッサータ
ンパク質の発現を司る発言ベクターを含む、形質転換大
腸菌株を水系発酵培地に接種することを包含する。形質
転換された大腸菌株は、その初期増殖期においては培地
中の溶解酸素濃度を約20％ないし約60％飽和に維持し、
培地の温度を約26℃ないし30℃に維持して増殖される。
初期増殖期に続く誘導期では、発酵培地温度を約40℃に
上げて温度感受性cl857を不活性化する一方、培地中の
溶解酸素濃度を約10％ないし40％飽和に維持してソマト
メジンＣの合成を誘導する。上記工程により生産された
ソマトメジンＣは、次いでこの分野において周知の方法
により大腸菌細胞から回収される。
プロモーターの制御下においてソマトメジンＣの発現を
司る発現ベクターと、cl857温度感受性リプレッサータ
ンパク質の発現を司る発言ベクターを含む、形質転換大
腸菌株を水系発酵培地に接種することを包含する。形質
転換された大腸菌株は、その初期増殖期においては培地
中の溶解酸素濃度を約20％ないし約60％飽和に維持し、
培地の温度を約26℃ないし30℃に維持して増殖される。
初期増殖期に続く誘導期では、発酵培地温度を約40℃に
上げて温度感受性cl857を不活性化する一方、培地中の
溶解酸素濃度を約10％ないし40％飽和に維持してソマト
メジンＣの合成を誘導する。上記工程により生産された
ソマトメジンＣは、次いでこの分野において周知の方法
により大腸菌細胞から回収される。
この発明の他の目的、利点及び新規な特徴は、以下の
この発明の詳細な説明から明らかになるであろう。
この発明の詳細な説明から明らかになるであろう。
この発明のソマトメジンＣの高力価生産方法は、は、
λファージプロモーター−オペレーターの制御下におい
てソマトメジンＣの発現を司る発現ベクターと、cl857
温度感受性リプレッサータンパク質の発現を司る発現ベ
クターを含む、形質転換大腸菌株を水系発酵培地に接種
する工程と、形質転換された大腸菌株を、その初期増殖
期において培地中の溶解酸素濃度を約20％ないし約60％
飽和に維持し、培地の温度を約26℃ないし30℃に維持し
て増殖させる工程と、発酵培地の温度を約40℃に上げて
温度感受性タンパク質を不活性化し、ソマトメジンＣが
その間に発現される誘導期を開始する工程と、溶解酸素
濃度を約10％ないし約40％飽和に維持して誘導期の残り
の間、形質転換株にソマトメジンＣの発現を行なわせる
工程と、当業者に周知の手段によって形質転換された細
胞からソマトメジンＣペプチドを回収する工程とを包含
する。
λファージプロモーター−オペレーターの制御下におい
てソマトメジンＣの発現を司る発現ベクターと、cl857
温度感受性リプレッサータンパク質の発現を司る発現ベ
クターを含む、形質転換大腸菌株を水系発酵培地に接種
する工程と、形質転換された大腸菌株を、その初期増殖
期において培地中の溶解酸素濃度を約20％ないし約60％
飽和に維持し、培地の温度を約26℃ないし30℃に維持し
て増殖させる工程と、発酵培地の温度を約40℃に上げて
温度感受性タンパク質を不活性化し、ソマトメジンＣが
その間に発現される誘導期を開始する工程と、溶解酸素
濃度を約10％ないし約40％飽和に維持して誘導期の残り
の間、形質転換株にソマトメジンＣの発現を行なわせる
工程と、当業者に周知の手段によって形質転換された細
胞からソマトメジンＣペプチドを回収する工程とを包含
する。
この発明の方法において、ソマトメジンＣの発現を司
る発現ベクターは、λバクテリオファージから誘導され
たプロモーター・オペレーター領域、好ましくはλPLプ
ロモーター・オペレーター領域を含む調節領域によって
ソマトメジンＣの発現が制御される、ソマトメジンＣを
コードするいずれの適当なプラスミドであってもよい。
調節領域はシャイン−ダルガーノ領域（リボソーム結合
領域）を含んでいてもよく、これは好ましくはμバクテ
リオファージから誘導されたものである。
る発現ベクターは、λバクテリオファージから誘導され
たプロモーター・オペレーター領域、好ましくはλPLプ
ロモーター・オペレーター領域を含む調節領域によって
ソマトメジンＣの発現が制御される、ソマトメジンＣを
コードするいずれの適当なプラスミドであってもよい。
調節領域はシャイン−ダルガーノ領域（リボソーム結合
領域）を含んでいてもよく、これは好ましくはμバクテ
リオファージから誘導されたものである。
操作的に調節領域と融合された、ソマトメジンＣをコ
ードする配列は、ソマトメジンＣ又はその生物学的に活
性な断片若しくは類似体のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするDNA配列を含む。ここで、「ソマト
メジンＣ」という用語は、欠失、挿入、置換又はその他
の修飾配列を有する変異ソマトメジンＣを包含する、ソ
マトメジンＣ活性を有する全ての組換えタンパク質を包
含する。好ましくは、ソマトメジンＣをコードするプラ
スミドは、ヒトα−メチオニルソマトメジンＣのアミノ
酸配列に対応するポリペプチドをコードする。
ードする配列は、ソマトメジンＣ又はその生物学的に活
性な断片若しくは類似体のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするDNA配列を含む。ここで、「ソマト
メジンＣ」という用語は、欠失、挿入、置換又はその他
の修飾配列を有する変異ソマトメジンＣを包含する、ソ
マトメジンＣ活性を有する全ての組換えタンパク質を包
含する。好ましくは、ソマトメジンＣをコードするプラ
スミドは、ヒトα−メチオニルソマトメジンＣのアミノ
酸配列に対応するポリペプチドをコードする。
また、プラスミドは例えば抗生物質耐性遺伝子のよう
な、そのプラスミドによって形質転換された細胞の選択
のための選択可能なマーカーをコードする遺伝子を有す
ることが有利である。
な、そのプラスミドによって形質転換された細胞の選択
のための選択可能なマーカーをコードする遺伝子を有す
ることが有利である。
この発明に用いるのに好ましい発現ベクターはプラス
ミドpGB721である。第１図に示すプラスミドpGB721（PL
−μ−SmC）は、α−メチオニルソマトメジンＣポリペ
プチドをコードする。ソマトメジンＣをコードする配列
の発現は、ファージPLプロモーター・オペレーターを包
含する調節領域、μバクテリオファージから誘導された
シャイン−ダルガーノ領域、及びソマトメジンＣ配列の
５′側に隣接する開始コドン（ATG）によって制御され
る。プラスミドまたは、アンピシリン耐性の遺伝子を有
する。pGB721の製造方法及びその特徴は、ブエルの「ソ
マトメジンＣ（IGF−Ｉ）をコードする合成遺伝子の大
腸菌における発現の最適換」“Optimizing the express
ion in E.coli of a synthetic gene encoding Somatom
edin−Ｃ（IGF−Ｉ）",Nucleic Acid Res.,1923−38（1
985年６月）に開示されている。
ミドpGB721である。第１図に示すプラスミドpGB721（PL
−μ−SmC）は、α−メチオニルソマトメジンＣポリペ
プチドをコードする。ソマトメジンＣをコードする配列
の発現は、ファージPLプロモーター・オペレーターを包
含する調節領域、μバクテリオファージから誘導された
シャイン−ダルガーノ領域、及びソマトメジンＣ配列の
５′側に隣接する開始コドン（ATG）によって制御され
る。プラスミドまたは、アンピシリン耐性の遺伝子を有
する。pGB721の製造方法及びその特徴は、ブエルの「ソ
マトメジンＣ（IGF−Ｉ）をコードする合成遺伝子の大
腸菌における発現の最適換」“Optimizing the express
ion in E.coli of a synthetic gene encoding Somatom
edin−Ｃ（IGF−Ｉ）",Nucleic Acid Res.,1923−38（1
985年６月）に開示されている。
第１図に関し、ソマトメジンＣ遺伝子は、pBR322（ジ
ー・サトクリフェ、Cold Spring Harbor Symposia 197
8）の誘導体であるプラスミドpPLC24（Gene,15:81−93,
1981）上でクローニングされた。プラスミド上の点Ａは
サトクリフェ配列のヌクレオチド4180である。プラスミ
ドpBR322は、pBR322配列のヌクレオチド2067におけるPv
u IIに反時計回りに連なる。点Ａから時計回りに進むと
291塩基対（bp）のPLプロモーターと共に挿入された、T
n903からの301bp断片に連なる。EcoR I制限部位が、リ
ボソーム結合部位から開始ATGコドンまでを供給するμ
配列からのプロモーターを分断する。ATGに続く６つの
コドンはGGT、CCT、GAA、ACT、TTG及びTGCである。その
次にソマトメジンＣの７〜71位のアミノ酸をコードする
192bpが連なる。リンカーはPvu II部位をHind III部位
に転化する。
ー・サトクリフェ、Cold Spring Harbor Symposia 197
8）の誘導体であるプラスミドpPLC24（Gene,15:81−93,
1981）上でクローニングされた。プラスミド上の点Ａは
サトクリフェ配列のヌクレオチド4180である。プラスミ
ドpBR322は、pBR322配列のヌクレオチド2067におけるPv
u IIに反時計回りに連なる。点Ａから時計回りに進むと
291塩基対（bp）のPLプロモーターと共に挿入された、T
n903からの301bp断片に連なる。EcoR I制限部位が、リ
ボソーム結合部位から開始ATGコドンまでを供給するμ
配列からのプロモーターを分断する。ATGに続く６つの
コドンはGGT、CCT、GAA、ACT、TTG及びTGCである。その
次にソマトメジンＣの７〜71位のアミノ酸をコードする
192bpが連なる。リンカーはPvu II部位をHind III部位
に転化する。
この発明における、cl857温度感受性レプレッサータ
ンパク質の発現を司る発現ベクターは、PLオペレーター
を包含するファージ１遺伝子調節領域のオペレーターと
相互作用して、その調節領域におけるプロモーターから
の転写を妨げるリプレッサータンパク質をコードする遺
伝子を含む。第２図で示されるプラスミドcl857は、cl8
57温度感受性リプレッサー及びカナマイシン耐性遺伝子
をコードする多コピープラスミドである。
ンパク質の発現を司る発現ベクターは、PLオペレーター
を包含するファージ１遺伝子調節領域のオペレーターと
相互作用して、その調節領域におけるプロモーターから
の転写を妨げるリプレッサータンパク質をコードする遺
伝子を含む。第２図で示されるプラスミドcl857は、cl8
57温度感受性リプレッサー及びカナマイシン耐性遺伝子
をコードする多コピープラスミドである。
cl857にコードされたリプレッサータンパク質は、種
々の形質転換株中の組換えベクターによってコードされ
る所望のタンパク質の合成の調節に用いられている。例
えば、シー・クイーン J.Mol．and Appl.Genctics,2:1
（1983）；エイチ・クッパー、欧州特許出願公開第0 07
6 037号；及びギー・ブエル、欧州特許出願公開第0 103
395号参照のこと。これらの文献は、組換えベクターに
コードされたタンパク質の合成を調節するc1857リプレ
ッサーの使用を開示しててる。cl857遺伝子は、所望の
タンパク質をコードする遺伝子及びその発現を司るプロ
モーター−オペレーター領域を有するベクターに担持さ
れていてもよいし、宿主細胞を形質転換する別のプラス
ミド上に担持されていてもよい。所望のタンパク質の合
成は、所望の細胞密度が達成されるまで28℃ないし32℃
の温度下で形質転換宿主細胞を培養することによって抑
制することができる。次に培養温度を40℃ないし43℃に
上げて培養期間の残りを培養することによって、cl857
リプレッサーを不活性化し、すなわち所望のタンパク質
の合成を誘導する。
々の形質転換株中の組換えベクターによってコードされ
る所望のタンパク質の合成の調節に用いられている。例
えば、シー・クイーン J.Mol．and Appl.Genctics,2:1
（1983）；エイチ・クッパー、欧州特許出願公開第0 07
6 037号；及びギー・ブエル、欧州特許出願公開第0 103
395号参照のこと。これらの文献は、組換えベクターに
コードされたタンパク質の合成を調節するc1857リプレ
ッサーの使用を開示しててる。cl857遺伝子は、所望の
タンパク質をコードする遺伝子及びその発現を司るプロ
モーター−オペレーター領域を有するベクターに担持さ
れていてもよいし、宿主細胞を形質転換する別のプラス
ミド上に担持されていてもよい。所望のタンパク質の合
成は、所望の細胞密度が達成されるまで28℃ないし32℃
の温度下で形質転換宿主細胞を培養することによって抑
制することができる。次に培養温度を40℃ないし43℃に
上げて培養期間の残りを培養することによって、cl857
リプレッサーを不活性化し、すなわち所望のタンパク質
の合成を誘導する。
cl857遺伝子は、この発明の方法において、ソマトメ
ジンＣ合成を制御するために用いられる。cl857遺伝子
は宿主細胞染色体上に有ってもよいし、ソマトメジンＣ
をコードするプラスミド又は第２のプラスミド上にあっ
てもよい。この発明の好ましい具体例では、宿主はソマ
トメジンＣをコードするプラスミド及びcl857リプレッ
サータンパク質の発現を司る第２のプラスミドによって
形質転換される。PLプロモーター・オペレーターを相互
作用するcl857リプレッサーは、37℃という低い温度で
も、振とうフラスコ培養物中に塊状物が形成されること
（ソマトメジンＣの合成を示す）からも明らかなよう
に、ある程度は不活性化される。しかしながら、最良の
結果は、温度を40℃に上げ、発酵の残りを40℃に行なう
ことによって達成される。
ジンＣ合成を制御するために用いられる。cl857遺伝子
は宿主細胞染色体上に有ってもよいし、ソマトメジンＣ
をコードするプラスミド又は第２のプラスミド上にあっ
てもよい。この発明の好ましい具体例では、宿主はソマ
トメジンＣをコードするプラスミド及びcl857リプレッ
サータンパク質の発現を司る第２のプラスミドによって
形質転換される。PLプロモーター・オペレーターを相互
作用するcl857リプレッサーは、37℃という低い温度で
も、振とうフラスコ培養物中に塊状物が形成されること
（ソマトメジンＣの合成を示す）からも明らかなよう
に、ある程度は不活性化される。しかしながら、最良の
結果は、温度を40℃に上げ、発酵の残りを40℃に行なう
ことによって達成される。
この発明における形質転換宿主細胞は、細胞内プロテ
アーゼ濃度に影響を与える突然変異を有するいずれの形
質転換可能な大腸菌であってもよい。プロテアーゼに損
傷を有する菌株は、lon遺伝子及びhtpR遺伝子に突然変
異を有するものを包含する。
アーゼ濃度に影響を与える突然変異を有するいずれの形
質転換可能な大腸菌であってもよい。プロテアーゼに損
傷を有する菌株は、lon遺伝子及びhtpR遺伝子に突然変
異を有するものを包含する。
この発明の方法において用いられる好ましい形質転換
株は大腸菌SG936（PL−μ−SmC及びpcl857）である。こ
の菌株は二重突然変異（すなわちlon −及びhtpR −）で
あるので、プロテアーゼ濃度が低く、ソマトメジンＣの
ようなペプチドの産生が可能になる。両方のプラスミド
で形質転換された大腸菌SG936は、アンピシリン及びカ
ナマイシンの両方が転化されたルリア肉汁中で生育する
ことにより、例えば欧州特許出願公開0 103 395号に記
載された方法のような、この分野において周知の方法を
用いて選択することができる。大腸菌SG936（PL−μ−S
mC及びpcl857）は、メリーランド州ロックビルのアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されて
おり、その受託番号は53551（ATCC 53551）である。出
願人は、米国特許の発行後、上記プラスミドを含む寄託
した微生物が自由に公衆に提供されるべきことを上記受
託番号を示して指示した。もっとも、この発明の方法
は、ソマトメジンＣの発現がcl857遺伝子にコードされ
たリプレッサータンパク質の制御下にある、他の形質転
換株を用いても同様にソマトメジンＣの高力価生産を達
成することを適用することができる。
株は大腸菌SG936（PL−μ−SmC及びpcl857）である。こ
の菌株は二重突然変異（すなわちlon −及びhtpR −）で
あるので、プロテアーゼ濃度が低く、ソマトメジンＣの
ようなペプチドの産生が可能になる。両方のプラスミド
で形質転換された大腸菌SG936は、アンピシリン及びカ
ナマイシンの両方が転化されたルリア肉汁中で生育する
ことにより、例えば欧州特許出願公開0 103 395号に記
載された方法のような、この分野において周知の方法を
用いて選択することができる。大腸菌SG936（PL−μ−S
mC及びpcl857）は、メリーランド州ロックビルのアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されて
おり、その受託番号は53551（ATCC 53551）である。出
願人は、米国特許の発行後、上記プラスミドを含む寄託
した微生物が自由に公衆に提供されるべきことを上記受
託番号を示して指示した。もっとも、この発明の方法
は、ソマトメジンＣの発現がcl857遺伝子にコードされ
たリプレッサータンパク質の制御下にある、他の形質転
換株を用いても同様にソマトメジンＣの高力価生産を達
成することを適用することができる。
形質転換株は、発酵器中に含まれた水系培地に接種さ
れる。水系培地は、大腸菌の高密度生育を支持するのに
適当ないかなる培地であってもよい。培地は炭素源、窒
素源、塩及び細胞の生育に必要な他の栄養をも含む。適
当な炭素源はとりわけグリセロール及び水和グルコース
（セレロースとして市販されている）を包含する。適当
な窒素源は、とりわけカゼインの酸加水分解物（ハイケ
ースアミノ酸又はカザミノ酸として市販されている）、
カゼインの酵素加水分解物（NZアミンＡ、カサトン、ト
リプトン）、アンベレックス510、野菜から誘導された
加水分解タンパク質（大豆ペプトン、加水分解トウモロ
コシグルテン、綿実ペプトン）、肉ペプトン、及び酵母
抽出物を包含する。上記炭素源及び窒素源は、単に公知
の市販のものを例示しただけである。この発明において
用いるのに適当な発酵培地は表４に示されている。他の
適当な炭素源及び窒素源は当業者にとって明らかであろ
う。
れる。水系培地は、大腸菌の高密度生育を支持するのに
適当ないかなる培地であってもよい。培地は炭素源、窒
素源、塩及び細胞の生育に必要な他の栄養をも含む。適
当な炭素源はとりわけグリセロール及び水和グルコース
（セレロースとして市販されている）を包含する。適当
な窒素源は、とりわけカゼインの酸加水分解物（ハイケ
ースアミノ酸又はカザミノ酸として市販されている）、
カゼインの酵素加水分解物（NZアミンＡ、カサトン、ト
リプトン）、アンベレックス510、野菜から誘導された
加水分解タンパク質（大豆ペプトン、加水分解トウモロ
コシグルテン、綿実ペプトン）、肉ペプトン、及び酵母
抽出物を包含する。上記炭素源及び窒素源は、単に公知
の市販のものを例示しただけである。この発明において
用いるのに適当な発酵培地は表４に示されている。他の
適当な炭素源及び窒素源は当業者にとって明らかであろ
う。
宿主細胞によるプラスミドの繊維に必要なあらゆる成
分が培地に加えられる。例えば、この発明に従って、大
腸菌SG936（PL−μ−SmC及びpcl857）が発酵器中で生育
される場合には、抗生物質アンピシリン及びカナマイシ
ンが添加される。
分が培地に加えられる。例えば、この発明に従って、大
腸菌SG936（PL−μ−SmC及びpcl857）が発酵器中で生育
される場合には、抗生物質アンピシリン及びカナマイシ
ンが添加される。
形質転換株の培養物は発酵器中に接種される。培養物
は予め、撹拌（例えば200rpm）しながら８ないし24時間
（すなわち、550ナノメーターにおける吸光度A550が４
ないし６になるまで）インキュベートすることが有利で
ある。培養物は例えばルリア肉汁のような、いずれの適
当な培地中でも生育することができる。発酵器に接種さ
れる培養物の体積は0.5ないし5.0％（vol/vol）、好ま
しくは約2.0％（vol/vol）である。
は予め、撹拌（例えば200rpm）しながら８ないし24時間
（すなわち、550ナノメーターにおける吸光度A550が４
ないし６になるまで）インキュベートすることが有利で
ある。培養物は例えばルリア肉汁のような、いずれの適
当な培地中でも生育することができる。発酵器に接種さ
れる培養物の体積は0.5ないし5.0％（vol/vol）、好ま
しくは約2.0％（vol/vol）である。
この発明では、高力価発酵は２つの段階で行なわれ
る。形質転換株を発酵培地に接種した後、初期増殖期
は、培地中に溶解された酸素の濃度を約20−％ないし約
60℃飽和、好ましくは約50％飽和に維持して行なう。こ
れは、適当ないずれかの機械的手段により発酵培地を撹
拌しながら、溶解酸素濃度を所望レベルに維持するのに
十分な速度で大気を発酵培地中に供給することによって
達成することができる。空気を、液体の体積に対して毎
分0.8ないし1.2、好ましくは約1.0体積（標準温度）の
流速で供給し、培地を800ないし1200rpm、好ましくは約
1000rpmで撹拌することが好ましい。撹拌機は、100ガロ
ンの発酵培地当たり約0.5ないし2.0馬力の入力電源のモ
ーターによって駆動されるものが好ましい。
る。形質転換株を発酵培地に接種した後、初期増殖期
は、培地中に溶解された酸素の濃度を約20−％ないし約
60℃飽和、好ましくは約50％飽和に維持して行なう。こ
れは、適当ないずれかの機械的手段により発酵培地を撹
拌しながら、溶解酸素濃度を所望レベルに維持するのに
十分な速度で大気を発酵培地中に供給することによって
達成することができる。空気を、液体の体積に対して毎
分0.8ないし1.2、好ましくは約1.0体積（標準温度）の
流速で供給し、培地を800ないし1200rpm、好ましくは約
1000rpmで撹拌することが好ましい。撹拌機は、100ガロ
ンの発酵培地当たり約0.5ないし2.0馬力の入力電源のモ
ーターによって駆動されるものが好ましい。
初期増殖期における培地の温度は、大腸菌の生育が支
持されるがcl857リプレッサータンパク質が活性で従っ
て形質転換株中のソマトメジンＣの発現が抑制される温
度であればよい。初期増殖期の間、温度は好ましくは26
℃ないし30℃、最も好ましくは約28℃に維持される。
持されるがcl857リプレッサータンパク質が活性で従っ
て形質転換株中のソマトメジンＣの発現が抑制される温
度であればよい。初期増殖期の間、温度は好ましくは26
℃ないし30℃、最も好ましくは約28℃に維持される。
初期増殖期は、細胞密度が約25ないし35、好ましくは
約30A550を達成するまで続けられる。これは一般に、発
酵培地への接種後約14ないし20時間で達成される。
約30A550を達成するまで続けられる。これは一般に、発
酵培地への接種後約14ないし20時間で達成される。
この時点で、第２の発酵階段、すわち誘導期が開始さ
れる。発酵培地の温度を約40℃に上げ、この温度で約３
ないし８時間、好ましくは約４ないし５時間維持する。
この高温度によりcl857リプレッサータンパク質が不活
性化され、形質転換株中のソマトメジンＣの発現が誘導
される。
れる。発酵培地の温度を約40℃に上げ、この温度で約３
ないし８時間、好ましくは約４ないし５時間維持する。
この高温度によりcl857リプレッサータンパク質が不活
性化され、形質転換株中のソマトメジンＣの発現が誘導
される。
培地中の溶媒酸素濃度は、誘導期の間、約10％ないし
40％飽和に維持される。この溶解酸素濃度を維持するた
めに、いずれの適当な通気手段及び撹拌手段をも採用す
ることができる。この発明の好ましい具体例では、空気
を、液体の体積に対して毎分0.8ないし1.2、好ましくは
約1.0体積（標準温度）の流速で供給し、培地を800ない
し1200rpm、好ましくは約1000rpmで撹拌する。撹拌機
は、100ガロンの発酵培地当たり約0.5ないし2.0馬力の
モーターによって駆動されるものが好ましい。誘導期に
は酸素消費速度が高まるので、所望の溶解酸素濃度を維
持するために、発酵器中に酸素を供給することにより、
大気中に存在する酸素を補給することが好ましい。発酵
培地に酸素を供給するための従来のいかなる手段をも採
用することができる。例えば、酸素源に連結されたスパ
ージャーを直接培地中に挿入することもできるし、発酵
器中に供給される大気に酸素を加えることもできる。
40％飽和に維持される。この溶解酸素濃度を維持するた
めに、いずれの適当な通気手段及び撹拌手段をも採用す
ることができる。この発明の好ましい具体例では、空気
を、液体の体積に対して毎分0.8ないし1.2、好ましくは
約1.0体積（標準温度）の流速で供給し、培地を800ない
し1200rpm、好ましくは約1000rpmで撹拌する。撹拌機
は、100ガロンの発酵培地当たり約0.5ないし2.0馬力の
モーターによって駆動されるものが好ましい。誘導期に
は酸素消費速度が高まるので、所望の溶解酸素濃度を維
持するために、発酵器中に酸素を供給することにより、
大気中に存在する酸素を補給することが好ましい。発酵
培地に酸素を供給するための従来のいかなる手段をも採
用することができる。例えば、酸素源に連結されたスパ
ージャーを直接培地中に挿入することもできるし、発酵
器中に供給される大気に酸素を加えることもできる。
誘導期は、A550が約35ないし45、好ましくは約40の細
胞密度になるまで続けられる。これらの細胞密度は一般
的に誘導期の開始後約３ないし８時間で達成される。細
胞増殖及びソマトメジンＣ発現が完了したことを示すパ
ラメーターは、（１）酸素要求が有意に減少する、
（２）細胞密度（A550値）がさらに増大しない及び
（３）pH制御のためのNaOH（塩基）が停止することを包
含する。
胞密度になるまで続けられる。これらの細胞密度は一般
的に誘導期の開始後約３ないし８時間で達成される。細
胞増殖及びソマトメジンＣ発現が完了したことを示すパ
ラメーターは、（１）酸素要求が有意に減少する、
（２）細胞密度（A550値）がさらに増大しない及び
（３）pH制御のためのNaOH（塩基）が停止することを包
含する。
細胞増殖の間に発酵培地から枯渇した栄養素は、この
分野において知られたいずれかの方法により補給され
る。栄養素は発酵期間中連続的に又は一時に加えること
ができる。好ましくは、栄養素は、温度を上げて誘導期
を開始する直前、通常、接種後約14ないし20時間に加え
られる。
分野において知られたいずれかの方法により補給され
る。栄養素は発酵期間中連続的に又は一時に加えること
ができる。好ましくは、栄養素は、温度を上げて誘導期
を開始する直前、通常、接種後約14ないし20時間に加え
られる。
加えられる栄養素は、選択される発酵培地の組成に依
存するが、一般的に炭素源及び窒素源を含む。供給され
る栄養素は、同重量のグリセロール、酵母抽出物酸素、
カゼイン加水分解物、好ましくはNZアミンＡ及びA510酵
母抽出物を包含するのが有利である。好ましくは、供給
物は発酵器中の培地１リットル当たり、組み合された栄
養素を合計で約45ないし60グラム含む。１リットルの水
中にそれぞれ約200グラムのNZアミンＡ、A510酵母抽出
物及びグリセロールを含むものを、温度を上げて誘導期
を開始する直前に発酵培地９リットルに加えることによ
って優れた結果が得られた。
存するが、一般的に炭素源及び窒素源を含む。供給され
る栄養素は、同重量のグリセロール、酵母抽出物酸素、
カゼイン加水分解物、好ましくはNZアミンＡ及びA510酵
母抽出物を包含するのが有利である。好ましくは、供給
物は発酵器中の培地１リットル当たり、組み合された栄
養素を合計で約45ないし60グラム含む。１リットルの水
中にそれぞれ約200グラムのNZアミンＡ、A510酵母抽出
物及びグリセロールを含むものを、温度を上げて誘導期
を開始する直前に発酵培地９リットルに加えることによ
って優れた結果が得られた。
この発明の方法に用いられる発酵培地のpHは、適当な
塩基、好ましくはNaOHを用いて約6.5ないし7.0に維持さ
れる。
塩基、好ましくはNaOHを用いて約6.5ないし7.0に維持さ
れる。
培地の温度を制御する手段、培地を撹拌し通気するた
めの手段、pHを制御するための手段及び取り込み空気に
酸素を提供する手段を有するものであれば、公知のいか
なる発酵設備も用いることができる。
めの手段、pHを制御するための手段及び取り込み空気に
酸素を提供する手段を有するものであれば、公知のいか
なる発酵設備も用いることができる。
この発明において有用な典型的な発酵パラメーターが
表２に示されている。これらのパラメーターは好ましい
大腸菌SG936株に対して特に有用である。
表２に示されている。これらのパラメーターは好ましい
大腸菌SG936株に対して特に有用である。
形質転換株によって生産されたソマトメジンＣはこの
分野において知られたいかなる適当な手段によっても回
収することができる。細胞は例えば遠心することによっ
て発酵培地から収穫される。次いで細胞は、適当な酵素
的、化学的又は機械的手段、例えば音波処理、フレンチ
プレス、リゾチーム又はトリトンＸ−100のような界面
活性剤処理を用いることにより破壊される。ソマトメジ
ンＣは、アフィニティクロマトグラフィー、硫酸アンモ
ニウムのような塩溶液からの選択的沈澱、イオン交換ク
ロマトグラフィー、等電点電気泳動及びこれらの組合せ
並びに適当な方法を包含するいずれの適当なタンパク質
精製方法によっても細胞破壊物から精製することができ
る。
分野において知られたいかなる適当な手段によっても回
収することができる。細胞は例えば遠心することによっ
て発酵培地から収穫される。次いで細胞は、適当な酵素
的、化学的又は機械的手段、例えば音波処理、フレンチ
プレス、リゾチーム又はトリトンＸ−100のような界面
活性剤処理を用いることにより破壊される。ソマトメジ
ンＣは、アフィニティクロマトグラフィー、硫酸アンモ
ニウムのような塩溶液からの選択的沈澱、イオン交換ク
ロマトグラフィー、等電点電気泳動及びこれらの組合せ
並びに適当な方法を包含するいずれの適当なタンパク質
精製方法によっても細胞破壊物から精製することができ
る。
この発明の高力価発酵方法は、900ないし1000mg/1の
ソマトメジンＣを生産した。これは、300リットルの商
業規模の発酵器でも達成することができた。これは、小
さな体積スケールにおける従来の方法により得られるソ
マトメジンＣの報告された力価である100ないし500mg/1
の約２倍であり、また、小さなスケールで生産されたも
のについてのSDS−PAGEに基いた生産量の約２倍であ
る。
ソマトメジンＣを生産した。これは、300リットルの商
業規模の発酵器でも達成することができた。これは、小
さな体積スケールにおける従来の方法により得られるソ
マトメジンＣの報告された力価である100ないし500mg/1
の約２倍であり、また、小さなスケールで生産されたも
のについてのSDS−PAGEに基いた生産量の約２倍であ
る。
この発明を一般的に記載したが、以下の実施例はこの
発明の特定の具体例として、この発明の実施及び利点を
例示する。実施例は、例示のためにのみ示されるもので
あり、この発明の範囲をいずれの意味においても限定す
るものではない。
発明の特定の具体例として、この発明の実施及び利点を
例示する。実施例は、例示のためにのみ示されるもので
あり、この発明の範囲をいずれの意味においても限定す
るものではない。
実施例 １ pGB721及びpCI857プラスミドで形質転換した大腸菌HB
101株及びSG936株を用いて比較発酵試験を行なった。SG
936株はlon及びhtpRに染色体突然変異を有しており、そ
の結果、lon ＋、htpR ＋大腸菌に比べて細胞内プロテア
ーゼ濃度が低い。SG936株のようなプロテアーゼが損傷
された菌株内における方が、タンパク質分解により生産
量が低くなるHB101株のようなlon ＋、htpR ＋株内で発現
された場合よりもソマトメジンＣの蓄積量が多くなるも
のと仮定された。
101株及びSG936株を用いて比較発酵試験を行なった。SG
936株はlon及びhtpRに染色体突然変異を有しており、そ
の結果、lon ＋、htpR ＋大腸菌に比べて細胞内プロテア
ーゼ濃度が低い。SG936株のようなプロテアーゼが損傷
された菌株内における方が、タンパク質分解により生産
量が低くなるHB101株のようなlon ＋、htpR ＋株内で発現
された場合よりもソマトメジンＣの蓄積量が多くなるも
のと仮定された。
野生型及びプロテアーゼ損傷大腸菌内におけるソマト
メジンＣの発現を比較するために、９リットルの複合培
地を含むミクロゲン発酵器中で28℃で菌株を培養した。
A550の細胞密度が36の時に、新鮮な栄養素を加え、α−
メチオニルソマトメジンＣを誘導するための発酵器の温
度を42℃に上げた。
メジンＣの発現を比較するために、９リットルの複合培
地を含むミクロゲン発酵器中で28℃で菌株を培養した。
A550の細胞密度が36の時に、新鮮な栄養素を加え、α−
メチオニルソマトメジンＣを誘導するための発酵器の温
度を42℃に上げた。
大腸菌HB101株の場合と異なり、lon −及びhtpR −であ
る宿主SG936は、誘導後約２〜４時間で1000倍の倍率で
見ることができる凝集したソマトメジンＣの、屈折率の
異なる塊が生産された。大腸菌SG936により生産された
バイオマスの量（全細胞の湿潤重量519g）は、HB101菌
株のそれ（湿潤重量885g）よりも少なかったが、ゲルろ
過クロマトグラフィー分析又はSDS−PAGEによる分析に
よって示された検出可能なソマトメジンＣの量はSG936
株における方が多かった。大腸菌HB101株とSG936株にお
けるソマトメジンＣの発現の比較は表１にまとめられて
いる。
る宿主SG936は、誘導後約２〜４時間で1000倍の倍率で
見ることができる凝集したソマトメジンＣの、屈折率の
異なる塊が生産された。大腸菌SG936により生産された
バイオマスの量（全細胞の湿潤重量519g）は、HB101菌
株のそれ（湿潤重量885g）よりも少なかったが、ゲルろ
過クロマトグラフィー分析又はSDS−PAGEによる分析に
よって示された検出可能なソマトメジンＣの量はSG936
株における方が多かった。大腸菌HB101株とSG936株にお
けるソマトメジンＣの発現の比較は表１にまとめられて
いる。
SG936株中のソマトメジンＣは、破壊細胞から遠心に
よって容易に回収される凝集塊として存在する。ソマト
メジンＣ封入体を回収するために細菌をリゾチームで処
理し、600psiの圧力でマントン−ガウリンホモジナイザ
ーを４往復させることによって細胞を破砕した。ソマト
メジンＣ封入体は14,300×ｇで20分間遠心することによ
って回収し、粗ペレットを500mlのトリス緩衝液（100mM
Tris−Cl,ph 7.5,0.5mM DTT,0.5mm PMSF）に再懸濁し
た。封入体は、その後の生物学的に活性なソマトメジン
Ｃの回収及び精製に用いるために洗わずに−80℃で冷凍
した。
よって容易に回収される凝集塊として存在する。ソマト
メジンＣ封入体を回収するために細菌をリゾチームで処
理し、600psiの圧力でマントン−ガウリンホモジナイザ
ーを４往復させることによって細胞を破砕した。ソマト
メジンＣ封入体は14,300×ｇで20分間遠心することによ
って回収し、粗ペレットを500mlのトリス緩衝液（100mM
Tris−Cl,ph 7.5,0.5mM DTT,0.5mm PMSF）に再懸濁し
た。封入体は、その後の生物学的に活性なソマトメジン
Ｃの回収及び精製に用いるために洗わずに−80℃で冷凍
した。
実施例 ２ ソマトメジンＣの発明は、λ−C1857遺伝子によって
コードされる温度感受性リプレッサーにより制御され
る。HB101株のような多くのlon+、htpR ＋大腸菌におい
て、発現の誘導にとっての至適温度は42℃ないし45℃で
ある。SG936株は大腸菌における熱ショック応答を制御
するhtpRが損傷されているので、高温誘導下におけるこ
の菌株の増殖能力及びソマトメジンＣを生産する能力を
調べた。吸光度（A550）の増加により測定される増殖と
ゲルろ過によって測定されるソマトメジンＣの生産量を
40℃ないし42℃の誘導温度において比較した。結果を表
２に示す。振盪フラスコ及び10リットルの発酵器で繰り
返し試験したところ、誘導温度として40℃を採用した方
が、大腸菌HB101株の外来性タンパク質の発現の至適温
度である42℃ないし45℃を採用した場合よりもソマトメ
ジンＣの発現量が多かった。
コードされる温度感受性リプレッサーにより制御され
る。HB101株のような多くのlon+、htpR ＋大腸菌におい
て、発現の誘導にとっての至適温度は42℃ないし45℃で
ある。SG936株は大腸菌における熱ショック応答を制御
するhtpRが損傷されているので、高温誘導下におけるこ
の菌株の増殖能力及びソマトメジンＣを生産する能力を
調べた。吸光度（A550）の増加により測定される増殖と
ゲルろ過によって測定されるソマトメジンＣの生産量を
40℃ないし42℃の誘導温度において比較した。結果を表
２に示す。振盪フラスコ及び10リットルの発酵器で繰り
返し試験したところ、誘導温度として40℃を採用した方
が、大腸菌HB101株の外来性タンパク質の発現の至適温
度である42℃ないし45℃を採用した場合よりもソマトメ
ジンＣの発現量が多かった。
実施例 ３ pcl857＋pGB721で形質転換された大腸菌SG936株にお
けるソマトメジンＣの生産に対する数種類の生育培地及
び誘導培地の効果を評価した。基本培地に異なる量のカ
ゼイン酸素加水分解物（NZA−Ａ）、酸加水分解物（ハ
イケース）及び酵母抽出物（アンベレックス510）を基
本培地に加えた。ソマトメジンＣの生産は12％〜20％の
直線勾配ゲル及びゲルろ過クロマトグラフィーにより評
価した。基本培地に酵母抽出物を加えることは大腸菌SG
936の増殖を促進することが示された。同様に、酵母抽
出物の誘導培地への添加により表３に示すように培養物
１リットル当たりのソマトメジンＣの生産量が２倍にな
った。
けるソマトメジンＣの生産に対する数種類の生育培地及
び誘導培地の効果を評価した。基本培地に異なる量のカ
ゼイン酸素加水分解物（NZA−Ａ）、酸加水分解物（ハ
イケース）及び酵母抽出物（アンベレックス510）を基
本培地に加えた。ソマトメジンＣの生産は12％〜20％の
直線勾配ゲル及びゲルろ過クロマトグラフィーにより評
価した。基本培地に酵母抽出物を加えることは大腸菌SG
936の増殖を促進することが示された。同様に、酵母抽
出物の誘導培地への添加により表３に示すように培養物
１リットル当たりのソマトメジンＣの生産量が２倍にな
った。
実施例 ４ 振盪フラスコ及び10リットル発酵器における培地最適
化試験により、酵母抽出物を基本培地に加えることは、
大腸菌SG936株の良好な生育（A550＝30−40）を支持す
る上において、カゼイン加水分解物に代り得ることが示
された。酵母抽出物及びカゼイン加水分解物が誘導培地
中に用いられた場合にソマトメジンＣの力価が最も高く
なる（1,000−2,000mg/l）ことが示された。同様に、再
現性のあるソマトメジンＣ生産を伴なう一貫した発酵プ
ロセスは、濃厚な種培地を用いて、発酵操作のための一
次接種物を調整した場合に確保される。
化試験により、酵母抽出物を基本培地に加えることは、
大腸菌SG936株の良好な生育（A550＝30−40）を支持す
る上において、カゼイン加水分解物に代り得ることが示
された。酵母抽出物及びカゼイン加水分解物が誘導培地
中に用いられた場合にソマトメジンＣの力価が最も高く
なる（1,000−2,000mg/l）ことが示された。同様に、再
現性のあるソマトメジンＣ生産を伴なう一貫した発酵プ
ロセスは、濃厚な種培地を用いて、発酵操作のための一
次接種物を調整した場合に確保される。
大腸菌SG936株は２つの部位（lon及びhtpR）において
染色体突然変異を有するので、発酵によるソマトメジン
Ｃの生産の一貫性は、一次種培養物を調整する前に復帰
体を定型的に調べることにより確保される。培養物の保
存のためには、大腸菌SG936の細胞は10％グリセロール
中で−80℃において、又は液体窒素中で保存することが
できる。貯蔵培養物をLB寒天培地上に画線培養し、プレ
ートを30℃及び42℃でインキュベートして復帰体を調べ
る。単一コロニー単離体を30℃でインキュベートされた
プレートから採り、種培地の一次種フラスコに接種す
る。
染色体突然変異を有するので、発酵によるソマトメジン
Ｃの生産の一貫性は、一次種培養物を調整する前に復帰
体を定型的に調べることにより確保される。培養物の保
存のためには、大腸菌SG936の細胞は10％グリセロール
中で−80℃において、又は液体窒素中で保存することが
できる。貯蔵培養物をLB寒天培地上に画線培養し、プレ
ートを30℃及び42℃でインキュベートして復帰体を調べ
る。単一コロニー単離体を30℃でインキュベートされた
プレートから採り、種培地の一次種フラスコに接種す
る。
大腸菌SG936株は２つの部位（lon及びhtpR）において
染色体突然変異を有するので、発酵によるソマトメジン
Ｃの生産の一貫性は、一次種培養物を調整する前に復帰
体を定型的に調べることにより確保される。培養物の保
存のためには、大腸菌SG936の細胞は10％グリセロール
中で−80℃において、又は液体窒素中で保存することが
できる。貯蔵培養物をLB寒天培地上に画線培養し、プレ
ートを30℃及び42℃でインキュベートして復帰体を調べ
る。単一コロニー単離体を30℃でインキュベートされた
プレートから採り、種培地の一次種フラスコに接種す
る。
染色体突然変異を有するので、発酵によるソマトメジン
Ｃの生産の一貫性は、一次種培養物を調整する前に復帰
体を定型的に調べることにより確保される。培養物の保
存のためには、大腸菌SG936の細胞は10％グリセロール
中で−80℃において、又は液体窒素中で保存することが
できる。貯蔵培養物をLB寒天培地上に画線培養し、プレ
ートを30℃及び42℃でインキュベートして復帰体を調べ
る。単一コロニー単離体を30℃でインキュベートされた
プレートから採り、種培地の一次種フラスコに接種す
る。
接種物、発酵器中でのSG936の生育培地及びソマトメ
ジンＣの誘導培地を調整するための組成が表４に示され
ている。pH、通気及び温度を制御するための発酵操作パ
ラメーターが表５に示されている。
ジンＣの誘導培地を調整するための組成が表４に示され
ている。pH、通気及び温度を制御するための発酵操作パ
ラメーターが表５に示されている。
表 ４ 生 育 培 地 （g/L） アンベレックス510酵母抽出物 35.0 グリセロール 30.0 （NH4）2SO4 5.0 K2HPO4 6.0 NaH3PO4 3.0 クエン酸ナトリウム 1.0 MgSO4（無水物） 1.7 微量元素 20 ml アンピシリン 100 Ng/ml カナマイシン 50 Ng/ml Ｋ−67 5ml/9リツトル 誘導培地 グリセロール 100g NZA−Ａ 100g Ａ−510酵母抽出物 100g 種培地（g/L） NZA−Ａ 20.0 Ａ−510酵母抽出物 3.0 グリセロール 20.0 （NH4）2SO4 5.0 K2HPO4 6.0 NaH2PO4 3.0 クエン酸ナトリウム 1.0 MgSO4（無水物） 1.7 微量元素 20 ml アンピシリン 100 Ng/ml カナマイシン 50 Ng/ml 微量元素（g/蒸留水１） EDTA（ニナトリウム塩） 5.00 FeCl3.6H2O 0.50 ZnO 0.05 CuCl2.2H2O 0.01 CoNO3.6H2O 0.01 モリブデン酸アンモニウム 0.01 表 ５ 発酵パラメータ 〜 pH:6.7（20％NaOHで制御） 空気:10リットル／分（必要に応じて増加） 撹拌:1000rpm 温度:28℃（生育） 40℃（誘導） 背圧 3psi 溶存酸素 10％以上に維持。
誘導期間の間、発酵器は溶存酸素10％以上を維持する
ように酸素が富化される。
ように酸素が富化される。
第１図はこの発明の方法に用いることができるソマトメ
ジンＣ発現ベクターであるプラスミドpGB721の特徴を示
す図、 第２図はこの発明においてソマトメジンＣ生産を制御す
るために用いられる温度感受性リプレッサーをコードす
る発現ベクターであるプラスミドpcl857の特徴を示す図
である。
ジンＣ発現ベクターであるプラスミドpGB721の特徴を示
す図、 第２図はこの発明においてソマトメジンＣ生産を制御す
るために用いられる温度感受性リプレッサーをコードす
る発現ベクターであるプラスミドpcl857の特徴を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−65698（ＪＰ，Ａ) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．13，Ｎｏ．６, Ｐ．1923−1938（1985)
Claims (17)
- 【請求項１】λファージプロモーター・オペレーターの
制御下においてソマトメジンＣの発現を司る発現ベクタ
ーと、c1857温度感受性リプレッサータンパク質の発現
を司る発現ベクターを含む、lon-及びhtpR-である形質
転換大腸菌株を水系発酵培地に接種する工程と、 形質転換された大腸菌株を、その初期増殖期において培
地中の溶解酸素濃度を約20％ないし約60％飽和に維持
し、培地の温度を約26℃ないし30℃に維持して増殖させ
る工程と、 発酵培地の温度を約40℃に上げて温度感受性タンパク質
を不活性化し、ソマトメジンＣがその間に発現される誘
導期を開始する工程と、 溶解酸素濃度を約10％ないし約40％飽和に維持して誘導
期の残りの間、形質転換株にソマトメジンＣの発現を行
なわせる工程と、 形質転換された細胞からソマトメジンＣペプチドを回収
する工程とを有するソマトメジンＣの生産方法。 - 【請求項２】形質転換された菌株は大腸菌SG936株（ATC
C 53551）である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】初期増殖期の間、培地の温度は約28℃に維
持される請求項１記載の方法。 - 【請求項４】初期増殖期の間、培地中の溶解酸素の濃度
は約50％飽和に維持される請求項１記載の方法。 - 【請求項５】初期増殖期は約14ないし20時間である請求
項１記載の方法。 - 【請求項６】初期増殖期は約16時間である請求項１記載
の方法。 - 【請求項７】誘導期は約３ないし８時間である請求項１
記載の方法。 - 【請求項８】発酵培地中の細菌密度がA550で表して50な
いし60になった時に培地の温度を約40℃に上げてソマト
メジンＣの生産を誘導する請求項１記載の方法。 - 【請求項９】培地の温度を上げて誘導期を開始する直前
に栄養素を加える請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】栄養素は酵母抽出物を含む請求項９記載
の方法。 - 【請求項１１】発酵培地１リットル当たり約45ないし60
グラムの栄養素が加えられる請求項９記載の方法。 - 【請求項１２】栄養素はほぼ等重量のグリセロール、酵
母抽出物及び酵素カゼイン加水分解物を含む請求項11記
載の方法。 - 【請求項１３】初期増殖期における溶解酸素濃度は、液
体の体積に対して標準温度下の体積に換算して毎分約0.
8ないし1.2体積の大気を発酵器に供給し、発酵培地100
ガロン当たり約0.5ないし2.0馬力の電源入力を有する撹
拌機で約1000rpmで発酵培地を機械的に撹拌することに
よって維持される請求項１記載の方法。 - 【請求項１４】大気は液体の体積に対して毎分約1.0体
積の速度で発酵器に供給される請求項13記載の方法。 - 【請求項１５】誘導期における溶解酸素濃度は、発酵器
に供給される空気に酸素を加えることによって約10％な
いし40％に維持される請求項１記載の方法。 - 【請求項１６】誘導期における溶解酸素濃度は、液体の
体積に対して標準温度下の体積に換算して毎分約0.8な
いし1.2体積の、酸素が添加された大気を発酵器に供給
し、発酵培地100ガロン当たり約0.5ないし2.0馬力の電
源入力を有する撹拌機で約1000rpmで発酵培地を機械的
に撹拌することによって維持される請求項15記載の方
法。 - 【請求項１７】大気は液体の体積に対して毎分約1.0体
積の速度で発酵器に供給される請求項16記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US34847 | 1987-04-06 | ||
| US07/034,847 US5104796A (en) | 1987-04-06 | 1987-04-06 | High titer production of human somatomedin c |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6420098A JPS6420098A (en) | 1989-01-24 |
| JP2609462B2 true JP2609462B2 (ja) | 1997-05-14 |
Family
ID=21878973
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63082404A Expired - Lifetime JP2609462B2 (ja) | 1987-04-06 | 1988-04-05 | ソマトメジンｃの生産方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5104796A (ja) |
| EP (1) | EP0286345B1 (ja) |
| JP (1) | JP2609462B2 (ja) |
| KR (1) | KR960011523B1 (ja) |
| AT (1) | ATE98654T1 (ja) |
| AU (1) | AU607986B2 (ja) |
| DE (1) | DE3886250T2 (ja) |
| ES (1) | ES2047544T3 (ja) |
| NZ (1) | NZ224113A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5200509A (en) * | 1987-04-06 | 1993-04-06 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Human somatomedin carrier protein subunits and process for producing them; recombinant DNA molecules, hosts, processes and human somatomedin carrier protein-like polypeptides |
| US5288931A (en) * | 1991-12-06 | 1994-02-22 | Genentech, Inc. | Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation |
| US5663304A (en) * | 1993-08-20 | 1997-09-02 | Genentech, Inc. | Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I |
| US5589364A (en) * | 1994-07-29 | 1996-12-31 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Recombinant production of biologically active peptides and proteins |
| JPH10504971A (ja) * | 1994-09-08 | 1998-05-19 | カイロン コーポレイション | インスリン様増殖因子の改善された生産方法 |
| US6475725B1 (en) | 1997-06-20 | 2002-11-05 | Baxter Aktiengesellschaft | Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3926737A (en) * | 1972-05-10 | 1975-12-16 | New Brunswick Scientific Co | Method and apparatus for control of biochemical processes |
| US4413305A (en) * | 1982-06-21 | 1983-11-01 | The Bendix Corporation | Terminal for a capacitor and a method of forming same |
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio- Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| WO1985000831A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of insulin-like growth factor |
| US4788144A (en) * | 1985-06-28 | 1988-11-29 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermentation process for the high level production of swine growth |
| US4762784A (en) * | 1985-07-15 | 1988-08-09 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermemtation process for the high level production of bovine growth hormone |
| US4769361A (en) * | 1986-08-07 | 1988-09-06 | International Minerals & Chemical Corp. | Method for purifying and isolating two ionic forms of somatomedin C |
-
1987
- 1987-04-06 US US07/034,847 patent/US5104796A/en not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-03-31 NZ NZ224113A patent/NZ224113A/en unknown
- 1988-04-05 ES ES88302994T patent/ES2047544T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-05 DE DE88302994T patent/DE3886250T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-05 AT AT88302994T patent/ATE98654T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-04-05 AU AU14393/88A patent/AU607986B2/en not_active Ceased
- 1988-04-05 EP EP88302994A patent/EP0286345B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-05 JP JP63082404A patent/JP2609462B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-06 KR KR1019880003812A patent/KR960011523B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．６，Ｐ．１９２３−１９３８（１９８５） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ224113A (en) | 1990-11-27 |
| KR880012757A (ko) | 1988-11-29 |
| EP0286345B1 (en) | 1993-12-15 |
| EP0286345A3 (en) | 1989-10-04 |
| EP0286345A2 (en) | 1988-10-12 |
| ATE98654T1 (de) | 1994-01-15 |
| ES2047544T3 (es) | 1994-03-01 |
| AU1439388A (en) | 1988-10-06 |
| US5104796A (en) | 1992-04-14 |
| AU607986B2 (en) | 1991-03-21 |
| DE3886250T2 (de) | 1994-05-05 |
| KR960011523B1 (ko) | 1996-08-23 |
| DE3886250D1 (de) | 1994-01-27 |
| JPS6420098A (en) | 1989-01-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2564506B2 (ja) | 異種タンパク質の製造方法 | |
| CN111763678B (zh) | 一种提高角蛋白酶异源表达酶活的启动子 | |
| Yim et al. | High-level secretory production of human granulocyte-colony stimulating factor by fed-batch culture of recombinant Escherichia coli | |
| JP2609462B2 (ja) | ソマトメジンｃの生産方法 | |
| US4894334A (en) | Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria | |
| EP0209355B1 (en) | High level microbial production of bovine growth hormone | |
| EP0208489B1 (en) | High level microbial production of swine growth hormone | |
| AU753879B2 (en) | Industrial method for producing heterologous proteins in E.coli and strains useful for said method | |
| EP0137646A1 (en) | Recombinant process for preparing L-amino acids, recombinant expression vectors and transformed microorganisms for use in the process | |
| US4746608A (en) | Process for producing peptides | |
| JPH0838189A (ja) | 遺伝子的に修飾された生物体を用いるビタミンｃ先駆体の製造方法 | |
| Lee et al. | Mass production of thermostable D‐hydantoinase by batch culture of recombinant Escherichia coli with a constitutive expression system | |
| WO1994019474A1 (en) | Process for producing human growth hormone | |
| EP0076037A2 (en) | Amplified expression of DNA sequences | |
| Han et al. | Fed‐batch cultivation of an oxygen‐dependent inducible promoter system, the nar promoter in Escherichia coli with an inactivated nar operon | |
| JP2002511273A (ja) | 原核細胞における組換えタンパク質の制御発現のための新規な構築体 | |
| CN118373922A (zh) | 可溶性的标签蛋白在制备司美格鲁肽主链中的应用 | |
| CN115678818A (zh) | 一种重组微生物及其应用 | |
| WO2000008174A9 (en) | β-CASEIN EXPRESSING CONSTRUCTS | |
| CN115678820A (zh) | 产缬氨酸的重组微生物及其构建方法和应用 | |
| JPH08224089A (ja) | グルタリルアミダーゼの組換え生産のための改善された誘導を伴わない方法 | |
| KR19990027555A (ko) | 재조합 대장균을 이용한 재조합 단백질의 제조방법 |