JP2004511248A - 乳酸菌における異種遺伝子産物の製造のための改良発酵法 - Google Patents
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Abstract
ｉ） 異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及びコード配列の発現と遺伝子産物の分泌を制御するための適当な制御ヌクレオチド配列、例えば制御プロモーター及びシグナルペプチドからなる組換え乳酸菌を構築し、
（ｉｉ） 遺伝子を発現させる流加培養又は連続培養条件下で組換え細菌を培養し、かつ
（ｉｉｉ） 組換え細菌又は遺伝子産物を回収する工程
からなる、乳酸菌において異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造するための流加培養又は連続方法。好ましくは、培養培地は、化学的に定義されているか、又は酵母抽出物で任意に補充された合成培地である。
（ｉｉ） 遺伝子を発現させる流加培養又は連続培養条件下で組換え細菌を培養し、かつ
（ｉｉｉ） 組換え細菌又は遺伝子産物を回収する工程
からなる、乳酸菌において異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造するための流加培養又は連続方法。好ましくは、培養培地は、化学的に定義されているか、又は酵母抽出物で任意に補充された合成培地である。
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、最も広い観点で、組換えＤＮＡ技術を用いて組換えの細菌細胞、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造する分野、特に乳酸菌宿主細胞における遺伝子発現系の使用に関する。詳細には、この発明は、異種のペプチド、ポリペプチド又は酵素及び医薬的に活性な生成物を含むタンパク質の乳酸菌における効果的な製造を可能にするような遺伝子発現系を用いる流加培養又は連続的な発酵法を提供する。
【０００２】
従来技術及び技術背景
所望の遺伝子産物の過剰発現のための適切な系を選択するには、多くの検討を行う必要がある。重要な問題には、必要とされる異種遺伝子産物の収率、発現系を用いる損害（ｃｏｓｔ）及び生産宿主で産生される組換え遺伝子産物の確実性／生物活性が含まれる。
異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の高レベルな生産は宿主細胞に負担となるので、培養期間の延長を避け、非生産変異体を選択する危険性を最小限にするため、誘導性、つまり生産生物の増殖中に抑制され得る制御可能な遺伝子発現系を使用するのが有利な可能性がある。
【０００３】
産業規模での生産に適当な誘導性発現系を開発するには、系の誘導が技術的な困難性を伴わないか、高価であるか、もしくは毒性の物質の使用を伴わないことも重要である。生産生物から得られる生成物の量に加えて、生産される遺伝子産物の純度が極めて重要である。全細胞溶解物に含まれる生成物の高収率は、望ましくない宿主細胞成分を除くために必要な以降の下流処理の工程中に実質的に減少される可能性がある。したがって、グラム−陰性細菌の周辺細胞質又はグラム−陽性細菌の細胞外環境いずれかへの分泌が、一般的には好ましい。
【０００４】
これまでのところ、エシェリキア・コリとバシラス・ズブチルスが、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質の組換え生産用に最も広く使用される細菌宿主生物である。これらの生物の分子生物学は、他の全原核細胞微生物のそれを上回るレベルに特徴付けられており、この広範囲な研究は、これらの細菌における異種遺伝子の容易なクローニングと発現を可能にする遺伝的手段の大きなコレクションを生じる基礎を形成している。
【０００５】
しかし、最近１０年のあいだ、同種又は異種のペプチド、ポリペプチド及びタンパク質の生産用細胞工場としての乳酸菌（ＬＡＢ）、特にラクトコッカス・ラクチスの開発に焦点が集まっている。ＬＡＢは、幾つかの点で異種遺伝子産物の製造に有利である。医薬上の適用のための組換えペプチド、ポリペプチド及びタンパク質の生産と投与は、世界中で規定の当局によって厳密な要求を受けている。例えば、大部分のグラム−陰性細菌の細胞壁成分であるエンドトキシンは、最終製品には存在すべきではない。乳酸菌は、エンドトキシンを生産せず、そのために、魅力的なタンパク質生産宿主生物となっている。加えて、エル．ラクティス株を含む幾つかの乳酸菌株は、細胞外プロテアーゼを生産せず、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を分泌でき、遺伝子産物の安定性を高く確保し、その後の精製を容易にすることができる
【０００６】
乳酸菌で用いるための誘導性遺伝子発現系を見込む幾つかの計画（Ｋｏｋ， １９９６； Ｋｕｉｐｅｒｓら、１９９７； Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ 及びＫｌａｅｎｈａｍｍｅｒ， １９９８）は、エル．ラクティス及びそのファージにおける遺伝子発現の制御に焦点をあてた研究をとおして達成されている。有用な乳酸菌発現系には、エル．ラクティスにおける抗微生物ペプチドのナイシンの生合成を制御する２成分系からの遺伝的要素に基づくＮＩＣＥ系が含まれる（ｄｅ Ｒｕｙｔｅｒら、１９９６）。２つの他の有用な誘導性発現系は、エル．ラクティスバクテリオファージＯ３１（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９９６； Ｗａｌｋｅｒ 及びＫｌａｅｎｈａｍｍｅｒ， １９９８）とｒ１ｔ（Ｎａｕｔａら、１９９７）由来の遺伝的要素に基づいている。
トランスポゾン、組込みベクター又はプラスミド中のプロモーターレスレポーター遺伝子（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎら、１９８７；Ｉｓｒａｅｌｓｅｎ 及び Ｈａｎｓｅｎ， １９９３；Ｓａｎｄｅｒｓら、１９９８）を用い、ＬＡＢで誘導性プロモーターを同定した。これらのプロモーターは、ｐＨ（Ｉｓｒａｅｌｓｅｎら、１９９５）及び塩濃度（Ｓａｎｄｅｒｓら、１９９８）のような環境変化によって誘導される。
【０００７】
宿主細胞により生じる代謝産物又は宿主細胞の成長中に天然に生じる条件によって誘導される遺伝子発現系は、低コスト及び誘導因子の食品グレードの状態により産業上興味深い。したがって、エル．ラクティスで用いるための新規な遺伝子発現系の開発で、共有されている公表された国際特許出願ＷＯ ９４／１６０８６ 及びＷＯ ９８／１００７９に開示されるようなｐＨ誘導性のＰ１７０及びその誘導体を含む誘導性プロモーターを利用した。Ｐ１７０プロモーターからの転写は、定常期への同時移行中に低ｐＨによって誘導され、つまり発現が指数的成長期中に抑制される。最近の研究で、Ｐ１７０プロモーターは詳細に特徴づけられ、本来の発現レベルは、制御に影響することなく遺伝工学により約１５０〜２００倍に増加された（Ｍａｄｓｅｎら、１９９９）。
【０００８】
乳酸菌宿主細胞を用いて費用−効果的な遺伝子産物レベルに達するための試みは将来有望であるが、しかし、そのような生産系の生産性を増すには持続的な産業上の必要性がある。さらに、培地が生産物の最終消費者に健康上危険な可能性がある潜在的に危険な成分を含まない発酵法を提供する必要がある。そのような望ましくない成分の例には動物ウイルス及びプリオンが含まれ、その存在は、窒素成分などの動物由来成分を含む従来の発酵培地中で完全に除くことができない。しかし、最も現在使用されている発酵培地は、そのような動物由来成分を含む化学的に定義されない培地である。
したがって、絶対に安全で、所望の遺伝子産物を現在の製造法と同一、好ましくはより高い収率で提供できる、異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造する方法を提供することが、強く求められている。
【０００９】
乳酸菌宿主細胞を用いる異種遺伝子産物の現在の製造法は、化学的に定義されていない、栄養素がリッチな培地中での宿主細胞の回分培養に基づいている。この発明は、そのような製造法における化学的に定義される、つまり合成培地の使用を包含する。従来の回分法でのそのような培地の使用は、遺伝子産物の収率を、従来の栄養素がリッチで化学的に定義されていない培地で達成されるよりも著しく低くすることが分かった。しかし、この問題は、製造法を連続法又は流加培養法として行うことによって克服できることが分かった。
【００１０】
発明の要約
したがって、この発明は、最も広い観点では、（ｉ）異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び操作可能に連結される、コード配列の発現を制御するための適当な制御ヌクレオチド配列からなる組換え乳酸菌を構築し、（ｉｉ）遺伝子を発現させる流加培養又は連続培養条件下で組換え細菌を培養し、かつ（ｉｉｉ）組換え細菌、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を回収する工程からなる、乳酸菌において異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造する方法を提供する。
【００１１】
適当な制御ヌクレオチド配列には、構成プロモーター又は制御可能な、つまり誘導性のプロモーターが含まれる。制御可能なプロモーターが使用される例では、そのようなプロモーターは、組換え菌の培養中に存在する環境因子によって制御されることが好ましく、それは、培地に誘導性物質を追加する必要がないことを意味する。特に有用な制御可能なプロモーターには、ＷＯ ９４／１６０８６及びＷＯ ９８／１００７９に開示される乳酸菌ｐＨ制御可能なプロモーターＰ１７０及びその誘導体が含まれる。
さらなる観点では、この発明は、以下からなる乳酸菌を培養するための化学的に定義される基礎培地（ＬＭ１ 培地）に関する。
【００１２】
【表２】
【００１３】
ａ Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １１９：７３６−７４７から
ｂ ビタミン： ０．４μＭビオチン、１０μＭピリドキサル−ＨＣｌ、２．３μＭ葉酸、２．６μＭリボフラビン、８μＭナイアシンアミド、３μＭチアミン−ＨＣｌ 及び２μＭパントテン酸塩
ｃ 微量栄養素： ０．００３μＭ （ＮＨ４）６（ＭＯ７）２４、０．４μＭ Ｈ３ＢＯ４、０．０３μＭ ＣｏＣｌ２、０．０１μＭ ＣｕＳＯ４、０．０８μＭ ＭｎＣｌ２及び０．０１μＭ ＺｎＳＯ４
【００１４】
さらなる観点では、この発明は、リン酸塩と酢酸ナトリウムを除くＬＭ１培地の全成分を３倍量で含む（各量はＬＭ１培地と同一レベルに維持される）乳酸菌を培養するための化学的に定義される培地（ＬＭ３培地）、及びリン酸塩と酢酸ナトリウムを除くＬＭ１培地の全成分を５倍量で含む（各量はＬＭ１培地と同一レベルで維持される）乳酸菌を培養するための化学的に定義される培地（ＬＭ５培地）に関する。
【００１５】
発明の詳細な開示
この発明のひとつの主たる目的は、組換え乳酸菌を製造し、乳酸菌で異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造する改良法を提供することである。
ここで用いられるように、用語「乳酸菌」は、優勢に製造される酸として乳酸を含む酸の製造とともに糖を発酵するグラム−陽性の微好気性又は嫌気性の細菌を示す。産業上もっとも有用な乳酸菌は、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバシラス種、ロイコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム種及びプロピオニバクテリウム種に見られる。さらに、乳酸菌群には、単独で又は乳酸菌との組み合わせで食品のスターター培養物として頻繁に用いられ、厳密には嫌気性細菌群に属する乳酸生産菌、ビフィドバクテリア、つまりビフィドバクテリア種が一般的には含まれる。
【００１６】
この方法の第一工程で、組換え乳酸菌は、所望の異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及びそれに操作可能に連結される、コード配列の発現を制御するための適当な制御ヌクレオチド配列を含むよう構築される。そのような構築は、当該分野で周知の方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載される方法を用いて行うことができる。
【００１７】
有用な具体例では、所望の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、リパーゼ、ペプチダーゼ、キモシンのような乳凝固活性を有するアスパラギン酸プロテアーゼ、ペプシン及び微生物由来のアスパラギン酸プロテアーゼをはじめとするプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼと他の澱粉分解酵素を含む炭水化物代謝に関与する酵素、グルコースオキシダーゼ及びヘキソースオキシダーゼを例として含むオキシドリダクターゼ、及び溶解酵素を含む酵素をコードする配列、キャプシドタンパク質のようなウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列、微生物細胞表面タンパク質構造をコードする配列及び例えばナイシン、ロイテリン及びペディオシンのようなバクテリオシンをコードする配列から選択される。また、ヌクレオチド配列は、抗生物質耐性を付与する遺伝子産物をコードする配列であってもよい。
【００１８】
特に興味深い例では、組換え乳酸菌は、微生物毒素を含む生物学的に機能的な遺伝子産物、免疫学的に活性なペプチド又はポリペプチド、医薬上活性なペプチド、ポリペプチド又はタンパク質及び抗微生物学的に活性なペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
この明細書で、免疫学的に活性な遺伝子産物は、少なくとも１つのエピトープを含むいずれかのアミノ酸配列を含む。そのような配列は、ワクチン及び／又は診断剤として有用で、ヒトを含む哺乳動物のような動物の免疫化が必要なあらゆる病原性生物に由来することができる。コードするヌクレオチド配列によって発現されるエピトープは、培養培地へ細胞から分泌されるものであってもよく、あるいは宿主生物の外表面に位置し、それにより組換え細胞自体のワクチンとしての適用を可能にすることが理解される。あるいは、エピトープは、細胞から単離される際には、細胞内に生ずることができる。エピトープを発現させる別の興味深い手段は、免疫学的に活性型のエピトープが融合タンパク質の一部として発現されるように、別のコード配列にエピトープをコードするヌクレオチド配列を挿入することによる。
【００２０】
詳細な例では、コードヌクレオチド配列は、マイコバクテリアの抗原決定基つまりエピトープ、すなわちヒトを含む動物への投与時に体液性及び／又は細胞性免疫反応に刺激作用を有する免疫学的に活性なオリゴペプチド又はポリペプチドをコードする。特に、そのようなコード配列は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、エム．ボビス及びエム．アフリカヌムを含む、「結核複合体」として一般的に言及されるマイコバクテリア種の群に属する生物に由来していてもよい。マイコバクテリア起源のそのような抗原性遺伝子産物は、結核皮膚試験で結核ワクチン及び／又は診断試薬として使用できる可能性を有する。乳酸菌のような安全な非病原性生物におけるヒト及び動物が用いるワクチン及び診断上活性な剤の産業上の生産が非常に有利であることは明らかである。
【００２１】
さらなる有利な具体例では、コードするヌクレオチド配列は、モノクローナル及びポリクローナル抗体を含む抗体をコードする配列である。そのようなコード配列は、鳥、哺乳動物及びヒトを含むあらゆる動物源に由来することができる。
本発明の方法によれば、組換え細胞は、コードヌクレオチド配列に操作可能に連結された少なくとも１つの構成プロモーター又は少なくとも１つの制御可能なプロモーターを含んでいてもよく、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合できる部位を示すために通常の意味で用いられる。
【００２２】
プロモーター領域は、本発明によれば、いずれかの原核細胞に由来してもよいが、好ましい例では、上記の種を含む乳酸菌種及びビフィドバクテリウム種に由来する。有用な具体例では、プロモーター領域は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスを含むラクトコッカス・ラクティス、例えばＭＧ１３６３と称される株［この株はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとしても文献（Ｎａｕｔａら、１９９６）で言及される］、及びラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス生物型ジアセチルラクティスのプロモーター領域に由来する。プロモーターＰ１７０からなる領域及びその誘導体（その例はＷＯ９８／１００７９に開示される）を含む組換え乳酸菌の構築に有用な本発明によるかかるプロモーター領域の例は、ＷＯ９４／１６０８６に示されている。
【００２３】
上記のとおり、組換え乳酸菌で用いられるプロモーターは制御可能なプロモーター又は誘導性プロモーターであるのが、所定の目的のためには有利である。プロモーターを制御又は誘導する因子には、温度及び光のような物理的条件、例えばＩＰＴＧ、トリプトファン、乳酸塩又はナイシンのような化学物質を含むプロモーター配列の活性を制御できる物理的かつ化学的なあらゆる因子が含まれる。現在好ましい例では、この発明で使用される制御可能なプロモーターは、培養工程中に生じる環境因子又は成長条件因子によって制御される。そのような制御可能なプロモーターを用いる利点は、培養培地に誘導性化合物又は制御化合物を加える必要がないことである。そのような制御因子は、ｐＨ、成長温度、酸素含量、熱ショック遺伝子の発現を誘導する温度シフト、イオン強度／ＮａＣｌ含量を含む成長培地の組成、細胞内又は乳酸／乳酸塩を含む代謝物の培地中での蓄積、必須細胞構成物又はその前駆体の有無、細菌の成長期又は細菌の成長速度から選択される。
【００２４】
プロモーターが、その誘導又は制御が成長培地に存在する１以上の物質によって制御されるプロモーターであるときに、通常そのような培地の成分ではない物質、例えば抗生物質又はバクテリオシンが、本発明によれば、環境又は成長条件因子として一般には含まれないことは理解されたい。
【００２５】
ひとつの好ましい例では、プロモーターと異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチドは、プラスミド、トランスポゾン因子、バクテリオファージ又はコスミドのような自律複製レプリコンで乳酸菌に導入される。少なくともコード配列が宿主細胞染色体に組みこまれる条件でプロモーターとコード配列を導入することが、コード配列の細胞での維持を安定にするので、有利であり得る。あるいは、異種のコード配列は、選択された宿主生物の染色体に天然に存在するプロモーターに操作可能に連結される位置で宿主細胞の染色体に導入される。つまり、さらなる具体例では、異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターは、コード配列と天然には結合していないプロモーターである。
【００２６】
さらに有利な具体例では、コードヌクレオチド配列は、遺伝子産物が細胞膜を越えて培地に分泌されることを許容するシグナルペプチド（ＳＰ）をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結される。ＳＰは、 Ｓｅｃ−依存性分泌タンパク質に存在するＮ−末端伸長である。典型的なＳＰの構造は、３つの異なる領域を含む： （ｉ） 正に帯電したアミノ酸、リジン及びアルギニンを幾つか含むＮ−末端領域； （ｉｉ） 中心の疎水性コア及び； （ｉｉｉ） シグナルペプチダーゼによって認識される配列モチーフを含む親水性Ｃ−末端。分泌のために標的化されるタンパク質は、Ｎ−末端にシグナル配列又はシグナルペプチド（ＳＰ）を含む。ＳＰは、細胞膜を介する移動中に細胞の分泌機序の成分であるリーダー又はシグナルペプチダーゼによって認識され、切断される。ＳＰは、グラム−陽性細菌で通常２５アミノ酸〜３５アミノ酸（ａａ）以上の大きさである。ＳＰは、配列ホモロジーを共有しないが、しばしば１以上の塩基性ａａを含むアミノ末端、７以上のａａの中心疎水性コア及びシグナルペプチダーゼによって認識されるモチーフを含む親水性カルボキシ末端からなる。エル．ラクティス由来の利用可能なＳＰの調査は、主に分泌されるラクトコッカスタンパク質であるＵｓｐ４５由来のＳＰの使用を示唆した（ｖａｎ Ａｓｓｅｌｄｏｎｋら、１９９０）。このＳＰは、エル．ラクティスで幾つかの異種タンパク質の分泌に機能的であることが報告された（ｖａｎ Ａｓｓｅｌｄｏｎｋら、１９９３）。
【００２７】
詳細な具体例では、シグナルペプチドは、Ｕｓｐ４５シグナルペプチドと配列ＭＫＦＮＫＫＲＶＡＩＡＴ−ＦＩＡＬＩＦＶＳＦＦＴＩＳＳＱＤＡＱＡＡＥＲＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）を有するシグナルペプチドからなる群から選択される。
本発明による方法の以降の工程では、こうして得た組換え乳酸菌を、所望の遺伝子産物をコードする配列を発現させる流加培養又は連続培養条件で培養し、培養中（連続時）又は培養工程の終了時（流加培養時）に、細胞、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を分離する従来技術を用いて組換え細胞又はペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を回収する。
【００２８】
もっとも広い意味において、表現「流加培養」は、１以上の栄養素が培養中に培養容器又はバイオリアクターに供給され、培養細胞と遺伝子産物が操作の最後まで依然として封入される培養技術として定義される。幾つかの場合、全ての栄養素は、徐々にバイオリアクターに供給される。ここで用いられるように表現「連続培養」は、全栄養素が連続的に培養容器又はバイオリアクターに添加され、培地及び／又は細胞培養の画分が供給された栄養素と同一の流速で除かれ、一定の培養量を維持する培養法を記載するために用いられる。
本発明のこれらの培養方法とは逆に、従来の「回分」培養は、好気処理中における分子酸素及びｐＨ調整のための化学物質を除いて、培養操作中に必要な全栄養素が培養の開始前に培地に添加される方法である。
【００２９】
時間−温度条件、ｐＨ条件及び通気条件、関連する際には、バイオリアクターへの栄養素の供給速度は、使用される乳酸菌の特定の型に依存するであろう。そのような条件の詳細な例を、以下の実施例で示す。一般的に、上記条件下の流加培養は、１５〜４０℃の温度範囲かつ４〜８のｐＨ範囲で２４〜７２時間行われる。この発明による連続培養法は、数１００時間のような長期間のあいだこれらの温度とｐＨ条件で行ってもよい。
【００３０】
方法の現在好ましい具体例では、組換え乳酸菌は、化学的に定義される培地で培養される。ここで用いられるように表現「化学的に定義される培地」は、定義されない窒素又は炭素源、例えば動物又は植物のタンパク質もしくはタンパク質加水分解組成物又は例えば糖蜜もしくはコーンスティープリカーのような複雑な炭素源を本質的に含まないが、窒素源がアンモニア又はアミノ酸のような十分に定義された無機又は有機化合物であり、かつ炭素源がグルコースのような十分に定義された糖である培地を意味する。さらに、そのような合成培地は、塩、例えば硫酸塩、酢酸塩、リン酸塩及びアルカリならびにアルカリ土類金属の塩化物、ビタミン及び微量栄養素のような無機成分を含む。この発明の目的のため、化学的に定義された培地の例をここに示す。これらの培地は単なる例であることを認識されたい。当業者は、上記の培養条件下で組換え乳酸菌の培養を許容する他の培地を提供できるであろう。
【００３１】
この方法で用いられる合成培地は、炭素源を含む必要がある。炭素源の濃度は、組換え乳酸菌の種類と選択された培養条件に依存する。有用な具体例では、炭素源はグルコースである。好ましい具体例では、培養中のグルコース濃度は、流加培養法での制御されたグルコース供給によって、又は連続培養法での完全なグルコース含有完全培地の供給によって、少なくとも約０．５ｇ／Ｌの予備選択濃度に維持される。培養培地中のグルコース濃度は、少なくとも５ｇ／Ｌ、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０、８０又は１００ ｇ／Ｌであることが好ましい。
【００３２】
本発明によれば、流加培養法で培地へのグルコース供給を制御するひとつの簡便な方法は、バイオリアクターのｐＨ制御手段にそのような供給を連結又は接続することである。こうして、グルコースの供給が、ｐＨを制御する基礎の自動添加制御手段によって作動される。同様に、連続培養法では、完全培地の供給は、ｐＨのオーキソスタット（ａｕｘｏｓｔａｔ）原理によるｐＨの制御に関連付けることができる。
純粋な合成培地を用いて十分な収率の遺伝子産物を得ることができることが分かったが、収率は、上記の化学的に定義された培地を酵母抽出物とともに供給することでさらに増加できることが見出された。酵母抽出物の適当な量は、例えば１〜５ｇ／Ｌの範囲のような０．１〜１０ｇ／Ｌの範囲の量である。したがって、この明細書で、「化学的に定義された培地」は、適当な量の酵母抽出物で富化された化学的に定義された培地を含んでいてもよい。
【００３３】
この発明の主たる目的は、遺伝子産物を高収率で製造する方法を提供することである。したがって、好ましい具体例では、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の収率は、少なくとも５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも５０ｍｇ／Ｌを含む少なくとも２０ｍｇ／Ｌである。特に好ましい具体例では、得られる収率は、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ及び少なくとも２００ｍｇ／Ｌを含む少なくとも１００ｍｇ／Ｌである。
上記のように、この発明は、さらなる観点では、以下からなる、細菌を培養するための具体的に化学的に定義された基礎培地（ＬＭ１培地）に関する：
【００３４】
【表３】
【００３５】
ａ Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １１９：７３６−７４７から
ｂ ビタミン：０．４μＭビオチン、１０μＭピリドキサル−ＨＣｌ、２．３μＭ葉酸、２．６μＭリボフラビン、８μＭナイアシンアミド、３μＭチアミン−ＨＣｌ 及び２μＭパントテン酸塩
ｃ 微量栄養素： ０．００３μＭ （ＮＨ４）６（ＭＯ７）２４、０．４μＭ Ｈ３ＢＯ４、０．０３μＭ ＣｏＣｌ２、０．０１μＭ ＣｕＳＯ４、０．０８μＭ ＭｎＣｌ２及び０．０１μＭ ＺｎＳＯ４
【００３６】
また、各量がＬＭ１培地と同一レベルに維持されている、リン酸塩及び酢酸ナトリウムを除くＬＭ１培地の全成分を３倍量で含むＬＭ３培地、及び各量がＬＭ１培地と同一レベルに維持されている、リン酸塩及び酢酸ナトリウムを除くＬＭ１培地の全成分を５倍量で含むＬＭ５培地と称される培地を含むＬＭ１培地由来の化学的に定義された培地が提供される。
また、上記のように、この発明の化学的に定義された培地は、適当な所定の炭素源で補充される必要がある。したがって、有用な具体例では、上記培地はいずれも、一般に５〜４０ｇ／Ｌのような２〜５０ｇ／Ｌの範囲を含む１〜１００ｇ／Ｌの範囲の量のグルコースで補充される。
【００３７】
この発明は、以下の実施例及び図でさらに詳述されるであろう：
図１は、ここで用いられるプラスミドを発現するＳＮａｓｅの概略図である。フラスコ培養又は発酵槽中のＧＭ１７培地で得られる分泌されたＳＮａｓｅの収率（単位／ｍｌ）を右に示す。
図２は、グルコース濃度とｐＨ値が異なる所定の培地における発酵実験から得た最大ＯＤ６００値を示す： ５．５、■； ６．０、▲； ６．５、●； 及び ７．０、◆。
図３Ａ〜Ｄは、異なるｐＨ値で発酵した後のＬＭ３−３０ 培地中のエル．ラクティス株ＳＭＢＩ１１１（中程度のコピープラスミド、ＳＰ３１０ｍｕｔ２）による成長動態（ＯＤ６００、◆）とＳＮａｓｅ産生（単位／ｍｌ、■）を示す。（Ａ） ｐＨ ５．５； （Ｂ） ｐＨ ６．０； （Ｃ） ｐＨ ６．５； （Ｄ） ｐＨ ７．０。
【００３８】
図４Ａ〜Ｂは、ｐＨ ５．５（■）、６．０（▲）、６．５（●）及び７．０（◆）のＬＭ３−１５ 培地での成長中（Ａ）及びＬＭ３−３０培地での成長中（Ｂ）のＳＭＢＩ１１１についてのＯＤ６００に対するＳＮａｓｅ活性を示す。
図５は、ｐＨ ６．５のＬＭ３−３０培地で発酵後のエル．ラクティスＳＭＢＩ１１１由来の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１〜９は、図３Ｃでヌクレアーゼ活性を分析した培養試料に相当する。１０μｌの粗培養上清を各レーンに充填した。分子量（キロダルトン）を右に示す。▲は、分泌されたＳＮａｓｅの位置を示す。
【００３９】
図６Ａ〜Ｃは、乳酸カリウムの添加によるＰ１７０の誘導を示す。ＳＭＢＩ１１１をｐＨ ７．０のＬＭ３−３０培地中に成長させた。ＯＤ６００がほぼ０．７である矢印で示した時点で、水（６Ａ）、２００ ｍＭ乳酸カリウム（６Ｂ）又は２００ ｍＭ塩化カリウム（６Ｃ）を培養物に加えた。ＯＤ６００を▲として、ヌクレアーゼ活性（単位／ｍｌ）を■として示す。
図７Ａ〜Ｄは、異なるｐＨ値（Ａ） ｐＨ ５．５、（Ｂ） ｐＨ ６．０、（Ｃ） ６．５のＬＭ５−５培地における流加培養発酵中のＳＭＢＩ１１１によるＳＮａｓｅ産生の動態を示す。７Ａ〜７Ｃで、ＯＤ６００を▲かつヌクレアーゼ活性（単位／ｍｌ）を■として示す。７Ｄは、異なるｐＨ値： ５．５、■； ６．０、▲； 及び６．５、●のＯＤ６００に対するＳＮａｓｅ活性を示す。点線は、高いＯＤ６００値で散乱が生じることを示している。結果として、幾つかの介在するＯＤ６００値をパネルＤで省略した。
【００４０】
図８は、グルコール濃度が異なり： ５０ ｍＭ ＮａＣｌを有するＬＭ１−５中５ ｇ／ｌ； ＬＭ３−１５中１５ ｇ／ｌ； ＬＭ３−３０中３０ ｇ／ｌ； 及び流加培養中に徐々に加えられる７０ ｇ／ｌ以上、かつｐＨ値が異なる所定の培地での発酵によるＳＭＢＩ１１１から得られるＳＮａｓｅの最終収率を示す： ７．０、白色棒； ６．５、点線棒； ６．０、縞の棒；及び５．５、黒色棒。
図９Ａ〜Ｂは、ｐＨ ６．５のＬＭ５−５培地におけるＳＭＢＩ１０４株（高−コピープラスミド、ＳＰ３１０ｍｕｔ２）の流加培養発酵を示す。（Ａ）成長動態（ＯＤ６００、 ▲）及びＳＮａｓｅ産生（単位／ｍｌ、■）。（Ｂ）流加培養発酵後のＳＭＢＩ１０４の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１〜９は、図９Ａでヌクレアーゼ活性を分析した培養試料に相当する。粗培養上清１０μｌを各レーンに充填した。分子量（キロダルトン）を右に示す。▲は、分泌されたＳＮａｓｅの位置を示す。
【００４１】
図１０は、ｐＨ制御単位に応じて水酸化カリウムと培地を発酵槽に同時に添加した フォキソスタット（ｐｈａｕｘｏｓｔａｔ）におけるｐＨ６．５でのＡＭＪ６２７のＬＭ５−５０培地中での培養を示す。実験中、発酵槽に添加するベースと培地の量の比を異なる値に設定した。バーは、添加した全容量（ベース＋培地）リットル当たりの水酸化物のモル数として算出される、異なる比に起因する入口の緩衝能を示す。培養物中の乳酸塩濃度を▲で示し、希釈率を■として示す。ＯＤ６００と ＳＮａｓｅ活性（単位／ｍＬ）は、それぞれ◆と●として示す。
【００４２】
図１１は、同時に開始した回分培養（□）に比較した２つの異なる培地添加速度（△： ０．１４ Ｌ／ｈ及び○： ０．０７Ｌ／ｈ） でのＳＭＢＩ１１１の短期ケモスタット培養中のＯＤ６００ （黒塗り（ｆｉｌｌｅｄ）記号）とＳＮａｓｅ活性（白抜き（ｏｐｅｎ）記号）を示す。全ての場合にＬＭ５−５０培地、ｐＨ ６．５を用いた。及び
図１２は、新鮮な培地を連続的に加え、ろ液を除去しながらの、ｐＨ ６．５のＬＭ５−５０培地におけるＳＭＢＩ１１１の培養中のＯＤ６００（黒塗り◇）とＳＮａｓｅ活性（白抜き◇）を示すが、細胞を培養容器に再利用した。同時に開始した回分培養の結果を比較して示す（□）。
【００４３】
実施例
材料と方法
細菌株、プラスミド及び成長条件
この研究で用いた株とプラスミドを表４に挙げる。
大腸菌株ＤＨ１０Ｂ （Ｇｒａｎｔら、１９９０）を、適当な時にエリスロマイシン２００ μｇ／ｍｌを補充した ＬＢ培地中で３７℃で成長させた。ラクトコッカス・ラクティス株 ＭＧ１３６３ （Ｇａｓｓｏｎ， １９８３）を、必要であれば、エリスロマイシン１μｇ／ｍｌを補充した ＧＭ１７培地（５ｇ／Ｌ グルコースを有する１．５ ｘ Ｍ１７）に３０℃で常套的に成長させた。全てのフラスコと発酵槽の実験を３０℃で行った。
Ｐ１７０プロモーターの誘導を避けるために、前培養物をＡｒｇＭ１７ 培地（Ｍａｄｓｅｎら、１９９９）中で成長させ、０．５〜１．０のＯＤ６００で回収した。細胞を洗浄し、ｐＨ６．８の冷２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で２０倍に濃縮した。懸濁液のアリコート１ ｍｌを−７０℃でグリセロールとともに凍結し（３５％最終濃度）、発酵槽培地１Ｌの接種に用いた。
【００４４】
【表４】
【００４５】
発酵に用いた所定の基礎培地、ＬＭ１は、ＪｅｎｓｅｎとＨａｍｍｅｒ （１９９３）によって開発されるＳＡ培地に由来した。この後者の培地は、以下の組成を有する（ｍＭ又は培地中での有無）：
【００４６】
【表５】
【００４７】
ａ Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １１９：７３６−７４７から
ｂ ビタミン： ０．４μＭビオチン、１０μＭピリドキサル−ＨＣｌ、２．３μＭ葉酸、２．６μＭリボフラビン、８μＭナイアシンアミド、３μＭチアミン−ＨＣｌ及び２μＭパントテン酸塩
ｃ 微量栄養素： ０．００３μＭ （ＮＨ４）６（ＭＯ７）２４、０．４μＭ Ｈ３ＢＯ４、０．０３μＭ ＣｏＣｌ２、０．０１μＭ ＣｕＳＯ４、０．０８μＭ ＭｎＣｌ２及び０．０１μＭ ＺｎＳＯ４
【００４８】
ＳＡ培地と比較して、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、トリシン（ｔｒｉｃｉｎｅ）とＭＯＰＳをＬＭ１培地中で除き、リン酸塩（Ｋ２ＨＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４）の濃度を１０ ｍＭ に（緩衝ストック溶液のｐＨ ７から）上げ、０．１ ｍＭクエン酸を加えて鉄塩の沈降を妨げた。ＬＭ３及びＬＭ５と称される培地で、リン酸塩緩衝液と酢酸ナトリウムを除く全成分をそれぞれ３倍と５倍に増した。培地の名称の最終的な案は、ｇ／Ｌでのグルコース濃度を示す（例えばＬＭ１−５は５ ｇ／Ｌグルコースを含む）。ＨＣｌを用いてｐＨを調整し、発酵中に２ Ｍ又は５ ＭのＫＯＨを自動的に加え、ｐＨを維持した。全容量２Ｌのアプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）ディッシュの底ガラス容器を１Ｌの培養に用いた。攪拌速度は、３００ｒｐｍであった。
【００４９】
クローニング法、形質転換、ＰＣＲ及びＤＮＡシーケンシング
ＰＣＲ増幅とＤＮＡシーケンシングを含むＤＮＡ操作は、標準的な手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）にしたがって行った。大腸菌由来のプラスミドＤＮＡをＪｅｔ Ｐｒｅｐカラム（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いて単離した。Ｈｏｌｏ及びＮｅｓ （１９８９）によって記載されるように、エル．ラクティスをエレクトロポレーションで形質転換した。
【００５０】
ｐＨ及び成長期制御遺伝子発現及び分泌のためのプラスミドの構築
エル．ラクティスについてのｐＨ及び成長期制御分泌ベクターは、ＷＯ ９８／１００７９ とＭａｄｓｅｎら（１９９９）に開示され、ブタペスト条約の下、受託番号ＤＳＭ １１１３７で寄託されるプラスミドｐＡＭＪ５８６のＰ１７０プロモーター誘導体をＵｓｐ４５シグナル配列（ｖａｎ Ａｓｓｅｌｄｏｎｋら、１９９０）と組み合わせて構築した。プラスミドｐＡＭＪ５８６をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、ｌａｃＬＭレポーター遺伝子を、ｌａｃＬＭ リボソーム結合部位（Ｉｓｒａｅｌｓｅｎら、１９９５）、Ｕｓｐ４５シグナルペプチド及びＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ及びＳａｌＩ制限部位からなるイン−フレームのマルチクローニング部位を含む１５８ ｂｐのＤＮＡフラグメントで置換した。ＰｓｔＩ部位は、シグナル配列中のＰｓｔＩ部位の位置のためにユニークではない。この１５８ ｂｐのＤＮＡフラグメントは、鋳型としてのｐＮＺ１０２０（Ｕｓｐ４５シグナルペプチドを有するプラスミド）及びＵｓｐプライマー１ （５’ ＴＡＧ ＴＡＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＴＡ ＧＧＧ ＴＡＡ ＣＴＴ ＴＧＡ ＡＡＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＣＣＴ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＡＴ ＣＴＣ ＡＧＣ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） 及びＵｓｐプライマー２ （５’ ＡＣＧ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＴＧ ＴＧＴ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ ＣＡＣ Ｃ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）のプライマーを用いてＰＣＲにより合成した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、同じ酵素で予め消化したｐＡＭＪ５８６に連結し、ｐＳＭＡ６１０を得た。
【００５１】
ｐＳＭＡ６１０は、マルチクローニング部位の後に転写ターミネーターを含まない。したがって、大腸菌の転写ターミネーター、ｒｒｎＣｔｔ’ （Ａｌｂｒｅｃｈｔｓｅｎら、１９９０）を、鋳型としてのｐＨＢＡ１０２ （Ａｌｂｒｅｃｈｔｓｅｎら、１９９０）及びプライマーＴｅｒ １ （５’ ＴＡＧ ＴＡＧ ＴＣＧ ＡＣＡ ＡＣＣ ＧＧＧ ＴＧＴ ＴＧＧ ＧＡＧ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４） とｒｒｎｃｔｔ ＸｈｏＩ （５’ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＣＧ ＡＧＧ ＧＣＧ ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＧＣ ＧＡＴ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）を用いてＰＣＲ増幅した。フラグメントをＸｈｏＩとＳａｌＩで消化し、ｐＳＭＡ６１０のＳａｌＩ部位に挿入した。得られたベクターを、ｐＡＭＪ２１９と称した。
【００５２】
高コピー数のＰ１７０−ベースの発現ベクター、ｐＡＭＪ３２５を、高コピーベクターｐＴＲＫＨ４ （Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ及びＫｌａｅｎｈａｍｍｅｒ， １９９３ａ）に、ｐＡＭＪ７５２由来の強力なＰ１７０プロモーター（Ｍａｄｓｅｎら、１９９９）、ｌａｃＬＭリボソーム結合部位及び新たなマルチクローニング部位を含むＰＣＲフラグメントを挿入して構築した。プラスミドｐＴＲＫＨ４をＸｂａＩで消化し、次いでクレノウフラグメントで平滑末端化した。ＰＣＲフラグメントを、鋳型としてのｐＡＭＪ７５２及びｐＡＫ８０ｒｅｖ２ （５’ ＣＣＣ ＡＴＴ ＴＡＧ ＣＣＧ ＴＣＡ ＴＴＴ ＣＡＧ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６） とＬＢＥｐ０４１ （５’ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＡＴ ＡＴＣ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＧＡＡ ＴＡＴ ＣＣＴ ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＴＴ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）のプライマーを用いて増幅により得た。ＰＣＲフラグメントをクレノウ処理したｐＴＲＫＨ４に平滑末端で連結し、ｐＡＭＪ３２５を得た。大腸菌の転写ターミネーター、ｒｒｎＣｔｔ’を、鋳型としてのｐＡＭＪ２１９及び上記のＴｅｒ １ ならびにｒｒｎｃｔｔ ＸｈｏＩのプライマーを用いてＰＣＲ増幅後にｐＡＭＪ３２５に挿入した。得られた高−コピー数発現ベクターを、ｐＡＭＪ３２８と称した。ｐＡＭＪ３２５とｐＡＭＪ３２８は、分泌シグナルをエンコードする遺伝子を含まない。
【００５３】
スタフィロコッカス・アウレウスのヌクレアーゼの発現ベクターへのクローニング
スタフィロコッカス・アウレウスのヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）を分泌する発現ベクターの適正を評価するため、シグナルペプチドをエンコードする遺伝子を欠くＮｕｃＢ遺伝子（Ｄａｖｉｓら、１９７７； Ｌｅ Ｌｏｉｒら、１９９４）を、２つのプライマーＮｕｃ１ （５’ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＡＴ ＡＡＣ ＧＧＣ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８） 及びＮｕｃ２ （５’ ＡＣＧ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＧＡ ＴＣＴ ＡＡＡ ＡＡＴ ＴＡＴ ＡＡＡ ＡＧＴ ＧＣＣ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーの下線配列は、それぞれＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩ制限部位を示す。これらのプライマーを設計して、翻訳停止コドンの直後に１６８個のＣ−末端アミノ酸のコード配列と６３ ｂｐを含む５６７ ｂｐのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅させた。８７１ ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントに全ＳＮａｓｅ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳ：：ｎｕｃ （Ｌｅ Ｌｏｉｒら、１９９４）を、プライマーＮｕｃ１及びＮｕｃ２とともにＰＣＲ反応で鋳型として用いた。増幅したフラグメントを、次いでＢｇｌＩＩとＳａｌＩで消化し、ｐＳＭＡ６１０に挿入して、Ｕｓｐ４５シグナルペプチドへのｎｕｃＢ遺伝子の翻訳融合体を生じた。得られたプラスミドをｐＡＭＪ１６６と命名した。
【００５４】
最近の別の研究では、シグナルペプチドプローブベクターｐΔＳＰＮｕｃを開発し、これを用いてラクトコッカス・ラクティス由来の新規な分泌シグナルを分析した（Ｒａｖｎら、２０００）。ＳＰ３１０の最適化されたシグナルペプチド誘導体、配列ＭＫＦＮＫＫＲＶＡＩＡＴＦＩＡＬＩＦＶＳＦＦＴＩＳＳＱＤＡＱＡＡＥＲＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）を有するＳＰ３１０ｍｕｔ２をｐΔＳＰＮｕｃに挿入し、プラスミド ｐ３１０ｍｕｔ２を得た。
【００５５】
最大レベルのヌクレアーゼ分泌を研究するため、ｐＡＭＪ７５２に位置する最も強力なＰ１７０誘導体（Ｍａｄｓｅｎら、１９９９）をＵｓｐ４５及び最適化されたＳＰ３１０ｍｕｔ２シグナルペプチドそれぞれと組み合わせた。これらの構築のため、ｐＡＭＪ１６６とｐ３１０ｍｕｔ２をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、シグナルペプチドをエンコードする遺伝子とヌクレアーゼ遺伝子を含む９００ ｂｐのフラグメントを精製し、Ｐ１７０プロモーター、エリスロマイシン耐性遺伝子及びクエン酸塩プラスミドレプリコン（Ｉｓｒａｅｌｓｅｎら、１９９５）を含むｐＡＭＪ７５２のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントに連結し、プラスミドｐＳＭＢＩ９３とｐＳＭＢＩ１０９それぞれを生じた。ｐＳＭＢＩ９３とｐＳＭＢＩ１０９をエル．ラクティスに形質転換し、株ＳＭＢＩ１０５とＳＭＢＩ１１１を得た。
【００５６】
ヌクレアーゼ分泌に対する高コピー数の影響を研究するため、ｐＡＭＪ３２８ベースの２つのヌクレアーゼ発現プラスミドを構築した。同様にして消化したｐＡＭＪ３２８にｐ３１０ｍｕｔ２由来の９００ ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントとｐＡＭＪ１６６を挿入して、ｐＳＭＢＩ９１とｐＳＭＢＩ９８を構築した。エル．ラクティスへのｐＳＭＢＩ９１とｐＳＭＢＩ９８の形質転換により、株ＳＭＢＩ１０４とＳＭＢＩ１０６を得た。
【００５７】
ヌクレアーゼ活性測定
培養上清のヌクレアーゼ活性を、基質として超音波処理したサケのＤＮＡと共にインキュベートし、次いで氷冷過塩素酸に沈降させ、次いで２６０ ｎｍ （Ａ２６０）で吸光度を測定して決定した。適当な希釈液の試料１０μｌをアッセイ緩衝液（１ ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡ、０．１ ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１０ ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８，８） ５００μｌに加え、３７℃でインキュベートした。３０分後、氷冷４％ （ｗ／ｖ）過塩素酸５００μｌを加えた。大きなＤＮＡフラグメントを０℃で１５〜３０分沈降させ、最後に遠心分離により酸可溶性分解産物から分離した。上清でＡ２６０を測定した。各試料について「ゼロ時」に相当する Ａ２６０を得るため、アッセイ緩衝液５００μｌを５００μｌの４％ ＰＣＡと０℃で混合し、適当な希釈液試料１０μｌ （希釈緩衝液： ０．１ ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン、１０ ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８，８）を加え、上記のように沈降させた。ヌクレアーゼ１単位を、天然のＤＮＡから酸可溶性ポリヌクレオチド１μｍｏｌを１分当たりに生じるヌクレアーゼ量として定義する。試料ｍｌ当たりの ＳＮａｓｅ活性単位は、式
【数１】
［１０は、混合ヌクレオチドに対する２６０ｎｍでのミリモルの吸光度係数であり、１．０１は最終容量ｍｌである］によってＡ２６０から得られる。適当な範囲でΔＡ２６０を得るため、アッセイを行う前に、高活性試料を０．０６〜０．１２単位／ｍｌに希釈した。
【００５８】
タンパク質の特徴づけとＳＤＳ−ＰＡＧＥ
製造者の指示にしたがって、ＳＤＳ−トリス−グリシン緩衝液中の１２％ ポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳ）で分離することにより、培養上清を分析した。製造者の指示に従って、ゲルをクマシーブリリアントブルーＲ２５０ （Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ， ６４２６１ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色した。分子量マーカーＭａｒｋ１２ＴＭ （ＮＯＶＥＸ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳ）を分子量の大きさの評価に用いた。
【００５９】
中程度のコピー数プラスミド及び高コピー数プラスミドの細胞当たりの相対的なコピー数の粗決定
培養物を、３０℃で一晩ＧＭ１７培地（５ｇ／Ｌグルコースを有する１．５ｘＭ１７）で成長させた。一晩の培養物を新鮮な培地で２０倍に希釈し、プラスミド抽出用に試料１０ ｍｌを細胞の成長中に回収した。プラスミド ＤＮＡを、Ｏ’ＳｕｌｌｉｖａｎとＫｌａｅｎｈａｍｍｅｒ （１９９３ｂ）のプロトコルにしたがって、等量の細胞から抽出した。各プラスミドを５０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、ＳａｌＩで消化した後、アガロースゲルの電気泳動により分析した。
【００６０】
実施例１
栄養リッチな培地を用いるフラスコ培養と発酵槽培養におけるエス．アウレウスのヌクレアーゼの分泌
１．１． フラスコ培養
プラスミドｐＳＭＢＩ９１、ｐＳＭＢＩ９３、ｐＳＭＢＩ９８及びｐＳＭＢＩ１０９を発現する４つのヌクレアーゼそれぞれをエル．ラクティスＭＧ１３６３に形質転換し、ＧＭ１７培地中フラスコで一晩成長させた後にヌクレアーゼ活性を測定した。結果を図１に要約する。
【００６１】
ｐＡＫ８０骨格に基づく中程度のコピー数ベクターを用いて、Ｕｓｐ４５シグナルペプチドの使用により、ＳＰ３１０ｍｕｔ２シグナルペプチドの使用に対して収率が約１８％高い分泌ヌクレアーゼを得た。この違いは、高コピー数ベクターｐＴＲＫＨ４を発現に用いる際には、約２３％とわずかに高い。 高コピーベクターの使用により、中程度のコピーベクターに対して力価が２．５〜３である分泌ＳＮａｓｅの収率が増した。この増加は、アガロースゲル電気泳動によって決定されたように（データ示さず）、ｐＡＫ８０に対し４倍高いコピー数のｐＴＲＫＨ４に一致している。このことは、高コピー数プラスミドの使用が、分泌系の飽和をもたらさないことを示している。これらの結果は、プラスミドのコピー数と分泌ＳＮａｓｅの収率との正の相関関係を立証したＬａｎｇｅｌｌａとＬｅ Ｌｏｉｒ （１９９９）によって行われた研究と一致している。
【００６２】
１．２． 発酵槽培養
Ｐ１７０を細胞内に位置するβ−ガラクトシダーゼの生産の駆動に用いた先の実験（Ｉｓｒａｅｌｓｅｎら、１９９５）で、同一培地でのフラスコ培養に対して５倍の高い収率が、発酵槽中での低いｐＨ５．５での培養によって得られた。この収率増加は、乳酸の生産のためにｐＨが徐々に低下し、成長のごく最後にのみ５．７〜５．８に達するフラスコ培養に比較して、長期間にわたって活性なＰ１７０プロモーターの単なる結果であると思われる。
【００６３】
制御された−ｐＨ発酵の使用が分泌産物の生産レベルをも改善するかどうかを研究するため、発酵槽中でｐＨ５．５のＧＭ１７培地で成長させた４つのヌクレアーゼ発現株から得たヌクレアーゼの収率を測定し、分析した。遺伝子発現誘導の動態を追跡するため、試料を異なるＯＤ６００値で採取し、ヌクレアーゼ活性に対して分析した。β−ガラクトシターゼを用いる同様の研究から予想されるように、ヌクレアーゼの顕著な成長期−依存性生産が、４つの試験株全てで観察された（データ示さず）。４つの株全てについて、最大分泌レベルは、上記のフラスコ培養実験に対して発酵槽実験で約３〜４倍高かった（図１）。また、ＳＮａｓｅ分泌に対するＵｓｐ４５の使用は、ＳＰ３１０ｍｕｔ２の使用に比較してわずかに効率的であった（〜１２−１７ ％）。最大収率は、Ｕｓｐ４５シグナルペプチドと組合わせた高コピー数ベクターを用いて分泌ＳＮａｓｅについて約１０単位／ｍｌであった。
【００６４】
実施例２
回分発酵を用いる合成培地におけるＳＮａｓｅのｐＨ及び成長期依存性発現
定常期へ移行中の低ｐＨでのＰ１７０プロモーターからの発現の誘導は、栄養リッチなＧＭ１７培地で以前に立証されている（Ｉｓｒａｅｌｓｅｎら、１９９５； Ｍａｄｓｅｎら、１９９９）。このリッチな培地は、医薬品生産での大多数の適用に許容されないであろう。というのは、成分の幾つかが動物ウイルス、プリオン又はアレルギー性因子の潜在的な原因であるからである。したがって、プロモーターの制御がＧＭ１７又は別のリッチな培地の使用に依存している場合には、Ｐ１７０発現系の適用範囲が厳密に制限されるであろう。この実験は、異種タンパク質の有効な発現が、合成、つまり所定の培地中で制御可能なＰ１７０発現系を用いて達成できるかどうかを決定することを目的とした。
【００６５】
合成培地中でのＰ１７０からのＳＮａｓｅの制御された発現と分泌についての第一試験として、株ＳＭＢＩ１１１を、ＪｅｎｓｅｎとＨａｍｍｅｒ（１９９３、上記参照）に記載されるＳＡ培地ベースの合成培地ＬＭ１−５で培養した。ＬＭ１−５ 培地は、ＧＭ１７と同一のグルコース濃度、つまり５ ｇ／Ｌを含み、５０ ｍＭ ＮａＣｌを加えて低溶質濃度を補償した。ｐＨ ５．５、６．０、６．５及び７．０それぞれで同時に４個の発酵槽培養物を成長させた。指数期から定常期まで間隔をあけて採取した培養試料の上清をヌクレアーゼ活性についてアッセイした。ヌクレアーゼ生産は、ｐＨ ５．５で０．８１単位／ｍｌ、ｐＨ ６．０で０．１５単位／ｍｌに達し、ｐＨ ６．５と７．０に維持した２つの発酵槽中ではそれぞれ０．０５単位／ｍｌ未満のままであった。
これらの結果は、ｐＨ調節が所定の培地で維持されることを明らかに立証した。さらに、定常期への移行中に生じたヌクレアーゼ発現は、所定の複雑な培地中におけるＰ１７０プロモーターの同一の制御パターンを確証している（データ示さず）。
【００６６】
また、結果は、生産収率が、ＧＭ１７培地を用いて達成された収率より約４倍低い（０．８１単位／ｍｌ対 ３．１１単位／ｍｌ、図１参照）が、最大ＯＤはわずか２５％低いことを示した。定常期への移行に伴う生理学的な代謝事象は、所定のＬＭ１−５とＧＭ１７で異なることが予想される。ＬＭ１−５培養では、最大ＯＤに達し、酸の生産が停止してからわずか３時間の分離された指数増殖は、グルコースが消費されたことを示している。ごくわずかな量のヌクレアーゼが、成長停止後に生じた。ＧＭ１７では、ヌクレアーゼの生産は、 成長と酸の生産の終了から少なくとも４時間を含む６時間のあいだに生じた。したがって、リッチな培地が、グルコースの涸渇後にタンパク質の合成を支持できる代替的な炭素源とエネルギー源を提供しているものと考えられる。
【００６７】
この実験から、ＧＭ１７のような栄養がリッチで複雑な培地にみられるｐＨと成長に依存した発現系の制御パターンは、合成培地又は所定の培地に維持されることが結論付けられる。しかし、異種遺伝子産物の収率は、リッチな培地を用いて達成される収率よりも所定の培地で著しく低かった。
【００６８】
実施例３
回分発酵を用いる基質濃度の高い所定の培地におけるＰ１７０発現系の生産性と動態
この実験では、培地の成分量を増すことによりＳＮａｓｅの収率を改善することを試みた。２セットの発酵槽実験を行い、基礎培地ＬＭ３、つまりＬＭ３−１５とＬＭ３−３０（上記参照）中でグルコース濃度をそれぞれ１５ ｇ／Ｌと３０ ｇ／Ｌに上げた。株ＳＭＢＩ１１１を、それぞれｐＨ ５．５、 ６．０、６．５及び７．０のこれらの培地中に成長させた。図２に例示するように、最終的な細胞密度はグルコース濃度に比例して増加しなかった。直線的な関係の欠失は、低いｐＨ値で最も顕著であった。これは、利用可能な炭素源が消費される前に乳酸又は他の代謝産物によって成長がしばしば阻害される乳酸菌には周知の現象である（Ｋａｓｈｋｅｔ， １９８７； Ｌｏｕｂｉｅｒｅｒ、１９９７）。 乳酸の阻害作用は、細胞膜を介する分離していない酸の拡散能力に関連していると思われ、細胞質の酸性化と膜の潜在的な非結合を引き起こす。作用は、全体的な乳酸／乳酸塩の大きな画分が非分離形態で存在する低いｐＨ値ではかなり深刻になる。したがって、グルコース濃度の増加は、ｐＨに依存して、あるレベルまで高収率のバイオマスを生じるにすぎないであろう（図２）。
【００６９】
したがって、Ｐ１７０プロモーターを用いてＳＮａｓｅのような異種タンパク質の生産を改善するためには、高いｐＨを要する高収率のバイオマスと６．０未満のｐＨで最適であるべきであるＰ１７０プロモーターの高活性とにバランスが必要である。しかし、興味深いことに、より濃縮された培地ＬＭ３−３０ではｐＨ ６．０と６．５でもＳＮａｓｅは生産されたが、ＳＮａｓｅ発現はｐＨ ７．０で依然として抑制された（図３Ａ〜Ｄ）。成長期の依存性は、ｐＨ ５．５、６．０及び６．５で明らかに観察された（図４Ａ〜Ｂ）。また、Ｐ１７０が誘導される細胞密度は高いｐＨ値では高度であることが観察された。グルコース濃度が十分に増加すれば、ＳＮａｓｅはｐＨ ７．０で生じることすら予想される。
【００７０】
ｐＨ ６．５のＬＭ３−３０ 培地における ＳＮａｓｅの生産は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図５）。ＳＮａｓｅの２２ ｋＤａのタンパク質のバンドが、定常期への移行後に明らかに検出された（図５、レーン５）。上清は、ごく少量の他のタンパク質を含むと思われる。
これらの実験の結果は、５ ｇ／Ｌ （実施例２参照）〜１５ ｇ／Ｌの所定中でのグルコース濃度の増加は、遺伝子産物の収率を著しく増すことも示した。また、さらなるグルコース濃度の増加、つまりＬＭ３培地中での１５から３０ ｇ／Ｌへの増加は、ｐＨ ６．０〜６．５でＳＮａｓｅの収率を３．７〜１２倍にそれぞれ増すことが観察された。
【００７１】
実施例４
乳酸カリウムの添加によるＰ１７０発現系におけるＳＮａｓｅ産生の回分発酵法における誘導
図３及び４に示す結果は、乳酸がＰ１７０を誘導し得ることを示唆した。乳酸濃度は、培養物中の細胞密度に強く相関している。細胞成長とＰ１７０誘導に対する乳酸塩の阻害作用は、ともにｐＨに依存している。ｐＨ ７．０に維持して、ＬＭ３−３０培地で３つの同時発酵を行った。ＯＤ６００ ０．７〜０．８では、乳酸カリウム（ｐＨ ７．０）又は塩化カリウムを、２００ ｍＭの最終濃度まで加えた。この乳酸塩濃度は、ＬＭ３−３０培地では通常ＯＤ６００ ７で達するであろう。双方の塩の添加はわずかに成長速度を減じたが、乳酸カリウムの添加のみがＳＮａｓｅ産生を誘導した（図６Ａ〜Ｃ）。これは、エル．ラクティスにおけるＰ１７０活性が乳酸塩によって誘導されることを示している。実際上の観点から、乳酸塩の添加は、他の点ではＰ１７０プロモーターの活性に最適ではない条件下で発現の誘導に用いられ得る。
【００７２】
実施例 ５
流加培養発酵法を用いて利用可能な基質のレベルを増すことによる、Ｐ１７０発現系における遺伝子産物収率のさらなる増加
実施例３に示すように、ｐＨ ６．０〜６．５でのＳＮａｓｅ収率は、回分発酵法でＬＭ３培地中のグルコース濃度を１５から３０ ｇ／Ｌに増すことによって、３．７〜１２倍にそれぞれ増した。
【００７３】
より高いグルコース濃度の使用を含むため、さらなる最適化が期待される。Ｐ１７０発現系ベースの他の株構築物を用いる回分発酵実験では、５０〜８０ ｇ／Ｌまでのグルコースの濃度増加が遺伝子産物の収率を増すことは以前に観察された。しかし、発酵時間も、おそらくは浸透圧によって成長が遅くなったために延長された（データ示さず）。これを避けるために、グルコースの段階添加用の流加培養発酵系を設定した。濃縮グルコース溶液（５００ ｇ／Ｌ）の添加用ポンプを、発酵槽のｐＨコントローラーのベースポンプの出力に接続した。この設定では、ｐＨ制御用のＫＯＨを加えながらグルコースが同時に添加される。グルコースの供給により培養物中の酸の産生が比例し、細胞密度と基質の要求に厳密に相関していた。他の培養成分（酢酸塩とリン酸塩除く）の濃度は、高い細胞密度での栄養の涸渇を妨げるためにＬＭ１に比較して５倍に増した。グルコースの初期濃度は、５ｇ／Ｌ （ＬＭ５−５培地）であった。
【００７４】
ＳＭＢＩ１１１を、ｐＨ ５．５、６．０及び６．５にそれぞれ調整したＬＭ５−５培地を含む３つの発酵槽に接種した。酸の生産でｐＨが低下する時にグルコースの添加を開始し、積極的な成長中、添加速度を増した。全培養物中で、最大ＯＤに達した後、酸の生産とグルコースの添加が続いた。ＳＮａｓｅの全収率の大部分が、この段階で生産された（図７Ａ〜Ｄ）。各ｐＨで、ＳＮａｓｅの全収率は、回分発酵に比較して改善された。異なる培地中で異なるｐＨ値での最終的なＳｎａｓｅ収率を、図８に要約する。最低ｐＨ値は低グルコース濃度でＳＮａｓｅの産生に最適であったこと、及びこのパターンはグルコース濃度が増すにつれて徐々に変化したことが、明らかに示されている。これらの流加培養発酵では、最高のＳＮａｓｅ収率、つまり３３．１単位／ｍｌは、ｐＨ ６．５で得られた。
【００７５】
実施例６
Ｐ１７０発現系を含む高コピー数ベクター株でのｐＨ制御流加培養発酵
高コピー数プラスミドｐＳＭＢＩ ９１を含む株ＳＭＢＩ１０４を、株ＳＭＢＩ１１１（中程度のコピー数プラスミド）中で最高量のＳＮａｓｅを示した条件、つまりｐＨ ６．５でｐＨ制御グルコース供給を伴うＬＭ５−５培地下の発酵槽中で成長させた（図９Ａ〜Ｂ）。達成された最終的な収率は５４単位／ｍｌ、つまりＳＭＢＩ１１１から得た収率（３３単位／ｍｌ）より６４％高く、コピー数の作用がＧＭ１７でのこれらの条件下ほど強くないことを示している。発現機序又は分泌系でのボトルネックは、高コピー数プラスミドを流加培養発酵で用いる際の高い収率の欠失に起因していると思われる。図９Ｂから分かるように、この実験で成長させたＬＭ５−５培地から得られる上清は、宿主タンパク質をごくわずかにのみ含み、きわめて純粋であった。一般的に、異種産物（ＳＮａｓｅ）の量は上清に存在する全タンパク質の５０％を越えた。したがって、わずか１回の又はごく少数の精製工程の使用により、純粋な医薬品グレードの生産物が生じるはずである。
【００７６】
流加培養発酵条件下のラクトコッカス・ラクティスでＰ１７０発現系を用いるこれらの実験で得られた最大産生能は、培養上清ｍｌ当たり分泌ＳＮａｓｅ ５４単位であった。ＳＮａｓｅの比活性の予備測定に基づけば（約５５０単位／ｍｇ）、この活性は分泌されたＳＮａｓｅの約１００ ｍｇ／Ｌに相当する。タンパク質産生についての報告のように、異なる遺伝子発現系の効率を比較するのは異なる遺伝子産物を用いるために難しいだろうか。しかし、最近、ＬａｎｇｅｌｌａとＬｅ Ｌｏｉｒ （１９９９）は、エル．ラクティスにおける分泌研究のため同一のＳＮａｓｅの使用を記載した。高コピー数ベクターで強力な構成プロモーターと合成プロペプチドを用いて、これらの著者らは、リッチな培地を用いるフラスコ実験で１０〜２５ ｍｇ／Ｌの分泌ＳＮａｓｅを得た。
【００７７】
実施例７
流加培養発酵法におけるＰ１７０発現系で得られる遺伝子産物収率のさらなる改善
産生能を潜在的に増す努力において、実験Ｉ実施例６に似た別の流加培養実験を行ったが、ＬＭ５−５培地を、１〜１０ ｇ／Ｌの量範囲の酵母抽出物で補充した。５ ｇ／Ｌ量の酵母抽出物において、分泌ＳＮａｓｅ の収率は、約２２５ ｍｇ／Ｌ ＳＮａｓｅ に相当する１２３単位／ｍｌに増した。これは、我々の知る限り、乳酸菌についてこれまでに報告されている分泌異種タンパク質の最高量である。
【００７８】
実施例８
連続培養設定の使用による延長生産期
実施例１〜７に記載される回分培養発酵と流加培養発酵において、異種産物の合成を、グルコースの欠失から、又は代謝産物（主に乳酸）の蓄積から最終的に停止する。連続培養の種々の方法を適用して、生産期を延長することができた。３つの異なる方法を３０℃かつｐＨ ６．５でＬＭ５−５０培地中のＳＭＢＩ１１１又は株ＡＭＪ ６２７を用いる短期実験で試験した。最初の２つの実験をフォキソスタット及びケモスタット培養として行った。第三の実験には、細胞のリサイクル発酵、つまりフィルター単位を介した新鮮な培地の一定の流入（ｉｎｌｅｔ）と培養培地の流出（ｏｕｔｌｅｔ）を用いる一定培養量での培養を含めた。
【００７９】
８．１ フォキソスタット−培養
フォキソスタットの設定には、１Ｌの作動容量発酵槽、１０ Ｌの新鮮なＬＭ５−５０培地のレザバーと５モルの水酸化カリウムのレザバーを含めた。ベースと培地の発酵槽への添加用ポンプは、ｐＨコントローラーに応じて同時にスイッチを入れ、切った。第三ポンプを用い、水準管から流出量を排出して発酵容器に一定容量を維持した。培地と緩衝液レザバーを電子バランスで設置し、添加量のモニターに用いた。希釈率は、これらの値から算出した。流入中のベースと培地との割合は、培地添加ポンプの流速を変えて変えることができる。それにより、全添加量Ｌ当たりの水酸化カリウムのモル数を制御することができた。この数は、Ｍａｒｔｉｎと Ｈｅｍｆｌｉｎｇ （１９７６）によるフォキソスタット法の最初の記載における培地の緩衝能ＢＣＲに相当している。ラクトコッカス・ラクティスのフォキソスタット培養における乳酸濃度は、同一値に達することが予測される。
【００８０】
この実験に用いた株ＡＭＪ６２７は、プラスミドｐＡＭＪ１６６を有するＭＧ１３６３であった。この株はＳＭＢＩ１１１に似ているが、ＳＰ３１０ｍｕｔ２及びＡＭＪ７５２誘導体の代わりにＵｓｐ４５シグナルペプチドとＰ１７０の ＡＭＪ５８６誘導体を含む。
図１０は、ＢＣＲ、乳酸濃度、希釈率、光学密度及びＳＮａｓｅ活性を示す。最初の期の調整後、ＢＣＲを０．２２モル／Ｌに設定した。乳酸濃度は ０．２０〜０．２３モル／Ｌに増し、ＳＮａｓｅ活性は２０〜３０単位／ｍＬに増した。しかし、光学密度と希釈率は、この期のあいだに着実に減少した。おそらくは、成長阻害は乳酸の生産に起因していた。
【００８１】
０．２２モル／ＬのＢＣＲでの操作から２０時間後、値を０．１１モル／Ｌに再設定した。乳酸濃度が低下し、希釈率が徐々に増した。次の８．５時間中に、わずかに低い値でＯＤ６００が安定化され、ＳＮａｓｅ活性は徐々に８単位／ｍＬまで減少した。ＢＣＲを０．１８モル／Ｌに再調整すると、希釈率はすぐに低下したが、次の１４時間のあいだ再度増加した。一方、 ＳＮａｓｅレベルはわずかに１０単位／ｍＬまで増加した。
全容量１０ Ｌの新鮮な培地を加えた。培地の添加を止めると、培養物が定常期に成長できた。最終的なＳＮａｓｅ活性は同一培地での同時の回分培養より高く、２７ 単位／ｍＬに対し５３単位／ｍＬであった。
【００８２】
方法はこの実験中に定常状態に達しなかったが、培養物の成長と生産性が、発酵槽に供給される培地と水酸化カリウムとの割合の変化に反応していたことは明らかである。比較的高レベルのＳＮａｓｅが０．２２モル／Ｌの緩衝能で達せられたが、これらの条件下で成長速度と希釈率は低下していた。緩衝能が最初に０．１１モル／Ｌまで低下し、次いで０．１８モル／Ｌまで再上昇すると、希釈率は高いがＳＮａｓｅレベルが低かった。最適な緩衝能値は、０．１８〜０．２２モル／Ｌの可能性がある。
【００８３】
８．２ ケモスタットでの培養
ＳＭＢＩ１１１を、３Ｍ水酸化カリウムの添加によりｐＨを６．５に維持した３１Ｌの発酵槽で成長させた。約５のＯＤ６００値で、２つの発酵槽への培地添加を異なる速度０．０７及び０．１４ Ｌ／ｈで開始した。容量は、水準管から培養物を排出するポンプにより一定に維持した。
【００８４】
培養物中の光学密度とＳＮａｓｅ活性を、図１１に示す。回分培養は９．９の最大ＯＤ６００に１４時間以内で達し、１６時間で酸の産生を止めた。ＳＮａｓｅ活性は、発酵終了時に１７単位／ｍＬであった。２つの連続的な発酵を１６〜１７時間以上行い、それぞれ１．６５ Ｌと３．０ Ｌの全体的な培地処理量を得た。最大光学密度は、双方の場合とも回分培養より低く、後のＯＤの低下から、特異的な成長速度が希釈率より低いことが示された（図１１）。しかし、最大ＯＤが達せられてから少なくとも６時間のあいだＳＮａｓｅレベルが増しつづけ、１０時間後に培地の添加を止めた時のみ１０〜２０％まで低下した。発酵槽培養物と出口から回収した培養物における全体的なヌクレアーゼ活性を以下の表に示す（幾つかの追加生産は、回収した培養物中で生じ得る）。
【００８５】
【表６】
【００８６】
双方の連続発酵によって、ＳＮａｓｅの全体収率が回分培養より高くなった。最高希釈率では、培地Ｌ当たりの収率が、回分培養よりも低かった。しかし、発酵の容易さにおける作業時間の損害を培地の損害に比較すると、連続法は、培地調整と装置の清浄化ならびに滅菌のための中断時間で分離される一連の回分法に比較して依然として有利であろう。
いずれの場合にも、細胞密度は最初の１４〜１５時間後に低下し、生産性は３２時間後に低下した。これは、おそらくは培養物に生産される乳酸菌からの阻害によって生じた。高い密度で生産を安定にするには、流入培地のグルコース濃度を乳酸があまり産生されない値に低減する必要があるであろう。
【００８７】
８．３ 細胞をリサイクルする培養及び培地の連続置換
上記のケモスタットの実験では、生産能は、容器からの培養物の連続除去により低下した。これは、細胞を容器にリサイクルして回避された。
接線流量ろ過装置（Ｖｉｖａｆｌｏｗ ５０， ０．２μｍ， Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を、シリコンチューブを介して１Ｌの発酵槽に接続した。ＳＭＢＩ１１１を発酵槽中のｐＨ ６．５のＬＭ５−５０培地で成長させた。約５の光学密度で、新鮮なＬＭ５−５０培地の培養物への添加を０．１３ Ｌ／ｈの速度で開始した。同時に、培養物から培地の接線流量ろ過を開始した。発酵槽に再循環された非透過ガス（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）の流量は４０〜４５ ｍＬ／ｍｉｎであり、約２ ｍＬ／ｍｉｎのろ過速度が調整されて、培養量が一定に保たれた。
【００８８】
全容量３ Ｌの培地を２４時間以内に培養物に供給した。この時間中、光学密度は１９．８に増し、ＳＮａｓｅ活性は４１単位／ｍＬに増した（図１２）。全体的なＳＮａｓｅ収率は、回収ろ液中の７１，０００ 単位を含む１１２，０００単位であった。
この場合、生産細胞が培養物から損失されず、最終的にろ過が高い細胞密度によって阻害されるか、生理学的な制限がさらなる成長とＳＮａｓｅ産生を妨げるまで、方法を続けることができる。生産性のさらなる改善は、培養ｐＨ、基質濃度及び流速の最適化で達成され得る。
【００８９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ここで用いられるプラスミドを発現するＳＮａｓｅの概略図である。フラスコ培養又は発酵槽中のＧＭ１７培地で得られる分泌されたＳＮａｓｅの収率（単位／ｍｌ）を右に示す。
【図２】
図２は、グルコース濃度とｐＨ値が異なる所定の培地における発酵実験から得た最大ＯＤ６００値を示す： ５．５、■； ６．０、▲； ６．５、●； 及び ７．０、◆。
【図３】
図３Ａ〜Ｄは、異なるｐＨ値で発酵した後のＬＭ３−３０ 培地中のエル．ラクティス株ＳＭＢＩ１１１（中程度のコピープラスミド、ＳＰ３１０ｍｕｔ２）による成長動態（ＯＤ６００、◆）とＳＮａｓｅ産生（単位／ｍｌ、■）を示す。（Ａ） ｐＨ ５．５； （Ｂ） ｐＨ ６．０； （Ｃ） ｐＨ ６．５； （Ｄ） ｐＨ ７．０。
【図４Ａ〜Ｂ】
図４Ａ〜Ｂは、ｐＨ ５．５（■）、６．０（▲）、６．５（●）及び７．０（◆）のＬＭ３−１５ 培地での成長中（Ａ）及びＬＭ３−３０培地での成長中（Ｂ）のＳＭＢＩ１１１についてのＯＤ６００に対するＳＮａｓｅ活性を示す。
【図５】
図５は、ｐＨ ６．５のＬＭ３−３０培地で発酵後のエル．ラクティスＳＭＢＩ１１１由来の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１〜９は、図３Ｃでヌクレアーゼ活性を分析した培養試料に相当する。１０μｌの粗培養上清を各レーンに充填した。分子量（キロダルトン）を右に示す。▲は、分泌されたＳＮａｓｅの位置を示す。
【図６Ａ〜Ｃ】
図６Ａ〜Ｃは、乳酸カリウムの添加によるＰ１７０の誘導を示す。ＳＭＢＩ１１１をｐＨ ７．０のＬＭ３−３０培地中に成長させた。ＯＤ６００がほぼ０．７である矢印で示した時点で、水（６Ａ）、２００ ｍＭ乳酸カリウム（６Ｂ）又は２００ ｍＭ塩化カリウム（６Ｃ）を培養物に加えた。ＯＤ６００を▲として、ヌクレアーゼ活性（単位／ｍｌ）を■として示す。
【図７Ａ〜Ｄ】
図７Ａ〜Ｄは、異なるｐＨ値（Ａ） ｐＨ ５．５、（Ｂ） ｐＨ ６．０、（Ｃ） ６．５のＬＭ５−５培地における流加培養発酵中のＳＭＢＩ１１１によるＳＮａｓｅ産生の動態を示す。７Ａ〜７Ｃで、ＯＤ６００を▲かつヌクレアーゼ活性（単位／ｍｌ）を■として示す。７Ｄは、異なるｐＨ値： ５．５、■； ６．０、▲； 及び６．５、●のＯＤ６００に対するＳＮａｓｅ活性を示す。点線は、高いＯＤ６００値で散乱が生じることを示している。結果として、幾つかの介在するＯＤ６００値をパネルＤで省略した。
【図８】
図８は、グルコール濃度が異なり： ５０ ｍＭ ＮａＣｌを有するＬＭ１−５中５ ｇ／ｌ； ＬＭ３−１５中１５ ｇ／ｌ； ＬＭ３−３０中３０ ｇ／ｌ； 及び流加培養中に徐々に加えられる７０ ｇ／ｌ以上、かつｐＨ値が異なる所定の培地での発酵によるＳＭＢＩ１１１から得られるＳＮａｓｅの最終収率を示す： ７．０、白色棒； ６．５、点線棒； ６．０、縞の棒；及び５．５、黒色棒。
【図９Ａ〜Ｂ】
図９Ａ〜Ｂは、ｐＨ ６．５のＬＭ５−５培地におけるＳＭＢＩ１０４株（高−コピープラスミド、ＳＰ３１０ｍｕｔ２）の流加培養発酵を示す。（Ａ）成長動態（ＯＤ６００、 ▲）及びＳＮａｓｅ産生（単位／ｍｌ、■）。（Ｂ）流加培養発酵後のＳＭＢＩ１０４の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１〜９は、図９Ａでヌクレアーゼ活性を分析した培養試料に相当する。粗培養上清１０μｌを各レーンに充填した。分子量（キロダルトン）を右に示す。▲は、分泌されたＳＮａｓｅの位置を示す。
【図１０】
図１０は、ｐＨ制御単位に応じて水酸化カリウムと培地を発酵槽に同時に添加した フォキソスタットにおけるｐＨ６．５でのＡＭＪ６２７のＬＭ５−５０培地中での培養を示す。実験中、発酵槽に添加するベースと培地の量の比を異なる値に設定した。バーは、添加した全容量（ベース＋培地）リットル当たりの水酸化物のモル数として算出される、異なる比に起因する入口の緩衝能を示す。培養物中の乳酸塩濃度を▲で示し、希釈率を■として示す。ＯＤ６００と ＳＮａｓｅ活性（単位／ｍＬ）は、それぞれ◆と●として示す。
【図１１】
図１１は、同時に開始した回分培養（□）に比較した２つの異なる培地添加速度（△： ０．１４ Ｌ／ｈ及び○： ０．０７Ｌ／ｈ） でのＳＭＢＩ１１１の短期ケモスタット培養中のＯＤ６００ （黒塗り記号）とＳＮａｓｅ活性（白抜き記号）を示す。全ての場合にＬＭ５−５０培地、ｐＨ ６．５を用いた。
【図１２】
図１２は、新鮮な培地を連続的に加え、ろ液を除去しながらの、ｐＨ ６．５のＬＭ５−５０培地におけるＳＭＢＩ１１１の培養中のＯＤ６００（黒塗り◇）とＳＮａｓｅ活性（白抜き◇）を示すが、細胞を培養容器に再利用した。同時に開始した回分培養の結果を比較して示す（□）。
発明の分野
本発明は、最も広い観点で、組換えＤＮＡ技術を用いて組換えの細菌細胞、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造する分野、特に乳酸菌宿主細胞における遺伝子発現系の使用に関する。詳細には、この発明は、異種のペプチド、ポリペプチド又は酵素及び医薬的に活性な生成物を含むタンパク質の乳酸菌における効果的な製造を可能にするような遺伝子発現系を用いる流加培養又は連続的な発酵法を提供する。
【０００２】
従来技術及び技術背景
所望の遺伝子産物の過剰発現のための適切な系を選択するには、多くの検討を行う必要がある。重要な問題には、必要とされる異種遺伝子産物の収率、発現系を用いる損害（ｃｏｓｔ）及び生産宿主で産生される組換え遺伝子産物の確実性／生物活性が含まれる。
異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の高レベルな生産は宿主細胞に負担となるので、培養期間の延長を避け、非生産変異体を選択する危険性を最小限にするため、誘導性、つまり生産生物の増殖中に抑制され得る制御可能な遺伝子発現系を使用するのが有利な可能性がある。
【０００３】
産業規模での生産に適当な誘導性発現系を開発するには、系の誘導が技術的な困難性を伴わないか、高価であるか、もしくは毒性の物質の使用を伴わないことも重要である。生産生物から得られる生成物の量に加えて、生産される遺伝子産物の純度が極めて重要である。全細胞溶解物に含まれる生成物の高収率は、望ましくない宿主細胞成分を除くために必要な以降の下流処理の工程中に実質的に減少される可能性がある。したがって、グラム−陰性細菌の周辺細胞質又はグラム−陽性細菌の細胞外環境いずれかへの分泌が、一般的には好ましい。
【０００４】
これまでのところ、エシェリキア・コリとバシラス・ズブチルスが、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質の組換え生産用に最も広く使用される細菌宿主生物である。これらの生物の分子生物学は、他の全原核細胞微生物のそれを上回るレベルに特徴付けられており、この広範囲な研究は、これらの細菌における異種遺伝子の容易なクローニングと発現を可能にする遺伝的手段の大きなコレクションを生じる基礎を形成している。
【０００５】
しかし、最近１０年のあいだ、同種又は異種のペプチド、ポリペプチド及びタンパク質の生産用細胞工場としての乳酸菌（ＬＡＢ）、特にラクトコッカス・ラクチスの開発に焦点が集まっている。ＬＡＢは、幾つかの点で異種遺伝子産物の製造に有利である。医薬上の適用のための組換えペプチド、ポリペプチド及びタンパク質の生産と投与は、世界中で規定の当局によって厳密な要求を受けている。例えば、大部分のグラム−陰性細菌の細胞壁成分であるエンドトキシンは、最終製品には存在すべきではない。乳酸菌は、エンドトキシンを生産せず、そのために、魅力的なタンパク質生産宿主生物となっている。加えて、エル．ラクティス株を含む幾つかの乳酸菌株は、細胞外プロテアーゼを生産せず、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を分泌でき、遺伝子産物の安定性を高く確保し、その後の精製を容易にすることができる
【０００６】
乳酸菌で用いるための誘導性遺伝子発現系を見込む幾つかの計画（Ｋｏｋ， １９９６； Ｋｕｉｐｅｒｓら、１９９７； Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ 及びＫｌａｅｎｈａｍｍｅｒ， １９９８）は、エル．ラクティス及びそのファージにおける遺伝子発現の制御に焦点をあてた研究をとおして達成されている。有用な乳酸菌発現系には、エル．ラクティスにおける抗微生物ペプチドのナイシンの生合成を制御する２成分系からの遺伝的要素に基づくＮＩＣＥ系が含まれる（ｄｅ Ｒｕｙｔｅｒら、１９９６）。２つの他の有用な誘導性発現系は、エル．ラクティスバクテリオファージＯ３１（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９９６； Ｗａｌｋｅｒ 及びＫｌａｅｎｈａｍｍｅｒ， １９９８）とｒ１ｔ（Ｎａｕｔａら、１９９７）由来の遺伝的要素に基づいている。
トランスポゾン、組込みベクター又はプラスミド中のプロモーターレスレポーター遺伝子（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎら、１９８７；Ｉｓｒａｅｌｓｅｎ 及び Ｈａｎｓｅｎ， １９９３；Ｓａｎｄｅｒｓら、１９９８）を用い、ＬＡＢで誘導性プロモーターを同定した。これらのプロモーターは、ｐＨ（Ｉｓｒａｅｌｓｅｎら、１９９５）及び塩濃度（Ｓａｎｄｅｒｓら、１９９８）のような環境変化によって誘導される。
【０００７】
宿主細胞により生じる代謝産物又は宿主細胞の成長中に天然に生じる条件によって誘導される遺伝子発現系は、低コスト及び誘導因子の食品グレードの状態により産業上興味深い。したがって、エル．ラクティスで用いるための新規な遺伝子発現系の開発で、共有されている公表された国際特許出願ＷＯ ９４／１６０８６ 及びＷＯ ９８／１００７９に開示されるようなｐＨ誘導性のＰ１７０及びその誘導体を含む誘導性プロモーターを利用した。Ｐ１７０プロモーターからの転写は、定常期への同時移行中に低ｐＨによって誘導され、つまり発現が指数的成長期中に抑制される。最近の研究で、Ｐ１７０プロモーターは詳細に特徴づけられ、本来の発現レベルは、制御に影響することなく遺伝工学により約１５０〜２００倍に増加された（Ｍａｄｓｅｎら、１９９９）。
【０００８】
乳酸菌宿主細胞を用いて費用−効果的な遺伝子産物レベルに達するための試みは将来有望であるが、しかし、そのような生産系の生産性を増すには持続的な産業上の必要性がある。さらに、培地が生産物の最終消費者に健康上危険な可能性がある潜在的に危険な成分を含まない発酵法を提供する必要がある。そのような望ましくない成分の例には動物ウイルス及びプリオンが含まれ、その存在は、窒素成分などの動物由来成分を含む従来の発酵培地中で完全に除くことができない。しかし、最も現在使用されている発酵培地は、そのような動物由来成分を含む化学的に定義されない培地である。
したがって、絶対に安全で、所望の遺伝子産物を現在の製造法と同一、好ましくはより高い収率で提供できる、異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造する方法を提供することが、強く求められている。
【０００９】
乳酸菌宿主細胞を用いる異種遺伝子産物の現在の製造法は、化学的に定義されていない、栄養素がリッチな培地中での宿主細胞の回分培養に基づいている。この発明は、そのような製造法における化学的に定義される、つまり合成培地の使用を包含する。従来の回分法でのそのような培地の使用は、遺伝子産物の収率を、従来の栄養素がリッチで化学的に定義されていない培地で達成されるよりも著しく低くすることが分かった。しかし、この問題は、製造法を連続法又は流加培養法として行うことによって克服できることが分かった。
【００１０】
発明の要約
したがって、この発明は、最も広い観点では、（ｉ）異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び操作可能に連結される、コード配列の発現を制御するための適当な制御ヌクレオチド配列からなる組換え乳酸菌を構築し、（ｉｉ）遺伝子を発現させる流加培養又は連続培養条件下で組換え細菌を培養し、かつ（ｉｉｉ）組換え細菌、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を回収する工程からなる、乳酸菌において異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造する方法を提供する。
【００１１】
適当な制御ヌクレオチド配列には、構成プロモーター又は制御可能な、つまり誘導性のプロモーターが含まれる。制御可能なプロモーターが使用される例では、そのようなプロモーターは、組換え菌の培養中に存在する環境因子によって制御されることが好ましく、それは、培地に誘導性物質を追加する必要がないことを意味する。特に有用な制御可能なプロモーターには、ＷＯ ９４／１６０８６及びＷＯ ９８／１００７９に開示される乳酸菌ｐＨ制御可能なプロモーターＰ１７０及びその誘導体が含まれる。
さらなる観点では、この発明は、以下からなる乳酸菌を培養するための化学的に定義される基礎培地（ＬＭ１ 培地）に関する。
【００１２】
【表２】
ａ Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １１９：７３６−７４７から
ｂ ビタミン： ０．４μＭビオチン、１０μＭピリドキサル−ＨＣｌ、２．３μＭ葉酸、２．６μＭリボフラビン、８μＭナイアシンアミド、３μＭチアミン−ＨＣｌ 及び２μＭパントテン酸塩
ｃ 微量栄養素： ０．００３μＭ （ＮＨ４）６（ＭＯ７）２４、０．４μＭ Ｈ３ＢＯ４、０．０３μＭ ＣｏＣｌ２、０．０１μＭ ＣｕＳＯ４、０．０８μＭ ＭｎＣｌ２及び０．０１μＭ ＺｎＳＯ４
【００１４】
さらなる観点では、この発明は、リン酸塩と酢酸ナトリウムを除くＬＭ１培地の全成分を３倍量で含む（各量はＬＭ１培地と同一レベルに維持される）乳酸菌を培養するための化学的に定義される培地（ＬＭ３培地）、及びリン酸塩と酢酸ナトリウムを除くＬＭ１培地の全成分を５倍量で含む（各量はＬＭ１培地と同一レベルで維持される）乳酸菌を培養するための化学的に定義される培地（ＬＭ５培地）に関する。
【００１５】
発明の詳細な開示
この発明のひとつの主たる目的は、組換え乳酸菌を製造し、乳酸菌で異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造する改良法を提供することである。
ここで用いられるように、用語「乳酸菌」は、優勢に製造される酸として乳酸を含む酸の製造とともに糖を発酵するグラム−陽性の微好気性又は嫌気性の細菌を示す。産業上もっとも有用な乳酸菌は、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス種、ラクトバシラス種、ロイコノストック種、ペディオコッカス種、ブレビバクテリウム種及びプロピオニバクテリウム種に見られる。さらに、乳酸菌群には、単独で又は乳酸菌との組み合わせで食品のスターター培養物として頻繁に用いられ、厳密には嫌気性細菌群に属する乳酸生産菌、ビフィドバクテリア、つまりビフィドバクテリア種が一般的には含まれる。
【００１６】
この方法の第一工程で、組換え乳酸菌は、所望の異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及びそれに操作可能に連結される、コード配列の発現を制御するための適当な制御ヌクレオチド配列を含むよう構築される。そのような構築は、当該分野で周知の方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載される方法を用いて行うことができる。
【００１７】
有用な具体例では、所望の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、リパーゼ、ペプチダーゼ、キモシンのような乳凝固活性を有するアスパラギン酸プロテアーゼ、ペプシン及び微生物由来のアスパラギン酸プロテアーゼをはじめとするプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼと他の澱粉分解酵素を含む炭水化物代謝に関与する酵素、グルコースオキシダーゼ及びヘキソースオキシダーゼを例として含むオキシドリダクターゼ、及び溶解酵素を含む酵素をコードする配列、キャプシドタンパク質のようなウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列、微生物細胞表面タンパク質構造をコードする配列及び例えばナイシン、ロイテリン及びペディオシンのようなバクテリオシンをコードする配列から選択される。また、ヌクレオチド配列は、抗生物質耐性を付与する遺伝子産物をコードする配列であってもよい。
【００１８】
特に興味深い例では、組換え乳酸菌は、微生物毒素を含む生物学的に機能的な遺伝子産物、免疫学的に活性なペプチド又はポリペプチド、医薬上活性なペプチド、ポリペプチド又はタンパク質及び抗微生物学的に活性なペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
この明細書で、免疫学的に活性な遺伝子産物は、少なくとも１つのエピトープを含むいずれかのアミノ酸配列を含む。そのような配列は、ワクチン及び／又は診断剤として有用で、ヒトを含む哺乳動物のような動物の免疫化が必要なあらゆる病原性生物に由来することができる。コードするヌクレオチド配列によって発現されるエピトープは、培養培地へ細胞から分泌されるものであってもよく、あるいは宿主生物の外表面に位置し、それにより組換え細胞自体のワクチンとしての適用を可能にすることが理解される。あるいは、エピトープは、細胞から単離される際には、細胞内に生ずることができる。エピトープを発現させる別の興味深い手段は、免疫学的に活性型のエピトープが融合タンパク質の一部として発現されるように、別のコード配列にエピトープをコードするヌクレオチド配列を挿入することによる。
【００２０】
詳細な例では、コードヌクレオチド配列は、マイコバクテリアの抗原決定基つまりエピトープ、すなわちヒトを含む動物への投与時に体液性及び／又は細胞性免疫反応に刺激作用を有する免疫学的に活性なオリゴペプチド又はポリペプチドをコードする。特に、そのようなコード配列は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、エム．ボビス及びエム．アフリカヌムを含む、「結核複合体」として一般的に言及されるマイコバクテリア種の群に属する生物に由来していてもよい。マイコバクテリア起源のそのような抗原性遺伝子産物は、結核皮膚試験で結核ワクチン及び／又は診断試薬として使用できる可能性を有する。乳酸菌のような安全な非病原性生物におけるヒト及び動物が用いるワクチン及び診断上活性な剤の産業上の生産が非常に有利であることは明らかである。
【００２１】
さらなる有利な具体例では、コードするヌクレオチド配列は、モノクローナル及びポリクローナル抗体を含む抗体をコードする配列である。そのようなコード配列は、鳥、哺乳動物及びヒトを含むあらゆる動物源に由来することができる。
本発明の方法によれば、組換え細胞は、コードヌクレオチド配列に操作可能に連結された少なくとも１つの構成プロモーター又は少なくとも１つの制御可能なプロモーターを含んでいてもよく、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合できる部位を示すために通常の意味で用いられる。
【００２２】
プロモーター領域は、本発明によれば、いずれかの原核細胞に由来してもよいが、好ましい例では、上記の種を含む乳酸菌種及びビフィドバクテリウム種に由来する。有用な具体例では、プロモーター領域は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスを含むラクトコッカス・ラクティス、例えばＭＧ１３６３と称される株［この株はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとしても文献（Ｎａｕｔａら、１９９６）で言及される］、及びラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス生物型ジアセチルラクティスのプロモーター領域に由来する。プロモーターＰ１７０からなる領域及びその誘導体（その例はＷＯ９８／１００７９に開示される）を含む組換え乳酸菌の構築に有用な本発明によるかかるプロモーター領域の例は、ＷＯ９４／１６０８６に示されている。
【００２３】
上記のとおり、組換え乳酸菌で用いられるプロモーターは制御可能なプロモーター又は誘導性プロモーターであるのが、所定の目的のためには有利である。プロモーターを制御又は誘導する因子には、温度及び光のような物理的条件、例えばＩＰＴＧ、トリプトファン、乳酸塩又はナイシンのような化学物質を含むプロモーター配列の活性を制御できる物理的かつ化学的なあらゆる因子が含まれる。現在好ましい例では、この発明で使用される制御可能なプロモーターは、培養工程中に生じる環境因子又は成長条件因子によって制御される。そのような制御可能なプロモーターを用いる利点は、培養培地に誘導性化合物又は制御化合物を加える必要がないことである。そのような制御因子は、ｐＨ、成長温度、酸素含量、熱ショック遺伝子の発現を誘導する温度シフト、イオン強度／ＮａＣｌ含量を含む成長培地の組成、細胞内又は乳酸／乳酸塩を含む代謝物の培地中での蓄積、必須細胞構成物又はその前駆体の有無、細菌の成長期又は細菌の成長速度から選択される。
【００２４】
プロモーターが、その誘導又は制御が成長培地に存在する１以上の物質によって制御されるプロモーターであるときに、通常そのような培地の成分ではない物質、例えば抗生物質又はバクテリオシンが、本発明によれば、環境又は成長条件因子として一般には含まれないことは理解されたい。
【００２５】
ひとつの好ましい例では、プロモーターと異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチドは、プラスミド、トランスポゾン因子、バクテリオファージ又はコスミドのような自律複製レプリコンで乳酸菌に導入される。少なくともコード配列が宿主細胞染色体に組みこまれる条件でプロモーターとコード配列を導入することが、コード配列の細胞での維持を安定にするので、有利であり得る。あるいは、異種のコード配列は、選択された宿主生物の染色体に天然に存在するプロモーターに操作可能に連結される位置で宿主細胞の染色体に導入される。つまり、さらなる具体例では、異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されるプロモーターは、コード配列と天然には結合していないプロモーターである。
【００２６】
さらに有利な具体例では、コードヌクレオチド配列は、遺伝子産物が細胞膜を越えて培地に分泌されることを許容するシグナルペプチド（ＳＰ）をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結される。ＳＰは、 Ｓｅｃ−依存性分泌タンパク質に存在するＮ−末端伸長である。典型的なＳＰの構造は、３つの異なる領域を含む： （ｉ） 正に帯電したアミノ酸、リジン及びアルギニンを幾つか含むＮ−末端領域； （ｉｉ） 中心の疎水性コア及び； （ｉｉｉ） シグナルペプチダーゼによって認識される配列モチーフを含む親水性Ｃ−末端。分泌のために標的化されるタンパク質は、Ｎ−末端にシグナル配列又はシグナルペプチド（ＳＰ）を含む。ＳＰは、細胞膜を介する移動中に細胞の分泌機序の成分であるリーダー又はシグナルペプチダーゼによって認識され、切断される。ＳＰは、グラム−陽性細菌で通常２５アミノ酸〜３５アミノ酸（ａａ）以上の大きさである。ＳＰは、配列ホモロジーを共有しないが、しばしば１以上の塩基性ａａを含むアミノ末端、７以上のａａの中心疎水性コア及びシグナルペプチダーゼによって認識されるモチーフを含む親水性カルボキシ末端からなる。エル．ラクティス由来の利用可能なＳＰの調査は、主に分泌されるラクトコッカスタンパク質であるＵｓｐ４５由来のＳＰの使用を示唆した（ｖａｎ Ａｓｓｅｌｄｏｎｋら、１９９０）。このＳＰは、エル．ラクティスで幾つかの異種タンパク質の分泌に機能的であることが報告された（ｖａｎ Ａｓｓｅｌｄｏｎｋら、１９９３）。
【００２７】
詳細な具体例では、シグナルペプチドは、Ｕｓｐ４５シグナルペプチドと配列ＭＫＦＮＫＫＲＶＡＩＡＴ−ＦＩＡＬＩＦＶＳＦＦＴＩＳＳＱＤＡＱＡＡＥＲＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）を有するシグナルペプチドからなる群から選択される。
本発明による方法の以降の工程では、こうして得た組換え乳酸菌を、所望の遺伝子産物をコードする配列を発現させる流加培養又は連続培養条件で培養し、培養中（連続時）又は培養工程の終了時（流加培養時）に、細胞、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を分離する従来技術を用いて組換え細胞又はペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を回収する。
【００２８】
もっとも広い意味において、表現「流加培養」は、１以上の栄養素が培養中に培養容器又はバイオリアクターに供給され、培養細胞と遺伝子産物が操作の最後まで依然として封入される培養技術として定義される。幾つかの場合、全ての栄養素は、徐々にバイオリアクターに供給される。ここで用いられるように表現「連続培養」は、全栄養素が連続的に培養容器又はバイオリアクターに添加され、培地及び／又は細胞培養の画分が供給された栄養素と同一の流速で除かれ、一定の培養量を維持する培養法を記載するために用いられる。
本発明のこれらの培養方法とは逆に、従来の「回分」培養は、好気処理中における分子酸素及びｐＨ調整のための化学物質を除いて、培養操作中に必要な全栄養素が培養の開始前に培地に添加される方法である。
【００２９】
時間−温度条件、ｐＨ条件及び通気条件、関連する際には、バイオリアクターへの栄養素の供給速度は、使用される乳酸菌の特定の型に依存するであろう。そのような条件の詳細な例を、以下の実施例で示す。一般的に、上記条件下の流加培養は、１５〜４０℃の温度範囲かつ４〜８のｐＨ範囲で２４〜７２時間行われる。この発明による連続培養法は、数１００時間のような長期間のあいだこれらの温度とｐＨ条件で行ってもよい。
【００３０】
方法の現在好ましい具体例では、組換え乳酸菌は、化学的に定義される培地で培養される。ここで用いられるように表現「化学的に定義される培地」は、定義されない窒素又は炭素源、例えば動物又は植物のタンパク質もしくはタンパク質加水分解組成物又は例えば糖蜜もしくはコーンスティープリカーのような複雑な炭素源を本質的に含まないが、窒素源がアンモニア又はアミノ酸のような十分に定義された無機又は有機化合物であり、かつ炭素源がグルコースのような十分に定義された糖である培地を意味する。さらに、そのような合成培地は、塩、例えば硫酸塩、酢酸塩、リン酸塩及びアルカリならびにアルカリ土類金属の塩化物、ビタミン及び微量栄養素のような無機成分を含む。この発明の目的のため、化学的に定義された培地の例をここに示す。これらの培地は単なる例であることを認識されたい。当業者は、上記の培養条件下で組換え乳酸菌の培養を許容する他の培地を提供できるであろう。
【００３１】
この方法で用いられる合成培地は、炭素源を含む必要がある。炭素源の濃度は、組換え乳酸菌の種類と選択された培養条件に依存する。有用な具体例では、炭素源はグルコースである。好ましい具体例では、培養中のグルコース濃度は、流加培養法での制御されたグルコース供給によって、又は連続培養法での完全なグルコース含有完全培地の供給によって、少なくとも約０．５ｇ／Ｌの予備選択濃度に維持される。培養培地中のグルコース濃度は、少なくとも５ｇ／Ｌ、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０、８０又は１００ ｇ／Ｌであることが好ましい。
【００３２】
本発明によれば、流加培養法で培地へのグルコース供給を制御するひとつの簡便な方法は、バイオリアクターのｐＨ制御手段にそのような供給を連結又は接続することである。こうして、グルコースの供給が、ｐＨを制御する基礎の自動添加制御手段によって作動される。同様に、連続培養法では、完全培地の供給は、ｐＨのオーキソスタット（ａｕｘｏｓｔａｔ）原理によるｐＨの制御に関連付けることができる。
純粋な合成培地を用いて十分な収率の遺伝子産物を得ることができることが分かったが、収率は、上記の化学的に定義された培地を酵母抽出物とともに供給することでさらに増加できることが見出された。酵母抽出物の適当な量は、例えば１〜５ｇ／Ｌの範囲のような０．１〜１０ｇ／Ｌの範囲の量である。したがって、この明細書で、「化学的に定義された培地」は、適当な量の酵母抽出物で富化された化学的に定義された培地を含んでいてもよい。
【００３３】
この発明の主たる目的は、遺伝子産物を高収率で製造する方法を提供することである。したがって、好ましい具体例では、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の収率は、少なくとも５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、例えば少なくとも５０ｍｇ／Ｌを含む少なくとも２０ｍｇ／Ｌである。特に好ましい具体例では、得られる収率は、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ及び少なくとも２００ｍｇ／Ｌを含む少なくとも１００ｍｇ／Ｌである。
上記のように、この発明は、さらなる観点では、以下からなる、細菌を培養するための具体的に化学的に定義された基礎培地（ＬＭ１培地）に関する：
【００３４】
【表３】
ａ Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １１９：７３６−７４７から
ｂ ビタミン：０．４μＭビオチン、１０μＭピリドキサル−ＨＣｌ、２．３μＭ葉酸、２．６μＭリボフラビン、８μＭナイアシンアミド、３μＭチアミン−ＨＣｌ 及び２μＭパントテン酸塩
ｃ 微量栄養素： ０．００３μＭ （ＮＨ４）６（ＭＯ７）２４、０．４μＭ Ｈ３ＢＯ４、０．０３μＭ ＣｏＣｌ２、０．０１μＭ ＣｕＳＯ４、０．０８μＭ ＭｎＣｌ２及び０．０１μＭ ＺｎＳＯ４
【００３６】
また、各量がＬＭ１培地と同一レベルに維持されている、リン酸塩及び酢酸ナトリウムを除くＬＭ１培地の全成分を３倍量で含むＬＭ３培地、及び各量がＬＭ１培地と同一レベルに維持されている、リン酸塩及び酢酸ナトリウムを除くＬＭ１培地の全成分を５倍量で含むＬＭ５培地と称される培地を含むＬＭ１培地由来の化学的に定義された培地が提供される。
また、上記のように、この発明の化学的に定義された培地は、適当な所定の炭素源で補充される必要がある。したがって、有用な具体例では、上記培地はいずれも、一般に５〜４０ｇ／Ｌのような２〜５０ｇ／Ｌの範囲を含む１〜１００ｇ／Ｌの範囲の量のグルコースで補充される。
【００３７】
この発明は、以下の実施例及び図でさらに詳述されるであろう：
図１は、ここで用いられるプラスミドを発現するＳＮａｓｅの概略図である。フラスコ培養又は発酵槽中のＧＭ１７培地で得られる分泌されたＳＮａｓｅの収率（単位／ｍｌ）を右に示す。
図２は、グルコース濃度とｐＨ値が異なる所定の培地における発酵実験から得た最大ＯＤ６００値を示す： ５．５、■； ６．０、▲； ６．５、●； 及び ７．０、◆。
図３Ａ〜Ｄは、異なるｐＨ値で発酵した後のＬＭ３−３０ 培地中のエル．ラクティス株ＳＭＢＩ１１１（中程度のコピープラスミド、ＳＰ３１０ｍｕｔ２）による成長動態（ＯＤ６００、◆）とＳＮａｓｅ産生（単位／ｍｌ、■）を示す。（Ａ） ｐＨ ５．５； （Ｂ） ｐＨ ６．０； （Ｃ） ｐＨ ６．５； （Ｄ） ｐＨ ７．０。
【００３８】
図４Ａ〜Ｂは、ｐＨ ５．５（■）、６．０（▲）、６．５（●）及び７．０（◆）のＬＭ３−１５ 培地での成長中（Ａ）及びＬＭ３−３０培地での成長中（Ｂ）のＳＭＢＩ１１１についてのＯＤ６００に対するＳＮａｓｅ活性を示す。
図５は、ｐＨ ６．５のＬＭ３−３０培地で発酵後のエル．ラクティスＳＭＢＩ１１１由来の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１〜９は、図３Ｃでヌクレアーゼ活性を分析した培養試料に相当する。１０μｌの粗培養上清を各レーンに充填した。分子量（キロダルトン）を右に示す。▲は、分泌されたＳＮａｓｅの位置を示す。
【００３９】
図６Ａ〜Ｃは、乳酸カリウムの添加によるＰ１７０の誘導を示す。ＳＭＢＩ１１１をｐＨ ７．０のＬＭ３−３０培地中に成長させた。ＯＤ６００がほぼ０．７である矢印で示した時点で、水（６Ａ）、２００ ｍＭ乳酸カリウム（６Ｂ）又は２００ ｍＭ塩化カリウム（６Ｃ）を培養物に加えた。ＯＤ６００を▲として、ヌクレアーゼ活性（単位／ｍｌ）を■として示す。
図７Ａ〜Ｄは、異なるｐＨ値（Ａ） ｐＨ ５．５、（Ｂ） ｐＨ ６．０、（Ｃ） ６．５のＬＭ５−５培地における流加培養発酵中のＳＭＢＩ１１１によるＳＮａｓｅ産生の動態を示す。７Ａ〜７Ｃで、ＯＤ６００を▲かつヌクレアーゼ活性（単位／ｍｌ）を■として示す。７Ｄは、異なるｐＨ値： ５．５、■； ６．０、▲； 及び６．５、●のＯＤ６００に対するＳＮａｓｅ活性を示す。点線は、高いＯＤ６００値で散乱が生じることを示している。結果として、幾つかの介在するＯＤ６００値をパネルＤで省略した。
【００４０】
図８は、グルコール濃度が異なり： ５０ ｍＭ ＮａＣｌを有するＬＭ１−５中５ ｇ／ｌ； ＬＭ３−１５中１５ ｇ／ｌ； ＬＭ３−３０中３０ ｇ／ｌ； 及び流加培養中に徐々に加えられる７０ ｇ／ｌ以上、かつｐＨ値が異なる所定の培地での発酵によるＳＭＢＩ１１１から得られるＳＮａｓｅの最終収率を示す： ７．０、白色棒； ６．５、点線棒； ６．０、縞の棒；及び５．５、黒色棒。
図９Ａ〜Ｂは、ｐＨ ６．５のＬＭ５−５培地におけるＳＭＢＩ１０４株（高−コピープラスミド、ＳＰ３１０ｍｕｔ２）の流加培養発酵を示す。（Ａ）成長動態（ＯＤ６００、 ▲）及びＳＮａｓｅ産生（単位／ｍｌ、■）。（Ｂ）流加培養発酵後のＳＭＢＩ１０４の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１〜９は、図９Ａでヌクレアーゼ活性を分析した培養試料に相当する。粗培養上清１０μｌを各レーンに充填した。分子量（キロダルトン）を右に示す。▲は、分泌されたＳＮａｓｅの位置を示す。
【００４１】
図１０は、ｐＨ制御単位に応じて水酸化カリウムと培地を発酵槽に同時に添加した フォキソスタット（ｐｈａｕｘｏｓｔａｔ）におけるｐＨ６．５でのＡＭＪ６２７のＬＭ５−５０培地中での培養を示す。実験中、発酵槽に添加するベースと培地の量の比を異なる値に設定した。バーは、添加した全容量（ベース＋培地）リットル当たりの水酸化物のモル数として算出される、異なる比に起因する入口の緩衝能を示す。培養物中の乳酸塩濃度を▲で示し、希釈率を■として示す。ＯＤ６００と ＳＮａｓｅ活性（単位／ｍＬ）は、それぞれ◆と●として示す。
【００４２】
図１１は、同時に開始した回分培養（□）に比較した２つの異なる培地添加速度（△： ０．１４ Ｌ／ｈ及び○： ０．０７Ｌ／ｈ） でのＳＭＢＩ１１１の短期ケモスタット培養中のＯＤ６００ （黒塗り（ｆｉｌｌｅｄ）記号）とＳＮａｓｅ活性（白抜き（ｏｐｅｎ）記号）を示す。全ての場合にＬＭ５−５０培地、ｐＨ ６．５を用いた。及び
図１２は、新鮮な培地を連続的に加え、ろ液を除去しながらの、ｐＨ ６．５のＬＭ５−５０培地におけるＳＭＢＩ１１１の培養中のＯＤ６００（黒塗り◇）とＳＮａｓｅ活性（白抜き◇）を示すが、細胞を培養容器に再利用した。同時に開始した回分培養の結果を比較して示す（□）。
【００４３】
実施例
材料と方法
細菌株、プラスミド及び成長条件
この研究で用いた株とプラスミドを表４に挙げる。
大腸菌株ＤＨ１０Ｂ （Ｇｒａｎｔら、１９９０）を、適当な時にエリスロマイシン２００ μｇ／ｍｌを補充した ＬＢ培地中で３７℃で成長させた。ラクトコッカス・ラクティス株 ＭＧ１３６３ （Ｇａｓｓｏｎ， １９８３）を、必要であれば、エリスロマイシン１μｇ／ｍｌを補充した ＧＭ１７培地（５ｇ／Ｌ グルコースを有する１．５ ｘ Ｍ１７）に３０℃で常套的に成長させた。全てのフラスコと発酵槽の実験を３０℃で行った。
Ｐ１７０プロモーターの誘導を避けるために、前培養物をＡｒｇＭ１７ 培地（Ｍａｄｓｅｎら、１９９９）中で成長させ、０．５〜１．０のＯＤ６００で回収した。細胞を洗浄し、ｐＨ６．８の冷２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で２０倍に濃縮した。懸濁液のアリコート１ ｍｌを−７０℃でグリセロールとともに凍結し（３５％最終濃度）、発酵槽培地１Ｌの接種に用いた。
【００４４】
【表４】
発酵に用いた所定の基礎培地、ＬＭ１は、ＪｅｎｓｅｎとＨａｍｍｅｒ （１９９３）によって開発されるＳＡ培地に由来した。この後者の培地は、以下の組成を有する（ｍＭ又は培地中での有無）：
【００４６】
【表５】
ａ Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １１９：７３６−７４７から
ｂ ビタミン： ０．４μＭビオチン、１０μＭピリドキサル−ＨＣｌ、２．３μＭ葉酸、２．６μＭリボフラビン、８μＭナイアシンアミド、３μＭチアミン−ＨＣｌ及び２μＭパントテン酸塩
ｃ 微量栄養素： ０．００３μＭ （ＮＨ４）６（ＭＯ７）２４、０．４μＭ Ｈ３ＢＯ４、０．０３μＭ ＣｏＣｌ２、０．０１μＭ ＣｕＳＯ４、０．０８μＭ ＭｎＣｌ２及び０．０１μＭ ＺｎＳＯ４
【００４８】
ＳＡ培地と比較して、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、トリシン（ｔｒｉｃｉｎｅ）とＭＯＰＳをＬＭ１培地中で除き、リン酸塩（Ｋ２ＨＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４）の濃度を１０ ｍＭ に（緩衝ストック溶液のｐＨ ７から）上げ、０．１ ｍＭクエン酸を加えて鉄塩の沈降を妨げた。ＬＭ３及びＬＭ５と称される培地で、リン酸塩緩衝液と酢酸ナトリウムを除く全成分をそれぞれ３倍と５倍に増した。培地の名称の最終的な案は、ｇ／Ｌでのグルコース濃度を示す（例えばＬＭ１−５は５ ｇ／Ｌグルコースを含む）。ＨＣｌを用いてｐＨを調整し、発酵中に２ Ｍ又は５ ＭのＫＯＨを自動的に加え、ｐＨを維持した。全容量２Ｌのアプリコン（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）ディッシュの底ガラス容器を１Ｌの培養に用いた。攪拌速度は、３００ｒｐｍであった。
【００４９】
クローニング法、形質転換、ＰＣＲ及びＤＮＡシーケンシング
ＰＣＲ増幅とＤＮＡシーケンシングを含むＤＮＡ操作は、標準的な手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）にしたがって行った。大腸菌由来のプラスミドＤＮＡをＪｅｔ Ｐｒｅｐカラム（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いて単離した。Ｈｏｌｏ及びＮｅｓ （１９８９）によって記載されるように、エル．ラクティスをエレクトロポレーションで形質転換した。
【００５０】
ｐＨ及び成長期制御遺伝子発現及び分泌のためのプラスミドの構築
エル．ラクティスについてのｐＨ及び成長期制御分泌ベクターは、ＷＯ ９８／１００７９ とＭａｄｓｅｎら（１９９９）に開示され、ブタペスト条約の下、受託番号ＤＳＭ １１１３７で寄託されるプラスミドｐＡＭＪ５８６のＰ１７０プロモーター誘導体をＵｓｐ４５シグナル配列（ｖａｎ Ａｓｓｅｌｄｏｎｋら、１９９０）と組み合わせて構築した。プラスミドｐＡＭＪ５８６をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、ｌａｃＬＭレポーター遺伝子を、ｌａｃＬＭ リボソーム結合部位（Ｉｓｒａｅｌｓｅｎら、１９９５）、Ｕｓｐ４５シグナルペプチド及びＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ及びＳａｌＩ制限部位からなるイン−フレームのマルチクローニング部位を含む１５８ ｂｐのＤＮＡフラグメントで置換した。ＰｓｔＩ部位は、シグナル配列中のＰｓｔＩ部位の位置のためにユニークではない。この１５８ ｂｐのＤＮＡフラグメントは、鋳型としてのｐＮＺ１０２０（Ｕｓｐ４５シグナルペプチドを有するプラスミド）及びＵｓｐプライマー１ （５’ ＴＡＧ ＴＡＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＴＡ ＧＧＧ ＴＡＡ ＣＴＴ ＴＧＡ ＡＡＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＣＣＴ ＣＡＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＡＴ ＣＴＣ ＡＧＣ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） 及びＵｓｐプライマー２ （５’ ＡＣＧ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＴＧ ＴＧＴ ＣＡＧ ＣＧＴ ＡＡＡ ＣＡＣ Ｃ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）のプライマーを用いてＰＣＲにより合成した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、同じ酵素で予め消化したｐＡＭＪ５８６に連結し、ｐＳＭＡ６１０を得た。
【００５１】
ｐＳＭＡ６１０は、マルチクローニング部位の後に転写ターミネーターを含まない。したがって、大腸菌の転写ターミネーター、ｒｒｎＣｔｔ’ （Ａｌｂｒｅｃｈｔｓｅｎら、１９９０）を、鋳型としてのｐＨＢＡ１０２ （Ａｌｂｒｅｃｈｔｓｅｎら、１９９０）及びプライマーＴｅｒ １ （５’ ＴＡＧ ＴＡＧ ＴＣＧ ＡＣＡ ＡＣＣ ＧＧＧ ＴＧＴ ＴＧＧ ＧＡＧ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４） とｒｒｎｃｔｔ ＸｈｏＩ （５’ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＣＧ ＡＧＧ ＧＣＧ ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＧＣ ＧＡＴ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）を用いてＰＣＲ増幅した。フラグメントをＸｈｏＩとＳａｌＩで消化し、ｐＳＭＡ６１０のＳａｌＩ部位に挿入した。得られたベクターを、ｐＡＭＪ２１９と称した。
【００５２】
高コピー数のＰ１７０−ベースの発現ベクター、ｐＡＭＪ３２５を、高コピーベクターｐＴＲＫＨ４ （Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ及びＫｌａｅｎｈａｍｍｅｒ， １９９３ａ）に、ｐＡＭＪ７５２由来の強力なＰ１７０プロモーター（Ｍａｄｓｅｎら、１９９９）、ｌａｃＬＭリボソーム結合部位及び新たなマルチクローニング部位を含むＰＣＲフラグメントを挿入して構築した。プラスミドｐＴＲＫＨ４をＸｂａＩで消化し、次いでクレノウフラグメントで平滑末端化した。ＰＣＲフラグメントを、鋳型としてのｐＡＭＪ７５２及びｐＡＫ８０ｒｅｖ２ （５’ ＣＣＣ ＡＴＴ ＴＡＧ ＣＣＧ ＴＣＡ ＴＴＴ ＣＡＧ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６） とＬＢＥｐ０４１ （５’ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＡＴ ＡＴＣ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＧＡＡ ＴＡＴ ＣＣＴ ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＴＴ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）のプライマーを用いて増幅により得た。ＰＣＲフラグメントをクレノウ処理したｐＴＲＫＨ４に平滑末端で連結し、ｐＡＭＪ３２５を得た。大腸菌の転写ターミネーター、ｒｒｎＣｔｔ’を、鋳型としてのｐＡＭＪ２１９及び上記のＴｅｒ １ ならびにｒｒｎｃｔｔ ＸｈｏＩのプライマーを用いてＰＣＲ増幅後にｐＡＭＪ３２５に挿入した。得られた高−コピー数発現ベクターを、ｐＡＭＪ３２８と称した。ｐＡＭＪ３２５とｐＡＭＪ３２８は、分泌シグナルをエンコードする遺伝子を含まない。
【００５３】
スタフィロコッカス・アウレウスのヌクレアーゼの発現ベクターへのクローニング
スタフィロコッカス・アウレウスのヌクレアーゼ（ＳＮａｓｅ）を分泌する発現ベクターの適正を評価するため、シグナルペプチドをエンコードする遺伝子を欠くＮｕｃＢ遺伝子（Ｄａｖｉｓら、１９７７； Ｌｅ Ｌｏｉｒら、１９９４）を、２つのプライマーＮｕｃ１ （５’ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＧＡＴ ＡＡＣ ＧＧＣ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８） 及びＮｕｃ２ （５’ ＡＣＧ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＧＡ ＴＣＴ ＡＡＡ ＡＡＴ ＴＡＴ ＡＡＡ ＡＧＴ ＧＣＣ ３’） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）を用いてＰＣＲ増幅した。プライマーの下線配列は、それぞれＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩ制限部位を示す。これらのプライマーを設計して、翻訳停止コドンの直後に１６８個のＣ−末端アミノ酸のコード配列と６３ ｂｐを含む５６７ ｂｐのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅させた。８７１ ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントに全ＳＮａｓｅ遺伝子を含むプラスミドｐＢＳ：：ｎｕｃ （Ｌｅ Ｌｏｉｒら、１９９４）を、プライマーＮｕｃ１及びＮｕｃ２とともにＰＣＲ反応で鋳型として用いた。増幅したフラグメントを、次いでＢｇｌＩＩとＳａｌＩで消化し、ｐＳＭＡ６１０に挿入して、Ｕｓｐ４５シグナルペプチドへのｎｕｃＢ遺伝子の翻訳融合体を生じた。得られたプラスミドをｐＡＭＪ１６６と命名した。
【００５４】
最近の別の研究では、シグナルペプチドプローブベクターｐΔＳＰＮｕｃを開発し、これを用いてラクトコッカス・ラクティス由来の新規な分泌シグナルを分析した（Ｒａｖｎら、２０００）。ＳＰ３１０の最適化されたシグナルペプチド誘導体、配列ＭＫＦＮＫＫＲＶＡＩＡＴＦＩＡＬＩＦＶＳＦＦＴＩＳＳＱＤＡＱＡＡＥＲＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）を有するＳＰ３１０ｍｕｔ２をｐΔＳＰＮｕｃに挿入し、プラスミド ｐ３１０ｍｕｔ２を得た。
【００５５】
最大レベルのヌクレアーゼ分泌を研究するため、ｐＡＭＪ７５２に位置する最も強力なＰ１７０誘導体（Ｍａｄｓｅｎら、１９９９）をＵｓｐ４５及び最適化されたＳＰ３１０ｍｕｔ２シグナルペプチドそれぞれと組み合わせた。これらの構築のため、ｐＡＭＪ１６６とｐ３１０ｍｕｔ２をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、シグナルペプチドをエンコードする遺伝子とヌクレアーゼ遺伝子を含む９００ ｂｐのフラグメントを精製し、Ｐ１７０プロモーター、エリスロマイシン耐性遺伝子及びクエン酸塩プラスミドレプリコン（Ｉｓｒａｅｌｓｅｎら、１９９５）を含むｐＡＭＪ７５２のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントに連結し、プラスミドｐＳＭＢＩ９３とｐＳＭＢＩ１０９それぞれを生じた。ｐＳＭＢＩ９３とｐＳＭＢＩ１０９をエル．ラクティスに形質転換し、株ＳＭＢＩ１０５とＳＭＢＩ１１１を得た。
【００５６】
ヌクレアーゼ分泌に対する高コピー数の影響を研究するため、ｐＡＭＪ３２８ベースの２つのヌクレアーゼ発現プラスミドを構築した。同様にして消化したｐＡＭＪ３２８にｐ３１０ｍｕｔ２由来の９００ ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントとｐＡＭＪ１６６を挿入して、ｐＳＭＢＩ９１とｐＳＭＢＩ９８を構築した。エル．ラクティスへのｐＳＭＢＩ９１とｐＳＭＢＩ９８の形質転換により、株ＳＭＢＩ１０４とＳＭＢＩ１０６を得た。
【００５７】
ヌクレアーゼ活性測定
培養上清のヌクレアーゼ活性を、基質として超音波処理したサケのＤＮＡと共にインキュベートし、次いで氷冷過塩素酸に沈降させ、次いで２６０ ｎｍ （Ａ２６０）で吸光度を測定して決定した。適当な希釈液の試料１０μｌをアッセイ緩衝液（１ ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡ、０．１ ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１０ ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８，８） ５００μｌに加え、３７℃でインキュベートした。３０分後、氷冷４％ （ｗ／ｖ）過塩素酸５００μｌを加えた。大きなＤＮＡフラグメントを０℃で１５〜３０分沈降させ、最後に遠心分離により酸可溶性分解産物から分離した。上清でＡ２６０を測定した。各試料について「ゼロ時」に相当する Ａ２６０を得るため、アッセイ緩衝液５００μｌを５００μｌの４％ ＰＣＡと０℃で混合し、適当な希釈液試料１０μｌ （希釈緩衝液： ０．１ ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン、１０ ｍＭ ＣａＣｌ２、２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８，８）を加え、上記のように沈降させた。ヌクレアーゼ１単位を、天然のＤＮＡから酸可溶性ポリヌクレオチド１μｍｏｌを１分当たりに生じるヌクレアーゼ量として定義する。試料ｍｌ当たりの ＳＮａｓｅ活性単位は、式
【数１】
【００５８】
タンパク質の特徴づけとＳＤＳ−ＰＡＧＥ
製造者の指示にしたがって、ＳＤＳ−トリス−グリシン緩衝液中の１２％ ポリアクリルアミドゲル（ＮＯＶＥＸ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳ）で分離することにより、培養上清を分析した。製造者の指示に従って、ゲルをクマシーブリリアントブルーＲ２５０ （Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ， ６４２６１ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色した。分子量マーカーＭａｒｋ１２ＴＭ （ＮＯＶＥＸ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳ）を分子量の大きさの評価に用いた。
【００５９】
中程度のコピー数プラスミド及び高コピー数プラスミドの細胞当たりの相対的なコピー数の粗決定
培養物を、３０℃で一晩ＧＭ１７培地（５ｇ／Ｌグルコースを有する１．５ｘＭ１７）で成長させた。一晩の培養物を新鮮な培地で２０倍に希釈し、プラスミド抽出用に試料１０ ｍｌを細胞の成長中に回収した。プラスミド ＤＮＡを、Ｏ’ＳｕｌｌｉｖａｎとＫｌａｅｎｈａｍｍｅｒ （１９９３ｂ）のプロトコルにしたがって、等量の細胞から抽出した。各プラスミドを５０μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、ＳａｌＩで消化した後、アガロースゲルの電気泳動により分析した。
【００６０】
実施例１
栄養リッチな培地を用いるフラスコ培養と発酵槽培養におけるエス．アウレウスのヌクレアーゼの分泌
１．１． フラスコ培養
プラスミドｐＳＭＢＩ９１、ｐＳＭＢＩ９３、ｐＳＭＢＩ９８及びｐＳＭＢＩ１０９を発現する４つのヌクレアーゼそれぞれをエル．ラクティスＭＧ１３６３に形質転換し、ＧＭ１７培地中フラスコで一晩成長させた後にヌクレアーゼ活性を測定した。結果を図１に要約する。
【００６１】
ｐＡＫ８０骨格に基づく中程度のコピー数ベクターを用いて、Ｕｓｐ４５シグナルペプチドの使用により、ＳＰ３１０ｍｕｔ２シグナルペプチドの使用に対して収率が約１８％高い分泌ヌクレアーゼを得た。この違いは、高コピー数ベクターｐＴＲＫＨ４を発現に用いる際には、約２３％とわずかに高い。 高コピーベクターの使用により、中程度のコピーベクターに対して力価が２．５〜３である分泌ＳＮａｓｅの収率が増した。この増加は、アガロースゲル電気泳動によって決定されたように（データ示さず）、ｐＡＫ８０に対し４倍高いコピー数のｐＴＲＫＨ４に一致している。このことは、高コピー数プラスミドの使用が、分泌系の飽和をもたらさないことを示している。これらの結果は、プラスミドのコピー数と分泌ＳＮａｓｅの収率との正の相関関係を立証したＬａｎｇｅｌｌａとＬｅ Ｌｏｉｒ （１９９９）によって行われた研究と一致している。
【００６２】
１．２． 発酵槽培養
Ｐ１７０を細胞内に位置するβ−ガラクトシダーゼの生産の駆動に用いた先の実験（Ｉｓｒａｅｌｓｅｎら、１９９５）で、同一培地でのフラスコ培養に対して５倍の高い収率が、発酵槽中での低いｐＨ５．５での培養によって得られた。この収率増加は、乳酸の生産のためにｐＨが徐々に低下し、成長のごく最後にのみ５．７〜５．８に達するフラスコ培養に比較して、長期間にわたって活性なＰ１７０プロモーターの単なる結果であると思われる。
【００６３】
制御された−ｐＨ発酵の使用が分泌産物の生産レベルをも改善するかどうかを研究するため、発酵槽中でｐＨ５．５のＧＭ１７培地で成長させた４つのヌクレアーゼ発現株から得たヌクレアーゼの収率を測定し、分析した。遺伝子発現誘導の動態を追跡するため、試料を異なるＯＤ６００値で採取し、ヌクレアーゼ活性に対して分析した。β−ガラクトシターゼを用いる同様の研究から予想されるように、ヌクレアーゼの顕著な成長期−依存性生産が、４つの試験株全てで観察された（データ示さず）。４つの株全てについて、最大分泌レベルは、上記のフラスコ培養実験に対して発酵槽実験で約３〜４倍高かった（図１）。また、ＳＮａｓｅ分泌に対するＵｓｐ４５の使用は、ＳＰ３１０ｍｕｔ２の使用に比較してわずかに効率的であった（〜１２−１７ ％）。最大収率は、Ｕｓｐ４５シグナルペプチドと組合わせた高コピー数ベクターを用いて分泌ＳＮａｓｅについて約１０単位／ｍｌであった。
【００６４】
実施例２
回分発酵を用いる合成培地におけるＳＮａｓｅのｐＨ及び成長期依存性発現
定常期へ移行中の低ｐＨでのＰ１７０プロモーターからの発現の誘導は、栄養リッチなＧＭ１７培地で以前に立証されている（Ｉｓｒａｅｌｓｅｎら、１９９５； Ｍａｄｓｅｎら、１９９９）。このリッチな培地は、医薬品生産での大多数の適用に許容されないであろう。というのは、成分の幾つかが動物ウイルス、プリオン又はアレルギー性因子の潜在的な原因であるからである。したがって、プロモーターの制御がＧＭ１７又は別のリッチな培地の使用に依存している場合には、Ｐ１７０発現系の適用範囲が厳密に制限されるであろう。この実験は、異種タンパク質の有効な発現が、合成、つまり所定の培地中で制御可能なＰ１７０発現系を用いて達成できるかどうかを決定することを目的とした。
【００６５】
合成培地中でのＰ１７０からのＳＮａｓｅの制御された発現と分泌についての第一試験として、株ＳＭＢＩ１１１を、ＪｅｎｓｅｎとＨａｍｍｅｒ（１９９３、上記参照）に記載されるＳＡ培地ベースの合成培地ＬＭ１−５で培養した。ＬＭ１−５ 培地は、ＧＭ１７と同一のグルコース濃度、つまり５ ｇ／Ｌを含み、５０ ｍＭ ＮａＣｌを加えて低溶質濃度を補償した。ｐＨ ５．５、６．０、６．５及び７．０それぞれで同時に４個の発酵槽培養物を成長させた。指数期から定常期まで間隔をあけて採取した培養試料の上清をヌクレアーゼ活性についてアッセイした。ヌクレアーゼ生産は、ｐＨ ５．５で０．８１単位／ｍｌ、ｐＨ ６．０で０．１５単位／ｍｌに達し、ｐＨ ６．５と７．０に維持した２つの発酵槽中ではそれぞれ０．０５単位／ｍｌ未満のままであった。
これらの結果は、ｐＨ調節が所定の培地で維持されることを明らかに立証した。さらに、定常期への移行中に生じたヌクレアーゼ発現は、所定の複雑な培地中におけるＰ１７０プロモーターの同一の制御パターンを確証している（データ示さず）。
【００６６】
また、結果は、生産収率が、ＧＭ１７培地を用いて達成された収率より約４倍低い（０．８１単位／ｍｌ対 ３．１１単位／ｍｌ、図１参照）が、最大ＯＤはわずか２５％低いことを示した。定常期への移行に伴う生理学的な代謝事象は、所定のＬＭ１−５とＧＭ１７で異なることが予想される。ＬＭ１−５培養では、最大ＯＤに達し、酸の生産が停止してからわずか３時間の分離された指数増殖は、グルコースが消費されたことを示している。ごくわずかな量のヌクレアーゼが、成長停止後に生じた。ＧＭ１７では、ヌクレアーゼの生産は、 成長と酸の生産の終了から少なくとも４時間を含む６時間のあいだに生じた。したがって、リッチな培地が、グルコースの涸渇後にタンパク質の合成を支持できる代替的な炭素源とエネルギー源を提供しているものと考えられる。
【００６７】
この実験から、ＧＭ１７のような栄養がリッチで複雑な培地にみられるｐＨと成長に依存した発現系の制御パターンは、合成培地又は所定の培地に維持されることが結論付けられる。しかし、異種遺伝子産物の収率は、リッチな培地を用いて達成される収率よりも所定の培地で著しく低かった。
【００６８】
実施例３
回分発酵を用いる基質濃度の高い所定の培地におけるＰ１７０発現系の生産性と動態
この実験では、培地の成分量を増すことによりＳＮａｓｅの収率を改善することを試みた。２セットの発酵槽実験を行い、基礎培地ＬＭ３、つまりＬＭ３−１５とＬＭ３−３０（上記参照）中でグルコース濃度をそれぞれ１５ ｇ／Ｌと３０ ｇ／Ｌに上げた。株ＳＭＢＩ１１１を、それぞれｐＨ ５．５、 ６．０、６．５及び７．０のこれらの培地中に成長させた。図２に例示するように、最終的な細胞密度はグルコース濃度に比例して増加しなかった。直線的な関係の欠失は、低いｐＨ値で最も顕著であった。これは、利用可能な炭素源が消費される前に乳酸又は他の代謝産物によって成長がしばしば阻害される乳酸菌には周知の現象である（Ｋａｓｈｋｅｔ， １９８７； Ｌｏｕｂｉｅｒｅｒ、１９９７）。 乳酸の阻害作用は、細胞膜を介する分離していない酸の拡散能力に関連していると思われ、細胞質の酸性化と膜の潜在的な非結合を引き起こす。作用は、全体的な乳酸／乳酸塩の大きな画分が非分離形態で存在する低いｐＨ値ではかなり深刻になる。したがって、グルコース濃度の増加は、ｐＨに依存して、あるレベルまで高収率のバイオマスを生じるにすぎないであろう（図２）。
【００６９】
したがって、Ｐ１７０プロモーターを用いてＳＮａｓｅのような異種タンパク質の生産を改善するためには、高いｐＨを要する高収率のバイオマスと６．０未満のｐＨで最適であるべきであるＰ１７０プロモーターの高活性とにバランスが必要である。しかし、興味深いことに、より濃縮された培地ＬＭ３−３０ではｐＨ ６．０と６．５でもＳＮａｓｅは生産されたが、ＳＮａｓｅ発現はｐＨ ７．０で依然として抑制された（図３Ａ〜Ｄ）。成長期の依存性は、ｐＨ ５．５、６．０及び６．５で明らかに観察された（図４Ａ〜Ｂ）。また、Ｐ１７０が誘導される細胞密度は高いｐＨ値では高度であることが観察された。グルコース濃度が十分に増加すれば、ＳＮａｓｅはｐＨ ７．０で生じることすら予想される。
【００７０】
ｐＨ ６．５のＬＭ３−３０ 培地における ＳＮａｓｅの生産は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図５）。ＳＮａｓｅの２２ ｋＤａのタンパク質のバンドが、定常期への移行後に明らかに検出された（図５、レーン５）。上清は、ごく少量の他のタンパク質を含むと思われる。
これらの実験の結果は、５ ｇ／Ｌ （実施例２参照）〜１５ ｇ／Ｌの所定中でのグルコース濃度の増加は、遺伝子産物の収率を著しく増すことも示した。また、さらなるグルコース濃度の増加、つまりＬＭ３培地中での１５から３０ ｇ／Ｌへの増加は、ｐＨ ６．０〜６．５でＳＮａｓｅの収率を３．７〜１２倍にそれぞれ増すことが観察された。
【００７１】
実施例４
乳酸カリウムの添加によるＰ１７０発現系におけるＳＮａｓｅ産生の回分発酵法における誘導
図３及び４に示す結果は、乳酸がＰ１７０を誘導し得ることを示唆した。乳酸濃度は、培養物中の細胞密度に強く相関している。細胞成長とＰ１７０誘導に対する乳酸塩の阻害作用は、ともにｐＨに依存している。ｐＨ ７．０に維持して、ＬＭ３−３０培地で３つの同時発酵を行った。ＯＤ６００ ０．７〜０．８では、乳酸カリウム（ｐＨ ７．０）又は塩化カリウムを、２００ ｍＭの最終濃度まで加えた。この乳酸塩濃度は、ＬＭ３−３０培地では通常ＯＤ６００ ７で達するであろう。双方の塩の添加はわずかに成長速度を減じたが、乳酸カリウムの添加のみがＳＮａｓｅ産生を誘導した（図６Ａ〜Ｃ）。これは、エル．ラクティスにおけるＰ１７０活性が乳酸塩によって誘導されることを示している。実際上の観点から、乳酸塩の添加は、他の点ではＰ１７０プロモーターの活性に最適ではない条件下で発現の誘導に用いられ得る。
【００７２】
実施例 ５
流加培養発酵法を用いて利用可能な基質のレベルを増すことによる、Ｐ１７０発現系における遺伝子産物収率のさらなる増加
実施例３に示すように、ｐＨ ６．０〜６．５でのＳＮａｓｅ収率は、回分発酵法でＬＭ３培地中のグルコース濃度を１５から３０ ｇ／Ｌに増すことによって、３．７〜１２倍にそれぞれ増した。
【００７３】
より高いグルコース濃度の使用を含むため、さらなる最適化が期待される。Ｐ１７０発現系ベースの他の株構築物を用いる回分発酵実験では、５０〜８０ ｇ／Ｌまでのグルコースの濃度増加が遺伝子産物の収率を増すことは以前に観察された。しかし、発酵時間も、おそらくは浸透圧によって成長が遅くなったために延長された（データ示さず）。これを避けるために、グルコースの段階添加用の流加培養発酵系を設定した。濃縮グルコース溶液（５００ ｇ／Ｌ）の添加用ポンプを、発酵槽のｐＨコントローラーのベースポンプの出力に接続した。この設定では、ｐＨ制御用のＫＯＨを加えながらグルコースが同時に添加される。グルコースの供給により培養物中の酸の産生が比例し、細胞密度と基質の要求に厳密に相関していた。他の培養成分（酢酸塩とリン酸塩除く）の濃度は、高い細胞密度での栄養の涸渇を妨げるためにＬＭ１に比較して５倍に増した。グルコースの初期濃度は、５ｇ／Ｌ （ＬＭ５−５培地）であった。
【００７４】
ＳＭＢＩ１１１を、ｐＨ ５．５、６．０及び６．５にそれぞれ調整したＬＭ５−５培地を含む３つの発酵槽に接種した。酸の生産でｐＨが低下する時にグルコースの添加を開始し、積極的な成長中、添加速度を増した。全培養物中で、最大ＯＤに達した後、酸の生産とグルコースの添加が続いた。ＳＮａｓｅの全収率の大部分が、この段階で生産された（図７Ａ〜Ｄ）。各ｐＨで、ＳＮａｓｅの全収率は、回分発酵に比較して改善された。異なる培地中で異なるｐＨ値での最終的なＳｎａｓｅ収率を、図８に要約する。最低ｐＨ値は低グルコース濃度でＳＮａｓｅの産生に最適であったこと、及びこのパターンはグルコース濃度が増すにつれて徐々に変化したことが、明らかに示されている。これらの流加培養発酵では、最高のＳＮａｓｅ収率、つまり３３．１単位／ｍｌは、ｐＨ ６．５で得られた。
【００７５】
実施例６
Ｐ１７０発現系を含む高コピー数ベクター株でのｐＨ制御流加培養発酵
高コピー数プラスミドｐＳＭＢＩ ９１を含む株ＳＭＢＩ１０４を、株ＳＭＢＩ１１１（中程度のコピー数プラスミド）中で最高量のＳＮａｓｅを示した条件、つまりｐＨ ６．５でｐＨ制御グルコース供給を伴うＬＭ５−５培地下の発酵槽中で成長させた（図９Ａ〜Ｂ）。達成された最終的な収率は５４単位／ｍｌ、つまりＳＭＢＩ１１１から得た収率（３３単位／ｍｌ）より６４％高く、コピー数の作用がＧＭ１７でのこれらの条件下ほど強くないことを示している。発現機序又は分泌系でのボトルネックは、高コピー数プラスミドを流加培養発酵で用いる際の高い収率の欠失に起因していると思われる。図９Ｂから分かるように、この実験で成長させたＬＭ５−５培地から得られる上清は、宿主タンパク質をごくわずかにのみ含み、きわめて純粋であった。一般的に、異種産物（ＳＮａｓｅ）の量は上清に存在する全タンパク質の５０％を越えた。したがって、わずか１回の又はごく少数の精製工程の使用により、純粋な医薬品グレードの生産物が生じるはずである。
【００７６】
流加培養発酵条件下のラクトコッカス・ラクティスでＰ１７０発現系を用いるこれらの実験で得られた最大産生能は、培養上清ｍｌ当たり分泌ＳＮａｓｅ ５４単位であった。ＳＮａｓｅの比活性の予備測定に基づけば（約５５０単位／ｍｇ）、この活性は分泌されたＳＮａｓｅの約１００ ｍｇ／Ｌに相当する。タンパク質産生についての報告のように、異なる遺伝子発現系の効率を比較するのは異なる遺伝子産物を用いるために難しいだろうか。しかし、最近、ＬａｎｇｅｌｌａとＬｅ Ｌｏｉｒ （１９９９）は、エル．ラクティスにおける分泌研究のため同一のＳＮａｓｅの使用を記載した。高コピー数ベクターで強力な構成プロモーターと合成プロペプチドを用いて、これらの著者らは、リッチな培地を用いるフラスコ実験で１０〜２５ ｍｇ／Ｌの分泌ＳＮａｓｅを得た。
【００７７】
実施例７
流加培養発酵法におけるＰ１７０発現系で得られる遺伝子産物収率のさらなる改善
産生能を潜在的に増す努力において、実験Ｉ実施例６に似た別の流加培養実験を行ったが、ＬＭ５−５培地を、１〜１０ ｇ／Ｌの量範囲の酵母抽出物で補充した。５ ｇ／Ｌ量の酵母抽出物において、分泌ＳＮａｓｅ の収率は、約２２５ ｍｇ／Ｌ ＳＮａｓｅ に相当する１２３単位／ｍｌに増した。これは、我々の知る限り、乳酸菌についてこれまでに報告されている分泌異種タンパク質の最高量である。
【００７８】
実施例８
連続培養設定の使用による延長生産期
実施例１〜７に記載される回分培養発酵と流加培養発酵において、異種産物の合成を、グルコースの欠失から、又は代謝産物（主に乳酸）の蓄積から最終的に停止する。連続培養の種々の方法を適用して、生産期を延長することができた。３つの異なる方法を３０℃かつｐＨ ６．５でＬＭ５−５０培地中のＳＭＢＩ１１１又は株ＡＭＪ ６２７を用いる短期実験で試験した。最初の２つの実験をフォキソスタット及びケモスタット培養として行った。第三の実験には、細胞のリサイクル発酵、つまりフィルター単位を介した新鮮な培地の一定の流入（ｉｎｌｅｔ）と培養培地の流出（ｏｕｔｌｅｔ）を用いる一定培養量での培養を含めた。
【００７９】
８．１ フォキソスタット−培養
フォキソスタットの設定には、１Ｌの作動容量発酵槽、１０ Ｌの新鮮なＬＭ５−５０培地のレザバーと５モルの水酸化カリウムのレザバーを含めた。ベースと培地の発酵槽への添加用ポンプは、ｐＨコントローラーに応じて同時にスイッチを入れ、切った。第三ポンプを用い、水準管から流出量を排出して発酵容器に一定容量を維持した。培地と緩衝液レザバーを電子バランスで設置し、添加量のモニターに用いた。希釈率は、これらの値から算出した。流入中のベースと培地との割合は、培地添加ポンプの流速を変えて変えることができる。それにより、全添加量Ｌ当たりの水酸化カリウムのモル数を制御することができた。この数は、Ｍａｒｔｉｎと Ｈｅｍｆｌｉｎｇ （１９７６）によるフォキソスタット法の最初の記載における培地の緩衝能ＢＣＲに相当している。ラクトコッカス・ラクティスのフォキソスタット培養における乳酸濃度は、同一値に達することが予測される。
【００８０】
この実験に用いた株ＡＭＪ６２７は、プラスミドｐＡＭＪ１６６を有するＭＧ１３６３であった。この株はＳＭＢＩ１１１に似ているが、ＳＰ３１０ｍｕｔ２及びＡＭＪ７５２誘導体の代わりにＵｓｐ４５シグナルペプチドとＰ１７０の ＡＭＪ５８６誘導体を含む。
図１０は、ＢＣＲ、乳酸濃度、希釈率、光学密度及びＳＮａｓｅ活性を示す。最初の期の調整後、ＢＣＲを０．２２モル／Ｌに設定した。乳酸濃度は ０．２０〜０．２３モル／Ｌに増し、ＳＮａｓｅ活性は２０〜３０単位／ｍＬに増した。しかし、光学密度と希釈率は、この期のあいだに着実に減少した。おそらくは、成長阻害は乳酸の生産に起因していた。
【００８１】
０．２２モル／ＬのＢＣＲでの操作から２０時間後、値を０．１１モル／Ｌに再設定した。乳酸濃度が低下し、希釈率が徐々に増した。次の８．５時間中に、わずかに低い値でＯＤ６００が安定化され、ＳＮａｓｅ活性は徐々に８単位／ｍＬまで減少した。ＢＣＲを０．１８モル／Ｌに再調整すると、希釈率はすぐに低下したが、次の１４時間のあいだ再度増加した。一方、 ＳＮａｓｅレベルはわずかに１０単位／ｍＬまで増加した。
全容量１０ Ｌの新鮮な培地を加えた。培地の添加を止めると、培養物が定常期に成長できた。最終的なＳＮａｓｅ活性は同一培地での同時の回分培養より高く、２７ 単位／ｍＬに対し５３単位／ｍＬであった。
【００８２】
方法はこの実験中に定常状態に達しなかったが、培養物の成長と生産性が、発酵槽に供給される培地と水酸化カリウムとの割合の変化に反応していたことは明らかである。比較的高レベルのＳＮａｓｅが０．２２モル／Ｌの緩衝能で達せられたが、これらの条件下で成長速度と希釈率は低下していた。緩衝能が最初に０．１１モル／Ｌまで低下し、次いで０．１８モル／Ｌまで再上昇すると、希釈率は高いがＳＮａｓｅレベルが低かった。最適な緩衝能値は、０．１８〜０．２２モル／Ｌの可能性がある。
【００８３】
８．２ ケモスタットでの培養
ＳＭＢＩ１１１を、３Ｍ水酸化カリウムの添加によりｐＨを６．５に維持した３１Ｌの発酵槽で成長させた。約５のＯＤ６００値で、２つの発酵槽への培地添加を異なる速度０．０７及び０．１４ Ｌ／ｈで開始した。容量は、水準管から培養物を排出するポンプにより一定に維持した。
【００８４】
培養物中の光学密度とＳＮａｓｅ活性を、図１１に示す。回分培養は９．９の最大ＯＤ６００に１４時間以内で達し、１６時間で酸の産生を止めた。ＳＮａｓｅ活性は、発酵終了時に１７単位／ｍＬであった。２つの連続的な発酵を１６〜１７時間以上行い、それぞれ１．６５ Ｌと３．０ Ｌの全体的な培地処理量を得た。最大光学密度は、双方の場合とも回分培養より低く、後のＯＤの低下から、特異的な成長速度が希釈率より低いことが示された（図１１）。しかし、最大ＯＤが達せられてから少なくとも６時間のあいだＳＮａｓｅレベルが増しつづけ、１０時間後に培地の添加を止めた時のみ１０〜２０％まで低下した。発酵槽培養物と出口から回収した培養物における全体的なヌクレアーゼ活性を以下の表に示す（幾つかの追加生産は、回収した培養物中で生じ得る）。
【００８５】
【表６】
双方の連続発酵によって、ＳＮａｓｅの全体収率が回分培養より高くなった。最高希釈率では、培地Ｌ当たりの収率が、回分培養よりも低かった。しかし、発酵の容易さにおける作業時間の損害を培地の損害に比較すると、連続法は、培地調整と装置の清浄化ならびに滅菌のための中断時間で分離される一連の回分法に比較して依然として有利であろう。
いずれの場合にも、細胞密度は最初の１４〜１５時間後に低下し、生産性は３２時間後に低下した。これは、おそらくは培養物に生産される乳酸菌からの阻害によって生じた。高い密度で生産を安定にするには、流入培地のグルコース濃度を乳酸があまり産生されない値に低減する必要があるであろう。
【００８７】
８．３ 細胞をリサイクルする培養及び培地の連続置換
上記のケモスタットの実験では、生産能は、容器からの培養物の連続除去により低下した。これは、細胞を容器にリサイクルして回避された。
接線流量ろ過装置（Ｖｉｖａｆｌｏｗ ５０， ０．２μｍ， Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を、シリコンチューブを介して１Ｌの発酵槽に接続した。ＳＭＢＩ１１１を発酵槽中のｐＨ ６．５のＬＭ５−５０培地で成長させた。約５の光学密度で、新鮮なＬＭ５−５０培地の培養物への添加を０．１３ Ｌ／ｈの速度で開始した。同時に、培養物から培地の接線流量ろ過を開始した。発酵槽に再循環された非透過ガス（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）の流量は４０〜４５ ｍＬ／ｍｉｎであり、約２ ｍＬ／ｍｉｎのろ過速度が調整されて、培養量が一定に保たれた。
【００８８】
全容量３ Ｌの培地を２４時間以内に培養物に供給した。この時間中、光学密度は１９．８に増し、ＳＮａｓｅ活性は４１単位／ｍＬに増した（図１２）。全体的なＳＮａｓｅ収率は、回収ろ液中の７１，０００ 単位を含む１１２，０００単位であった。
この場合、生産細胞が培養物から損失されず、最終的にろ過が高い細胞密度によって阻害されるか、生理学的な制限がさらなる成長とＳＮａｓｅ産生を妨げるまで、方法を続けることができる。生産性のさらなる改善は、培養ｐＨ、基質濃度及び流速の最適化で達成され得る。
【００８９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ここで用いられるプラスミドを発現するＳＮａｓｅの概略図である。フラスコ培養又は発酵槽中のＧＭ１７培地で得られる分泌されたＳＮａｓｅの収率（単位／ｍｌ）を右に示す。
【図２】
図２は、グルコース濃度とｐＨ値が異なる所定の培地における発酵実験から得た最大ＯＤ６００値を示す： ５．５、■； ６．０、▲； ６．５、●； 及び ７．０、◆。
【図３】
図３Ａ〜Ｄは、異なるｐＨ値で発酵した後のＬＭ３−３０ 培地中のエル．ラクティス株ＳＭＢＩ１１１（中程度のコピープラスミド、ＳＰ３１０ｍｕｔ２）による成長動態（ＯＤ６００、◆）とＳＮａｓｅ産生（単位／ｍｌ、■）を示す。（Ａ） ｐＨ ５．５； （Ｂ） ｐＨ ６．０； （Ｃ） ｐＨ ６．５； （Ｄ） ｐＨ ７．０。
【図４Ａ〜Ｂ】
図４Ａ〜Ｂは、ｐＨ ５．５（■）、６．０（▲）、６．５（●）及び７．０（◆）のＬＭ３−１５ 培地での成長中（Ａ）及びＬＭ３−３０培地での成長中（Ｂ）のＳＭＢＩ１１１についてのＯＤ６００に対するＳＮａｓｅ活性を示す。
【図５】
図５は、ｐＨ ６．５のＬＭ３−３０培地で発酵後のエル．ラクティスＳＭＢＩ１１１由来の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１〜９は、図３Ｃでヌクレアーゼ活性を分析した培養試料に相当する。１０μｌの粗培養上清を各レーンに充填した。分子量（キロダルトン）を右に示す。▲は、分泌されたＳＮａｓｅの位置を示す。
【図６Ａ〜Ｃ】
図６Ａ〜Ｃは、乳酸カリウムの添加によるＰ１７０の誘導を示す。ＳＭＢＩ１１１をｐＨ ７．０のＬＭ３−３０培地中に成長させた。ＯＤ６００がほぼ０．７である矢印で示した時点で、水（６Ａ）、２００ ｍＭ乳酸カリウム（６Ｂ）又は２００ ｍＭ塩化カリウム（６Ｃ）を培養物に加えた。ＯＤ６００を▲として、ヌクレアーゼ活性（単位／ｍｌ）を■として示す。
【図７Ａ〜Ｄ】
図７Ａ〜Ｄは、異なるｐＨ値（Ａ） ｐＨ ５．５、（Ｂ） ｐＨ ６．０、（Ｃ） ６．５のＬＭ５−５培地における流加培養発酵中のＳＭＢＩ１１１によるＳＮａｓｅ産生の動態を示す。７Ａ〜７Ｃで、ＯＤ６００を▲かつヌクレアーゼ活性（単位／ｍｌ）を■として示す。７Ｄは、異なるｐＨ値： ５．５、■； ６．０、▲； 及び６．５、●のＯＤ６００に対するＳＮａｓｅ活性を示す。点線は、高いＯＤ６００値で散乱が生じることを示している。結果として、幾つかの介在するＯＤ６００値をパネルＤで省略した。
【図８】
図８は、グルコール濃度が異なり： ５０ ｍＭ ＮａＣｌを有するＬＭ１−５中５ ｇ／ｌ； ＬＭ３−１５中１５ ｇ／ｌ； ＬＭ３−３０中３０ ｇ／ｌ； 及び流加培養中に徐々に加えられる７０ ｇ／ｌ以上、かつｐＨ値が異なる所定の培地での発酵によるＳＭＢＩ１１１から得られるＳＮａｓｅの最終収率を示す： ７．０、白色棒； ６．５、点線棒； ６．０、縞の棒；及び５．５、黒色棒。
【図９Ａ〜Ｂ】
図９Ａ〜Ｂは、ｐＨ ６．５のＬＭ５−５培地におけるＳＭＢＩ１０４株（高−コピープラスミド、ＳＰ３１０ｍｕｔ２）の流加培養発酵を示す。（Ａ）成長動態（ＯＤ６００、 ▲）及びＳＮａｓｅ産生（単位／ｍｌ、■）。（Ｂ）流加培養発酵後のＳＭＢＩ１０４の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。レーン１〜９は、図９Ａでヌクレアーゼ活性を分析した培養試料に相当する。粗培養上清１０μｌを各レーンに充填した。分子量（キロダルトン）を右に示す。▲は、分泌されたＳＮａｓｅの位置を示す。
【図１０】
図１０は、ｐＨ制御単位に応じて水酸化カリウムと培地を発酵槽に同時に添加した フォキソスタットにおけるｐＨ６．５でのＡＭＪ６２７のＬＭ５−５０培地中での培養を示す。実験中、発酵槽に添加するベースと培地の量の比を異なる値に設定した。バーは、添加した全容量（ベース＋培地）リットル当たりの水酸化物のモル数として算出される、異なる比に起因する入口の緩衝能を示す。培養物中の乳酸塩濃度を▲で示し、希釈率を■として示す。ＯＤ６００と ＳＮａｓｅ活性（単位／ｍＬ）は、それぞれ◆と●として示す。
【図１１】
図１１は、同時に開始した回分培養（□）に比較した２つの異なる培地添加速度（△： ０．１４ Ｌ／ｈ及び○： ０．０７Ｌ／ｈ） でのＳＭＢＩ１１１の短期ケモスタット培養中のＯＤ６００ （黒塗り記号）とＳＮａｓｅ活性（白抜き記号）を示す。全ての場合にＬＭ５−５０培地、ｐＨ ６．５を用いた。
【図１２】
図１２は、新鮮な培地を連続的に加え、ろ液を除去しながらの、ｐＨ ６．５のＬＭ５−５０培地におけるＳＭＢＩ１１１の培養中のＯＤ６００（黒塗り◇）とＳＮａｓｅ活性（白抜き◇）を示すが、細胞を培養容器に再利用した。同時に開始した回分培養の結果を比較して示す（□）。
Claims (24)
- ｉ） 異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び操作可能に連結される、コード配列の発現を制御するための適当な制御ヌクレオチド配列からなる組換え乳酸菌を構築し、
（ｉｉ） 遺伝子を発現させる流加培養又は連続培養条件下で組換え細菌を培養し、かつ
（ｉｉｉ） 組換え細菌又はペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を回収する工程からなる、乳酸菌において異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を製造する方法。 - 組換え細胞が、コード配列に操作可能に連結される構成プロモーターを含む請求項１に記載の方法。
- 組換え細胞が、コード配列に操作可能に連結される制御可能なプロモーターを含む請求項１に記載の細胞。
- 制御可能なプロモーターが、ｐＨ、成長温度、酸素含量、熱ショック遺伝子の発現を誘導する温度シフト、イオン強度とＮａＣｌ含量を含む成長培地の組成、必須細胞構成物又はその前駆体の有無、細胞内又は培地中での代謝産物の蓄積、乳酸菌の成長期及び乳酸菌の成長速度からなる群から選択される因子によって制御される請求項３に記載の方法。
- 制御可能なプロモーターが、乳酸菌由来である請求項３又は４に記載の方法。
- 制御可能なプロモーターが、ＷＯ９８／１００７９に開示されるｐＨ制御可能なＰ１７０プロモーター又はｐＨ制御可能なその誘導体である請求項５に記載の方法。
- プロモーターが、自律複製レプリコンで乳酸菌に導入される請求項１又は２に記載の方法。
- プロモーターが、異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列と天然に結合していないプロモーターである請求項１又は２に記載の方法。
- 異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質が、酵素及び医薬的に活性な化合物からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
- コードするヌクレオチド配列が、シグナルペプチド（ＳＰ）をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結される請求項１に記載の方法。
- シグナルペプチドが、Ｕｓｐ４５シグナルペプチドと配列ＭＫＦＮＫＫＲＶＡＩＡＴＦＩＡＬＩＦＶＳＦＦＴＩＳＳＱＤＡＱＡＡＥＲＳ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）を有するシグナルペプチドからなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
- 乳酸菌が、化学的に定義される培地中で培養される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
- グルコースの濃度が、制御されたグルコース供給によって少なくとも約０．５ｇ／Ｌの好ましい濃度で維持される請求項１２に記載の方法。
- グルコースの培地への供給制御が、ｐＨ制御に関連している請求項１３に記載の方法。
- 化学的に定義される培地が、酵母抽出物によって補充される請求項１２に記載の方法。
- 酵母抽出物の量が、０．１〜１０ｇ／Ｌの範囲である請求項１５に記載の方法。
- 異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の収率が、少なくとも５ｍｇ／Ｌである請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
- 異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の収率が、少なくとも１００ｍｇ／Ｌである請求項１７に記載の方法。
- 異種のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の収率が、少なくとも２００ｍｇ／Ｌである請求項１８に記載の方法。
- 培地が
ｂ ビタミン： ０．４μＭビオチン、１０μＭピリドキサル−ＨＣｌ、２．３μＭ葉酸、２．６μＭリボフラビン、８μＭナイアシンアミド、３μＭチアミン−ＨＣｌ 及び２μＭパントテン酸塩
ｃ 微量栄養素： ０．００３μＭ （ＮＨ４）６（ＭＯ７）２４、０．４μＭ Ｈ３ＢＯ４、０．０３μＭ ＣｏＣｌ２、０．０１μＭ ＣｕＳＯ４、０．０８μＭ ＭｎＣｌ２及び０．０１μＭ ＺｎＳＯ４
からなる、細菌を培養するための化学的に定義される基礎培地（ＬＭ１培地）。 - 各量がＬＭ１培地と同一レベルに維持されている、リン酸塩及び酢酸ナトリウムを除く、請求項２０に記載の培地の全成分を３倍量で含む細菌を培養するための化学的に定義される培地（ＬＭ３培地）。
- 各量がＬＭ１培地と同一レベルに維持されている、リン酸塩及び酢酸ナトリウムを除く、請求項２０に記載の培地の全成分を５倍量で含む細菌を培養するための化学的に定義される培地（ＬＭ５培地）。
- １〜１００ｇ／Ｌの範囲の量でグルコースを含む請求項２０〜２２のいずれかに記載の化学的に定義される培地。
- 化学的に定義される培地が、請求項２０〜２３のいずれかに定義される培地である請求項１２に記載の方法。
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