WO2021049764A1 - 유산균 유래 p8 단백질의 발현 컨스트럭트를 포함하는 대장 질환의 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

유산균 유래 p8 단백질의 발현 컨스트럭트를 포함하는 대장 질환의 치료 또는 예방용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the treatment or prevention of colon disease comprising the expression construct of lactic acid bacteria-derived P8 protein and the same.
  • colorectal cancer In 2018, about 145,600 adults were diagnosed with colorectal cancer in the U.S., and about 51,020 people died of colorectal cancer. The 5-year survival rate for colorectal cancer in the United States is about 65%. Colon cancer is a cancer that can invade or spread to other parts of the body. Treatment of colorectal cancer includes a combination of surgery, radiation therapy, chemotherapy and targeted therapy. Chemotherapy for colorectal cancer includes natural, synthetic or biological substances that inhibit or prevent progression. However, many chemotherapeutic agents are toxic to normal cells.
  • probiotics In order to discover new biotherapeutics that do not have serious side effects, many studies on probiotics are being conducted. Because human gut microbiota and probiotics are generally considered safe, proteins isolated from probiotics can have anti-colorectal cancer effects while reducing systemic toxicity. Indeed, probiotic-derived proteins that inhibit colon cancer have few side effects (Widakowich, C. et al., A. Review: Side effects of approved molecular targeted therapies in solid cancers.Oncologist 2007, 12, 1443-1455; Steidler, L.; Vandenbroucke, K. Genetically modified Lactococcus lactis: Novel tools for drug delivery.Int. J. Dairy Technol. 2006, 59, 140-146.). In general, food-grade bacteria are safe to consume. Historically, these microbes have not been associated with the development of harmful pathological anomalies. Indeed, their positive effects on health are well documented in the context of human and animal food production. Thus, it can be concluded that the protein derived from probiotics is relatively safe.
  • Probiotics were selected in the laboratory to identify a novel therapeutic protein for colorectal cancer (An, BC; Ryu, Y.; Yoon, Y.-S.; Choi, O.; Park, HJ; Kim, TY; Chung) , MJ Colorectal cancer therapy using a Pediococcus pentosaceus SL4 drug delivery system secreting lactic acid bacteria-derived protein p8.Moll. Cells under review).
  • P8 protein an 8 kDa protein isolated from Lactobacillus Rhamnosus (LR) KCTC 12202BP was discovered, and it was confirmed that this protein inhibits the growth of colon cancer cells.
  • the present inventors have made research efforts to develop a new drug delivery system capable of enhancing the anticancer activity of the P8 protein.
  • a gene expression construct capable of stably expressing the P8 protein in mammalian cells was developed, and the developed P8 protein expression construct was successfully expressed in colon cancer cells, the P8 protein in the colon cancer cells
  • the present invention was completed by experimentally confirming that it can improve the anticancer effect on.
  • an object of the present invention is (a) a promoter; And (b) a P8 protein-encoding nucleotide sequence operably linked to the promoter.
  • Another object of the present invention is (a) a therapeutically effective amount of a P8 protein expression construct comprising a P8 protein coding nucleotide sequence operably linked to a promoter; And (b) to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of colon disease, comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention (a) a promoter; And (b) it provides a P8 protein expression construct (expression-construct) comprising a P8 protein coding nucleotide sequence operably linked to the promoter.
  • the present invention relates to an expression system for enhancing its anticancer activity by endogenously expressing "P8 protein" in mammalian cells, preferably in mammalian cancer cells.
  • the “P8 protein” is an 8 kDa-sized protein isolated from Lactobacillus Rhamnosus (LR) KCTC 12202BP by the present inventor, and it was confirmed to have excellent anticancer activity.
  • the P8 protein coding nucleotide sequence is a codon-optimized sequence for expression in eukaryotic cells.
  • the nucleotide sequence coding for the P8 protein is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • expression-construct refers to a minimum element for expression including a nucleotide sequence for expression and an expression sequence that induces expression of the sequence, for example, a promoter. Means ).
  • Such an expression construct may preferably include a transcriptional control sequence-a nucleotide sequence for expression purposes-a polyadenylation sequence.
  • promoter refers to a nucleotide sequence encoding a protein or nucleic acid molecule or a DNA sequence capable of controlling the expression of a functional RNA. More preferably, the "promoter” of the present invention means a transcriptional control sequence capable of inducing the transcription of a gene (polynucleotide sequence) of interest in eukaryotic cells.
  • Promoter sequences operable in eukaryotic cells include, for example, the immediate early type promoter of cytomegalovirus, the promoter of SV40 (SV 40 late type promoter and SV 40 early type promoter), the tk promoter of HSV (herpes simplex virus), adenovirus 2 major.
  • Late-type promoter (Adeno 2 major late promoter PAdml), adenovirus 2 early-type promoter (PAdE2), p19 promoter of AAV (human parvo virus associated virus), Epstein bar virus (EBV) promoter, Loose sacoma virus (RSV) promoter, vaccinia Nia virus 7.5K promoter, mouse metallothionein promoter (MT promoter), MMTV LTR promoter, HIV LTR promoter, ⁇ -actin promoter, EF1 alpha promoter, human IL-2 gene promoter, human IFN gene Of the promoter, human IL-4 gene promoter, human lymphotoxin gene promoter and human GM-CSF gene promoter, and promoters derived from human heroglobin, human muscle creatine or human metallothionein, but are limited thereto. no.
  • operatively linked refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter sequence) and another nucleotide sequence, whereby the control sequence is It regulates the transcription and/or translation.
  • a nucleic acid expression control sequence eg, a promoter sequence
  • another nucleotide sequence whereby the control sequence is It regulates the transcription and/or translation.
  • the expression construct of the present invention may include a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence, and, for example, a small growth hormone terminator (Gimmi, ER, et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998 (1989)). ), polyadenylation sequence derived from SV40 (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992)), HIV-1 polyA (Klasens, BIF, et al., Nucleic Acids Res.
  • the expression construct of the present invention may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, and It may contain a resistance gene for netisin (G418), neomycin or tetracycline.
  • an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, and It may contain a resistance gene for netisin (G418), neomycin or tetracycline.
  • the expression construct of the present invention may be prepared in various forms, for example, may be prepared as a plasmid vector or a viral vector system.
  • the present invention provides a therapeutically effective amount of a P8 protein expression construct comprising (a) a P8 protein coding nucleotide sequence operably linked to a promoter; And (b) provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of colon disease, comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the content of the “P8 protein expression construct” in the pharmaceutical composition of the present invention is another aspect of the present invention, “(a) a promoter; And (b) a P8 protein expression construct comprising a P8 protein-encoding nucleotide sequence operably linked to the promoter, so it is not described in duplicate.
  • the P8 protein coding nucleotide sequence is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the promoter is a promoter for expression in eukaryotic cells.
  • the expression construct is an expression construct based on a plasmid vector or a viral vector.
  • the term "therapeutically effective amount” means an amount sufficient to achieve a therapeutic or prophylactic effect for colon disease.
  • the “pharmaceutically acceptable carrier” used in the present invention is commonly used in formulation, and lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. no.
  • composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably parenterally administered, and may be administered using, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, or topical administration.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, severity of disease symptoms, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity. In general, a skilled physician can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in a unit dosage form by being formulated using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the technical field to which the present invention pertains. Alternatively, it may be prepared by enclosing it in a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.
  • colonal disease refers to a disease occurring in the large intestine, and preferably, colon cancer, colon polyps, colitis, ischemic bowel disease, dysentery, intestinal vascular dysplasia, diverticulum, irritable bowel syndrome , Crohn's disease, and the like, but are not limited thereto, and most preferably colon cancer.
  • the present invention relates to a composition for the treatment or prevention of colon disease comprising the expression construct of lactic acid bacteria-derived P8 protein and the same.
  • the expression construct of the P8 protein of the present invention can significantly improve the anticancer effect through cell cycle arrest by endogenously expressing the P8 protein in cancer cells.
  • 1A is a schematic diagram of cloning a codon-optimized P8 protein coding gene into a pCI-neo expression plasmid (EcoRI, NotI).
  • Figure 1b is a result of confirming the endogenous expression of the P8 protein by Western blotting [lane 1: r-p8 (100 ng), lane 2: DLD-1 cell extract (30 ⁇ g), lane 3: EV cell line extract (30 ⁇ g), Lane 4: P8 cell line extract (30 ⁇ g)]. GAPDH was used as an internal control.
  • 1C is a result of observing the endogenous P8 protein expression in cells by ImageXpress® micro confocal microscope (60X). Cells were stained to detect p8 (green), cell membrane marker EpCAM (red) or nucleus (DAPI: blue).
  • 1D is a result of confirming the endogenous expression of the P8 protein in the nucleus.
  • the upper panel is the result of Western blotting of the nuclear extract, and the lower panel is the result of ELISA analysis of the nuclear extract.
  • Lamin B1 was used as an internal control.
  • 1E is a result of confirming by Western blotting that there is no cytoplasmic contamination in the separated nuclear fraction [lane 1: DLD-1 cell lysate (30 ⁇ g), lane 2: cytoplasmic fraction (30 ⁇ g), lane 3: nucleus Fraction (30 ⁇ g)]. GAPDH was used as a cytoplasmic probe.
  • Figure 2a is a result of investigating the anti-proliferative effect through MTT analysis to investigate whether the anti-cancer activity of the endogenous P8 protein expression is improved by endogenous expression.
  • 2B is a measurement result of colony formation after endogenous expression of the P8 protein. It was determined by staining with crystal violet.
  • Figure 2c is a result of measuring the anti-migration activity (anti-migration activity) by endogenous expression of the P8 protein. Anti-migration activity was determined through wound healing analysis. Wound healing was analyzed using image J.
  • 2D is a result of investigation of the anticancer efficacy of endogenous expression of P8 protein under ImageXpress® micro-confocal microscope.
  • Cells were stained using Syto9 (green)/EthD-1 (red) as a marker of live/dead cells or Hoechst (blue) as a total cell marker.
  • Figure 2e is a result of measuring the apoptosis characteristics by exogenous P8 protein treatment.
  • P8 protein 40 ⁇ M
  • DLD-1 cells 3 X 10 3 cells/well
  • two cells control and r-p8 (40 ⁇ M) treatment
  • Markers Syto9 (green)/EthD-1 (red) or whole cell marker Hoechst (blue) were used.
  • 3A is a Western blotting result showing the effect of endogenous P8 protein expression on molecules associated with G2 arrest in DLD-1 cells (EV, empty vector).
  • 3B is a result of harvesting cells and performing flow cytometry to determine the effect of endogenous P8 protein expression on the cell cycle. Endogenous P8 protein induced arrest of DLD-1 cells in the G2-phase.
  • the P8 protein was obtained from Lactobacillus rhamnosus (LR) KCTC 12202BP strain isolated from human feces. LR is a probiotic, and was obtained from the culture maintained by Cell Biotech Co., Ltd (Gimpo, Korea).
  • the pCI-neo expression vector was used as a delivery vehicle for endogenous expression of the P8 protein.
  • Cells were cultured for 18 to 24 hours at 37° C. using De Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS) broth (Difco, Detroit, MI, USA) E. coli (Escherichia coli) strains DH5 ⁇ and C41 ( DE3) (Novagen, Madison, WI, USA) was incubated at 37° C. for 18-24 hours using Luria-Bertani (LB) broth (Difco).
  • LB Luria-Bertani
  • the underlined region in the sequence of Table 1 is the restriction enzyme cleavage site.
  • a codon-optimized P8 protein gene was synthesized, including a hexa-histidine (6X His) tag and a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage site (305 bp) (Cosmogenetech, Inc. (Seoul, Korea)) (Table 1).
  • the P8 protein was expressed using the expression vector pET-28a.
  • the P8 construct was transformed into E. coli strain C41 (DE3) cultured in M9 medium until an OD value of 0.6 was reached.
  • Overexpression of (SeMet:selenomethionine-substituted)-P8 protein was performed for 4 hours by adding 0.5 mM IPTG.
  • SeMet P8 protein was checked using size exclusion chromatography ((HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (GE Healthcare) equilibrated with 20 mM HEPES (pH 7.5)/150 mM NaCl)).
  • the P8 protein gene codon was synthesized for expression in mammalian cells (Cosmogenetech, Inc.).
  • the P8 DNA fragment (236 bp) was digested with EcoRI/NotI and then cloned into the EcoRI/NotI site of the pCI-neo vector (Promega, Madison, WI) (Table 1).
  • the constructed construct was transformed into E. coli DH5 ⁇ for its amplification. All restriction enzymes used were purchased from New England BioLabs (Ipswich, MA).
  • Colon cancer cells (DLD-1) were transformed with plasmid DNA (pCI-neo and pCI-neo-p8).
  • DLD-1 cells Prior to transformation, DLD-1 cells were plated in 6-well plates at a density of 7 ⁇ 10 5 cells per well. After overnight incubation, the cells were transformed using Lipofectamine 3000 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Transformed cells were selected in RPMI 1640 medium containing antibiotic G-418 (Sigma, St. Louis, MO, USA).
  • Human CRC (colorectal cancer) cell line DLD-1 was purchased from Korean Cell Line Bank (KCLB; Seoul, Korea), and contains 10% fetal calf serum (Gibco) and 1% penicillin/streptomycin (Gibco). In RPMI-1640 medium (Gibco, Grand Island, NY), it was maintained at 5% CO2 / 37°C.
  • DLD-1 cell lines (pCI-neo (EV) and pCI-neo-P8 (P8)) were inoculated into 96-well plates (1 X 10 3 cells/well) and incubated at 37°C. After 72 hours, cell viability was measured through MTT analysis (Cell Counting Kit-8; Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan). Absorbance was measured using a multifunctional microplate reader (SpectraMax M5; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
  • DLD-1 cell lines (EV and P8) were seeded in 6-well plates (5 X 10 6 cells per well). 24 hours after inoculation, the center of the plate was scraped using a pipette tip. Subsequently, the cells were washed three times with phosphate buffered saline (PBS), and incubated at 37° C. for 3 days. Wound healing was observed daily under a microscope (Nikon, Tokyo, Japan).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the optimized ELISA procedure was performed as follows: A 96-well polystyrene plate (SPL Life Sciences, Pocheon-si, Gyeonggi-do, Korea) was diluted with 100 ⁇ L of anti-P8 IgG (1:5500) (polyclonal-rabbit; Young In Frontier Co. , Ltd, Seoul, Korea), and coated overnight at 4° C. in an ELISA coating buffer (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA).
  • the wells were washed twice with 300 ⁇ L washing buffer [1 ⁇ Tris-Buffered-Saline buffer (TBS) (TBS-T) with 0.05% Tween-20] and then washed twice with 300 ⁇ L blocking buffer (1 ⁇ PBS and 5% fetal calf serum). (FBS; Gibco)) was blocked at room temperature for 1 hour. Before adding the protein sample (nuclear extract: 100 ⁇ L), the wells were washed three times with 300 ⁇ L washing buffer, and then incubated at room temperature for 150 minutes.
  • TBS Tris-Buffered-Saline buffer
  • FBS fetal calf serum
  • TMS-T washing buffer
  • 100 ⁇ L tetramethylbenzidine (TMB) 1 solution (Bethyl Laboratories; Montgomery, TX, USA) was used for 20 minutes in dark conditions at room temperature. After adding during the color development. The reaction was stopped by adding 50 ⁇ L stop buffer (Bethyl Laboratories). Absorbance was measured using a multifunctional micro plate reader (SpectraMax M5; Molecular Devices). To build a standard curve for the P8 protein, mouse serum (2-fold dilution: 1000 ng/mL to 15.625 ng/mL) was analyzed 3 times. Each sample was analyzed at two different dilutions and run twice. Results for the endogenous P8 protein were reported in nanograms/milliliter (ng/mL).
  • DLD-1 cells were lysed in RIPA lysis buffer containing protease inhibitor cocktail (Roche). Next, protein (40 ⁇ g in total) was separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA). ). The blotted membrane was blocked in 5% skim milk/T-TBS and then incubated overnight at 4° C. with an appropriate primary antibody (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); All antibodies were diluted 1:1000.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the membrane was washed 3 times with T-TBS (for 15 minutes each) and then blocked with 5% skim milk/T-TBS. Subsequently, the membrane was incubated with HRP-linked secondary antibody (Cell Signaling Technology) at 4° C. for 1 hour. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as an internal control. Protein bands were detected using an Enhanced Chemiluminescence Kit (Millipore, Billerica, MA, USA), and then radiographed using a Chemi-docTM Touch Imaging System (Bio-Rad Laboratories, CA, USA).
  • HRP-linked secondary antibody Cell Signaling Technology
  • Colorectal cancer cells (DLD-1) were inoculated on a cover slip placed in a 6-well plate. After 24 hours, P8 protein (0-40 ⁇ M) was added to each well for an additional 72 hours. Cells were fixed for 15 minutes in 3% paraformaldehyde (PFA) at room temperature and then washed 3 times in PBS. After incubating for 2 minutes in 0.2% Triton X-100/PBS, the cells were permeated and washed. To reduce the background signal, cells were blocked with 4% bovine serum albumin (BSA) in PBS for 30 minutes. The cells were then incubated overnight at 4° C. with a rabbit polyclonal anti-P8 antibody (Young In Frontier Co., Ltd), or 2 at 4° C.
  • BSA bovine serum albumin
  • DLD-1 cell lines (EV and P8) were plated and incubated for 48 hours. DLD-1 cells were removed from the culture dish by trypsin treatment, collected by centrifugation, and washed with PBS. 5 X 10 5 cells from each sample were fixed in ice-cooled 70% ethanol and incubated on ice for at least 30 minutes. The cells were then washed with PBS, resuspended in 400 ⁇ L PBS, and 50 ⁇ L RNAse (1 mg/mL) and 50 ⁇ L propidium iodide (0.4 mg/ml) were added. After incubation (1 hour at room temperature), the stained nuclei were analyzed with a flow cytometer (FACSCalibur, BD Biosciences, Glostrup, Denmark). Cell cycle distribution was analyzed.
  • the P8 protein was endogenously expressed in mammalian cells using a codon-optimized sequence and a pCI-neo vector (FIG. 1A). Expression of the endogenous P8 protein was measured by Western blotting method (Fig. 1b), and the intracellular location of the endogenous P8 protein was visualized using an ImageXpress® Micro confocal microscope (Fig. 1c). Endogenously expressed P8 protein was observed in both cytoplasm and nucleus (Fig. 1c). Through Western blotting analysis and ELISA analysis (below panel) of the nuclear extract, it was confirmed that the endogenously expressed P8 protein migrated from the cytoplasm to the nucleus (FIGS. 1D and 1E).
  • the present invention relates to a composition for the treatment or prevention of colon disease comprising the expression construct of lactic acid bacteria-derived P8 protein and the same.

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Abstract

본 발명은 유산균 유래 P8 단백질의 발현 컨스트럭트 및 이를 포함하는 대장 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 P8 단백질의 발현 컨스트럭트는 P8 단백질을 암세포내에서 내생적으로 발현시킴으로써 세포주기 정지 활성을 통해 항암 효과를 크게 향상시킬 수 있다.

Description

유산균 유래 P8 단백질의 발현 컨스트럭트를 포함하는 대장 질환의 치료 또는 예방용 조성물
본 발명은 유산균 유래 P8 단백질의 발현 컨스트럭트 및 이를 포함하는 대장 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
2018년에 미국에서 약 145,600명의 성인이 대장암 진단을 받았으며, 약 51,020명이 대장암으로 사망하였다. 미국에서 대장암 5년 생존율은 약 65%이다. 대장암은 신체의 다른 부분으로 침입하거나 퍼질 수 있는 암이다. 대장암의 치료에는 수술, 방사선 요법, 화학 요법 및 표적 요법의 조합이 포함된다. 대장암에 대한 화학 요법은 진행을 억제하거나 예방하는 천연, 합성 또는 생물학적 물질을 포함한다. 그러나 많은 화학 요법제는 정상 세포에 독성을 갖는다.
심각한 부작용을 갖지 않는 새로운 바이오 치료제를 발굴하기 위해, 프로바이오틱스(probiotics)에 대한 많은 연구들이 진행되고 있다. 사람의 장내 미생물과 프로바이오틱스는 일반적으로 안전하다고 간주되기 때문에, 프로바이오틱스로부터 분리된 단백질은 항-대장암 효과를 가지면서, 전신 독성은 감소할 수 있다. 실제로, 대장암을 억제하는 프로바이오틱스 유래 단백질은 부작용이 거의 없다(Widakowich, C. et al., A. Review: Side effects of approved molecular targeted therapies in solid cancers. Oncologist 2007, 12, 1443-1455; Steidler, L.; Vandenbroucke, K. Genetically modified Lactococcus lactis: Novel tools for drug delivery. Int. J. Dairy Technol. 2006, 59, 140-146.). 일반적으로 식품 등급의 박테리아는 섭취하기에 안전하다. 역사적으로 이러한 미생물은 해로운 병리적 이상 현상의 발전과는 관련이 없었다. 실제로, 그들의 건강에 대한 긍정적인 영향은 인간과 동물성 식품 생산의 맥락에서 잘 문서화 되어 있다. 따라서, 프로바이오틱스 유래 단백질이 상대적으로 안전하다고 결론을 내릴 수 있다.
대장암에 대한 신규의 치료 단백질을 확인하기 위해 실험실에서 프로바이오틱스를 선별되었다(An, B.C.; Ryu, Y.; Yoon, Y.-S.; Choi, O.; Park, H.J.; Kim, T.Y.; Chung, M.J. Colorectal cancer therapy using a Pediococcus pentosaceus SL4 drug delivery system secreting lactic acid bacteria-derived protein p8. Moll. Cells under review). 이러한 선별과정에서 락토바실러스 람노서스(Latobacillus Rhamnosus, LR) KCTC 12202BP로부터 분리된 8 kDa 단백질(이하 “P8 단백질”)을 발견하였고, 이 단백질이 대장암 세포의 성장을 억제함이 확인되었다. DLD-1 세포를 사용하여 P8 단백질이 종양의 성장을 억제하고, 항-증식 및 항-이동활성(anti-migration activity)을 가짐을 발견하였다. 그러나, 이러한 항암 활성은 P8 단백질이 세포 내부로 효율적으로 침투하지 않기 때문에 상당히 약했다. 따라서 세포내로의 P8 단백질의 전달을 개선하기 위한 새로운 치료법이 요구된다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명자들은 P8 단백질의 항암 활성을 증대시킬 수 있는 새로운 약물 전달 시스템을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, P8 단백질을 포유동물 세포에서 안정적으로 발현시킬 수 있는 유전자 발현 컨스트럭트를 개발하고, 이 개발된 P8 단백질 발현 컨스트럭트를 대장암 세포에서 성공적으로 발현시키면, P8 단백질의 대장암 세포에 대한 항암 효과를 향상시킬 수 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 (a) 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 P8 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, P8 단백질 발현 컨스트럭트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 프로모터에 작동적으로 연결된 P8 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 P8 단백질 발현 컨스트럭트의 치료학적 유효량; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대장 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 P8 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, P8 단백질 발현 컨스트럭트(expression-construct)를 제공한다.
본 발명은 “P8 단백질”을 포유동물세포내에서, 바람직하게는 포유동물의 암세포내에서 내생적으로 발현시켜 이의 항암 활성을 향상시키기 위한 발현 시스템에 관한 것이다.
본 발명에서 “P8 단백질”은 본 발명자에 의해 락토바실러스 람노서스(Latobacillus Rhamnosus, LR) KCTC 12202BP로부터 분리된 8 kDa 크기의 단백질이며, 뛰어한 항암활성이 있는 것으로 확인되었다.
본 발명에서 P8 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열은 진핵세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화(codon optimization)된 서열이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 P8 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명에서 사용되는 용어 “발현 컨스트럭트(expression-construct)”는 발현 목적의 뉴클레오타이드 서열 및 이 서열의 발현을 유도하는 발현서열, 예컨대 프로모터(promoter)를 포함하는 발현을 위한 최소한의 요소(element)를 의미한다. 이러한 발현 컨스트럭트는 바람직하게는, 전사조절 서열 - 발현 목적의 뉴클레오타이드 서열 - 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “프로모터(promoter)”는 단백질 또는 핵산 분자 인코딩 뉴클레오타이드 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 “프로모터(promoter)”는 진핵세포에서 발현 목적의 유전자(폴리뉴클레오타이드 서열)의 전사(transcription)을 유도할 수 있는 전사 조절 서열을 의미한다. 진핵세포에서 작동 가능한 프로모터 서열은, 예를 들어, 사이토메갈로 바이러스의 즉시 초기형 프로모터, SV40의 프로모터(SV 40 후기형 프로모터 및 SV 40 초기형 프로모터), HSV(herpes simplex virus)의 tk 프로모터, 아데노바이러스 2 주요 후기형 프로모터(Adeno 2 major late promoter PAdml), 아데노바이러스 2 초기형 프로모터(PAdE2), AAV (human parvo virusassociated virus)의 p19 프로모터, 엡스타인 바바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, 마우스의 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터 (MT 프로모터), MMTV LTR 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, β-액틴 프로모터, EF1 알파 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 그리고 인간 헤로글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 “작동적으로 연결된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열(예컨대, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사(trascription) 및/또는 해독(translation)을 조절하게 된다.
본 발명의 발현 컨스트럭트에는 전사 종결 서열로서, 폴리 아데닐화 서열이 포함될 수 있으며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA (Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 발현 컨스트럭트에는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신 (G418), 네오마이신 또는 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 컨스트럭트는 다양한 형태로 제작될 수 있으며, 예를 들어 플라스미드(plasmid) 벡터 또는 바이러스 벡터(viral vector) 시스템으로 제작될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 프로모터에 작동적으로 연결된 P8 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 P8 단백질 발현 컨스트럭트의 치료학적 유효량; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대장 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물에서 “P8 단백질 발현 컨스트럭트”에 관한 내용은 본 발명의 다른 양태인, “(a) 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 P8 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, P8 단백질 발현 컨스트럭트”에 관해 설명된 내용과 동일하므로, 중복하여 설명하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 P8 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 프로모터는 진핵 세포 발현용 프로모터이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 발현 컨스트럭트는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터 기반의 발현 컨스트럭트이다.
본 발명의 약학적 조성물에서 용어 “치료학적 유효량”은 대장 질환에 대한 치료 또는 예방 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 “약학적으로 허용되는 담체”는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “대장질환”이란, 대장에 발생하는 질병을 총칭하는 의미로서, 바람직하게는 대장암, 대장용종, 대장염, 허혈성 장질환, 이질, 장내 혈관 이형성, 게실증, 과민성대장증후군, 크론병 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 가장 바람직하게는 대장암이다.
본 발명은 유산균 유래 P8 단백질의 발현 컨스트럭트 및 이를 포함하는 대장 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 P8 단백질의 발현 컨스트럭트는 P8 단백질을 암세포내에서 내생적으로 발현시킴으로써 세포주기 정지 활성을 통해 항암 효과를 크게 향상시킬 수 있다.
도 1a는 코돈-최적화된 P8 단백질 코딩 유전자를 pCI-neo 발현 플라스미드(EcoRI, NotI)로 클로닝한 모식도이다.
도 1b는 P8 단백질의 내생적 발현을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다[레인 1: r-p8 (100ng), 레인 2: DLD-1 세포 추출물(30μg), 레인 3: EV 세포주 추출물 (30μg), 레인 4: P8 세포주 추출물 (30μg)]. GAPDH는 내부 대조군으로 사용하였다.
도 1c는 내생적 P8 단백질 발현을 ImageXpress® 마이크로 공초점 현미경(60X)에 의해 세포내에서 관찰한 결과이다. 세포를 염색하여 p8(녹색), 세포막 마커 EpCAM(적색) 또는 핵(DAPI:청색)을 검출하였다.
도 1d는 핵에서 P8 단백질의 내생적 발현을 확인한 결과이다. 윗 패널은 핵 추출물의 웨스턴 블로팅 결과이고, 아래 패널은 핵 추출물의 ELISA 분석 결과이다. Lamin B1을 내부 대조군으로 사용하였다.
도 1e는 분리된 핵 분획에서의 세포질 오염이 없다는 점을 웨스턴 블로팅에 의해 확인한 결과이다[레인 1: DLD-1 세포 용해물(30μg), 레인 2: 세포질 분획(30μg), 레인 3: 핵 분획(30μg)]. GAPDH는 세포질 프로브로서 사용되었다.
도 2a는 내생적 발현에 의해 내생적 P8 단백질 발현의 항암활성을 향상시키는 지 여부를 조사하기 위해, MTT 분석을 통해 항증식 효과를 조사한 결과이다.
도 2b는 P8 단백질의 내생적 발현 후 콜로니 형성의 측정 결과이다. 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 결정하였다.
도 2c는 P8 단백질의 내생적 발현에 의한 항-이동활성(anti-migration activity)을 측정한 결과이다. 항-이동활성은 상처 치유 분석을 통해 결정하였다. 상처 회복을 이미지 J를 사용하여 분석하였다.
도 2d는 P8 단백질의 내생적 발현의 항암 효능을 ImageXpress® 마이크로 공초점 현미경하에서 조사한 결과이다. 살아있는 세포/죽은 세포의 마커로 Syto9(녹색)/EthD-1(적색)을 또는 총세포 마커로서 Hoechst (청색)을 사용하여 세포를 염색하였다.
도 2e는 외생적 P8 단백질 처리에 의한 아폽토시스 특성을 측정한 결과이다. P8 단백질(40μM)을 72시간 동안 DLD-1 세포(3 X 10 3 세포/웰)와 함께 인큐베이션한 다음, 2가지 세포[대조군 및 r-p8(40μM) 처리]를 Live/Dead 세포로 염색하였다. 마커 Syto9(녹색)/EthD-1(빨간색) 또는 전체 셀 마커 Hoechst(파란색)를 사용하였다.
도 3a는 DLD-1 세포에서 G2 정지와 관련된 분자에 대한 내생적 P8 단백질 발현의 효과를 보여주는 웨스턴 블로팅 결과이다(EV, 빈 벡터).
도 3b는 세포 주기에 대한 내생적 P8 단백질 발현의 효과를 결정하기 위해, 세포를 수거하고, 유세포 분석법에 행한 결과이다. 내생적 P8 단백질은 G2-기에서 DLD-1 세포의 정지를 유도하였다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
실시예
실험방법
1. 박테리아 균주 및 이의 배양
P8 단백질은 사람의 분변으로부터 분리한 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) (LR) KCTC 12202BP 균주로부터 얻었다. LR은 프로바이오틱(probiotic)이며, 쎌바이오텍(Cell Biotech Co., Ltd (김포, 한국)에서 유지되고 있는 배양으로부터 얻었다. P8 단백질의 내생적 발현을 위한 전달 운반체로서 pCI-neo 발현 벡터를 사용하였다. 세포는 De Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS) broth (Difco, Detroit, MI, USA)를 사용하여 37℃에서 18 - 24 시간 동안 배양하였다. E. coli (Escherichia coli) 균주 DH5α 및 C41 (DE3) (Novagen, Madison, WI, USA)는 Luria-Bertani (LB) broth (Difco)를 사용하여 37℃에서 18 - 24 시간 동안 배양하였다.
타겟 세포/맵핑 코돈-최적화 서열 크기(bp)
본래 P8 단백질 atggcaacagtagatcctgaaaagacattgtttctcgatgaaccaatgaacaaggtatttgactggagcaacagcgaagcacctgtacgtgatgcgctgtgggattattacatggaaaagaacagccgtgataccatcaagactgaagaagaaatgaaaccagtcctagacatgtccgacgatgaggtcaaagccctagcagaaaaggttctcaagaagtaa (서열번호 1) 222
E. coli 세포/6XHis-TEV-P8(NdeI/EcoRI) catatgagaggatcgcatcaccatcaccatcac-attacgatatcccaacgaccgaaaacctgtattttcagggatcc-atggcaacagtagatcctgaaaagacattgtttctcgatgaaccaatgaacaaggtatttgactggagcaacagcgaagcacctgtccgtgatgcgctgtgggattattacatggaaaagaacagccgtgatactatcaagactgaagaagaaatgaaaccagtcctagacatgtccgacgacgaggtcaaagccctagcagaaaaggttctcaagaagta ggaattc (서열번호 2) 305
DLD-1 세포/P8 (EcoRI/NotI) gaattcatggctactgtcgacccagaaaaaaccctgttcttggacgaaccaatgaataaagtctttgattggtccaactctgaggccccggtacgggatgcgttgtgggattactacatggaaaaaaattccagggataccattaaaacagaagaagaaatgaagccagttctggacatgagtgacgacgaagtgaaagccctcgcggaaaaagttctcaagaaataggcg gccgc (서열번호 3) 236
상기 표 1의 서열에서 밑줄 부위는 제한효소 절단 위치이다.
2. 코돈 최적화 His-태그 P8 단백질의 제작, E. coli 에서 발현 및 정제
E. coli 세포에서 P8 단백질을 발현시키기 위해, 헥사-히스티딘(6X His) 태그 및 Tobacco Etch Virus(TEV) 프로테아제 절단 부위(305 bp)를 포함하는, 코돈 최적화된 P8 단백질 유전자를 합성하였다(Cosmogenetech, Inc. (Seoul, Korea))(표 1). P8 단백질은 발현 벡터 pET-28a을 사용하여 발현시켰다. P8 컨스트럭트를, M9 배지에 O.D.값 0.6에 이를 때까지 배양한 E. coli 균주 C41(DE3)에 형질전환시켰다. (SeMet:selenomethionine-substituted)-P8 단백질의 과발현은 0.5 mM IPTG을 첨가하여 4시간 동안 행하였다. 세포를 수집한 후 20 mM HEPES (pH 7.5)/150 mM NaCl 에서 재현탁시켰다. 초음파 처리 후에, 원심분리하여 세포 상등액을 얻었다. P8 단백질은 Ni2+-NTA 아가로스(Qiagen, Valencia, CA)에 결합시키고, 20 mM HEPES (pH 7.5)/150 mM NaCl/20 mM 이미다졸로 세척하여 정제하였다. 6X His 태그는 1 mM DTT의 존재하에서 TEV 프로테아제에 의해 제거하였다. SeMet P8 단백질의 균일성은 크기배제크로마토그래피((HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (GE Healthcare) equilibrated with 20 mM HEPES (pH 7.5)/150 mM NaCl)를 사용하여 체크하였다.
3. DLD-1 세포내에서 코돈-최적화 P8 단백질의 발현
포유동물 세포내에서 발현을 위한 P8 단백질 유전자 코돈을 합성하였다(Cosmogenetech, Inc.). P8 DNA 단편(236 bp)을 EcoRI/NotI으로 절단한 후 pCI-neo 벡터의 EcoRI/NotI 자리안으로 클로닝하였다(Promega, Madison, WI)(표 1). 제작한 컨스트럭트를 이의 증폭을 위해 E. coli DH5α에 형질전환시켰다. 사용한 모든 제한효소들은 New England BioLabs (Ipswich, MA)으로부터 구입하였다. 대장암세포(DLD-1)을 플라스미드 DNA(pCI-neo 및 pCI-neo-p8)으로 형질전환시켰다. 형질전환 전에, DLD-1 세포는 웰당 7 X 10 5 세포의 밀도로 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 하룻밤 배양한 후, 세포를 Lipofectamine 3000(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 지시서에 따라 형질전환시켰다. 형질전환된 세포들은 항생제 G-418 (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 선별하였다.
4. 세포 배양
인간 CRC(colorectal cancer; 대장암) 세포주 DLD-1은 Korean Cell Line Bank (KCLB; Seoul, Korea)에서 구입하여, 10％ 우태아혈청(Gibco) 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)을 포함하는 RPMI-1640 배지(Gibco, Grand Island, NY)에서, 5% CO2 / 37℃에서 유지하였다.
5. 세포 증식 분석
DLD-1 세포주 (pCI-neo (EV) 및 pCI-neo-P8 (P8))를 96-웰 플레이트(1 X 10 3 세포/웰)에 접종하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 72 시간 후에, 세포 생존능을 MTT 분석(Cell Counting Kit-8; Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan)을 통해 측정하였다. 흡광도는 multifunctional microplate reader (SpectraMax M5; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
6. 상처 치유 분석(Wound healing assay)
DLD-1 세포주(EV 및 P8)를 6-웰 플레이트(웰당 5 X 10 6 세포)에 접종하였다. 접종 후 24 시간에, 피펫팁을 사용하여 플레이트의 중앙을 긁었다. 이어서, 세포를 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 3회 세척하고, 3일 동안 37℃에서 배양하였다. 상처 치유는 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 매일 관찰하였다.
7. ELISA 분석
최적화된 ELISA 절차는 다음과 같이 수행하였다: 96-웰 폴리스티렌 플레이트(SPL Life Sciences, 한국 경기도 포천시)를 100μL 희석된 항-P8 IgG(1:5500)(폴리클로날-토끼; Young In Frontier Co., Ltd, 한국, 서울)을 사용하여, ELISA 코팅 완충액(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA)내에서 4℃에서 밤새 코팅하였다. 이어서, 웰을 300μL 세척 완충액 [0.05％ Tween-20을 갖는 1x Tris-Buffered-Saline 완충액(TBS)(TBS-T)]으로 2회 세척한 후, 300μL 블로킹 완충액 (1x PBS 및 5％ 우태아혈청(FBS; Gibco))으로 상온에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 단백질 샘플(핵 추출물: 100μL)을 첨가하기 전에, 300μL 세척 완충액으로 웰을 3회 세척한 후, 실온에서 150분 동안 배양하였다. 샘플을 결합한 후, 웰을 300μL 세척 완충액(TBS-T)으로 4회 세척한 후, 실온에서 90분 동안 1X PBS/5% FBS 중 100μL 항-P8 IgG-비오틴(Young In Frontier Co., Ltd)을 첨가하였다. 다음으로, 웰을 300μL 세척 완충액(TBS-T)으로 4회 세척한 후, 상온에서 30분 동안, 1X PBS/2.5% FBS내의 100μL 스트렙타비딘-HRP(166 pg/ml)(Young In Frontier Co., Ltd)을 첨가하였다. 다음으로, 웰을 300μL 세척 완충액(TBS-T)으로 4회 세척한 후, 100μL 테트라메틸벤지딘(TMB) 1 용액(Bethyl Laboratories; Montgomery, TX, USA)을 실온의 암(dark) 조건에서 20분 동안 첨가한 후 발색시켰다. 50μL 정지 완충제(Bethyl Laboratories)를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 다기능 마이크로 플레이트 리더(SpectraMax M5; Molecular Devices)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. P8 단백질에 대한 표준 곡선을 구축하기 위해, 마우스 혈청(2배 희석: 1000 ng/mL 내지 15.625 ng/mL)을 3회 분석하였다. 각각의 샘플을 2개의 상이한 희석에서 분석하고 2회 수행하였다. 내생적 P8 단백질에 대한 결과는 나노그램/밀리리터(ng/mL)로 보고되었다.
8. 웨스턴 블로팅 분석
DLD-1 세포를 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)을 함유하는 RIPA 용해 완충액에 용해시켰다. 다음으로, 단백질(총 40㎍)을 소듐도데실설페이트-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF)막(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA)으로 옮겼다. 블로팅된 막을 5％ 탈지유/T-TBS에서 차단한 다음 적절한 1차 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다; 모든 항체는 1:1000으로 희석하였다. 막을 T-TBS로 3회(각 15분 동안) 세척한 다음 5% 탈지유/T-TBS로 차단하였다. 이어서 막을 HRP-연결된 이차 항체(Cell Signaling Technology)와 함께 4℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 내부 대조군으로서 글리세르 알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH)를 사용하였다. 단백질 밴드는 Enhanced Chemiluminescence Kit(Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 검출한 후, Chemi-doc™ Touch Imaging System (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)을 사용하여 방사능 사진 촬영하였다.
9. ImageXpress® 마이크로 공초점현미경을 사용한 면역세포화학
대장암세포(DLD-1)을 6-웰 플레이트에 배치된 커버 슬립에 접종하였다. 24 시간 후, P8 단백질(0 - 40μM)을 추가 72시간 동안 각 웰에 첨가하였다. 세포를 실온에서 3％ 파라포름알데히드(PFA)중에 15분 동안 고정시킨 후 PBS에서 3회 세척하였다. 0.2％ Triton X-100/PBS 에서 2 분간 배양하여 세포를 투과시킨 후 세척하였다. 배경 신호를 감소시키기 위해, 세포를 PBS 중 4％ 우혈청알부민(BSA)으로 30 분 동안 블로킹(blocking)하였다. 이어서, 세포를 토끼 폴리클로날 항-P8 항체(Young In Frontier Co., Ltd)와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하거나, 또는 마우스 모노클로날 항-EpCAM 항체(Cell Signaling Technology)와 함께 4℃에서 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 단백질 국재화(localization)는 FITC-접합된 염소 항-토끼 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., PA, USA, West Grove) 및 Alexa Fluor 568-접합된 당나귀 항-마우스 IgG(Invitrogen)을 사용하여 시각화하였다. 핵 염색은, 세포를 5 ㎍/mL Hoechst 33,258 (Sigma)과 함께 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, PBS에서 3회 세척한 후 장착하였다. 이미지는 ImageXpress® 마이크로 공초점현미경(Molecular Devices)을 사용하여 얻었다.
10. 유세포 분석 (Flow cytometry assay)
세포주기 단계 분포에 대한 내생적 P8 단백질의 효과를 조사하기 위해, 세포를 유세포 분석에 의해 분석하였다. DLD-1 세포주(EV 및 P8)를 플레이팅하고, 48 시간 동안 배양하였다. DLD-1 세포를 트립신 처리에 의해 배양 접시로부터 제거하고, 원심분리하여 수집한 후, PBS로 세척하였다. 각 샘플로부터 5 X 10 5 개의 세포를 얼음-냉각시킨 70％ 에탄올에 고정시키고, 30분 이상 동안 얼음상에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS로 세척하고, 400μL PBS에 재현탁시키고, 50μL RNAse(1 mg/mL) 및 50μL 요오드화 프로피디움(0.4 mg/ml)을 첨가하였다. 인큐베이션 후(상온에서 1시간) 염색된 핵을 유세포분석기(FACSCalibur, BD Biosciences, Glostrup, Denmark)로 분석하였다. 세포주기 분포를 분석하였다.
실험결과
1. 내생적(endogenous) P8 단백질의 발현
P8 단백질의 항암 활성을 보다 증대시키기 위해서, 코돈-최적화시킨 서열과 pCI-neo 벡터를 사용하여 포유동물세포에서 P8 단백질을 내생적으로(endogenously) 발현시켰다(도 1a). 웨스턴 블로팅 방법으로 내생적 P8 단백질의 발현을 측정하고(도 1b), ImageXpress®Micro 공초점 현미경을 사용하여 내생적 P8 단백질의 세포내 위치를 시각화하였다(도 1c). 내생적으로 발현된 P8 단백질은 세포질 및 핵 모두에서 관찰되었다(도 1c). 핵 추출물의 웨스턴 블로팅 분석 및 ELISA 분석(below panel)을 통해, 내생적으로 발현된 P8 단백질이 세포질로부터 핵으로 이동하였다는 것을 확인하였다(도 1d 및 도 1e).
2. 내생적 P8 단백질 발현에 의한 항암 활성의 현저한 증가
내생적 P8 단백질 발현이 인 비트로(in vitro)에서 항암 특성을 증가시키는 지를 평가하기 위해, 암 세포의 증식을 억제하는 지에 대해 측정하였다. 실험 결과, 내생적 P8 단백질 발현에 의해 종양 세포의 증식을 ~ 40％ 감소시켰는데(도 2a), 이러한 결과는 40μM의 외생적 P8 단백질의 처리에 의한 효과 보다 2배 더 큰 효과이었다. 또한, 내생적 P8 단백질의 발현은 대조군과 대비하여 DLD-1 세포의 콜로니 형성(colony formation)을 억제하였고(도 2b), 이동 활성(migration activity)을 억제하였다(도 2c). 이러한 실험결과에 의해, P8 단백질의 항암 활성은 세포내로 이동하는 단백질의 양에 의존한다는 것을 알 수 있었다.
P8 단백질이 다양한 신호전달경로에 미치는 영향을 측정하기 위해, 민감한 표현형들의 증식과 관련된 신호전달 경로들을 검사하였다. 먼저, P8 단백질이 DLD-1 세포에서 세포자멸사(apoptosis) 또는 세포주기 정지(cell cycle arrest)를 유도하는지 여부를 검사하였다. 40μM의 외생적 P8 단백질로 처리한 후의 사멸 세포의 수는 대조군의 것과 유사한 정도이었다(도 2e). 그러나, 사멸 세포의 수는 외생적 P8 단백질 처리의 농도가 증가한 후에 변화되었다. 이어서, 내생적 P8 단백질의 발현의 영향을 검사하였다(도 2d). 처리군 및 대조군에서의 사멸 세포의 수는 유사하였는데, 이는 내생적 P8 단백질이 세포자멸사(apoptosis)를 유도하지 않는다는 것을 의미한다.
3. DLD-1 세포에서 항암 신호전달 경로상에 미치는 P8 단백질의 영향
이어서, 발명자들은 세포 주기 관련 단백질의 발현을 검출하기 위한 웨스턴 블로팅을 사용하여, 내생적 P8 단백질 발현이 세포 주기에 미치는 영향을 조사하였다(도 3a). 내생적 P8 단백질 발현이 DLD-1 세포내에서 Cyclin B1 및 이의 파트너 단백질인 Cdk1의 발현을 강하게 감소시킨다는 것을 발견하였다. 또한, Cyclin B1/Cdk1을 억제하는 p21의 발현이 현저히 증가한다는 것을 발견하였다. p21의 포지티브 업스트림 조절자인 p53의 발현도 유도되는 것이 관찰되었다. 이러한 실험결과들은 내생적 P8 단백질이 p53-p21 신호전달 경로상에 제동을 걸어 G2에서 DLD-1 세포를 정지시키는 결과를 가져온다는 것을 암시한다. 세포 주기상에 내생적 P8 단백질 발현이 미치는 영향을 평가하기 위해, 유세포분석기를 사용하여 변화를 측정하였다. 내생적 P8 단백질의 발현은 G2에서 현저한 성장 정지를 유도하였다(도 3b).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 유산균 유래 P8 단백질의 발현 컨스트럭트 및 이를 포함하는 대장 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

Claims (9)

  1. (a) 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 P8 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, P8 단백질 발현 컨스트럭트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 P8 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는, P8 단백질 발현 컨스트럭트.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 프로모터는 진핵세포 발현용 프로모터인 것을 특징으로 하는, P8 단백질 발현 컨스트럭트.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 발현 컨스트럭트는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터 기반의 발현 컨스트럭트인 것을 특징으로 하는, P8 단백질 발현 컨스트럭트.
  5. (a) 프로모터에 작동적으로 연결된 P8 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 P8 단백질 발현 컨스트럭트의 치료학적 유효량; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 대장 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 P8 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 세포 발현용 프로모터인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 발현 컨스트럭트는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터 기반의 발현 컨스트럭트인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 대장 질환은 대장암, 대장용종, 대장염, 허혈성 장질환, 이질, 장내 혈관 이형성, 게실증, 과민성대장증후군, 및 크론병으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 약학적 조성물.
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