WO2022086143A1 - 엑소좀을 이용하는 covid-19 백신 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

엑소좀을 이용하는 covid-19 백신 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDF

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WO2022086143A1
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exosome
protein
recombinant
coronavirus
exosomes
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PCT/KR2021/014632
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조동규
김학균
김은애
김준식
조용우
최지숙
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주식회사 엑소스템텍
성균관대학교산학협력단
한양대학교 에리카산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for vaccine or treatment of respiratory diseases caused by coronavirus infection such as COVID-19.
  • Coronavirus is an enveloped, single-stranded, positive RNA virus.
  • Corona virus has a special structure in the shape of a flame or a crown because the spike protein, which is a club-shaped projection, is embedded in the outer shell, and the virus name is derived from the Latin Corona.
  • SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; type 2 severe acute respiratory syndrome coronavirus
  • COVID-19 coronavirus infection-19
  • ARS-CoV-2 appears to have strong genetic similarities to the Bat SARS-like coronavirus, and is believed to have originated from this virus.
  • Human-to-human transmission of SARS-CoV-2 has been confirmed in academia, and the coronavirus is mainly transmitted through close contact through respiratory droplets, particularly from coughing or runny nose, within a 2 m radius. Touching your eyes, nose or mouth after touching a contaminated surface or object is another cause of contracting the infection.
  • a general exosome is a material of a double lipid membrane structure with a size of 30-100 nm secreted from cells. Because it is derived from cells, it has low immunogenicity and has the same membrane topology as the cells, so various membrane proteins can be expressed through genetic manipulation. Exosomes typically have membrane proteins such as CD9, CD63, and LAMP2B expressed on the surface.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant vector for producing the recombinant exosome and a host cell transformed therewith.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing the recombinant exosome for use as an active ingredient in a composition for a vaccine or treatment of coronavirus infection.
  • Another object of the present invention is to provide a coronavirus infection vaccine composition comprising the recombinant exosome as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of respiratory diseases caused by coronavirus infection, comprising the recombinant exosome as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating a coronavirus infection using the recombinant exosome.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the recombinant exosomes as a vaccine or therapeutic agent for coronavirus infection.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the recombinant exosomes for the preparation of a coronavirus infection vaccine or therapeutic agent.
  • One aspect of the present invention is to provide a recombinant exosome in which an angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) protein or a spike protein of SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) is expressed on the surface.
  • ACE2 angiotensin-converting enzyme 2
  • SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
  • ACE2 cell surface receptor
  • the present invention provides a recombinant exosome in which ACE2 is overexpressed on the surface, and by using the recombinant exosome, the spike protein of the COVID-19 virus penetrates into the cell through binding to the cell surface receptor ACE2. 19 to achieve the effect of treatment or vaccine.
  • the present invention provides an exosome in which the spike protein is overexpressed on the surface, and the spike-exosome binds to ACE2 of the cell and blocks the binding of the spike protein of COVID-19 to ACE2 of the cell.
  • the spike protein overexpressed on the exosome surface acts as an antigen to induce the production of antibodies against it.
  • the ACE2 protein may include or consist of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 3, preferably represented by SEQ ID NO: 2 or 3 ACE2 mutant protein.
  • the ACE2 protein can bind to CD9, which is a surface marker protein of the exosome, and immobilize it on the surface of the exosome, and more preferably, after deletion of the fourth cell-penetrating region of CD9 (CD9 ⁇ TM4)
  • CD9 ⁇ TM4 fourth cell-penetrating region of CD9
  • the recombinant exosomes prepared in this way with ACE2 expressed on the surface bind to the spike protein on the surface of the corona virus, thereby inhibiting the virus from penetrating into the cell through binding to the ACE2 protein of the target cell.
  • the spike protein only the S1 unit including the ACE2 binding domain may be used to minimize the size, and preferably, the spike protein may include or consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 .
  • the spike protein can be immobilized on the exosome surface by binding to the exosome membrane protein Lamp2b-S1 or CD9 1 st TM-S1 protein.
  • the S1-Lamp2b exosome has a form in which the N-terminus of the S1 unit is exposed to the outside
  • the CD9 1 st TM-S1 exosome has a form in which the C-terminus of the S1 unit is exposed to the outside.
  • Another aspect of the present invention is to provide a recombinant vector comprising a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs 1 to 9.
  • the recombinant vector including the nucleic acid sequence may be a plasmid vector as an expression vector, preferably pCMV14.
  • the host cell may preferably be a human cell such as human embryonic kindey cells (HEK cells).
  • the recombinant vector containing the nucleic acid sequence is a plasmid vector
  • the microinjection method Capecchi, MR, Cell, 22:479 (1980); and Harland and Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)
  • calcium phosphate precipitation Graham, FL et al., Virology , 52:456 (1973); and Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)
  • electroporation Nemann
  • Tur-Kaspa et al. Mol. Cell Biol.
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of culturing the transformed host cell; And it is to provide a method for producing a recombinant exosome for use as an active ingredient of a vaccine or therapeutic composition for coronavirus infection, comprising the step of isolating and purifying the exosome from the cell culture medium.
  • the diameter of the recombinant exosomes produced as described above may be 30 to 350 nm, 30 to 300 nm, 30 to 250 nm, 30 to 200 nm, 30 to 150 nm, or 30 to 100 nm.
  • the concentration of ACE2 or spike protein contained in the recombinant exosome is 10 pg or more, 50 pg or more, 70 pg or more, 100 pg or more, 150 pg or more, 200 pg or more, 250 pg or more per 1 ug of the exosome protein.
  • pg or more, 300 pg or more, 350 pg or more, 400 pg or more, 450 pg or more, or 500 pg or more, preferably 10 to 500 pg, 50 to 400 pg, 70 to 350 pg, or 100 to 300 pg can be 10 pg or more, 50 pg or more, 70 pg or more, or 100 to 300 pg.
  • Another aspect of the present invention is to provide a vaccine composition for coronavirus infection, comprising a recombinant exosome as an active ingredient.
  • coronavirus infection and/or respiratory disease caused by coronavirus infection refers to severe acute respiratory syndrome (SARS), Middle East respiratory syndrome (MERS) and/or coronavirus It includes infection-19 (coronavirus disease 2019, COVID-19), and preferably, the coronavirus infection may be coronavirus disease 2019, COVID-19.
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • MERS Middle East respiratory syndrome
  • coronavirus infection may be coronavirus disease 2019, COVID-19.
  • the vaccine composition may further include an adjuvant.
  • An adjuvant or adjuvant component in the broadest sense is, for example, an agent or composition that can be modified pharmacologically or immunologically and is a substance that enhances the efficacy of a drug or other agent, such as a vaccine.
  • this term refers to a compound or composition which acts as a carrier or adjuvant for an immunogen and/or other pharmaceutically active compound in the context of the present invention.
  • this term is to be interpreted in a broad sense and refers to a broad spectrum of substances capable of increasing the immunogenicity of an antigen incorporated or co-administered with an adjuvant.
  • the adjuvant will preferably enhance the specific immunogenic effect of the recombinant exosome of the present invention.
  • adjuvants may aid in uptake of antigen presenting cell antigens, activate macrophages and lymphocytes, and support cytokine production.
  • an adjuvant can tolerate lower doses of an immune interacting agent to increase the efficacy or safety of a particular dose of the immune interacting agent.
  • adjuvants can prevent T cell depletion, increasing the effectiveness or safety of certain immune interactors.
  • Adjuvants can be divided, for example, into adjuvants, antigen delivery systems, or combinations thereof, and mineral substances, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, bacterial extracts (eg, bacterial lipid sugars, Freund's adjuvant, and/or MDP). , oily emulsions, saponins, squalene, potassium aluminum sulfate, calcium hydroxide, TLR agonists, and the like.
  • the recombinant exosome included as an active ingredient in the vaccine composition of the present invention can promote an immune response in vivo, and can generate antibodies against coronavirus in the blood of a mammal, preferably a human being administered.
  • Another aspect of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of respiratory diseases caused by corona virus infection, comprising a recombinant exosome as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of respiratory diseases caused by corona virus infection comprising a recombinant exosome as an active ingredient.
  • the recombinant exosome included as an active ingredient of the present invention can be used as a coronavirus therapeutic agent because it exhibits coronavirus neutralizing efficacy.
  • the vaccine composition or therapeutic composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the vaccine or therapeutic composition of the present invention are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil;
  • the present invention is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a talc, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, a talct, a talct, a talct, a stevia, glycerin, glycerin, glycerin,
  • vaccine compositions of the present invention may be formulated for parenteral administration, eg, for infusion, such as subcutaneous and/or intradermal injection.
  • a vaccine composition may be a liquid (ie, formulated as a liquid), including solutions, suspensions, dispersions, and gelled liquids.
  • a liquid vaccine composition can be administered to a subject after dissolving the recombinant exosomes of the present invention in a suitable solvent.
  • a suitable solvent may be any solvent that has physiologically acceptable properties and is capable of dissolving exosomes at a desired concentration. The desired concentration may vary depending on the aliquot to be administered (ie, to be infused) and the single desired dose.
  • the pharmaceutical composition for treatment of the present invention may be administered orally or parenterally, and a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is the formulation method, administration method, age, weight, sex, pathology, food, administration time of the patient. It can be prescribed in various ways depending on factors such as , route of administration, rate of excretion, and response sensitivity.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. or it may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup, or emulsion in oil or an aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or stabilizer.
  • the recombinant exosome of the present invention exhibits the effect of treatment or vaccine of corona virus infection by blocking the pathway in which the spike protein of the corona virus penetrates into the cell through binding to the cell surface receptor ACE2, or overexpressed on the surface of the exosome.
  • the spike protein can act as an antigen and cause the production of antibodies against it.
  • FIG. 1 shows a technical overview of a recombinant exosome overexpressing sACE2 binding to a spike protein on the surface of a virus, thereby inhibiting the virus from penetrating into a cell through binding to the ACE2 protein of a target cell.
  • Figure 2 shows the results of analyzing the characteristics of the sACE2 exosome.
  • Figure 3 shows the results of testing COVID-19 SPIKE-sACE2 binding inhibitory ability.
  • Figure 4 shows the neutralizing ability test results of sACE2 exosomes using a pseudovirus having COVID-19 wild-type SPIKE protein, D614G mutant SPIKE beta mutant, and delta mutant SPIKE protein.
  • 5 shows the results of a comparison test of neutralizing ability of sACE2 exosomes and ACE2 recombinant protein using a pseudovirus with COVID-19 delta mutated SPIKE protein.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram of the mechanism of action of the Spike Exosome.
  • FIG. 7 shows a schematic diagram of a fusion protein and a result of Spike Exosome characterization.
  • Figure 8 shows the test results of the binding capacity of the ACE2 protein and Spike exosomes.
  • Exosomes are substances of a double lipid membrane structure with a size of 30-100 nm that are secreted from cells. Because it is derived from cells, it has low immunogenicity and has the same membrane topology as the cells, so various membrane proteins can be expressed through genetic manipulation. Exosomes typically have membrane proteins such as CD9, CD63, and LAMP2B expressed on the surface.
  • SARS-CoV-2 is a type of coronavirus and, like most coronaviruses, expresses a spike protein.
  • the spike protein binds to the cell surface receptor ACE2, fuses with the cell membrane, and then penetrates into the cell.
  • wild type soluble ACE2 (sACE2), mutant 1 (V1), and mutant 2 (V2) three genes are fused with exosome surface marker proteins (CD9 ⁇ TM4), respectively, and sACE2wt on the surface , sACE2.v1 and sACE2.v2 were developed to overexpress exosomes, respectively.
  • the amino acid sequences of wild-type and mutant sACE2 are shown in the first sequence (sACE2wt), the second sequence (sACE2.v1) and the third sequence (sACE2.v2) of the SEQ ID NO: respectively.
  • Wild-type and mutant sACE2 were immobilized on the surface of exosomes by binding to CD9, a surface marker protein of exosomes. Specifically, in order to fix sACE2 to the cell membrane of exosomes, the fourth transmembrane region of CD9 was deleted (CD9 ⁇ TM4), and then it was connected to the sACE2 protein.
  • the amino acid sequence of CD9 ⁇ TM4-sACE2 is shown in SEQ ID NO: 4 (CD9 ⁇ TM4-sACE2wt), 5 (CD9 ⁇ TM4-sACE2.v1) and 6 (CD9 ⁇ TM4-sACE2.v2), respectively.
  • Exosomes isolated using each of these sequences were named sACE2wt exosome, sACE2.v1 exosome, and sACE2.v2 exosome, respectively, and through this, exosomes with a new structure in which sACE2 was fixed on the surface of the exosomes were prepared.
  • the sACE2-expressed exosome binds to the SPIKE protein on the surface of SARS-CoV-2, thereby inhibiting the virus from penetrating into the cell through binding to the ACE2 protein of the target cell (FIG. 1).
  • a plasmid with eGFP was prepared, and the plasmid to which eGFP-CD9 ⁇ TM4-sACE2 was connected was transfected into HEK293T cells and cultured to produce a cell culture medium. Thereafter, the exosomes were separated and purified from the cell culture medium through TFF. As a result of confirming the expression of GFP with a fluorescence microscope to confirm whether the plasmid is expressed in actual cells, it was confirmed that GFP was normally expressed (FIG. 2 (a)).
  • CD9 ⁇ TM4-sACE2wt (sACE2wt exosome), CD9 ⁇ TM4-sACE2.v1 (sACE2.v1 exosome), and CD9 ⁇ TM4-sACE2.v2 (sACE2.v2 exosome) were expressed on the surface of the exosome (sACE2 exosome) ), the size and number of particles were measured through NTA (nanoparticle tracking analysis) (Fig. 2 (B)).
  • the spike-sACE2 binding was significantly inhibited in the group treated with the sACE2v1 exosome and the group treated with the sACE2v2 exosome compared with the PBS or control exosome-treated group, and the binding of spike-sACE2 was concentration-dependently was inhibited (see Fig. 3; * means P ⁇ 0.05).
  • the neutralizing efficacy of sACE2 exosomes was tested using a Pseudovirus having a Spike protein of SARS-CoV-2.
  • Neutralization efficacy was tested using Pseudovirus with WT SPIKE and SPIKE with D614G mutation, SPIKE with Beta mutations K417N, E484K, and N501Y, and Delta mutation SPIKE with L452R, E484K, and D614G mutations.
  • Pseudovirus is a system that uses SPIKE instead of VSV-g, which uses only the surface protein in the Lentivirus backbone in Lentivirus.
  • Luciferase is used as a transfer vector for Lentivirus, and when Pseudovirus is infected, the degree of infection can be evaluated through the Luciferase system. Pseudovirus and each exosome were first incubated at room temperature, and ACE2-overexpressed HEK293T cells were infected and 72 hours later, the degree of infection was evaluated using Luciferase. When the group containing only Pseudovirus was normalized and displayed as a control group, the efficacy of each exosome was confirmed compared to the control exosome, HEK293T Exosome. It was found that the efficacy of exosomes was higher.
  • Exosomes are substances of a double lipid membrane structure with a size of 30-100 nm that are secreted from cells. Since it is derived from a cell, it has the same membrane topology as that of the cell, and thus various membrane proteins can be expressed through genetic manipulation. Exosomes typically express membrane proteins such as CD9, CD63, and LAMP2B.
  • SARS-CoV-2 is a type of coronavirus and, like most coronaviruses, expresses a spike protein.
  • the spike protein binds to the cell surface receptor ACE2, fuses with the cell membrane, and then penetrates into the cell.
  • a therapeutic agent or vaccine for masking the ACE2 receptor by expressing the spike protein on the surface of the exosome was developed.
  • exosome membrane protein Lamp2b-S1 or CD9 1 st TM-S1 protein was bound to produce exosomes overexpressed on the surface (FIG. 6).
  • the cDNA of the exosome marker protein and the cDNA of the Spike protein were fused using PCR to produce an exosome in which the Spike protein was expressed on the surface.
  • S2 unit Transmembrane domain included.
  • the amino acid sequence of the S1 unit is shown in the 7th sequence of the sequence listing.
  • S1-Lamp2b conjugate cDNA was synthesized by linking the S1 unit having the receptor binding region of the SARS-CoV-2 virus spike protein (S Protein) to the N-terminus of the exosome marker membrane protein Lamp2b through PCR and DNA ligation methods. By linking the first transmembrane domain of the exosome marker membrane protein CD9 to the N-terminus of the spike protein, CD9 1 st TM-S1 conjugated cDNA was synthesized (FIG.
  • S1-Lamp2b and CD9 1 st TM-S1 are shown in SEQ ID NO: 8 (S1-Lamp2b) and 9 (CD9 1 st TM-S1), respectively.
  • the number and size of the exosomes prepared in this way were analyzed through NTA (Nanoparticle Tracking Analysis). Proteins contained in the exosomes were confirmed by Western blot. Exosomes were identified using Alix, an exosome labeling protein, and Calnexin, a cell-specific protein. To confirm that the Spike protein is overexpressed on the exosome surface, the expression of 3xFlag and Lamp2b included in the fusion protein was confirmed through each antibody (FIG. 7 (B)).
  • the concentration of the S1 protein contained in the exosomes was analyzed through ELISA. It was confirmed that the CD9 1st TM-S1 exosome contained 200 pg of S1 per 1 ug of the exosome protein, and that the S1-Lamp2b exosome contained 100 pg of S1 per 1 ug of the exosome protein ( Fig. 7(C)).
  • ACE2 protein was coated on a plate and then reacted with PBS, S1-Lamp2b exosome or CD9 1 st TM-S1 exosome at room temperature. After removing the used PBS and exosomes, S1-Biotin protein was added to the plate. Thereafter, the S1-Biotin protein bound to the ACE2 protein coated on the plate was detected using the Streptavidin-HRP protein. Through luminescence measurement, the PBS-treated group showed high luminescence, confirming that ACE2-S1-Biotin was bound.
  • the experiment was conducted after administering the Spike exosome to mice.
  • 100 ug of exosomes mixed with an immune enhancer in a 1:1 ratio were administered by subcutaneous injection.
  • exosomes were administered a total of 4 times at 2-week intervals, and after 60 days had elapsed from the first injection, the antibody was isolated from the serum of the mouse and used for the experiment (FIG. 9).
  • the concentration of the antibody produced in the mouse was measured through ELISA that can specifically detect the S1 protein. As a result of the experiment, it was confirmed that, unlike the mice administered with PBS, the antibody isolated from the mice administered with the exosomes was measurable by binding specifically to the S1 protein (FIG. 10 (A)).
  • the neutralizing ability of the antibody generated in the Spike exosome-inoculated mouse was tested using a pseudovirus containing the Spike protein.
  • the antibody of 5.8 ug, 30 ug was treated, it was confirmed that the antibody of the mouse administered with the CD9 1 st TM-S1 exosome significantly reduced the infection of the pseudovirus according to the concentration (Fig. 10 (B) and (C) Reference, *: P ⁇ 0.05, ***: P ⁇ 0.001).

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Abstract

본 발명은 재조합 엑소좀을 이용한 COVID-19 백신 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 엑소좀은 코로나 바이러스의 스파이크 단백질이 세포 표면 수용체인 ACE2와의 결합을 통해 세포 내로 침투하는 경로를 차단시킴으로써 코로나 바이러스 감염증의 치료 또는 백신의 효과를 나타내거나, 또는 엑소좀 표면에 과발현된 스파이크 단백질이 항원으로 작용하여 이에 대한 항체 생성을 유발할 수 있다.

Description

엑소좀을 이용하는 COVID-19 백신 또는 치료용 약제학적 조성물
본 출원은 2020년 10월 20일 출원된 대한민국출원 제10-2020-0136330호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
본 발명은 COVID-19 와 같은 코로나 바이러스 감염으로 유발되는 호흡기 질환 백신 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
코로나 바이러스는 외피가 있는 단일가닥의 양성 RNA 바이러스이다. 코로나 바이러스는 외피에 곤봉모양의 돌기인 스파이크(spike) 단백질이 박혀 있어 화염 또는 왕관 모양의 특이적 구조를 가지고 있고, 라틴어 Corona로부터 바이러스 이름이 유래되었다.
이중 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스)는 인간에게 전염성이 있고　코로나바이러스감염증-19 (COVID-19)를 유발하는 원인 바이러스이다. ARS-CoV-2는 박쥐 중증급성호흡기증후군-유사 코로나바이러스(Bat SARS-like coronavirus)와 강한 유전적 유사성을 지니고 있는 것으로 보여지며, 이 바이러스에서 기원한 것으로 여겨지고 있다. SARS-CoV-2의 인간 대 인간 전염은 학계에서 확인되었고, 이 코로나바이러스는 특히 2m 반경 내 기침이나 콧물에서 온 호흡기 비말에 대한 밀접 접촉을 통해 주로 전파된다. 오염된 표면이나 물건 접촉 후 눈코입을 만지는 것도 해당 감염증에 걸릴 수 있는 다른 원인이다.
현재까지 SARS-CoV-2 바이러스 병원체를 효율적으로 억제, 치료하거나 예방하는 적절한 해결책의 개발이 미흡하여 전세계적으로 COVID-19 백신 및 치료제 개발이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 일반적인 엑소좀은 세포로부터 분비되는 30-100nm 크기를 가진 이중 지질막 구조의 물질이다. 세포에서 유래했기 때문에 면역원성이 낮고 세포와 동일한 막 위상을 갖고 있어 유전자 조작을 통해 다양한 막 단백질을 발현시킬 수 있다. 엑소좀은 대표적으로 CD9, CD63, LAMP2B와 같은 막 단백질이 표면에 발현되어 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 코로나 바이러스 감염증의 백신 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 사용하기 위한 재조합 엑소좀을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 엑소좀을 생산하기 위한 재조합 벡터 및 이로 형질 전환된 숙주 세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 코로나 바이러스 감염증의 백신 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 사용하기 위한 상기 재조합 엑소좀의 생산 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 코로나 바이러스 감염증 백신 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 코로나 바이러스 감염으로 유발되는 호흡기 질환 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 엑소좀을 사용하여 코로나 바이러스 감염증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 엑소좀의, 코로나 바이러스 감염증 백신 또는 치료제로서의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 엑소좀의, 코로나 바이러스 감염증 백신 또는 치료제 제조를 위한 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 하나의 관점은 ACE2(angiotensin-converting enzyme 2) 단백질 또는 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)의 스파이크 단백질이 표면에 발현된 재조합 엑소좀을 제공하는 것이다.
코로나 바이러스 표면에 발현된 스파이크 단백질은 세포 표면 수용체(ACE2)와 결합하여 세포 내로 침입하는 것이 알려져 있다.
본 발명은 ACE2가 표면에 과발현된 재조합 엑소좀을 제공하며, 상기 재조합 엑소좀을 이용하여 COVID-19 바이러스의 스파이크 단백질이 세포 표면 수용체인 ACE2와의 결합을 통해 세포 내로 침투하는 경로를 차단시킴으로서 COVID-19의 치료 혹은 백신의 효과를 달성한다.
또한 본 발명은 스파이크 단백질이 표면에 과발현된 엑소좀을 제공하는데, 상기 스파이크-엑소좀은 세포의 ACE2와 결합하여 COVID-19의 스파이크 단백질이 세포의 ACE2와 결합하는 것을 차단시킨다. 또한 엑소좀 표면에 과발현된 스파이크 단백질이 항원으로 작용하여 이에 대한 항체 생성을 유발시킨다.
일 구현예에서, 상기 ACE2 단백질은 서열목록 제1서열 내지 제3서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열목록 제2서열 또는 제3서열로 표시되는 ACE2 돌연변이 단백질일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 ACE2 단백질은 엑소좀의 표면마커 단백질인 CD9와 결합시켜 엑소좀 표면에 고정시킬 수 있으며, 더 바람직하게는 CD9의 4번째 세포막 관통 영역을 결손시킨 후(CD9△TM4) 이를 ACE2 단백질과 이어주는 방법으로 엑소좀 표면에 ACE2가 과발현되는 재조합 엑소좀을 제조할 수 있다.
이렇게 제조한 ACE2가 표면에 발현된 재조합 엑소좀은 코로나 바이러스 표면에 있는 스파이크 단백질과 결합하여, 바이러스가 타겟 세포의 ACE2 단백질과의 결합을 통해 세포 내로 침투하는 것을 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 스파이크 단백질로는 크기를 최소화하기 위해 ACE2 결합 domain이 포함된 S1 unit만을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 서열목록 제7서열로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 스파이크 단백질은 엑소좀 막 단백질 Lamp2b-S1 또는 CD9 1st TM-S1 단백질과 결합시켜 엑소좀 표면에 고정시킬 수 있다. 상기 S1-Lamp2b 엑소좀은 S1 unit의 N 말단이 외부로 노출된 형태를 가지며, 상기 CD9 1st TM-S1 엑소좀은 S1 unit의 C 말단이 외부로 노출된 형태를 가진다.
본 발명의 다른 관점은 서열목록 제1서열 내지 제9서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터는 발현 벡터로서 플라스미드 벡터일 수 있고, 바람직하게는 pCMV14일 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다. 상기 숙주 세포는 바람직하게는 인간신장세포주(human embryonic kindey cells,　HEK　cells)와 같은 인간 세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터가 플라스미드 벡터인 경우, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등의 방법에 의해 재조합 벡터를 세포 내로 transfection 시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 코로나 바이러스 감염증의 백신 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 사용하기 위한 재조합 엑소좀의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같이 생산한 재조합 엑소좀의 직경은 30 내지 350 nm, 30 내지 300 nm, 30 내지 250 nm, 30 내지 200 nm, 30 내지 150 nm, 또는 30 내지 100nm일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 재조합 엑소좀에 함유된 ACE2 또는 스파이크 단백질의 농도는 엑소좀 단백질 1 ug 당 10 pg 이상, 50 pg 이상, 70 pg 이상, 100 pg 이상, 150 pg 이상, 200 pg 이상, 250 pg 이상, 300 pg 이상, 350 pg 이상, 400 pg 이상, 450 pg 이상, 또는 500 pg 이상일 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 500 pg, 50 내지 400 pg, 70 내지 350 pg, 또는 100 내지 300 pg일 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 코로나 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물을 제공하는데 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 코로나 바이러스 감염증 및/또는 코로나 바이러스 감염으로 유발되는 호흡기 질환이란 중증급성호흡기증후군(severe acute respiratory syndrome, SARS), 중동호흡기증후군(Middle East respiratory syndrome, MERS) 및/또는 코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019,　COVID-19)를 포함하며, 바람직하게는 상기 코로나 바이러스 감염증은 코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019,　COVID-19)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 백신 조성물은 어쥬번트(adjuvant)를 더 포함할 수 있다. 가장 넓은 의미의 어쥬번트 또는 어쥬번트 성분은 예를 들어, 약리학적 또는 면역학적으로 변형될 수 있는 제제 또는 조성물로서 약물이나 백신과 같은 다른 약제의 효능을 향상시키는 물질이다. 통상적으로 이 용어는 본 발명의 맥락에서 면역원 및/또는 기타 약학적 활성 화합물에 대한 담체 또는 보조 물질로서 작용하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 본 명세서에서, 이 용어는 넓은 의미로 해석되어야 하고 어쥬번트와 혼입되거나 공동 투여되는 항원의 면역원성을 증가시킬 수 있는 물질의 넓은 스펙트럼을 지칭한다. 본 명세서에서, 어쥬번트는 바람직하게는 본 발명의 재조합 엑소좀이 갖는 특이적 면역원성 효과를 향상시킬 것이다. 예를 들어, 어쥬번트는 항원 제시 세포 항원의 흡수를 돕고, 대식세포와 림프구를 활성화하고, 사이토카인 생성을 지원할 수 있다. 면역 반응을 변화시킴으로써, 어쥬번트는 면역 상호작용제의 특정 용량의 유효성 또는 안전성을 증가시키기 위해 더 적은 용량의 면역 상호작용제를 허용할 수 있다. 예를 들어, 어쥬번트는 T 세포 고갈을 방지하여 특정 면역 상호 작용제의 효과 또는 안전성을 증가시킬 수 있다. 어쥬번트는 예를 들어 면역강화제, 항원 전달 시스템 또는 이들의 조합으로 나눌 수 있으며, 미네랄 물질, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 세균 추출물(예를 들어, 세균성 지질당, 프로인트 보조제, 및/또는 MDP), 유성 에멀젼, 사포닌, 스쿠알렌, 황산알루미늄칼륨, 수산화칼슘, TLR 작용제 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물에 유효성분으로서 포함되는 상기 재조합 엑소좀은 생체 내 면역 반응을 촉진할 수 있으며, 투여받는 포유동물, 바람직하게는 인간의 혈액 내 코로나 바이러스에 대한 항체를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 코로나 바이러스 감염으로 유발되는 호흡기 질환 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 유효성분으로서 포함되는 상기 재조합 엑소좀은 코로나 바이러스 중화 효능을 나타내므로 코로나 바이러스 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물 또는 치료용 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 백신 또는 치료용 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물은 비경구 투여용으로 제제화될 수 있으며, 예를 들어 피하 및/또는 피내 주사와 같은 주입용으로 제제화될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 백신 조성물은 용액, 현탁액, 분산액 및 겔화된 액체를 포함하는 액체(즉, 액체로서 제형화됨)일 수 있다. 예를 들어, 액체 백신 조성물은 본 발명의 재조합 엑소좀을 적합한 용매에 용해시킨 후 대상체에게 투여될 수 있다. 적합한 용매는 생리학적으로 허용되는 특성을 갖고 원하는 농도로 엑소좀을 용해할 수 있는 임의의 용매일 수 있다. 원하는 농도는 투여될(즉, 주입될) 분취량 및 원하는 단일 용량에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 치료용 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 엑소좀은 코로나 바이러스의 스파이크 단백질이 세포 표면 수용체인 ACE2와의 결합을 통해 세포 내로 침투하는 경로를 차단시킴으로써 코로나 바이러스 감염증의 치료 또는 백신의 효과를 나타내거나, 또는 엑소좀 표면에 과발현된 스파이크 단백질이 항원으로 작용하여 이에 대한 항체 생성을 유발할 수 있다.
도 1은 sACE2를 과발현하는 재조합 엑소좀이 바이러스 표면에 있는 스파이크 단백질과 결합하여, 바이러스가 타겟 세포의 ACE2 단백질과의 결합을 통해 세포 내로 침투하는 것을 억제하는 기술 개요를 나타낸 것이다.
도 2는 sACE2 엑소좀의 특성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 COVID-19 SPIKE-sACE2 결합 억제능을 시험한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 COVID-19 야생형 SPIKE 단백질과 D614G변이 SPIKE 베타변이, 델타변이 SPIKE단백질을 가진 슈도바이러스를 이용한 sACE2엑소좀의 중화능 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 COVID-19 델타변이 SPIKE단백질을 가진 슈도바이러스를 이용한 sACE2 엑소좀과 ACE2 재조합단백질의 중화능력 비교 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Spike Exosome 작용기전 모식도를 나타낸 것이다.
도 7은 융합단백질 모식도 및 Spike Exosome 특성분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 ACE2단백질과 Spike 엑소좀의 결합능 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 Spike Exosome Immunization 실험 개요를 나타낸 것이다.
도 10은 Spike엑소좀 접종 마우스에서 생성된 항체의 농도 측정과 Spike 단백질 함유 슈도바이러스를 이용한 중화능력 비교 실험 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
I. ACE2가 표면에 과발현된 엑소좀
(1) ACE2가 표면에 과발현된 엑소좀 개발
엑소좀은 세포로부터 분비되는 30-100nm 크기를 가진 이중 지질막 구조의 물질이다. 세포에서 유래했기 때문에 면역원성이 낮고 세포와 동일한 막 위상을 갖고 있어 유전자 조작을 통해 다양한 막 단백질을 발현시킬 수 있다. 엑소좀은 대표적으로 CD9, CD63, LAMP2B와 같은 막 단백질이 표면에 발현되어 있다.
SARS-CoV-2는 코로나바이러스의 일종으로 대부분의 코로나바이러스와 마찬가지로 스파이크 단백질을 발현하고 있다. 스파이크 단백질은 세포 표면 수용체인 ACE2와 결합하여 세포막과 융합하고, 이를 통해 세포 내로 침투한다.
본 발명은 야생형(wild type)의 soluble ACE2(sACE2)와 돌연변이1(V1), 돌연변이2(V2) 세 가지 유전자를 각각 엑소좀의 표면마커 단백질들과 (CD9△TM4) 융합시키고, 표면에 sACE2wt, sACE2.v1, sACE2.v2가 각각 과발현된 엑소좀을 개발하였다. 야생형 및 돌연변이 sACE2의 아미노산 서열은 각각 서열목록 제1서열(sACE2wt), 제2서열(sACE2.v1) 및 제3서열(sACE2.v2)에 나타내었다.
야생형 및 돌연변이 sACE2는 엑소좀의 표면마커 단백질인 CD9와 결합시켜 엑소좀 표면에 고정시켰다. 구체적으로 sACE2를 엑소좀의 세포막에 고정시키기 위해 CD9의 4번째 세포막 관통 영역을 결손시킨 후(CD9△TM4) 이를 sACE2 단백질과 이어주었다. CD9△TM4-sACE2의 아미노산 서열은 각각 서열목록 제4서열(CD9△TM4-sACE2wt), 제5서열(CD9△TM4-sACE2.v1) 및 제6서열(CD9△TM4-sACE2.v2)에 나타내었다. 이 각각의 서열을 이용하여 분리한 엑소좀을 각각 sACE2wt exosome, sACE2.v1 exosome, sACE2.v2 exosome이라 명명하고, 이를 통하여 엑소좀 표면에 sACE2가 고정된 새로운 구조의 엑소좀을 제작하였다. sACE2가 발현된 엑소좀은 SARS-CoV-2의 표면에 있는 SPIKE 단백질과 결합하여, 바이러스가 타겟 세포의 ACE2 단백질과의 결합을 통해 세포내로 침투하는 것을 억제할 수 있다(도 1).
본 발명이 잘 작동하는지 확인하기 위하여 eGFP를 붙인 플라스미드를 제작하였고, eGFP-CD9△TM4-sACE2가 연결되어 있는 플라스미드를 HEK293T 세포에 transfection 시키고 배양하여 세포배양액을 생산하였다. 이후 TFF를 통하여 세포배양액으로부터 엑소좀을 분리 정제하였다. 실제 세포내에서 plasmid가 발현되는지 확인하기 위하여 GFP의 발현을 형광현미경으로 확인한 결과, 정상적으로 GFP가 발현되는 것을 확인하였다(도 2 (가)). CD9△TM4-sACE2wt (sACE2wt 엑소좀), CD9△TM4-sACE2.v1 (sACE2.v1 엑소좀), CD9△TM4-sACE2.v2 (sACE2.v2 엑소좀) 가 표면에 발현된 엑소좀(sACE2 엑소좀)은 NTA(nanoparticle tracking analysis)를 통해 크기와 입자 개수를 측정하였다(도 2 (나)).
(2) 스파이크 단백질-ACE2 단백질 결합 분석
COVID-19 spike-ACE2 binding assay를 통해 sACE2wt 엑소좀, sACE2v1 엑소좀, 그리고 sACE2v2 엑소좀의 spike 단백질-ACE2 단백질 결합 억제능을 평가하였다. ACE2가 코팅되어 있는 플레이트에 비오틴이 붙어있는 SPIKE (SPIKE-Biotin)를 incubation 하였을때, 비오틴을 인식하는 스트렙타비딘에 HRP가 융합되어있는 incubation 하고 기질을 넣어주면 발광하는 시스템을 이용하였다. SPIKE-Biotin 과 엑소좀을 실온에서 먼저 1시간 incubation한뒤 시스템에 적용하였을 때, PBS 그룹이나, 대조군 엑소좀에 비해서 ACE2와 SPIKE와의 결합이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
실험결과, PBS 또는 control 엑소좀 처리군과 비교하였을 때 sACE2v1 엑소좀을 처리한 그룹과 sACE2v2 엑소좀을 처리한 그룹에서 spike-sACE2 결합을 유의적으로 억제시켰으며, 농도 의존적으로 spike-sACE2의 결합을 억제하였다(도 3 참조; * 은 P < 0.05을 의미).
(3) sACE2 엑소좀의 중화 효능 시험
도 4에서는 SARS-CoV-2의 Spike 단백질을 가지고 있는 Pseudovirus를 이용하여 sACE2 엑소좀의 중화 효능을 시험하였다. WT의 SPIKE를 가지고 있는 Pseudovirus와 D614G 돌연변이를 가지고 있는 SPIKE, Beta변이의 K417N, E484K, N501Y 변이를 가진 SPIKE, Delta 변이의 L452R, E484K, D614G 변이를 가진 SPIKE를 이용해 중화 효능을 테스트하였다. Pseudovirus는 Lentivirus의 골격에 표면 단백질만 Lentivirus 에서 사용하는 VSV-g 대신에 SPIKE를 사용하는 시스템이다. 리포터 유전자로써, Lentivirus에 transfer vector에는 Luciferase를 사용하여 Pseudovirus가 감염이 되면 Luciferase 시스템을 통하여 감염정도를 평가할 수 있다. Pseudovirus와 각각의 엑소좀을 먼저 실온에서 incubation하고, ACE2가 과발현되어 있는 HEK293T 세포에 감염을 시킨 후 72시간이 경과 후 감염의 정도를 Luciferase를 통하여 평가하였다. Pseudovirus만 들어있는 그룹을 대조군으로 하여 normalization하여서 표시하였을 때, 대조군 엑소좀인 HEK293T Exosome에 비해서 각각의 엑소좀들의 효능을 확인할 수 있었고, 특히 야생형의 Spike를 가진 Pseudovirus보다 변이형의 Spike를 지닌 Pseudovirus에서 엑소좀의 효능이 더 높게 나오는 것을 알 수 있었다.
실험 결과, 모든 변이에서 sACE2wt 엑소좀, sACE2v1 엑소좀 및 sACE2v2 엑소좀이 농도 의존적으로 슈도바이러스를 중화시키는 효능을 보였다(도 4 참조: * : P < 0.05, ** : P <0.01, *** : P <0.001).
또한, sACE2 엑소좀과 ACE2 재조합 단백질과의 중화효능은 Delta 변이의 L452R, E484K, D614G 변이를 가진 SPIKE를 이용해 비교하였다. 실험 결과, sACE2wt 엑소좀 안의 ACE2양을 ELISA를 통해서 측정 후 동일양의 ACE2 재조합 단백질과 비교하였을 때, 엑소좀의 중화 효능이 더 뛰어남을 알 수 있었고, 재조합 단백질보다 엑소좀을 통하여 전달하였을 때 현저히 우수한 효능을 보임을 확인하였다(도 5).
II. Spike 단백질이 표면에 과발현된 엑소좀 개발
(1) Spike 단백질이 표면에 과발현된 엑소좀 개발
엑소좀은 세포로부터 분비되는 30-100nm 크기를 가진 이중 지질막 구조의 물질이다. 세포에서 유래했기 때문에 세포와 동일한 막 위상을 갖고 있어 유전자 조작을 통해 다양한 막 단백질을 발현시킬 수 있다. 엑소좀은 대표적으로 CD9, CD63, LAMP2B와 같은 막 단백질이 발현되어 있다.
SARS-CoV-2는 코로나바이러스의 일종으로 대부분의 코로나바이러스와 마찬가지로 스파이크 단백질을 발현하고 있다. 스파이크 단백질은 세포 표면 수용체인 ACE2와 결합하여 세포막과 융합하고, 이를 통해 세포 내로 침투한다.
본 출원에서는 엑소좀의 표면에 스파이크 단백질을 발현함으로서 ACE2 수용체를 마스킹하는 치료제 또는 백신을 개발하였다. HEK293T 세포의 유전자 조작을 통해 엑소좀 막 단백질 Lamp2b-S1 또는 CD9 1st TM-S1 단백질이 결합되어 표면에 과발현된 엑소좀을 생산하였다(도 6).
구체적으로, Spike 단백질이 표면에 발현된 엑소좀을 생산하기 위해 엑소좀 표지 단백질의 cDNA와 Spike 단백질의 cDNA를 PCR을 이용해 융합하였다. 크기를 최소화하기 위해 ACE2 결합 domain이 포함된 S1 unit만 사용하였다(S2 unit: Transmembrane domain 포함). S1 unit의 아미노산 서열은 서열목록 제7서열로 나타내었다.
S1-Lamp2b 엑소좀은 S1 unit의 N 말단이 외부로 노출되어 있으며, CD9 1st TM-S1 엑소좀은 S1 unit의 C 말단이 외부로 노출된 형태를 가진다. 엑소좀 마커 막단백질 Lamp2b의 N말단에 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크 단백질(S Protein)의 수용체 결합영역을 가지는 S1 unit을 PCR 및 DNA ligation 방법을 통해 연결하여 S1-Lamp2b 결합체 cDNA를 합성하였다. 스파이크 단백질의 N 말단에 엑소좀 마커 막단백질 CD9 중 첫번째 막관통 domain을 연결하여 CD9 1st TM-S1 결합체 cDNA를 합성하였다(도 7 (A)). S1-Lamp2b 및 CD9 1st TM-S1의 아미노산 서열은 각각 서열목록 제8서열(S1-Lamp2b) 및 제9서열(CD9 1st TM-S1)로 나타내었다.
이렇게 제조한 엑소좀의 입자수와 크기를 NTA(Nanoparticle Tracking Analysis)를 통해 분석하였다. 엑소좀에 함유된 단백질은 Western blot을 통해 확인하였다. 엑소좀 표지 단백질인 Alix와 세포 특이적 단백질인 Calnexin를 이용해 엑소좀을 확인하였다. 엑소좀 표면에 Spike 단백질이 과발현됨을 확인하기 위해, 융합단백질에 포함된 3xFlag와 Lamp2b의 발현을 각각의 항체를 통해 확인하였다(도 7 (B)).
엑소좀에 함유된 S1 단백질의 농도를 ELISA를 통해 분석하였다. CD9 1st TM-S1 엑소좀의 경우 엑소좀 단백질 1 ug 당 200 pg의 S1이 함유되어 있었으며, S1-Lamp2b 엑소좀의 경우 엑소좀 단백질 1 ug 당 100 pg의 S1이 함유되어 있음을 확인하였다(도 7 (C)).
(2) Spike-ACE2 저해제 스크리닝 분석
Spike-ACE2 저해제 스크리닝 분석법을 통해 Spike 엑소좀이 ACE2와 스파이크 단백질 간의 결합을 효과적으로 저해하는지 확인하였다. 구체적으로, ACE2 단백질을 플레이트에 코팅한 뒤 PBS, S1-Lamp2b 엑소좀 또는 CD9 1st TM-S1 엑소좀과 상온에서 반응시켰다. 사용한 PBS 및 엑소좀을 제거한 뒤 S1-Biotin 단백질을 플레이트에 첨가하였다. 그 후 Streptavidin-HRP 단백질을 이용하여 플레이트에 코팅된 ACE2 단백질과 결합한 S1-Biotin 단백질을 탐지하였다. 발광도 측정을 통해 PBS를 처리한 군에서는 높은 발광도를 보임으로 ACE2-S1-Biotin의 결합이 이루어졌음을 확인하였다. 실험 결과, 두 가지의 엑소좀을 2.5 ug 또는 13 ug씩 처리했을 때, 발광도가 PBS를 처리한 군보다 유의적으로 감소하여 두 가지 엑소좀이 ACE2-S1-Biotin 결합을 저해함을 확인하였다(도 8 참조: ****: P < 0.0001).
(3) 인 비보 분석
백신으로서의 효능을 평가하기 위해 마우스에 Spike 엑소좀을 투여한 후 실험을 진행하였다. 면역반응 촉진을 위해 면역증강제와 1:1 비율로 섞인 100 ug의 엑소좀을 피하주사로 투여하였다. 이와 같은 방법으로 2주 간격으로 총 4회 엑소좀을 투여하였으며, 첫 주사로부터 60일이 경과한 뒤 마우스의 혈청으로부터 항체를 분리해 실험에 이용하였다(도 9).
마우스에서 생성된 항체의 농도를 S1 단백질을 특이적으로 탐지 가능한 ELISA를 통해 측정하였다. 실험 결과, PBS를 투여한 마우스와 달리 엑소좀을 투여한 마우스에서 분리한 항체는 S1 단백질과 특이적으로 결합하여 측정 가능함을 확인하였다(도 10 (A)).
또한, Spike 단백질을 함유한 슈도바이러스를 이용해 Spike 엑소좀 접종 마우스에서 생성된 항체의 중화능을 시험하였다. 5.8 ug, 30 ug의 항체를 처리하였을 때, CD9 1st TM-S1 엑소좀을 투여한 마우스의 항체가 슈도바이러스의 감염을 유의적으로 농도에 따라 감소시키는 것이 확인되었다(도 10 (B) 및 (C) 참조, *: P < 0.05, ***: P < 0.001).
제1서열. sACE2wt의 아미노산 서열
SSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADGSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK
제2서열. sACE2.v1의 아미노산 서열
SSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNAEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLQVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTPGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYLAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADGSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK
제3서열. sACE2.v2의 아미노산 서열
SSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKYFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTTAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWEYSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYLAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADGSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK
제4서열. CD9△TM4-sACE2wt의 아미노산 서열
MPVKGGTKCIKYLLFGFNFIFWLAGIAVLAIGLWLRFDSQTKSIFEQETNNNNSSFYTGVYILIGAGALMMLVGFLGCCGAVQESQCMLGLFFGFLLVIFAIEIAAAIWGYSHKDEVIKEVQEFYKDTYNKLKTKDEPQRETLKAIASATSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADGSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK*
제5서열. CD9△TM4-sACE2v1의 아미노산 서열
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제6서열. CD9△TM4-sACE2.v2의 의 아미노산 서열
MPVKGGTKCIKYLLFGFNFIFWLAGIAVLAIGLWLRFDSQTKSIFEQETNNNNSSFYTGVYILIGAGALMMLVGFLGCCGAVQESQCMLGLFFGFLLVIFAIEIAAAIWGYSHKDEVIKEVQEFYKDTYNKLKTKDEPQRETLKAIASATSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKYFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTTAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWEYSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYLAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADGSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK*
제7서열. S1 unit의 아미노산 서열
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARS
제8서열. S1-Lamp2b의 아미노산 서열
ANNNLSYWDAPLGSSYMCNKEQTVSVSGAFQINTFDLRVQPFNVTQGKYSTAQECSLDDDTILIPIIVGAGLSGLIIVIVIAYVIGRRKSYAGYQTLGSGGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK*
제9서열. CD9 1st TM-S1의 아미노산 서열
MPVKGGTKCIKYLLFGFNFIFWLAGIAVLAIGLWLRFGSGSGSGGSSFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK*

Claims (13)

  1. ACE2(angiotensin-converting enzyme 2) 단백질 또는 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)의 스파이크 단백질이 표면에 발현된 재조합 엑소좀.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ACE2 단백질은 서열목록 제1서열 내지 제3서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 엑소좀.
  3. 제1항에 있어서, 상기 스파이크 단백질은 서열목록 제7서열로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 엑소좀.
  4. 서열목록 제1서열 내지 제9서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포.
  6. 제5항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는,
    코로나 바이러스 감염증의 백신 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 사용하기 위한 재조합 엑소좀의 생산 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 코로나 바이러스 감염증 백신 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 코로나 바이러스 감염증은 코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019,　COVID-19)인 것인, 백신 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 백신 조성물은 어쥬번트(adjuvant)를 더 포함하는 것인, 백신 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 재조합 엑소좀은 생체 내 면역 반응을 촉진하는 것인, 백신 조성물.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 코로나 바이러스 감염으로 유발되는 호흡기 질환 치료용 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 코로나 바이러스 감염으로 유발되는 호흡기 질환이 코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019,　COVID-19)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 엑소좀은 코로나 바이러스 중화 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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