PT1356073E - Método de fermentação aperfeiçoado para a produção de produtos genéticos heterólogos em bactérias do ácido láctico - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODO DE FERMENTAÇÃO APERFEIÇOADO PARA A PRODUÇÃO DE PRODUTOS GENÉTICOS HETERÓLOGOS EM BACTÉRIAS DO ÁCIDO LÁCTICO"

ÁREA DA INVENÇÃO

No seu aspecto mais lato, a presente invenção refere-se ao domínio da produção de células, péptidos, polipéptidos ou proteínas de bactérias recombinantes utilizando tecnologia de DNA recombinante; em particular, refere-se à utilização de sistemas de expressão genética numa célula-hospedeiro de bactéria do ácido láctico. Especificamente, a invenção proporciona um processo de fermentação semi-descontínuo ("fed-batch") ou contínuo utilizando esses sistemas de expressão genética, permitindo a produção eficaz, em bactérias do ácido láctico, de péptidos, polipéptidos ou proteínas heterólogas, incluindo enzimas e produtos farmaceuticamente activos.

DOMÍNIO ANTERIOR E CONTEXTO TÉCNICO É necessário considerar alguns factores para seleccionar um sistema adequado para a super-expressão de um produto genético desejado. Pontos importantes incluem o rendimento do produto genético heterólogo requerido, custos da utilização do sistema de expressão e a autenticidade/ actividade biológica do produto genético recombinante produzido no hospedeiro produtor.

Uma vez que um nível de produção elevado de péptidos, polipéptidos ou proteínas heterólogas será um fardo para a célula-hospedeiro, poderá ser vantajoso utilizar um sistema 2 de expressão genética indutível, isto é, regulável, que possa ser reprimido durante a propagação do organismo produtor, para evitar períodos prolongados de cultura e para minimizar o risco de seleccionar variantes não produtoras.

Para desenvolver um sistema de expressão indutível que seja adequado para a produção à escala industrial também é importante que a indução do sistema não implique dificuldades técnicas ou a utilização de substâncias dispendiosas ou tóxicas. Para além da quantidade de produto obtida do organismo produtor é muito importante a pureza do produto genético produzido. Um rendimento elevado de produto contido num lisato celular completo pode ser substancialmente reduzido durante os passos subsequentes de processamento a jusante necessários para remover componentes indesejados da célula-hospedeiro. Em consequência, é geralmente preferida a secreção para o periplasma em bactérias Gram-negativas ou para o ambiente extracelular de bactérias Gram-positivas.

Até à data, Escherichia coli e Bacillus subtilis têm sido os organismos hospedeiros bacterianos mais extensamente utilizados para a produção recombinante de péptidos, polipéptidos e proteínas. A biologia molecular destes organismos está caracterizada num nível que excede o de todos os outros microrganismos procariotas, e esta investigação extensa formou a base para gerar uma grande colecção de ferramentas genéticas que têm permitido uma clonagem e expressão fáceis de genes heterólogos nestas bactérias. 3

No entanto, durante a última década, a investigação tem-se centrado cada vez mais no desenvolvimento de bactérias do ácido láctico (LAB), e em particular Lactococcus lactis, como fábricas celulares para a produção de péptidos, polipéptidos e proteínas homólogas ou heterólogas. As LAB são vantajosas em vários aspectos para a produção de produtos genéticos heterólogos. A produção e administração de péptidos, polipéptidos e proteínas recombinantes para aplicações farmacêuticas estão sujeitas a regulamentações estritas impostas por autoridades regulamentadoras em todo o mundo. Por exemplo, endotoxinas, um componente da parede celular na maior parte das bactérias Gram-negativas, devem estar ausentes no produto final. As bactérias do ácido láctico não produzem endotoxinas, tornando-as em organismos hospedeiros produtores de proteínas atractivos. Além disso, várias estirpes de bactérias do ácido láctico, incluindo estirpes L. lactis, não produzem proteases extracelulares e são capazes de segregar péptidos, polipéptidos ou proteínas, assegurando uma elevada estabilidade do produto genético que facilita a sua purificação subsequente.

Chegou-se à concepção de alguns sistemas de expressão genética indutíveis promissores para utilização em bactérias do ácido láctico (Kok, 1996; Kuipers et al., 1997; Djordjevic e Klaenhammer, 1998) através de estudos centrados na regulação da expressão genética em L. lactis e seus fagos. Sistemas de expressão úteis de bactérias do ácido láctico incluem o sistema NICE (de Ruyter et al., 1996), que se baseia em elementos genéticos de um sistema de dois componentes que controla a biossíntese do péptido anti-microbiano nisina em L. lactis. Outros dois sistemas de expressão indutíveis úteis baseiam-se em elementos genéticos dos bacteriófagos de L. lactis φ31 (0'Sullivan et 4 al., 1996; Walker e Klaenhammer, 1998) e rlt (Nauta et al., 1997).

Genes repórter sem promotores em transposões, vectores de integração ou plasmídeos (van der Vossen et al., 1987; Israelsen e Hansen, 1993; Sanders et al., 1998) têm sido utilizados para identificar promotores indutiveis em LAB. Estes promotores são induzidos por alterações do meio ambiente, como pH (Israelsen et al., 1995) e concentração de sal (Sanders et al., 1998).

Sistemas de expressão genética induzidos por metabolitos produzidos pela célula-hospedeiro ou por condições que ocorrem naturalmente durante o crescimento da célula-hospedeiro têm interesse industrial devido ao baixo custo e estatuto de qualidade alimentar do factor indutor. Em consequência, explorámos promotores indutiveis, incluindo o P170 indutível pelo pH e seus derivados, divulgados nos requerimentos de patentes internacionais publicados de co-autoria WO 94/16086 e WO 98/10079, no desenvolvimento de um novo sistema de expressão genética para utilização em L. lactis. A transcrição a partir do promotor P170 é induzida por pH baixo durante a transição concomitante para a fase estacionária, isto é, a expressão é reprimida durante a fase de crescimento exponencial. Num estudo recente, o promotor P170 foi caracterizado em pormenor, e o nivel de expressão original foi aumentado aproximadamente 150 - 200 vezes por engenharia genética sem afectar a regulação (Madsen et al., 1999).

Apesar de tentativas para se obterem níveis económicos de produtos genéticos utilizando células-hospedeiro de bactérias do ácido láctico terem sido promissoras, há, 5 todavia, uma necessidade industrial continuada para aumentar a produtividade desses sistemas de produção. Adicionalmente, há necessidade de proporcionar processos de fermentação nos quais o meio não contenha componentes potencialmente perigosos que possam constituir um risco de saúde para o utilizador final dos produtos. Exemplos desses componentes indesejados incluem virus e priões de animais, cuja presença não pode ser completamente excluída em meios de fermentação convencionais contendo componentes de origem animal, como compostos azotados. No entanto, a maior parte dos meios de fermentação presentemente utilizados consiste em meios quimicamente indefinidos que contêm esses componentes de origem animal.

Em consequência, há uma necessidade forte de proporcionar métodos para produzir péptidos, polipéptidos ou proteínas heterólogas que sejam absolutamente seguros e que permitam proporcionar os produtos genéticos desejados com rendimentos iguais e preferivelmente mais elevados do que os presentes métodos de produção.

Os presentes métodos de produção de produtos genéticos heterólogos utilizando células-hospedeiro de bactérias do ácido láctico baseiam-se na cultura descontínua das células-hospedeiro em meios quimicamente indefinidos e ricos em nutrientes. A presente invenção abrange a utilização de um meio quimicamente definido, isto é, sintético, nesses processos de produção. Verificou-se que a utilização desses meios num processo descontínuo convencional originou um rendimento do produto genético significativamente menor do que o obtido num meio convencional rico em nutrientes e quimicamente indefinido. No entanto, verificou-se que este problema podia ser 6 ultrapassado conduzindo o processo de produção na forma de um processo contínuo ou processo semi-descontínuo.

RESUMO DA INVENÇÃO

Em conformidade, a presente invenção proporciona, no seu aspecto mais lato, um método para produzir um péptido, polipéptido ou proteína heteróloga numa bactéria do ácido láctico, cujo método compreende os passos seguintes: (i) construir uma bactéria do ácido láctico recombinante compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica para o péptido, polipéptido ou proteína heteróloga e operativamente ligada àquela, sequências de nucleótidos reguladoras apropriadas para controlar a expressão da sequência codificadora, (ii) cultivar a referida bactéria recombinante em condições de cultura semi-descontínuas ou contínuas para expressar o gene e (iii) recolher a bactéria recombinante, o péptido, polipéptido ou proteína.

Sequências de nucleótidos reguladoras apropriadas incluem promotores constitutivos ou promotores reguláveis, isto é, indutíveis. Em formas de realização em que utilize um promotor regulável, esse promotor é preferivelmente regulado por um factor ambiental presente durante a cultura da bactéria recombinante, o que implica que não é necessário adicionar ao meio substâncias indutoras. Promotores reguláveis particularmente úteis incluem o promotor regulável pelo pH da bactéria do ácido láctico P170 e seus derivados, como revelado em WO 94/16086 e WO 98/10079. 7

Outro aspecto da invenção diz respeito à utilização de um meio basal quimicamente definido (meio LMl) para a cultura de bactérias lácticas no método acima, cujo meio consiste no seguinte:

Componente Concentração, mM ou +/- L-Alanina 3,4 L-Arginina 1,1 L-Asparagina O CG L-Cisteina OO O L-Glutamato 2,1 L-Glutamina 0,7 Glicina 2,7 L-Histidina 0,3 L-Isoleucina O co L-Leucina 0 co L-Lisina-HCl 1,4 L-Metionina 0,7 L-Fenilalanina 1,2 L-Prolina 2, 6 L-Serina 2,9 L-Treonina 1,7 L-Triptofano 0,5 L-Tirosina 0,3 L-Valina 0, 9 K2S04 0,28a KH2PO4/K2HPO4 4/6 Acetato de Na 15 CcLC]_2 0,0005a MgCl2 0,52a FeS04 0,01a Vitaminasb +

Componente Concentração, mM ou + /- Micronutrientesa,c + Ácido cítrico 0,1 a De Neidhardt et al., J. Bacteriol. 119: 736-747 b Vitaminas: biotina 0,4 μΜ, piridoxal-HCl 10 μΜ, ácido fólico 2,3 μΜ, riboflavina 2,6 μΜ, niacinamida 8 μΜ, tiamina-HCl 3 μΜ e pantotenato 2 μΜ c Micronutrientes: (NH4) 6 (M07) 24 0, 003 μΜ, H3B04 0,4 μΜ, CoCl2 0,03 μΜ, CuS04 0,01 μΜ, MnCl2 0,08 μΜ e ZnS04 0,01 μΜ

Ainda noutros aspectos, a invenção refere-se a um meio quimicamente definido (meio LM3) para cultivar bactérias do ácido láctico que contém todos os componentes do meio LM1 em quantidades triplicadas, com a excepção dos fosfatos e acetato de sódio cujas quantidades respectivas são mantidas no mesmo nivel do meio LMl, e um meio quimicamente definido (meio LM5) para cultivar bactérias do ácido láctico que contém todos os componentes do meio LMl em quantidades quintuplicadas, com a excepção dos fosfatos e acetato de sódio cujas quantidades respectivas são mantidas no mesmo nivel do meio LMl.

DIVULGAÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Um objectivo primário da presente invenção é proporcionar métodos aperfeiçoados para produzir bactérias do ácido láctico recombinantes e produzir péptidos, polipéptidos ou proteínas heterólogas numa bactéria do ácido láctico.

Tal como é aqui utilizado, o termo "bactéria do ácido láctico" designa uma bactéria Gram-positiva, micro-aerofílica ou anaeróbia que fermenta açúcares com produção de ácidos, incluindo o ácido láctico como ácido produzido 9 de forma predominante. As bactérias do ácido láctico mais úteis industrialmente encontram-se entre Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp. e Propionibacterium spp. Adicionalmente, bactérias produtoras de ácido láctico pertencentes ao grupo das bactérias estritamente anaeróbias, bifidobactérias, isto é, Bifidobacterium spp., que são frequentemente utilizadas como culturas iniciadoras de alimentos isoladamente ou em combinação com bactérias do ácido láctico, são geralmente incluídas no grupo das bactérias do ácido láctico.

Num primeiro passo do presente método constrói-se uma bactéria do ácido láctico recombinante de modo a compreender uma sequência de nucleótidos que codifica para o péptido, polipéptido ou proteína heteróloga desejada e operativamente ligada àquela, sequências de nucleótidos reguladoras apropriadas para controlar a expressão da sequência codificadora. Essa construção pode ser preparada utilizando métodos bem conhecidos na área, por exemplo, utilizando os métodos descritos em Sambrook et al., 1989.

Em formas de realização úteis, a sequência de nucleótidos que codifica para um produto genético desejado é seleccionada de uma sequência que codifica para uma enzima, incluindo uma lipase, uma peptidase, uma protease, incluindo uma protease aspártica com actividade de coagulação do leite, como quimosina, pepsina e proteases aspárticas de origem microbiana, uma nuclease, uma enzima envolvida no metabolismo dos hidratos de carbono, incluindo amilases e outras enzimas que degradam amido, oxidorredutases, incluindo como exemplos glucose-oxidase e hexose-oxidase, e uma enzima lítica, uma sequência de 10 nucleótidos que codifica para uma proteína virai, como uma proteína capsídica, uma sequência que codifica para uma estrutura proteica da superfície de células microbianas e uma sequência que codifica para uma bacteriocina, tal como, por exemplo, nisina, reuterina e pediocina. A sequência de nucleótidos também pode ser tal que codifica para um produto genético que confere resistência a um antibiótico.

Em formas de realização particularmente interessantes, a bactéria do ácido láctico recombinante compreende uma sequência de nucleótidos que codifica para um produto genético biologicamente funcional, incluindo uma toxina microbiana, um péptido ou polipéptido imunologicamente activo, um péptido, polipéptido ou proteína farmaceuticamente activo e um péptido, polipéptido ou proteína activo de forma antimicrobiana.

No presente contexto, produtos genéticos imunologicamente activos incluem quaisquer sequências de aminoácidos que compreendem pelo menos um epítopo. Essas sequências são úteis como vacinas e/ou agentes de diagnóstico e podem ser derivadas de qualquer organismo patogénico contra o qual é necessário imunizar um animal, como um mamífero, incluindo um ser humano. Deve entender-se que o epítopo expresso pela sequência de nucleótidos codificadora pode ser tal que é segregado fora da célula para o meio de cultura, ou que pode estar localizado na superfície externa do organismo hospedeiro, de modo que será possível aplicar a própria célula recombinante como vacina. Alternativamente, o epítopo pode ser produzido de modo intracelular, em cujo caso é isolado da célula. Outro meio interessante de obter um epítopo expresso consiste em inserir a sequência de nucleótidos que codifica para o epítopo noutra sequência 11 codificadora de modo que o epitopo, numa forma imunologicamente activa, é expresso como parte da proteína de fusão.

Numa forma de realização específica, a sequência de nucleótidos codificadora codifica para um determinante antigénico ou epitopo antigénico micobacteriano, isto é, um oligo- ou polipéptido imunologicamente activo que, quando administrado a um animal, incluindo um ser humano, tem um efeito estimulador na resposta imunológica humoral e/ou celular. Em particular, essa sequência codificadora pode ser derivada de um organismo que pertence ao grupo de espécies Mycobacterium, geralmente referido como "complexo de tuberculose" que inclui Mycobacterium tuberculosís, M. bovis e M. africanum. Esses produtos genéticos antigénicos de origem micobacteriana têm utilização potencial como vacinas para a tuberculose e/ou como reagentes de diagnóstico no teste na pele de tuberculose. É evidente que a produção industrial de vacinas e agentes activos de diagnóstico para utilização humana e animal num organismo seguro e não patogénico, como uma bactéria do ácido láctico, será altamente vantajosa.

Noutras formas de realização úteis, a sequência de nucleótidos codificadora é tal que codifica para um anticorpo, incluindo um anticorpo monoclonal e um anticorpo policlonal. Essa sequência codificadora pode ser derivada de qualquer fonte animal, incluindo pássaros, mamíferos e seres humanos.

De acordo com o método da invenção, a célula recombinante pode compreender pelo menos um promotor constitutivo ou pelo menos um promotor regulável operativamente ligado à 12 sequência de nucleótidos codificadora, em que o termo "promotor" é usado no sentido convencional para designar um sitio ao qual se pode ligar RNA polimerase.

De acordo com a invenção, a região promotora pode ser derivada de qualquer célula procariótica, mas em formas de realização preferidas é derivada de uma espécie de bactéria do ácido láctico, incluindo as espécies acima e Bífidobacterium spp. Em formas de realização úteis, a região promotora é derivada de uma região promotora de Lactococcus lactis, incluindo Lactococcus lactis subespécie lactis, por exemplo, a estirpe designada MG1363 [esta estirpe também é referida na literatura como Lactococcus lactis subespécie cremoris (Nauta et al., 1996)] e Lactococcus lactis subespécie lactis biovariedade diacetylactis. Exemplos dessas regiões promotoras que, de acordo com a presente invenção, são úteis na construção da bactéria do ácido láctico recombinante são apresentados em WO 94/16086, incluindo uma região compreendendo o promotor P170 e seus derivados, exemplos dos quais são divulgados em WO 98/10079.

Tal como mencionado acima, para certas finalidades poderá ser vantajoso que o promotor utilizado na bactéria do ácido láctico recombinante seja um promotor regulável ou indutivel. 0(s) factor(es) regulador(es) ou indutor(es) do promotor incluem qualquer factor físico e químico que possa regular a actividade de uma sequência promotora, incluindo condições físicas, como temperatura e luz, substâncias químicas, tais como, por exemplo, IPTG, triptofano, lactato ou nisina. Em formas de realização presentemente preferidas, um promotor regulável utilizado na invenção é regulado por um factor ambiental ou de condicionamento do 13 crescimento que ocorre durante o passo de cultura. A vantagem de utilizar esse promotor regulável é que não é necessário adicionar ao meio de cultura compostos indutores ou reguladores. Esse factor regulador é seleccionado de entre o pH, a temperatura de crescimento, o teor de oxigénio, um desvio de temperatura que induz a expressão de genes de choque térmico, a composição do meio de crescimento, incluindo a força iónica/teor de NaCl, acumulação intracelular ou no meio de metabolitos, incluindo ácido láctico/lactato, a presença/ausência de constituintes celulares essenciais ou respectivos precursores, a fase de crescimento da bactéria ou a velocidade de crescimento da bactéria.

Entender-se-á que quando o promotor é tal que a sua indução ou regulação é controlada por uma ou mais substâncias presentes num meio de crescimento, substâncias que normalmente não são componentes desses meios, como antibióticos ou bacteriocinas, geralmente não são incluídas, de acordo com a invenção, como factores ambientais ou de condicionamento do crescimento.

Numa forma de realização preferida, o promotor e o nucleótido que codifica para o péptido, polipéptido ou proteína heteróloga são introduzidos na bactéria do ácido láctico num replicão de replicação autónoma, como um plasmídeo, um elemento transponível, um bacteriófago ou um cosmídeo. Poderá ser vantajoso introduzir o promotor e a sequência codificadora em condições em que pelo menos a sequência codificadora fica integrada no cromossoma da célula-hospedeiro, pois isto proporciona manutenção estável da sequência codificadora na célula. Alternativamente, a sequência codificadora heteróloga é introduzida no 14 cromossoma da célula-hospedeiro numa localização onde fica operativamente ligada a um promotor que ocorre naturalmente no cromossoma do organismo hospedeiro seleccionado. Assim, noutra forma de realização, o promotor operativamente ligado à sequência de nucleótidos que codifica para o péptido, polipéptido ou proteína heteróloga é um promotor que não está naturalmente associado a essa sequência codificadora.

Noutra forma de realização vantajosa, a sequência de nucleótidos codificadora é operativamente ligada a uma sequência de nucleótidos que codifica para um péptido de sinal (SP), permitindo que o produto genético seja segregado sobre a membrana celular para o meio. Os SPs são as extensões N-terminais presentes em proteínas segregadas dependentes de Sec. A estrutura de um SP típico inclui três regiões distintas: (i) uma região N-terminal que contém alguns aminoácidos de carga positiva, lisina e arginina; (ii) um núcleo hidrófobo central, e (iii) um terminal C hidrófilo que contém o motivo de sequência reconhecido pela peptidase de sinal. Proteínas abordadas selectivamente para secreção incluem uma sequência de sinal ou péptido de sinal (SP) no terminal N. Os SPs são reconhecidos e clivados por uma peptidase líder ou de sinal, um componente da maquinaria de secreção da célula, durante o transporte através da membrana celular. Os SPs têm normalmente 25 até mais de 35 aminoácidos de comprimento em bactérias Gram-positivas. Os SPs não partilham homologia de sequências mas muitas vezes são compostos por um terminal amino que inclui um ou mais aminoácidos básicos, um núcleo hidrófobo central de sete ou mais aminoácidos e um terminal carboxi hidrófilo que contém o motivo que é reconhecido por peptidases de sinal. Um exame de SPs disponíveis de L. lactis sugeriu a 15 utilização do SP de Usp45, a principal proteina lactocócica segregada (van Asseldonk et al., 1990). Foi relatado que este SP é funcional na secreção de várias proteínas heterólogas em L. lactis (van Asseldonk et al., 1993).

Numa forma de realização específica, o péptido de sinal é seleccionado do grupo que consiste no péptido de sinal de Usp45 e no péptido de sinal com a sequência MKFNKKRVAIAT-FIALSFVSFRtSSQDAGMERS (id SEQ NO: 1).

Num passo subsequente do método de acordo com a invenção, a bactéria do ácido láctico recombinante obtida deste modo é cultivada em condições de cultura semi-descontínuas ou contínuas para expressar a sequência que codifica para o produto genético desejado, e as células recombinantes ou o péptido, polipéptido ou proteína são recolhidos, quer durante a cultura (quando continua) quer depois de terminado o passo de cultura (quando semi-descontínua), utilizando técnicas convencionais para separar células, péptidos, polipéptidos e proteínas.

No sentido mais lato, a expressão "cultura semi-descontínua" é definida como uma técnica de cultura em que um ou mais nutrientes são fornecidos durante a cultura ao recipiente da cultura ou biorreactor e em que as células cultivadas e o produto genético permanecem confinados até ao final da ronda. Nalguns casos, o biorreactor é gradualmente alimentado com todos os nutrientes. Tal como é aqui utilizada, a expressão "cultura contínua" é usada para descrever um processo de cultura no qual todos os nutrientes são continuamente adicionados ao recipiente de cultura ou biorreactor, e fracções do meio e/ou cultura de 16 células são removidas à mesma taxa de fluxo dos nutrientes fornecidos, para manter um volume de cultura constante.

Em contraste com estes métodos de cultura da invenção, uma cultura "descontinua" ("batch") convencional é um processo em que todos os nutrientes necessários durante uma ronda de cultura, excepto o oxigénio molecular num processo aeróbico e compostos químicos para ajuste do pH, são adicionados ao meio antes de começada a cultura.

As condições de tempo-temperatura, condições de pH e condições de arejamento, se relevantes, e a taxa de alimentação do biorreactor com nutrientes irão depender, inter alia, do tipo particular utilizado de bactéria do ácido láctico. Exemplos específicos dessas condições são fornecidos nos exemplos seguintes. Tipicamente, uma cultura semi-descontínua nas condições acima é efectuada durante 24-72 horas a uma temperatura situada na gama de 15-40°C e a um pH situado na gama de 4-8. Um processo de cultura contínuo de acordo com a invenção pode ser conduzido, nestas condições de temperatura e pH, durante períodos de tempo mais longos, como várias centenas de horas.

Em formas de realização presentemente preferidas do método, a bactéria do ácido láctico recombinante é cultivada num meio quimicamente definido. Tal como é aqui utilizada, a expressão "meio quimicamente definido" designa um meio que essencialmente não contém fontes de azoto ou carbono indefinidas, como composições de proteínas ou hidrolisados de proteínas animais ou vegetais, ou fontes complexas de carbono, tais como, por exemplo, melaço ou extracto solúvel de milho, mas em que as fontes de azoto são compostos inorgânicos ou orgânicos bem definidos, como amoníaco ou 17 aminoácidos, e a fonte de carbono é um açúcar bem definido, como glucose. Adicionalmente, esse meio sintético contém componentes minerais, como sais, por exemplo, sulfatos, acetatos, fosfatos e cloretos de metais alcalinos e alcalino-terrosos, vitaminas e micronutrientes. Apresentam-se aqui exemplos de meios quimicamente definidos para a finalidade da presente invenção. Será apreciado que estes meios são apenas exemplificativos. 0 profissional conseguirá proporcionar outros meios que permitam a cultura de bactérias do ácido láctico recombinantes nas condições de cultura acima. 0 meio sintético utilizado no presente método deve conter uma fonte de carbono. A concentração da fonte de carbono depende do tipo de bactéria do ácido láctico recombinante e das condições de cultura seleccionadas. Em formas de realização úteis, a fonte de carbono é glucose. Em formas de realização preferidas, a concentração de glucose na cultura é mantida numa concentração pré-seleccionada de pelo menos cerca de 0,5 g/L por adição controlada de glucose num processo semi-descontinuo ou por adição do meio completo que contém a glucose completa num processo de cultura continuo. A concentração de glucose no meio de cultura pode ser preferivelmente pelo menos 5 g/L, tal como pelo menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80 ou 100 g/L.

De acordo com a invenção, um modo conveniente de controlar a adição de glucose no meio num processo semi-descontinuo consiste em ligar ou acoplar essa adição ao meio de controlo do pH do biorreactor. Deste modo, a adição de glucose é activada pelo meio que controla a adição automática de base para controlar o pH. De modo semelhante, num processo de cultura contínuo, a adição do meio completo 18 pode ser ligada ao controlo do pH de acordo com o princípio do auxostato de pH.

Apesar de se ter verificado que se podem obter rendimentos satisfatórios do produto genético utilizando um meio puramente sintético, verificou-se que o rendimento pode ser suplementarmente aumentado por suplementação de um meio quimicamente definido como definido acima com extracto de levedura. Uma quantidade adequada de extracto de levedura é uma quantidade situada na gama de 0,1-10 g/L, tal como, por exemplo, na gama 1-5 g/L. Em conformidade, no presente contexto, um "meio quimicamente definido" pode incluir um meio quimicamente definido enriquecido com uma quantidade apropriada de extracto de levedura. O principal objectivo da presente invenção é proporcionar um método para produzir um produto genético com um rendimento elevado. Em conformidade, em formas de realização preferidas, o rendimento do péptido, polipéptido ou proteína é pelo menos 5 mg/L, mais preferivelmente pelo menos 10 mg/L, tal como pelo menos 20 mg/L, incluindo pelo menos 50 mg/L. Em formas de realização particularmente preferidas, o rendimento obtido é pelo menos 100 mg/L, incluindo pelo menos 150 mg/L e pelo menos 200 mg/L.

Como mencionado acima, a invenção refere -se, noutro aspecto, à utilização de um meio basal quimicamente definido e específico (meio LMl) para a cultura de bactérias no método da invenção, em que o meio consiste no seguinte: 19

Componente Concentração, mM ou +/- L-Alanina 3,4 L-Arginina 1,1 L-Asparagina O co L-Cisteína 00 0 L-Glutamato 2,1 L-Glutamina 0,7 Glicina 2,7 L-Histidina 0,3 L-Isoleucina O CO L-Leucina 0 co L-Lisina-HCl 1,4 L-Metionina 0,7 L-Fenilalanina 1,2 L-Prolina 2, 6 L-Serina 2,9 L-Treonina 1,7 L-Triptofano 0,5 L-Tirosina 0,3 L-Valina 0, 9 K2S04 0,28a KH2PO4/K2HPO4 4/6 Acetato de Na 15 CaCl2 0,0005a MgCl2 0,52a FeS04 0,01a Vitaminasb + Micronutrientesa,c + Ácido cítrico 0,1 a De Neidhardt et al., J. Bacteriol. 119: 736-747 20 b Vitaminas: biotina 0,4 μΜ, piridoxal-HCl 10 μΜ, ácido fólico 2,3 μΜ, riboflavina 2,6 μΜ, niacinamida 8 μΜ, tiamina-HCl 3 μΜ e pantotenato 2 μΜ c Micronutrientes: (NH4) 6 (MO7) 24 0, 003 μΜ, H3B04 0,4 μΜ, C0CI2 0,03 μΜ, CuS04 0,01 μΜ, MnCÍ2 0,08 μΜ e ZnS04 0,01 μΜ

Também são proporcionados meios quimicamente definidos derivados do meio LMl, incluindo o meio LM3 que contém todos os componentes do meio LMl em quantidades triplicadas, com a excepção dos fosfatos e acetato de sódio cujas quantidades respectivas são mantidas no mesmo nivel do meio LMl, e o meio referido como meio LM5 que contém todos os componentes do meio LMl em quantidades quintuplicadas, com a excepção dos fosfatos e acetato de sódio cujas quantidades respectivas são mantidas no mesmo nivel do meio LMl.

Também como mencionado acima, o meio quimicamente definido utilizado na invenção deve ser suplementado com uma fonte de carbono definida adequada. Em conformidade, em formas de realização úteis, qualquer um dos meios acima é suplementado com glucose, tipicamente numa quantidade situada na gama de 1-100 g/L, incluindo a gama 2-50 g/L, tal como a gama 5-40 g/L. A invenção será agora descrita mais pormenorizadamente nos exemplos seguintes e nas figuras, nas quais:

Fig. 1 é uma apresentação esquemática de plasmideos que expressam SNase utilizados aqui. O rendimento da SNase segregada (unidades/mL) obtida em meio GM17 em culturas em balão ou fermentadores está indicado à direita; 21

Fig. 2 é uma apresentação de valores OD6oo máximos obtidos de experiências de fermentação em meios definidos com diferentes concentrações de glucose e valores de pH: 5,5, quadrados; 6,0, triângulos; 6,5, círculos, e 7,0, losangos;

Fig. 3A-D mostram a cinética do crescimento (OD600, losangos) e produção de SNase (unidades/mL, quadrados) pela estirpe de L. lactis SMBI111 (plasmídeo de número médio de cópias, SP310mut2) em meio LM3-30 após fermentação a diferentes valores de pH. (A) pH 5,5; (B) pH 6,0; (C) pH 6,5; (D) pH 7,0;

Fig. 4A-B ilustram a actividade de SNase versus OD60o para SMBIlll durante o crescimento em meio LM3-15 (A) e durante o crescimento em meio LM3-30 (B) a pH 5,5 (quadrados), 6,0 (triângulos), 6,5 (círculos) e 7,0 (losangos);

Fig. 5 mostra a análise de SDS-PAGE de sobrenadantes de cultura de L. lactis SMBIlll após fermentação em meio LM3-30 a pH 6,5. As vias 1-9 correspondem às amostras de cultura que foram analisadas quanto à actividade de nuclease na Fig. 3C. Carregou-se cada via com 10 pL de sobrenadante de cultura em bruto. As massas moleculares (em quiloDaltons) estão indicadas à direita. O triângulo indica a posição da SNase segregada;

Fig. 6A-C mostram a indução de P170 por adição de lactato de potássio. SMBIlll cresceu em meio LM3-30 a pH 7,0. No instante indicado pelas setas, quando a OD60o era aproximadamente 0,7, adicionou-se à cultura água (6A), lactato de potássio 200 mM (B) ou cloreto de potássio 200 mM (6C). A OD6oo está apresentada em triângulos e a actividade de nuclease (unidades/mL) em quadrados; 22

Fig. 7A-D ilustram a cinética da produção de SNase por SMBllll durante fermentações semi-descontinuas em meio LM5-5 a diferentes valores de pH: (A) pH 5,5, (B) pH 6,0, (C) 6,5. Em 7A-7C, a ΟΏβοο está apresentada em triângulos e a actividade de nuclease (unidades/mL) em quadrados. 7D mostra a actividade de SNase versus OD6oo aos diferentes valores de pH: 5,5, quadrados; 6,0, triângulos, e 6,5, circulos. As linhas pontilhadas indicam que ocorre espalhamento nos valores elevados de OD60o· Consequentemente, alguns valores de OD60o intervenientes foram omitidos no painel D;

Fig. 8 mostra o rendimento final de SNase obtida de SMBllll por fermentação em meios definidos com diferentes concentrações de glucose: 5 g/L em LMl-5 com NaCl 50 mM; 15 g/L em LM3-15; 30 g/L em LM3-30, e h 70 g/L gradualmente adicionado a LM5-5 durante o processo semi-descontínuo, e a diferentes valores de pH: 7,0, barras brancas; 6,5, barras ponteadas; 6,0, barras listradas, e 5,5, barras pretas;

Fig. 9A-B ilustram a fermentação semi-descontínua da estirpe SMBI104 (plasmídeo com elevado número de cópias, SP310mut2) em meio LM5-5 a pH 6,5. (A) Cinética do crescimento (OD60o, triângulos) e produção de SNase (unidades/mL, quadrados). (B) Análise de SDS-PAGE de sobrenadantes de cultura de SMBI104 após fermentação semi-descontínua. As vias 1-9 correspondem às amostras de cultura que foram analisadas quanto à actividade de nuclease na Fig. 9A. Carregou-se cada via com 10 pL de sobrenadante de cultura em bruto. As massas moleculares (em quiloDaltons) estão indicadas à direita. O triângulo indica a posição da SNase segregada; 23

Fig. 10 ilustra a cultura em meio LM5-50 de AMJ627 a pH 6,5 num auxostato de pH, na qual hidróxido de potássio e meio foram adicionados simultaneamente ao fermentador em resposta à unidade de controlo do pH. Durante a experiência, a razão entre as quantidades de base e de meio adicionadas ao fermentador foi ajustada para diferentes valores. As barras indicam a capacidade de tamponamento na admissão resultante das diferentes razões, calculada em número de moles de hidróxido por litro de volume total adicionado (base mais meio). A concentração de lactato na cultura está apresentada em triângulos e a taxa de diluição está apresentada em quadrados. A OD6oo e actividade de SNase (unidades/mL) estão indicadas em losangos e círculos, respectivamente;

Fig. 11 mostra a OD60o (símbolos a cheio) e actividade de SNase (símbolos brancos) durante cultura de curta duração em quimiostato de SMBilll a duas taxas diferentes de adição de meio (triângulos: 0,14 L/hora e círculos: 0,07 L/hora) em comparação com uma cultura descontínua iniciada em paralelo (quadrados). Em todos os casos utilizou-se meio LM5-50, pH 6,5, e

Fig. 12 mostra a OD60o (losangos a cheio) e actividade de SNase (losangos brancos) durante cultura de SMBilll em meio LM5-50 a pH 6,5 com adição contínua de meio fresco e remoção do filtrado, enquanto células foram recicladas para o reactor da cultura. Para comparação apresentam-se resultados de uma cultura descontínua iniciada em paralelo (quadrados).

EXEMPLOS 24

Materiais e métodos

Estirpes bacterianas, plasmídeos e condições de crescimento

As estirpes e plasmídeos utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1. A estirpe de E. coli DH10B (Grant et al., 1990) cresceu a 37°C em meio LB suplementado com 200 pg/mL de eritromicina, quando apropriado. A estirpe de Lactococcus lactis MG1363 (Gasson, 1983) cresceu rotineiramente a 30°C em meio GM17 (1,5 x Ml 7 com 5 g/L de glucose) suplementado, quando requerido, com 1 pg/mL de eritromicina. Todas as experiências em balão e fermentador foram conduzidas a 30°C.

Para evitar a indução do promotor P170, as pré-culturas cresceram no meio ArgM17 (Madsen et al., 1999) e foram recolhidas a uma OD6oo de 0,5 até 1,0. As células foram lavadas e concentradas 20 vezes em tampão frio de fosfato de potássio 20 mM, pH 6,8. Alíquotas de 1 mL da suspensão foram congeladas com glicerol (concentração final de 35%) a -70°C para serem utilizadas para inoculação de 1 litro de meio do fermentador.

Tabela 1

Bactérias e Características relevantes Referência ou fonte plasmídeos

Bactérias L. lactis MG1363 Hospedeiro para expressão/secreção de nucleases Gasson, 1983 E. coli DH10B Hospedeiro de clonagem de E. coli Grant et al. 1990 Plasmídeos pHBA102 Plasmídeo que contém o terminador da transcrição de E. Albrechtsen et al., coli rrnCtt' 1990 pTRKH4 Vector de clonagem de E. coli-Lactococcus, elevado 0'Sullivan & número de cópias em L. lactis Klaenhammer, 1993 pBS::Nuc Plasmídeo que contém o gene de nuclease de S. aureus Le Loire et al, 1994 pASPNuc Vector de sonda do péptido de sinal que contém o promotor P170 de pAMJ586 Ravn et al. 2000 PAMJ586 Promotor P170 regulado em pAK80 Madsen et al., 1999 pAHJ752 Variante do promotor P170 regulado fortemente em pAK80 Madsen et al., 1999 pNZ1020 Plasmídeo que contém a sequência do péptido de sinal van Asseldonk et al.,

Bactérias e plasmídeos Características relevantes Referencia ou fonte de Usp45 1990 P310MUT2 Plasmídeo que contém a sequência do péptido de sinal Ravn et ai., dados SP310mut2 não publicados pSMA610 Vector de expressão/secreção de número médio de cópias (MC), promotor de pAMJ586, péptido de sinal de Usp45 Este estudo pSMA219 pSMA610 que contém o terminador da transcrição rrnCtt' Este estudo pAMJ325 Vector de expressão de elevado número de cópias (HC), promotor de pAMJ752 Este estudo PAMJ328 pAMJ325 que contém o terminador da transcrição rrnCtt' Este estudo PAMJ166 pAMJ610 que contém o gene de nuclease de S. ãureus Este estudo pSMBl91 Vector HC que expressa a nuclease, promotor forte P170; péptido de sinal SP310mut2 Este estudo pSMBl93 Vector MC que expressa a nuclease, promotor forte P170; péptido de sinal UspP45 Este estudo PSMBI98 Vector HC que expressa a nuclease, promotor forte P170; péptido de sinal UspP45 Este estudo pSHBI109 Vector MC que expressa a nuclease, promotor forte P170; péptido de sinal SP310mut2 Este estudo 2 6 27 0 meio basal definido utilizado para a fermentação, LM1, foi derivado do meio SA desenvolvido por Jensen e Hammer (1993) . Este último meio tem a seguinte composição (mM ou presença/ausência no meio):

Componente Concentração, mM ou +/- L-Alanina 3,4 L-Arginina 1,1 L-Asparagina O co L-Cisteina 00 0 L-Glutamato 2,1 L-Glutamina 0,7 Glicina 2,7 L-Histidina 0,3 L-Isoleucina O CO L-Leucina 0 co L-Lisina-HCl 1,4 L-Metionina 0,7 L-Fenilalanina 1,2 L-Prolina 2,6 L-Serina 2,9 L-Treonina 1,7 L-Triptofano 0, 5 L-Tirosina OO O L-Valina 0,9 NH4C1 9, 5a K2SO4 0,28a KH2PO4 1,3a Acetato de Na 15 Glucose 50 MOPS 40a Tricina 4a 28

Componente Concentração, mM ou + /- CaCl2 0,0005a MgCl2 0,52a FeS04 0,01a NaCl 50a Vitaminasb + Micronutrientes3'G + a De Neidhardt et al.r J. Bacteriol. 119: 736-747 b Vitaminas: biotina 0,4 μΜ, piridoxal-HCl 10 μΜ, ácido fólico 2,3 μΜ, riboflavina 2,6 μΜ, niacinamida 8 μΜ, tiamina-HCl 3 μΜ e pantotenato 2 μΜ c Micronutrientes: (NH4) 6 (M07) 24 0, 003 μΜ, H3B04 0,4 μΜ, CoCl2 0,03 μΜ, CuS04 0,01 μΜ, MnCl2 0,08 μΜ e ZnS04 0,01 μΜ

Comparado com o meio SA, NaCl, NH4C1, tricina e MOPS foram omitidos no meio LMl, a concentração de fosfato (K2HP04 e KH2P04) foi aumentada para 10 mM (de uma solução-mãe de tampão pH 7) e adicionou-se ácido citrico 0,1 mM para evitar a precipitação de sais de ferro. Nos meios designados LM3 e LM5, todos os componentes, exceptuando o tampão de fosfato e acetato de sódio, foram aumentados três e cinco vezes, respectivamente. O número final na designação do meio indica a concentração de glucose em g/L (por exemplo, LMl-5 contém 5 g/L de glucose) . O pH foi ajustado utilizando HC1, e durante a fermentação adicionou-se automaticamente KOH 2 M ou 5 M para manter o pH. Utilizaram-se reactores de vidro de fundo separado em placas Applikon com um volume total de 2 litros para culturas de 1 litro. A velocidade de agitação foi 300 rpm.

Procedimentos de clonagem, transformação, PCR e sequenciação de DNA 29

Efectuaram-se manipulações de DNA, incluindo amplificações por PCR e sequenciação de DNA, de acordo com procedimentos comuns (Sambrook et al., 1989). 0 DNA plasmidico de E. coli foi isolado utilizando as colunas Jet Prep (Genomed). L. lactis foi transformada por electroporação como descrito por Holo e Nes (1989).

Construção de plasmídeos para expressão e secreção genéticas controladas pelo pH e fase de crescimento

Construiu-se um vector de secreção regulado pelo pH e fase de crescimento para L. lactis combinando o derivado do promotor P170 do plasmideo pAMJ586 divulgado em WO 98/10079 e Madsen et al., 1999, e depositado, ao abrigo do Tratado de Budapeste, com o N° de acesso DSM 11137, com a sequência de sinal de Usp45 (van Asseldonk et al., 1990). O plasmideo pAMJ586 foi digerido com BamRI e SalI e o gene repórter lacLM foi substituído por um fragmento de DNA de 158 pares de bases contendo o sitio de ligação de ribossomas de lacLM (Israelsen et al., 1995), o péptido de sinal de Usp45 e um sitio múltiplo de clonagem na estrutura compreendendo sitios de restrição de BglII, PstI e SalI. O sitio PstI não é único devido à localização de um sitio PstI na sequência de sinal. Este fragmento de DNA de 158 pares de bases foi sintetizado por PCR utilizando pNZl020 (plasmideo que alberga o péptido de sinal de Usp45) como modelo e os "primers" Usp "primer" 1:

(5 - TA© TAG GAT ÇÇC GGG TCT AGA TTA GGG TAA CTT TGA AAG ©AT ATTCCTCATGAAAMAAA©ATTATCTCAGC 3') (ID SEQ NO: 2) e Usp "primer" 2: (5 . ACG CGT CGA CCT GCA ©ΑΘ ATC TTG TGT CAQ CGT AM CAC C 3 « ) 30 (ID SEQ NO: 3). O produto de PCR foi digerido com Bamhl e SalI e foi ligado em pAMJ586, pré-digerido com as mesmas enzimas, dando origem a pSMA610.

O pSMA610 não contém um terminador da transcrição após o sitio múltiplo de clonagem; em consequência, um terminador da transcrição de E. coli, rrnCtt ' (Albrechtsen et al.r 1990) foi amplificado por PCR utilizando pHBAl02 (Albrechtsen et al., 1990) como modelo e os "primers" Ter 1 (5' TMã TAS TCQ; ACA ACC SCSG TGT Τββ ©AO 3') ( id SEQ NO: 4) e rrnctt' Xhol (5 ' GGC ©CG CAA AAT AGC GAT 3 - ) (ID SEQ NO: 5). O fragmento foi digerido com Xhol e Sall e foi inserido no sitio Sall de pSMA610. O vector resultante foi designado pAMJ219.

Construiu-se um vector de expressão à base de P170 de elevado número de cópias, pAMJ325, por inserção de um fragmento de PCR contendo o derivado do promotor P170 forte de pAMJ752 (Madsen et al., 1999), o sitio de ligação de ribossomas de lacLM e um novo sitio múltiplo de clonagem no vector de elevado número de cópias pTRKH4 (0'Sullivan e Klaenhammer, 1993a). O plasmideo pTRKH4 foi digerido com Xbal e foi subsequentemente sujeito a tratamento de extremidades planas com o fragmento Klenow. Obteve-se o fragmento de PCR por amplificação utilizando pAMJ752 como modelo e os "primers" pAK80rev2 (5' CCC ATT TAG CCGTCAΤΤΎCAG 3 ') (ID SEQ NO: 6) e LBEp041 (5 ' GTC GAC CTG CAG AGT AGT :GAT

ATC AG A TCT AGG CAT GGG GAA TAT CCT TTC ΑΑΑ,βΤΤ 3') (id SEQ NO: 7). O fragmento de PCR foi submetido a ligação de extremidades planas ao pTRKH4 tratado com Klenow, dando origem a pAMJ325. O terminador da transcrição de E. coli, rrnctt ', foi inserido em pAMJ325 após amplificação por PCR 31 utilizando pAMJ219 como modelo e os "primers" Ter 1 e rrnctt Xhol como descrito acima. 0 vector de expressão de elevado número de cópias resultante foi designado pAMJ328. pAMJ325 e pAMJ328 não contêm um gene codificador de um sinal de secreção.

Clonagem da nuclease de Staphylococcus aureus nos vectores de expressão

Para avaliar a conveniência dos vectores de expressão para segregar a nuclease de Staphylococcus aureus (SNase), o gene NucB (Davis et al., 1977; Le Loire t al., 1994) sem o gene que codifica o péptido de sinal foi amplificado por PCR utilizando dois "primers" Nucl (5' '®3A âSÔJSlTCACAA ACA8ATMC8GC 3') (ID SEQ NO: 8) e Nuc2 (5' ACG CGT CQA GõÀ ATT CGA TGT ÂAA MT TAT MA AGT 8GC 3') (iD SEQ NO: 9). A sequência sublinhada dos "primers" indica sitios de restrição de BglI e Sall, respectivamente. Estes "primers" foram concebidos para permitir a amplificação por PCR de um fragmento de DNA de 567 pares de bases incluindo a sequência codificadora dos 168 aminoácidos C-terminais e 63 pares de bases imediatamente a seguir ao codão de terminação da tradução. 0 plasmideo pBS::nuc (Le Loire et al., 1994) contendo o gene completo da SNase num fragmento ScoRI de 871 pares de bases foi utilizado como modelo numa reacção de PCR com os "primers" Nucl e Nuc2. 0 fragmento amplificado foi subsequentemente digerido com BglII e Sall e foi inserido no pSMA610, dando origem a uma fusão de tradução do gene nucB ao péptido de sinal de Usp45. 0 plasmideo resultante foi denominado pAMJl66. 32

Noutro estudo recente desenvolvemos um vector de sonda de péptido de sinal, pASPNuc, que foi utilizado para analisar novos sinais de secreção de Lactococcus lactis (Ravn et al., 2000). Um derivado de péptido de sinal optimizado de SP310, SP310mut2, com a sequência MKFNKKiRVAlÂTRAUFVSfFnSSQDAQMERS (ID SEQ NO: 1), foi inserido em pASPNuc, dando origem ao plasmideo p310mut2.

Para explorar o nível máximo de secreção de nuclease, o derivado de P170 mais forte localizado no pAMJ752 (Madsen et al.r 1999) foi combinado com Usp45 e o péptido de sinal SP310mut2 optimizado, respectivamente. Para estas construções, pAMJl66 e p310mut2 foram digeridos com BamRI e SalI, em que o fragmento de 900 pares de bases contendo o gene que codifica o péptido de sinal e o gene da nuclease foi purificado e ligado ao fragmento BamRI-SalI de pAMJ752 contendo o promotor P170, o gene de resistência à eritromicina e o replicão do plasmideo de citrato (Israelsen et al., 1995), dando origem aos plasmídeos pSMBl93 e pSMBI109, respectivamente. O pSMBl93 e pSMBI109 foram transformados em L. lactis, dando origem às estirpes SMBI105 e SMBIlll.

Para investigar o efeito de um elevado número de cópias na secreção de nuclease construíram-se dois plasmídeos de expressão de nuclease, ambos à base de pAMJ328. pSMBl91 e pSMBl98 foram construídos por inserção dos fragmentos BamHI-SalI de 900 pares de bases de p310mut2 e pAMJ166 em pAMJ328 digerido de modo semelhante. A transformação de PSMBI91 e pSMBl98 em L. lactis deu origem às estirpes SMBI104 e SMBI106. 33

Determinações da actividade de nuclease

Determinou-se a actividade de nuclease em sobrenadantes de cultura por incubação com DNA de salmão sonicado como substrato, seguida de precipitação em ácido perclórico gelado e medição subsequente da absorvância a 260 nm (A26o)· Adicionaram-se 10 pL de amostra de uma diluição apropriada a 500 pL de tampão de ensaio (1 mg/mL de DNA, 0,1 mg/mL de Albumina do Soro Bovino, CaCl2 10 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8.8) e incubou-se o sistema a 37°C. Passados 30 minutos adicionaram-se 500 pL de ácido perclórico a 4% (p/v)

gelado. Deixaram-se precipitar os fragmentos de DNA maiores durante 15 até 30 minutos a 0°C e, por fim, foram separados dos produtos de degradação solúveis em ácido por centrifugação. Mediu-se a A26o no sobrenadante. Para se obter a A26o correspondente ao "instante zero" para cada amostra misturaram-se 500 pL de tampão de ensaio com 500 pL de PCA 4% a 0°C, adicionou-se uma amostra de 10 pL de uma diluição apropriada (Tampão de diluição: 0,1 mg/mL de Albumina do Soro Bovino, CaCl2 10 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8.8) e efectuou-se a precipitação como descrito acima. Uma unidade de nuclease é definida como a quantidade de nuclease que produzirá 1 pmole de polinucleótidos solúveis em ácido de DNA nativo por minuto. A actividade de SNase em unidades por mL de amostra é obtida da Δα26ο pela fórmula seguinte: ÍAaeaQO min) - Am (0 grân)} >; Ρ0Ϊ x SCO 10*30 em que 10 é o coeficiente de extinção milimolar a 260 nm para nucleótidos misturados e 1,01 é o volume final em mL. Para se obter uma Δα260 numa gama adequada, amostras com 34 actividade elevada foram diluídas para 0,06-0,12 unidades/ mL antes da realização do ensaio.

Caracterização de proteínas e SDS-page

Analisaram-se sobrenadantes de cultura por separação em géis de poliacrilamida 12% (NOVEX, San Diego, CA, E.U.A.) em tampão SDS-tris-glicina de acordo com as instruções do fabricante. Os géis foram corados em Azul Brilhante de Coomassie, R250 (Merck KGaA, 64261 Darmstadt, Alemanha) de acordo com o fabricante. Utilizou-se o marcador de pesos moleculares Markl2™ (NOVEX, San Diego, CA, E.U.A.) para estimar dimensões moleculares.

Determinação em bruto do número relativo de cópias por célula dos plasmídeos de número médio e elevado de cópias

Culturas cresceram durante a noite em meio GM17 (1,5 x Ml7 com 5 g/L de glucose) a 30°C. As culturas durante a noite foram diluídas 20 vezes em meio fresco e recolheram-se amostras de 10 mL durante o crescimento celular para a extracção de plasmídeos. O DNA plasmídico foi extraído de quantidades iguais de células de acordo com o protocolo de 0'Sullivan e Klaenhammer (1993b). Cada preparação plasmídica foi dissolvida em 50 pL de tampão Tris-EDTA e foi analisada por electroforese em gel de agarose após digestão com Sali. EXEMPLO 1

Secreção de nuclease de S. aureus em cultura em balão e cultura em fermentador utilizando um meio rico em nutrientes 35 1.1. Cultura em balão

Cada um dos quatro plasmídeos que expressam nuclease pSMBI91, pSMBl93, pSMBl98 e pSMBI109 foi transformado em MG1363 de L. lactis e determinou-se a actividade de nuclease após crescimento durante a noite em balões em meio GM17. Os resultados estão resumidos na Fig. 1.

Utilizando o vector de número médio de cópias, que se baseia na coluna vertebral do pAK80, a utilização do péptido de sinal de Usp45 deu origem a um rendimento cerca de 18% mais elevado de nuclease segregada relativamente à utilização do péptido de sinal SP310mut2. Esta diferença é ligeiramente maior, cerca de 23%, quando se utiliza para a expressão o vector de elevado número de cópias pTRKH4. A utilização do vector de elevado número de cópias aumentou o rendimento da SNase segregada por um factor de 2,5-3 relativamente ao vector de número médio de cópias. Este aumento é consistente com o número de cópias quatro vezes maior de pTRKH4 relativamente ao de pAK80, determinado por electroforese em gel de agarose (dados não mostrados). Isto indica que a utilização do plasmídeo com elevado número de cópias não conduz à saturação do sistema de secreção. Estes resultados estão de acordo com estudos realizados por Langella e Le Loir (1999), que demonstraram a existência de uma correlação positiva entre o número de cópias do plasmídeo e o rendimento da SNase segregada. 1.2. Cultura em Fermentador

Em experiências anteriores nas quais se utilizou ο P170 para conduzir a produção de uma β-galactosidase localizada 36 de forma intracelular (Israelsen et al., 1995) obteve-se um rendimento 5 vezes mais elevado por cultura a baixo pH 5,5 num fermentador relativamente a uma cultura em balão no mesmo meio. É provável que este aumento do rendimento resulte simplesmente de o promotor P170 ser activo durante um maior periodo de tempo em comparação com uma cultura em balão em que o pH decresce gradualmente devido à produção de ácido láctico, e atinge apenas 5,7 até 5,8 até ao final do crescimento.

Para investigar se a utilização de fermentação de pH controlado também melhoraria os níveis de produção de um produto segregado, os rendimentos de nuclease obtidos das quatro estirpes de expressão de nuclease, que cresceram em meio GM17 a pH 5,5 em fermentadores, foram determinados e analisados. Para seguir a cinética da indução da expressão genética recolheram-se amostras a diferentes valores de OD600 f tendo sido analisadas quanto à actividade de nuclease. Como esperado de estudos semelhantes com a β-galactosidase, observou-se uma produção pronunciada de nuclease dependente da fase de crescimento nas quatro estirpes testadas (dados não mostrados). Para as quatro estirpes, o nível máximo de secreção foi aproximadamente três até quatro vezes mais elevado em experiências em fermentador relativamente às experiências de cultura em balão acima (Fig. 1) . Mais uma vez, a utilização de Usp45 para a secreção de SNase foi ligeiramente mais eficiente (-12-17%) em comparação com a utilização de SP310mut2. 0 rendimento máximo foi cerca de 10 unidades/mL de SNase segregada utilizando o vector de elevado número de cópias em combinação com o péptido de sinal de Usp45. EXEMPLO 2 37

Expressão de SNase dependente do pH e da fase de crescimento num meio sintético utilizando fermentação descontínua A indução de expressão a partir do promotor P170 a baixo pH durante a transição para a fase estacionária foi previamente demonstrada no meio GM17 rico em nutrientes (Israelsen et al., 1995; Madsen et al., 1999). Este meio rico não é aceitável para a maior parte das aplicações da produção farmacêutica, pois alguns dos componentes são fontes potenciais de virus, priões ou factores alergénicos animais. Em consequência, limitaria gravemente a gama de aplicações do sistema de expressão P170 se a regulação do promotor dependesse da utilização de GM17 ou outro meio rico. Conceberam-se as presentes experiências para determinar se se poderia obter uma expressão eficaz de proteínas heterólogas utilizando o sistema de expressão P170 regulável num meio sintético, isto é, definido.

Como primeiro teste de expressão e secreção reguladas de SNase a partir de P170 num meio sintético, a estirpe SMBIlll foi cultivada no meio sintético LMl-5, que é baseado no meio SA descrito em Jensen e Hammer, 1993 (ver acima). 0 meio LMl-5 contém a mesma concentração de glucose de GM17, isto é, 5 g/L, e adicionou-se NaCl 50 mM para compensar a baixa concentração de soluto. Quatro culturas em fermentador cresceram em paralelo a pH 5,5, 6,0, 6,5 e 7,0, respectivamente. Sobrenadantes de amostras de cultura recolhidos em intervalos desde a fase exponencial até à estacionária foram avaliados quanto à actividade de nuclease. A produção de nuclease atingiu 0,81 unidades/mL a pH 5,5, 0,15 unidades/mL a pH 6,0 e permaneceu inferior a 38 0,05 unidades/mL nos dois fermentadores mantidos a pH 6,5 e 7,0, respectivamente.

Estes resultados demonstraram claramente que a regulação do pH é mantida no meio definido. Além disso, a expressão de nuclease ocorreu durante a transição para a fase estacionária, confirmando um padrão regulador idêntico do promotor P170 em meios definidos e complexos (dados não mostrados).

Os resultados também mostraram que o rendimento da produção foi cerca de quatro vezes menor do que o rendimento obtido utilizando meio GM17 (0,81 unidades/mL versus 3,11 unidades/mL, ver Fig. 1), ao passo que a OD máxima foi apenas 25% menor. É esperado que os acontecimentos fisiológicos e metabólicos que acompanham a transição para a fase estacionária sejam diferentes no LMl-5 definido e no GM17. Na cultura com LMl-5, apenas três horas separaram o crescimento exponencial do instante em que foi atingida a OD máxima e interrompida a produção de ácido, indicando que a glucose se tinha esgotado. Apenas uma quantidade insignificante de nuclease foi produzida depois de cessar o crescimento. Em GM17, a produção de nuclease ocorreu durante um período de seis horas, incluindo pelo menos quatro horas depois de terminado o crescimento e a produção de ácido. Assim, é concebível que o meio rico proporcione fontes alternativas de carbono e energia que podem suportar a síntese de proteínas após a depleção de glucose.

Desta experiência pode concluir-se que o padrão regulador do sistema de expressão dependente do pH e crescimento observado num meio rico em nutrientes e complexo, como Gml7, é mantido num meio sintético ou definido. No entanto, o rendimento do produto genético heterólogo foi 39 significativamente menor no meio definido do que o rendimento atingido utilizando um meio rico. EXEMPLO 3

Produtividade e cinética do sistema de expressão P170 num meio definido com elevada concentração de substrato utilizando fermentação descontínua

Nesta experiência tentou-se melhorar o rendimento da SNase aumentando a quantidade de componentes do meio. Realizaram-se dois conjuntos de experiências em fermentador nas quais se aumentou a concentração de glucose para 15 g/L e 30 g/L, respectivamente, no meio basal LM3, isto é, LM3-15 e LM3-30, ver acima. A estirpe SMBllll cresceu nestes meios a pH 5,5, 6,0, 6,5 e 7,0, respectivamente. Como ilustrado na

Fig. 2, as densidades celulares finais não aumentaram proporcionalmente à concentração de glucose. A ausência de uma relação linear é mais pronunciada aos valores mais baixos de pH. Este fenómeno é bem conhecido para bactérias do ácido láctico, nas quais o crescimento é muitas vezes inibido pelo ácido láctico ou outros produtos finais metabólicos antes da fonte de carbono disponível se ter esgotado (Kashket, 1987; Loubiere et al., 1997). Supõem-se que o efeito inibidor do ácido láctico esteja relacionado com a capacidade do ácido não dissociado para se difundir através da membrana celular, causando acidificação do citoplasma e desacoplamento do potencial membranar. O efeito torna-se mais forte a valores mais baixos de pH, pois estará presente uma fracção maior do total de ácido láctico/lactato na forma não dissociada. Em consequência, aumentar a concentração de glucose apenas originará um 40 maior rendimento da biomassa até um certo nível, que depende do pH (Fig. 2) .

Assim, para melhorar a produção de proteínas heterólogas, como SNase, utilizando o promotor P170 é necessário um equilíbrio entre elevado rendimento da biomassa, que requer um pH elevado, e elevada actividade do promotor P170, que deve ser óptima a pH inferior a 6,0. No entanto, é interessante notar que também ocorreu produção de SNase no meio mais concentrado, LM3-30, a pH 6,0 e 6,5, ao passo que a expressão de SNase ainda foi reprimida a pH 7,0 (Fig. 3A-D). A dependência da fase de crescimento foi claramente observada a pH 5,5, 6,0 e 6,5 (Fig. 4A-B) . Também foi observado que a densidade celular à qual ocorreu indução do P170 foi mais elevada a valores maiores de pH. Poderá mesmo esperar-se que a SNase seja produzida a pH 7,0 se a concentração de glucose for suficientemente aumentada. A produção de SNase no meio LM3-30 a pH 6,5 foi analisada por SDS-PAGE (Fig. 5). A banda proteica de 22 kDa da SNase foi claramente detectada após a transição para a fase estacionária (Fig. 5, via 5). Aparentemente o sobrenadante contém apenas uma pequena quantidade de outras proteínas.

Os resultados destas experiências também mostraram que o aumento da concentração de glucose no definido de 5 g/L (ver Exemplo 2) para 15 g/L originou um aumento significativo do rendimento do produto genético. Também foi observado que um aumento adicional da concentração de glucose, isto é, de 15 para 30 g/L, no meio LM3 originou um rendimento acrescido de SNase a pH 6,0 e 6,5 de 3,7 e 12 vezes, respectivamente. 41 EXEMPLO 4

Indução, num processo de fermentação descontínuo, da produção de SNase no sistema de expressão P170 por adição de lactato de potássio

Os resultados apresentados nas Figs. 3 e 4 sugeriram que o ácido láctico poderá induzir ο P170. A concentração de ácido láctico está fortemente correlacionada com a densidade celular na cultura. 0 efeito inibidor do lactato no crescimento celular e a indução do P170 dependem ambos do pH. Realizaram-se três fermentações em paralelo no meio LM3-30, todas mantidas a pH 7,0. À OD60o ~ 0,7-0,8 adicionou-se lactato de potássio (pH 7,0) ou cloreto de potássio para uma concentração final de 200 mM. Esta concentração de lactato será normalmente atingida à ODêoo * 7 no meio LM3-30. A adição de ambos os sais reduziu ligeiramente a velocidade de crescimento, mas apenas a adição de lactato de potássio induziu a produção de SNase (Fig. 6A-C) . Isto mostra que a actividade do P170 em L. lactis é induzida pelo lactato. Do ponto de vista prático, pode utilizar-se a adição de lactato para a indução da expressão em condições que, de outro modo, não seriam óptimas para a actividade do promotor P170. EXEMPLO 5

Aumento adicional do rendimento do produto genético no sistema de expressão P170 por aumento do nível de substrato disponível utilizando um processo de fermentação semi-descontínuo 42

Como mostrado no Exemplo 3, os rendimentos de SNase a pH 6,0 e 6,5 aumentaram 3,7 e 12 vezes, respectivamente, por aumento da concentração de glucose de 15 para 30 g/L no meio LM3 num processo de fermentação descontínuo. É de esperar que uma optimização suplementar inclua a utilização de concentrações de glucose ainda mais elevadas. Em experiências de fermentação descontínua utilizando outras construções de estirpes baseadas no sistema de expressão P170 foi previamente observado que um aumento da concentração de glucose para 50-80 g/L originou rendimentos mais elevados do produto genético. No entanto, o tempo de fermentação também foi prolongado devido ao crescimento lento, provavelmente causado por "stress" osmótico (dados não mostrados). Para evitá-lo montou-se um sistema de fermentação semi-descontínuo para adição gradual de glucose. Ligou-se uma bomba para adição de uma solução concentrada de glucose (500 g/L) à descarga da bomba de base do controlador do pH do fermentador. Nesta montagem, a glucose é adicionada em paralelo com a adição de KOH para a regulação do pH. O fornecimento de glucose seguiu a velocidade de produção de ácido na cultura e estava estritamente correlacionado com a densidade celular e requisito de substrato. A concentração de outros componentes do meio (excepto acetato e fosfato) foi aumentada cinco vezes em comparação com LMl, para prevenir a depleção de nutrientes a densidades celulares elevadas. A concentração inicial de glucose foi 5 g/L (meio LM5-5). SMBllll foi inoculada em três fermentadores contendo meio LM5-5 que foi ajustado para pH 5,5, 6,0 e 6,5, respectivamente. Iniciou-se a adição de glucose quando a produção de ácido originou redução do pH, e a taxa da 43 adição aumentou durante o crescimento activo. Em todas as culturas, a produção de ácido e adição de glucose continuaram depois de atingida a OD máxima. Uma grande parte do rendimento total de SNase foi produzida nesta fase (Fig. 7A-D). A cada pH, o rendimento total de SNase melhorou em comparação com a fermentação descontínua. Os rendimentos finais de SNase a diferentes valores de pH nos diferentes meios estão resumidos na Fig. 8. Observa-se claramente que o valor mais baixo de pH foi óptimo para a produção de SNase a baixas concentrações de glucose e que este padrão se alterou gradualmente à medida que as concentrações de glucose foram aumentadas. Nestas fermentações semi-descontínuas obteve-se o rendimento mais elevado de SNase, isto é, 33,1 unidades/mL, a pH 6,5. EXEMPLO 6

Fermentação semi-descontínua controlada pelo pH com a estirpe do vector de elevado número de cópias contendo o sistema de expressão P170 A estirpe SMBI104, contendo o plasmídeo de elevado número de cópias pSMBl91, cresceu num fermentador nas condições que originaram a quantidade mais elevada de SNase na estirpe SMBI111 (plasmídeo de número médio de cópias), isto é, meio LM5-5 com adição de glucose controlada pelo pH a pH 6,5 (Fig. 9A-B). 0 rendimento final atingido foi 54 unidades/mL, isto é, 64% mais elevado do que o obtido com SMBIlll (33 unidades/mL), o que indica que o efeito do número de cópias poderá não ser tão forte nestas condições como com GM17. É provável que estrangulamentos na maquinaria de expressão ou no sistema de secreção sejam responsáveis pela ausência de rendimentos maiores quando se 44 utiliza o plasmideo de elevado número de cópias na fermentação semi-descontinua. Como é claro da Fig. 9B, o sobrenadante obtido do meio de crescimento LM5-5 nesta experiência aparentou elevada pureza, apenas com algumas proteínas contaminantes do hospedeiro. Em geral, a quantidade de produto heterólogo (SNase) excedeu 50% do total de proteínas presentes no sobrenadante; em consequência, a utilização de apenas um ou alguns passos de purificação deve originar um produto puro de qualidade farmacêutica. A capacidade máxima de produção obtida nestas experiências utilizando o sistema de expressão P170 em Lactococcus lactis em condições de fermentação semi-descontinua foi 54 unidades de SNase segregada por mL de sobrenadante de cultura. Com base numa determinação preliminar da actividade específica da SNase (aproximadamente 550 unidades/mg), esta actividade corresponde aproximadamente a 100 mg/L de SNase segregada. É difícil comparar a eficiência de diferentes sistemas de expressão genética devido à utilização de diferentes produtos genéticos como repórteres para a produção de proteínas. No entanto, recentemente Langella e Le Loir (1999) descreveram a utilização da mesma SNase para estudos de secreção em L. lactis. Utilizando um promotor constitutivo forte e um pró-péptido sintético num vector de elevado número de cópias, estes autores obtiveram 10-25 mg/L de SNase segregada em experiências em balão utilizando um meio rico. EXEMPLO 7 45

Melhoria adicional do rendimento do produto genético obtida com o sistema de expressão PI70 num processo de fermentação s emi-descontinuo

Nos nossos esforços para aumentar possivelmente a capacidade de produção realizaram-se experiências adicionais semi-descontinuas semelhantes às experiências do Exemplo 6, mas em que o meio LM5-5 foi suplementado com extracto de levedura numa quantidade situada na gama de 1 até 10 g/L. A uma quantidade de 5 g/L de extracto de levedura, o rendimento da SNase segregada aumentou para 123 unidades/mL, que corresponde aproximadamente a 225 mg/L de SNase. Tanto quanto sabemos, esta é a quantidade mais elevada de proteína heteróloga segregada relatada até à data para bactérias do ácido láctico. EXEMPLO 8

Fase de produção prolongada por utilização de uma montagem de cultura contínua

Nas fermentações descontínuas e semi-descontinuas descritas nos Exemplos 1-7, a síntese do produto heterólogo acabaria por cessar, quer devido à falta de glucose quer devido à acumulação de produtos metabólicos (principalmente ácido láctico) . Por aplicação de vários métodos de cultura contínua foi possível prolongar a fase de produção. Testaram-se três métodos diferentes em experiências de curta duração com SMBIlll ou a estirpe AMJ627 em LM5-50 a 30°C e pH 6,5. As duas primeiras experiências foram realizadas como cultura em auxostato de pH e quimiostato. A terceira experiência incluiu uma fermentação com reciclagem de células, isto é, cultura num volume de cultura constante 46 com admissão constante de meio fresco e descarga de meio de cultura através de uma unidade de filtração.

8.1 Cultura em auxostato de pH A montagem de auxostato de pH incluiu um fermentador de volume operacional de um litro, um reservatório de 10 L de meio LM5-50 fresco e um reservatório de hidróxido de potássio 5 molar. As bombas para a adição de base e meio ao fermentador foram abertas e fechadas simultaneamente em resposta ao controlador de pH. Utilizou-se uma terceira bomba para manter um volume constante no fermentador por drenagem de fluxo em excesso por um tubo de nivelamento. Os reservatórios de meio e tampão foram colocados em balanças electrónicas, que foram utilizadas para monitorizar as quantidades adicionadas. A partir destes valores calculou-se a taxa de diluição. Foi possivel variar a razão entre a admissão de base e meio alterando a taxa de fluxo da bomba de adição de meio. Deste modo foi possivel controlar o número de moles de hidróxido de potássio por litro do volume total adicionado. Este número corresponde à capacidade de tamponamento do meio, BCR, na descrição original do método de auxostato de pH de Martin e Hemfling (1976). É esperado que a concentração de ácido láctico numa cultura de auxostato de pH de Lactococcus lactis se aproxime do mesmo valor. A estirpe utilizada para esta experiência, AMJ627, foi MG1363 contendo o plasmideo pAMJl66. Esta estirpe é semelhante a SMBllll mas contém o péptido de sinal de Usp45 e o derivado de P170 AMJ586 em vez de SP310mut2 e o derivado AMJ752. 47 A Fig. 10 mostra a BCr, concentração de lactato, taxa de diluição, densidade óptica e actividade de SNase. Após uma fase inicial de ajustamento, a BCR foi fixada em 0,22 mole/L. A concentração de lactato aumentou para 0,20-0,23 mole/L e a actividade de SNase aumentou para 20-30 unidades/mL. No entanto, a densidade óptica e a taxa de diluição diminuíram com regularidade durante esta fase. Presumivelmente, a inibição do crescimento deveu-se à produção de lactato.

Após 20 horas de operação a uma BCR de 0,22 mole/L, o valor foi reajustado para 0,11 mole/L. A concentração de lactato diminuiu e a taxa de diluição aumentou gradualmente. Durante as 8,5 horas seguintes, a OD60o estabilizou num valor ligeiramente menor e a actividade de SNase diminuiu gradualmente para 8 unidades/mL. Quando se reajustou a BCR para 0,18 mole/L, a taxa de diluição diminuiu imediatamente mas aumentou novamente durante as 14 horas seguintes, ao passo que o nível de SNase aumentou ligeiramente para 10 unidades/mL.

Adicionou-se um volume total de 10 L de meio fresco. Depois de terminada a adição do meio deixou-se a cultura crescer até à fase estacionária. A actividade final de SNase foi mais elevada do que numa cultura descontínua paralela no mesmo meio, 53 unidades/mL versus 27 unidades/mL.

Apesar do processo não ter atingido um estado estacionário durante esta experiência, foi claro que tanto o crescimento como a produtividade da cultura reagiram a alterações na razão entre o meio de hidróxido de potássio adicionados ao fermentador. Atingiu-se um nível de SNase relativamente elevado a uma capacidade de tamponamento de 0,22 mole/L, 48 mas a velocidade de crescimento e taxa de diluição diminuíram nestas condições. Quando a capacidade de tamponamento foi primeiramente reduzida para 0,11 mole/L e depois aumentada novamente para 0,18 mole/L, obteve-se uma taxa de diluição mais elevada mas um nivel inferior de SNase. Poderá encontrar-se um valor óptimo da capacidade de tamponamento entre 0,18 e 0,22 mole/L. 8.2 Cultura em químíostato SMBIlll cresceu em três fermentadores de um litro com pH mantido a 6,5 por adição de hidróxido de potássio 3 Μ. A um valor OD6oo de aproximadamente 5 iniciou-se a adição de meio de dois dos fermentadores a diferentes taxas, 0,07 e 0,14 L/hora. Manteve-se o volume constante por uma bomba de drenagem de cultura por um tubo de nivelamento.

Apresentam-se na Fig. 11 a densidade óptica e a actividade de SNase nas culturas. A cultura descontínua atingiu uma OD6oo máxima de 9,9 num período de 14 horas e terminou a produção de ácido às 16 horas. A actividade de SNase foi 17 unidades/mL no final da fermentação. Deixaram-se as duas fermentações contínuas em operação durante mais 16-17 horas, originando um rendimento médio global de 1,65 L e 3,0 L, respectivamente. A densidade óptica máxima foi menor em ambos os casos do que na cultura descontínua, e o decréscimo da OD subsequente mostrou que a velocidade de crescimento específica foi menor do que a taxa de diluição (Fig. 11). No entanto, o nível de SNase continuou a aumentar durante pelo menos seis horas depois de atingido o máximo da OD e foi apenas reduzido em 10-20% quando se terminou a adição de meio 10 horas mais tarde. A actividade de nuclease global na cultura em fermentador mais a cultura 49 recolhida da descarga está apresentada na tabela abaixo. (Poderá ter ocorrido alguma produção adicional na cultura recolhida.)

Tabela 2

Actividade de SNase Descontínuo Contínuo, Contínuo, (unidades) em: 0,07 L/hora 0,14 L/hora Fermentador 20 000 33 000 17 000 Descarga recolhida 40 000 40 000 Actividade total 20 000 73 000 57 000 Unidades/L de meio 20 000 27 500 14 300 Duração (horas) 16 32 32 Unidades/hora 1 250 2 280 1 780

Ambas as fermentações contínuas originaram um rendimento global mais elevado de SNase do que a cultura descontínua. À taxa de diluição mais elevada, o rendimento por litro de meio foi menor do que na cultura descontínua. No entanto, dependendo do custo das horas operacionais na instalação de fermentação em comparação com o custo do meio, o processo contínuo ainda poderá ser vantajoso comparado com uma série de processos descontínuos, que seriam separados por tempo não operacional para a preparação do meio e para limpeza e esterilização do equipamento.

Em ambos os casos, a densidade celular diminuiu após as primeiras 14-15 horas e a produtividade diminuiu após 32 horas. Isto foi provavelmente causado por inibição proveniente do lactato produzido na cultura. Para se obter uma produção estável a uma densidade mais elevada seria necessário reduzir a concentração de glucose no meio de 50 admissão para um valor em que pudesse ser produzido menos ácido láctico. 8.3 Cultura com reciclagem de células e substituição contínua de meio

Nas experiências em quimiostato descritas acima, a capacidade de produção diminuiu devido à remoção continua de cultura do reactor. Esta situação foi evitada por reciclagem das células para o reactor.

Ligou-se um dispositivo para filtração com fluxo tangencial (Vivaflow 50, 0,2 pm, Vivascience) a um fermentador de um litro por tubagem de silicone. A estirpe SMBIlll cresceu em meio LM5-50 a pH 6,5 no fermentador. A uma densidade óptica de aproximadamente 5 iniciou-se a adição de meio LM5-50 fresco à cultura a uma taxa de 0,13 L/hora. Na mesma altura iniciou-se a filtração com fluxo tangencial do meio da cultura. O fluxo do concentrado que foi circulado novamente para o fermentador foi 40-45 mL/minuto, e a taxa de filtração, aproximadamente 2 mL/minuto, foi ajustada para manter constante o volume da cultura.

Adicionou-se à cultura um volume total de 3 L de meio num período de 24 horas. Durante este período de tempo, a densidade óptica aumentou para 19,8 e a actividade de SNase aumentou para 41 unidades/mL (Figura 12) . O rendimento global de SNase foi 112 000 unidades, incluindo 71 000 unidades presentes no filtrado recolhido.

Neste caso em que as células produtoras não são perdidas da cultura deve ser possível continuar o processo até que, por fim, a filtração seja impedida por elevada densidade 51 celular ou que limitações fisiológicas evitem o crescimento e produção de SNase suplementares. Pode obter-se uma melhoria adicional da produtividade por optimização do pH da cultura, concentração do substrato e taxas de fluxo.

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Lisboa 8 de Fevereiro de 2010

Claims (23)

1. 59 REIVINDICAÇÕES 1. Método para produzir um péptido, polipéptido ou proteína heteróloga numa bactéria do ácido láctico, cujo método compreende os passos seguintes: (i) construir uma bactéria do ácido láctico recombinante compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica para o péptido, polipéptido ou proteína heteróloga e operativamente ligada àquela, sequências de nucleótidos reguladoras apropriadas para controlar a expressão da sequência codificadora, (ii) cultivar a referida bactéria recombinante em condições de cultura semi-descontínuas ou contínuas para expressar o gene e (iii) recolher a bactéria recombinante ou o péptido, polipéptido ou proteína.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a célula recombinante compreende um promotor constitutivo operativamente ligado à sequência codificadora.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a célula recombinante compreende um promotor regulável operativamente ligado à sequência codificadora.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o promotor regulável é regulado por um factor seleccionado do grupo que consiste no pH, temperatura de crescimento, teor de oxigénio, desvio da temperatura que induz a expressão de um gene de choque térmico, composição do meio de crescimento, incluindo a força iónica e teor de NaCl, presença/ausência de um 60 constituinte celular essencial ou seus precursores, acumulação intracelular ou no meio de um metabolito, fase de crescimento da bactéria do ácido láctico e velocidade de crescimento da bactéria do ácido láctico.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que o promotor regulável é derivado de uma bactéria do ácido láctico.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o promotor regulável é o promotor P170 regulável pelo pH ou seu derivado regulável pelo pH.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o promotor é introduzido na bactéria do ácido láctico num replicão de replicação autónoma.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o promotor é um promotor não naturalmente associado à sequência de nucleótidos que codifica para o péptido, polipéptido ou proteína heteróloga.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o péptido, polipéptido ou proteina heteróloga é seleccionado do grupo que consiste numa enzima e um composto farmacêutico activo.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de nucleótidos codificadora está operativamente ligada a uma sequência de nucleótidos que codifica para um péptido de sinal (SP). 61
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o péptido de sinal é seleccionado do grupo que consiste no péptido de sinal de Usp45 e no péptido de sinal que 61 tem a sequência MKFHKKRVAIATFiAUFVSFFTISSQDAQAASRS ID SEQ NO : 1) .
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, em que a bactéria do ácido láctico é cultivada num meio quimicamente definido.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a concentração de glucose é mantida numa concentração pré-seleccionada de pelo menos cerca de 0,5 g/L por adição controlada de glucose.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o controlo da adição de glucose ao meio está ligado ao controlo do pH.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o meio quimicamente definido é suplementado com extracto de levedura.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a quantidade de extracto de levedura se situa na gama 0,1-10 g/L.
17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, em que o rendimento do péptido, polipéptido ou proteina heteróloga é pelo menos 5 mg/L. 62 Método de acordo com a reivindicação 17, em que o rendimento do péptido, polipéptido ou proteína heteróloga é pelo menos 100 mg/L. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o rendimento do péptido, polipéptido ou proteína heteróloga é pelo menos 200 mg/L.
18. 20. Método da reivindicação 1 utilizando um meio basal quimicamente definido (meio LMl) para a cultura de bactérias, em que o meio consiste no seguinte: Componente Concentração, mM ou +/- L-Alanina 3,4 L-Arginina 1,1 L-Asparagina co o L-Cisteína co o L-Glutamato 2,1 L-Glutamina 0,7 Glicina 2,7 L-Histidina 0, 3 L-Isoleucina O co L-Leucina o co L-Lisina.HC1 1,4 L-Metionina 0,7 L-Fenilalanina 1,2 L-Prolina 2, 6 L-Serina 2,9 L-Treonina 1,7 L-Triptofano 0,5 L-Tirosina 0,3 L-Valina 0, 9 63 Componente Concentração, mM ou +/- K2S04 0,28a kh2po4/k2hpo4 4/6 Acetato de Na 15 CaCl2 0,0005a MgCl2 0,52a FeS04 0,01a Vitaminasb + Micronutrientesa,c + Ácido cítrico 0,1 De Neidhardt et al., J. Bacteriol. 119: 736-747 b Vitaminas: biotina 0,4 μΜ, piridoxal-HCl 10 μΜ, ácido fólico 2,3 μΜ, riboflavina 2,6 μΜ, niacinamida 8 μΜ, tiamina-HCl 3 μΜ e pantotenato 2 μΜ c Micronutrientes: (NH4) 6 (M07 ) 24 0 , 0 0 3 μΜ, H3B04 0, 4 μΜ, CoCl2 0,03 μΜ, CuS04 0,01 μΜ, MnCl2 0,08 μΜ e ZnS04 0,01 μΜ
19. 21. Utilização de um meio como definido na reivindicação 20 num processo de cultura semi-descontinuo ou continuo utilizando bactérias do ácido láctico.
20. 22. Método da reivindicação 1 utilizando um meio quimicamente definido (meio LM3) para cultivar bactérias, em que o referido meio quimicamente definido (meio LM3) contém todos os componentes do meio da reivindicação 20 em quantidades triplicadas, com a excepção dos fosfatos e acetato de sódio cujas quantidades respectivas são mantidas no mesmo nivel do meio LMl.
21. 23. Método da reivindicação 1 utilizando um meio quimicamente definido (meio LM5) para cultivar 64 bactérias, em que o referido meio quimicamente definido (meio LM5) contém todos os componentes do meio da reivindicação 20 em quantidades quintuplicadas, com a excepção dos fosfatos e acetato de sódio cujas quantidades respectivas são mantidas no mesmo nivel do meio LMl.
22. 24. Método da reivindicação 1 utilizando um meio quimicamente definido como descrito em qualquer uma das reivindicações 20-23 que adicionalmente contém glucose numa quantidade situada na gama de 1-100 g/L.
23. 25. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o meio quimicamente definido é o meio definido em qualquer uma das reivindicações 20, 22-24. Lisboa, 8 de Fevereiro de 2010