WO2019225962A1 - 바리셀라 조스터 바이러스의 항원 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

바리셀라 조스터 바이러스의 항원 변이체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2019225962A1
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zoster virus
varicella zoster
surface protein
antigen
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남효정
지가영
김은미
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    • C12N2710/16771—Demonstrated in vivo effect

Definitions

  • the present invention relates to antigenic variants of Varicella Zoster Virus and uses thereof, and more particularly antigenic variants with high expression and immunogenicity in surface protein (gE) antigenic variants of Varicella zoster Virus. And it relates to a vaccine composition for preventing or treating chickenpox or shingles comprising the same as an active ingredient.
  • gE surface protein
  • VZV Varicella Zoster Virus
  • shingles The initial symptoms of shingles are painful, painful, severe itching and tingling, burning, stinging, and severe pain, such as stabbing, and blisters develop after a few days. Patients tend to complain of more severe pain. Shingles, even when cured, leaves a sequelae of neuralgia, which is relatively rare for adults under 40, but over 60 years of age sleep, chronic fatigue, severe pain in small contacts or friction, It is known to cause depression.
  • Chickenpox vaccines include VARIVAX (Merck) and VARILRIX (Glaxos Mickline) developed using Oka strain, an attenuated strain developed in 1970, and domestically developed in 1980. Products such as chicken pox boxes (green cross) using the MAV / 06 strains are commercially available.
  • the commercialized live vaccine has an average protective effect of 80%, and 20% of the vaccinates are infected after the vaccine, and stability problems such as chickenpox and shingles due to live virus included in the vaccine have been pointed out.
  • the herpes zoster vaccine Oka's live attenuated vaccine, ZOSTAVAX (Merck Co., Ltd.), was developed. Due to the large amount of virus included in the vaccine, the US vaccine is intended for use in adults over 50 years of age, not children or adolescents. It is licensed and sold in South Korea and Korea. Recently, a vaccine consisting of gE and an immunoadjuvant, a virus surface protein, has been developed by GlaxoSmithKline for adults over 50 years of age, proving its preventive effect in clinical trials (US Patent No. 7,939,084). ).
  • Antigens used in the early stages of vaccine development were mainly attenuated live bacteria or dead bacteria, but due to safety problems and immunosuppressive substances present in pathogens, they are protein antigens with clear structure and components and can form immunity essential for disease defense. Is transitioning to development.
  • the present inventors have made intensive efforts to develop high-expression protein antigens in host cells that can contribute to productivity improvement without affecting immunogenicity among surface protein (gE) antigens of varicella zoster virus.
  • the surface protein antigen variant of the varicella zoster virus of was prepared and the expression amount thereof was measured to identify a specific amino acid sequence having a high expression level in the antigen variant, thereby completing the present invention.
  • An object of the present invention is to provide specific antigen variants with high expression and immunogenicity in surface protein (gE) antigen variants of Varicella Zoster Virus.
  • Another object of the present invention is to provide a gene encoding the antigen variant, a recombinant vector containing the gene, and a host cell transformed with the recombinant vector.
  • Still another object of the present invention is to provide a vaccine composition for preventing or treating chickenpox or shingles comprising the antigenic variant as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating chickenpox or shingles using the vaccine composition containing the antigenic variant as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a vaccine composition for preventing or treating chickenpox or shingles of a vaccine composition comprising the antigenic variant as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a use of a vaccine composition comprising the antigenic variant as an active ingredient for the manufacture of a medicament for preventing or treating chickenpox or shingles.
  • the present invention is a surface protein (gE) antigen of Varicella Zoster Virus represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • the present invention also provides a gene encoding the antigen variant, a recombinant vector containing the gene and a host cell transformed with the recombinant vector.
  • the present invention also provides a vaccine composition for preventing or treating chickenpox or shingles comprising the antigenic variant as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating chickenpox or shingles using the vaccine composition comprising the antigenic variant as an active ingredient.
  • the present invention also provides a prevention or treatment for chickenpox or shingles of the vaccine composition comprising the antigenic variant as an active ingredient.
  • the present invention also provides the use of a vaccine composition comprising the antigenic variant as an active ingredient for the manufacture of a medicament for preventing or treating chickenpox or shingles.
  • FIG. 1 is a view schematically showing an experimental process according to the present invention.
  • FIG. 2 shows amino acid sequences of Varicella Zoster Virus surface protein (gE) antigens of various lengths.
  • Figure 3 is a view showing the results of Western blot performed to compare the expression level of the gE fragment, the antigen of the varicella zoster virus.
  • Figure 4 is to compare the expression level of the surface protein antigen (GSK gE 546 aa) contained in Shingrix, a vaccine of the varixella zoster virus of GlaxoSmithKline Inc. and the antigen variants produced by the present inventors (mogam gE 537 aa) A diagram showing the results of the Western blot performed.
  • GSK gE 546 aa surface protein antigen contained in Shingrix
  • a vaccine of the varixella zoster virus of GlaxoSmithKline Inc. a vaccine of the varixella zoster virus of GlaxoSmithKline Inc.
  • mogam gE 537 aa A diagram showing the results of the Western blot performed.
  • FIG. 5 is a humoral immune response of the surface protein antigen (GSK gE 546 aa) included in Shingrix, a vaccine of varicella zoster virus from GlaxoSmithKline, and the antigen (mogam gE 537 aa) produced by the present inventors.
  • Figure 1 shows the anti-gE specific IgG ELISA results performed to compare the responses.
  • FIG. 6 is a cell mediated immune response (CMI) of the surface protein antigen (GSK gE 546 aa) contained in Shingrix, a vaccine of varicella zoster virus from GlaxoSmithKline, and the antigen (mogam gE 537 aa) produced by the present inventors. , which shows the results of mouse IFN- ⁇ ELISA performed to compare cell-mediated immune responses.
  • CMI cell mediated immune response
  • FIG. 7 shows anti-gE specific IgG ELISA results performed to compare humoral immune responses of gE fragments, which are antigens of varicella zoster virus.
  • FIG. 8 shows the number of responders showing antigen-specific antibody responses after anti-gE specific IgG ELISA to compare humoral immune responses of gE fragments, antigens of varicella zoster virus. to be.
  • the present invention provides a surface protein antigen of Varicella Zoster Virus represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • It relates to a varicella zoster virus surface protein antigen variant comprising a mutated carboxy terminus of any one amino acid residue selected from the group consisting of 525 th to 543 th amino acid residues.
  • a varicella zoster virus surface protein antigen variant comprising a mutation selected from the group consisting of cleavage of the 543th amino acid residue carboxy terminus.
  • the antigenic variant preferably comprises: j) cleavage of the 534th amino acid residue carboxy terminus; k) cleavage of the 535th amino acid residue carboxy terminus; l) cleavage of the 536th amino acid residue carboxy terminus; m) cleavage of the 537th amino acid residue carboxy terminus; n) cleavage of the 538th amino acid residue carboxy terminus; o) cleavage of the 539th amino acid residue carboxy terminus; p) may include, but is not limited to, a mutation selected from the group consisting of cleavage of the 540th amino acid residue carboxy terminus.
  • the varicella zoster virus surface protein antigen variant is a mutation in which some amino acid residues of the carboxy terminus are truncated at the surface protein antigen of the varicella zoster virus represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 consisting of 623 amino acids It may be characterized as a varicella zoster virus surface protein antigen variant consisting of 534 to 540 amino acids.
  • the term “534 amino acid residue carboxyl terminus cleaved mutation” refers to the amino acid residue 1-534 which extends from the amino terminus (N-terminus) to the carboxy (C-terminus) direction and the 535th amino acid. Refers to a mutation in which a contiguous amino acid residue from the residue to the carboxy terminus is cleaved.
  • the 40th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is threonine.
  • the 536th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is leucine.
  • the varicella zoster virus surface protein antigen variant may be represented by an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 2 to 8 and SEQ ID NO: 21 to 23,
  • the 543 th amino acid residue carboxy terminus represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 may be characterized as an antigen variant truncated.
  • the surface protein of the present invention is derived from a glycoprotein constituting the envelope of the varicella zoster virus derived from Clade 1, and is a peptide fragment consisting of 534 to 540 amino acids with a portion of the carboxy terminus removed. protein).
  • amino acid sequences used in the present invention are to be interpreted to include sequences showing substantial identity with the sequences of SEQ ID NOs: 2-8 and SEQ ID NOs: 21-23.
  • the substantial identity above is at least 70% homology when the sequences of the invention described above are aligned with each other as closely as possible and the aligned sequences are analyzed using algorithms commonly used in the art. , More specifically, 80% homology, even more specifically 90% homology, most specifically 95% homology, and refers to a sequence having the same function.
  • Antigens used in the early stages of vaccine development mainly used attenuated live bacteria or dead bacteria, but due to stability problems, there is a tendency to shift to the development of protein antigens with a clear structure and components.
  • protein antigens generally have a problem of low immunogenicity compared to conventional vaccines.
  • the antigenic variant according to the present invention is excellent in both stability and immunogenicity, and has a high expression level in the host cell, and thus can be usefully used as a vaccine for preventing or treating chickenpox or shingles caused by varicella zoster virus.
  • the present invention relates to a gene encoding the antigenic variant, a recombinant vector containing the same, and a host cell transformed with the recombinant vector.
  • the gene may be represented by any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 9 to 15.
  • vector refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing the DNA in a suitable host.
  • Vectors can be plasmids, phage particles or simply potential genomic inserts. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are the most commonly used form of current vectors, "plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. For the purposes of the present invention, it is preferred to use plasmid vectors.
  • Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) a replication origin that allows for efficient replication to include hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) host cells transformed with plasmid vectors. It has a structure comprising an antibiotic resistance gene that allows selection and (c) a restriction enzyme cleavage site into which foreign DNA fragments can be inserted. Although no suitable restriction enzyme cleavage site is present, the use of synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods can facilitate ligation of the vector and foreign DNA.
  • the term "recombinant vector” generally refers to a fragment of a double strand of DNA as a recombinant carrier into which a fragment of heterologous DNA is inserted.
  • heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not naturally found in host cells. Once the recombinant vector is within the host cell, it can replicate independently of the host chromosomal DNA and several copies of the vector and its inserted (heterologous) DNA can be produced.
  • the gene or the recombinant vector is transformed or transfected into a host cell.
  • Many different types of techniques commonly used to introduce exogenous nucleic acids (DNA or RNA) into prokaryotic or eukaryotic host cells for "transformation” or “transfection”, such as electrophoresis, calcium phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection or lipofection may be used.
  • the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host.
  • transformation in the present invention means that the DNA is introduced into the host so that the DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
  • vectors function equally in expressing the gene sequences of the present invention.
  • hosts function equally for the same expression system.
  • those skilled in the art can make appropriate choices among various vectors, expression control sequences and hosts without departing from the scope of the present invention without undue experimental burden. For example, in selecting a vector, the host must be considered, since the vector must be replicated in it. The number of copies of the vector, the ability to control the number of copies and the expression of other proteins encoded by the vector must also be considered.
  • the transgenic host cell is preferably selected from the group consisting of animal cells, plant cells, yeast, E. coli and insect cells, but is not limited thereto.
  • the microorganism used as the transforming host cell is E. coli, Salmonella typhi, Salmonella, which is Gram negative bacteria if the microorganism is not toxic or attenuated when applied in vivo.
  • Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Mycobacterium bovis, Shigella, etc. may be used, and Gram positive bacteria Bacillus, Lactobacillus Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Listeria monocytogenes, Streptococcus, etc. may be used, and preferably edible microorganisms, which are edible microorganisms. Can be used, but is not limited thereto.
  • the lactic acid bacteria may include the genus Lactobacillus sp., Streptococcus and Streptococcus, and Bifido bacterium, and the representative genus Lactobacillus is Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus lutericius (Lactobacillus relacsil) (Lactobacillus bulgaricus) and Lactobacillus casei; Genus Straptococcus is Streptococcus thermophiles; Bifido bacterium infantis, Bifido bacterium infantis, Bifido bacterium bifidum, Bifido bacterium longum, Bifido bacterium breve ), Bifido bacterium lactis and Bifido bacterium ad
  • Fungi such as Aspergillus sp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp.
  • Neurospora Eukaryotic cells such as yeast, such as Neurospora crassa, other lower eukaryotic cells, and cells of higher eukaryotes such as cells from insects.
  • COS7 cells monkey kidney cells (COS7) cells, NSO cells, SP2 / 0, Chinese hamster ovary (CHO) cells, W138, baby hamster kidney (BHK) cells, MDCK, myeloma cell line, HuT78 cells and HEK293 cells and the like can be used, more preferably CHO cells can be used, but is not limited thereto.
  • COS7 cells monkey kidney cells (COS7) cells, NSO cells, SP2 / 0, Chinese hamster ovary (CHO) cells, W138, baby hamster kidney (BHK) cells, MDCK, myeloma cell line, HuT78 cells and HEK293 cells and the like
  • CHO cells can be used, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a method for producing an antigen of varicella zoster virus by culturing the host cell.
  • the antibody When a recombinant vector capable of expressing the antigen of the varicella zoster virus is introduced into a host cell, the antibody is introduced into the host cell for a period sufficient to allow the antigen to be expressed, or more preferably into the culture medium in which the host cell is cultured. It can be prepared by incubating the host cell for a period sufficient to allow the antigen to be secreted.
  • the expressed antigen can be purified from the host cell to be homogeneous. Separation or purification of the antigen can be carried out by separation, purification methods, such as chromatography, which are used in conventional proteins.
  • the chromatography can include, for example, affinity chromatography comprising a Protein A column, Protein G column, ion exchange chromatography or hydrophobic chromatography.
  • the antibody can be separated and purified by further combining filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis and the like.
  • the present invention relates to a vaccine composition for preventing or treating chickenpox or shingles comprising the antigenic variant of the varicella zoster virus as an active ingredient.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating chickenpox or shingles using a vaccine composition comprising the antigenic variant of the varicella zoster virus as an active ingredient.
  • the present invention relates to a vaccine composition
  • a vaccine composition comprising varicella zoster virus antigen variant as an active ingredient, or to prevent or treat chickenpox or shingles.
  • the present invention relates to the use of a vaccine composition comprising the antigenic variant as an active ingredient for the manufacture of a medicament for preventing or treating chickenpox or shingles.
  • prevention in the present invention has not been diagnosed as having a disease or a disease, but means to inhibit the occurrence of the disease or disease in a subject who is likely to have such a disease or disease.
  • the term “treatment” means (a) inhibiting the development of a disease, disorder or condition; (b) alleviation of a disease, illness or condition; Or (c) eliminating a disease, condition or symptom.
  • the composition of the present invention inhibits, eliminates or alleviates the development of symptoms by activating an immune response against varicella zoster virus in a subject with chickenpox or shingles, a disease caused by varicella zoster virus infection. Play a role.
  • the composition of the present invention may itself be a therapeutic composition of chickenpox or shingles, or may be administered together with other pharmacological components to be applied as a therapeutic aid for the disease.
  • treatment or “therapeutic agent” in this specification includes the meaning of “treatment assistant” or “therapeutic assistant”.
  • the term "active ingredient” refers to inducing / increasing an immune response to varicella zoster virus in a patient, or to a virus that has been infected with a varicella zoster virus or has been given a live vaccine of varicella zoster virus. Preventing, alleviating or eliminating reactivation of, preventing herpes zoster (HZ) and / or post-herpetic neuralgia (PHN), severity or duration of HZ and / or PHN It means a vaccine composition sufficient to produce a desired effect, including, but not limited to, reducing the amount of. Those skilled in the art recognize that these levels can vary.
  • immune response in the present invention refers to a cell-mediated (T-cell) immune response and / or an antibody (B-cell) response.
  • Vaccine compositions of the invention include healthy patients and immune-limited patients who have undergone hematopoietic stem cell transplantation (HCT) or solid organ transplantation (SOT), HIV-infected patients, patients with autoimmune diseases, individuals with blood cancer; Individuals undergoing chemotherapy over a wide range of solid malignancies; In the population of immunocompetent and immunocompromised patients, including but not limited to patients undergoing chronic immunosuppressive therapy over a wide range of conditions including rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus (SLE), Crohn's disease, psoriasis, and multiple sclerosis And / or to prevent HZ and / or PHN, or to reduce the severity or duration of chickenpox and / or HZ and / or PHN.
  • HCT hematopoietic stem cell transplantation
  • SOT solid organ transplantation
  • HIV-infected patients patients with autoimmune diseases, individuals with blood cancer
  • the vaccine composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • the vaccine composition of the present invention is prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a large volume container. Formulations at this time are powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols according to conventional methods. Oral dosage forms, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions. Suitable formulations known in the art can be used as disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, EastonPA.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose and the like. , Lactose, gelatin and the like are mixed. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be used. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • a suppository base witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurinum, glycerol gelatin and the like can be used.
  • the vaccine composition may be characterized in that it further comprises an adjuvant (adjuvant), and since the protein antigen alone does not strongly induce an immune response, by combining the adjuvant of the vaccine composition To increase the effect.
  • adjuvant adjuvant
  • the term "immune enhancer” is a substance that promotes the immune response to the antigen in the specific process of the initial activation of the immune cells, agents, molecules that enhance immunity by increasing the activity of cells of the immune system, but not immunogen to the host (Warren et al., Annu. Rev. Immunol, 4: 369, 1986).
  • Immunostimulators that can enhance the immune response used in the present invention can be administered simultaneously with the vaccine composition or sequentially at intervals of time.
  • the immunopotentiators of the present invention are calcium phosphate hydroxide, mineral oil, squalene, toll-like receptor (TLR), agonists, and surfactants (detergent). ), Liposomes (liposome), saponin (Saponin), cytokines (cytokine) or a combination thereof may be characterized in that it is selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a method of treating or preventing a disease or disorder in a patient, comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of the vaccine composition.
  • Optimal dosages of the vaccine compositions of the invention can be ascertained by standard studies involving the observation of a suitable immune response in a subject. After initial vaccination, subjects may be subjected to one or several booster immunizations at appropriate intervals.
  • Suitable dosages of the vaccine compositions of the present invention vary in scope depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, pathological condition, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and response to response of the patient. In consideration of the above, it can be determined by those skilled in the art.
  • the vaccine composition of the present invention may be administered via a route commonly used in the medical field, and parenteral administration is preferred, for example intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, oral, intracardiac, intramedullary It can be administered via a route for intradural, transdermal, intestinal, subcutaneous, sublingual or topical administration, and generally contains a therapeutically effective amount of the varicella zoster virus surface protein antigen variant according to the present invention as an active ingredient. can do.
  • PCR was performed to construct a surface protein (gE) construct to obtain a desired gE fragment, which was then digested with a restriction enzyme and inserted into a pcDNA3.1 vector.
  • the gE fragment inserted into the pcDNA3.1 vector was sequenced by sequencing. DNA of the pcDNA3.1 vector containing the sequenced gE fragment was obtained by midiprep.
  • the amino acid sequences of the surface protein (gE) fragments are shown in Table 1 below.
  • transient transfection was performed on 293 cells using lipofectamine 3000. After incubating 5X105 cells per well of a 6 well plate, samples were prepared for transfection the next day. 0.2 ⁇ g of DNA and 0.4 ⁇ g of P3000 were added to the tube and diluted with 125 ⁇ L of optiMEM, and 3.75 ⁇ L of lipofectamine 3000 was added to another tube and diluted with 125 ⁇ L of optiMEM. The diluted DNA was transferred to the same amount of diluted lipofectamine 3000 tube, mixed and incubated at room temperature for 10 minutes to prepare a DNA-lipofectamine mix.
  • the cells were placed in a 6 well plate containing 293 cells and cultured in a CO 2 incubator for 2 days. After the incubation, the supernatant was obtained, placed in 4X sample buffer containing b-mercaptoethanol, and heated at 100 ° C. for 5 minutes. After heating, cryopreservation was performed until Western blot.
  • Example 4 Comparison of expression levels with surface protein antigen of varicella zoster virus from GlaxoSmithKline
  • Example 5 Comparison of immunogenicity with surface protein antigens of Varicella zoster virus from GlaxoSmithKline
  • an Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method was performed to measure gE antigen-specific IgG potency.
  • Recombinant gE protein (1 ⁇ g / mL) was aliquoted into ELISA plates and overnight incubation at 4 ° C. to allow protein antigen to be coated.
  • blocking was performed for 1 hour with a Phosphate-buffered saline (PBS) solution containing 2% BSA (Bovine serum albumin).
  • PBS Phosphate-buffered saline
  • the ELISA substrate is washed, incubated for 2 hours by adding a diluted serum sample, and HRP (Horseradish peroxidase) -conjugated goat anti-mouse IgG, IgG1 or IgG2c antibody is added. Add and incubate for 1 hour. After the final incubation, the ELISA substrate was washed and HRP reaction was induced by addition of HRP substrate TMB (3,3 ', 5,5'-TETRAMETHYLBENZIDINE, KPL).
  • HRP horseradish peroxidase
  • the HRP reaction was stopped by adding a TMB stop solution, and the absorbance (OD) was measured at a wavelength of 450 nm using an ELISA microplate reader (Spectramax 250, Molecular Device) to determine the amount of antibody produced. Confirmed.
  • the luminescence intensity was the highest in G6 including an immunopotentiator in the antigen (mogam gE 537 aa) prepared by the present inventors, and thus the highest humoral immune response in G6 was obtained. It could be confirmed that induced.
  • the IFN- ⁇ ELISA method was performed to confirm the secretion amount of IFN- ⁇ , a representative cytokine secreted by T cells by antigen stimulation.
  • Leukocytes collected from mice were stimulated with VZV lysate for 3 days, centrifuged to obtain supernatant, and analyzed by mouse IFN- ⁇ ELISA kit.
  • IFN- [gamma] capture antibody (4 [mu] g / mL) was dispensed onto ELISA plates and overnight incubation at room temperature to allow the IFN- [gamma] capture antibody to be coated.
  • 293 cells were subjected to transient transfection using an Expifectamine TM 293 transfection kit.
  • 2X10 6 cells / mL cells were cultured in a 125 mL flask, followed by transfection the next day.
  • 293 cells were diluted to a total of 25.5 mL at 2.9 ⁇ 10 6 cells / mL, and complexes for transfection were prepared.
  • 30 ⁇ g of DNA was added to a 15 mL tube, and complex 1 was prepared by optimizing 1.5 mL using Opti-MEM.
  • ExpiFectamineTM 293 Reagent 81 ⁇ L of ExpiFectamineTM 293 Reagent was added to another 15 mL tube to prepare 1.5 mL using Opti-MEM, and complex 2 was prepared and incubated at room temperature for 5 minutes. After 5 minutes, complex 1 was transferred to a tube containing complex 2, and then incubated at room temperature for 20 minutes to prepare a DNA-lipid complex. After incubation, the DNA-lipid complex was placed in a 125 mL flask containing 293 cells, incubated in an incubator, and treated with Enhancer 20 hours later.
  • ExpiFectamineTM 293 Transfection Enhancer 1 150 ⁇ L of ExpiFectamineTM 293 Transfection Enhancer 1 was added to a 1.5 mL tube, 1.5 mL was used for ExpiFectamineTM 293 Transfection Enhancer 2, and then placed in 293 cells and incubated in an incubator for 5 days. After 5 days, the culture supernatant was obtained, filtered through a 0.45 ⁇ m filter, and stored frozen until purification was performed.
  • GE antigen fragments were administered by intramuscular injection every two weeks to C57BL / 6 rat females, and blood samples were taken from mice two weeks after the second immunization. Serum was separated from the collected blood and the antibody was frozen and stored until measurement.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay was performed to determine antigen-specific IgG titers.
  • VZV surface protein (1 ⁇ g / mL) was coated onto ELISA plates, overnight incubation at 4 ° C., washing ELISA substrates three times, and then BSA (Bovine serum albumin) Block for 1 hour with 2% PBS (Phosphate-buffered saline) solution, wash ELISA substrate, incubate for 2 hours by adding diluted serum sample, HRP (Horseradish peroxidase) -conjugated goat anti-mouse IgG was added and incubated for 1 hour.
  • HRP Hydrophilphate-buffered saline
  • the ELISA substrate was washed, TMB (3, 3 ', 5, 5'-tetramethyl benzidine) substrate was added to induce the HRP reaction, and then ELISA stop solution was added to stop the HRP reaction, 450
  • the luminescence intensity (OD) was measured using a spectrometer at nm wavelength.
  • Example 6-3 In order to determine whether the difference in sequence between gE antigen fragments showed a difference in antigen specific immunogenicity, animal immunization was performed by the method of Example 6-3, and the antibody was measured by the serum obtained from animal experiments. The antigen specific antibody titer was measured accordingly. As a result, as shown in FIG. 7, the O.D. value after immunizing gE 534 aa and 543 aa was higher than the O.D. value after immunizing gE 500 aa, 510 aa, 525 aa or 546 aa.
  • the surface protein (gE) antigenic variant of Varicella Zoster Virus is a protein antigen, when used as a vaccine composition, it is safer than a live viral vaccine and has a high expression level in the host cell. It is useful as a vaccine for preventing or treating chickenpox or shingles caused by Sella zoster virus.

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Abstract

본 발명은 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus)의 표면 단백질(gE) 중에서 발현량 및 면역원성이 높은 항원 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 이를 백신 조성물로 사용하는 경우 생 바이러스 백신보다 안전성이 우수하며, 다른 항원에 비하여 숙주세포 내에서 발현량이 높기 때문에 바리셀라 조스터 바이러스에 의한 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 백신으로 유용하다.

Description

바리셀라 조스터 바이러스의 항원 변이체 및 이의 용도
본 발명은 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus)의 항원 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질(gE) 항원 변이체 중에서 발현량 및 면역원성이 높은 항원 변이체 및 이를 유효성분으로 포함하는 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus, VZV)는 주로 아동 및 청소년에서 수두를 일으키는 바이러스로, 한번 감염 후 수년 동안 감각신경근 및 뇌신경의 신경절 세포에 잠복해 있다가, 성인이 되어 면역력이 떨어지면, 재활성화 되어 대상포진을 유발하는 바이러스이다. 수두는 전염성이 강한데 일단 감염되면 열감 및 권태감을 동반한 전신에 수포성 홍반을 나타내게 된다. 정상 소아에서는 대부분의 경우 심각하게 진행되는 경우가 드물고 최종적으로 자기 한정 질환(self-limiting disease)로 진행하지만, 장기이식, 항암치료를 받은 환자에서 심각한 증상으로 진행하는 경우가 많이 발생하는 것으로 알려져 있다(Adriana Weinberg et al., J Infectious Diseases, 200(7):1068, 2009; Judith Breuer et al., Expert Review of Vaccines, 2017, DOI:10.1080/14760584.2017.1394843).
대상포진의 초기 증상은 몸살처럼 온몸이 쑤시고 아프거나 심한 가려움증과 따끔거림, 화끈거림, 칼로 찌르는 듯한 심한 통증이 수반되며, 수일이 지나면 수포가 발생하게 되는데, 피부 병변이 많을수록 통증이 커지며, 고령의 환자일수록 더 심각한 통증을 호소하는 경향이 있는 질병이다. 대상포진은 완치가 돼도 신경통증의 후유증을 남기는데, 40세 이하의 성인에게는 비교적 드물지만, 60세 이상에서는 잠을 설치거나, 만성피로를 호소하기도 하고, 작은 접촉이나 마찰에도 심한 통증을 느끼거나, 우울증까지 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다.
수두 예방 백신으로는 1970년도에 개발된 약독화 균주인 Oka 주(strain)를 사용하여 개발된 VARIVAX(머크사), VARILRIX(글락소스미스클라인사) 등의 제품이 대표적이며, 국내에서는 1980년도에 개발된 MAV/06 주를 사용한 수두박스(녹십자) 등의 제품이 상용화되어 있다. 해당 상용화 생백신은 평균 80%의 방어 효능을 보여 백신 접종자 중 20%에서 백신 후에도 질병에 감염되고 있으며, 백신에 포함된 살아있는 바이러스로 인한 수두 및 대상포진 발병 등의 안정성 문제가 꾸준히 지적되어 왔다.
대상포진 예방 백신으로는 Oka 주의 약독화 생백신인 ZOSTAVAX(머크사)가 개발되었으며, 백신에 포함된 바이러스의 양이 많기 때문에, 어린이나 청소년이 아닌 50세 이상 성인을 대상으로 사용하는 것을 조건으로 미국과 한국에서 허가되어 판매되고 있다. 최근에는 글락소스미스클라인사에 의하여 50세 이상의 성인을 대상으로 하는 바이러스 표면 단백질인 gE 및 면역증강제로 구성된 백신이 개발되어, 임상시험에서 예방효과가 입증되었다(미국 등록특허공보 제7,939,084호 2011.01.07).
백신 개발 초기에 사용된 항원은 주로 약독화 생균 또는 사균을 사용하였으나, 안전성 문제 및 병원체 내에 존재하는 면역억제 물질로 인하여, 구조와 성분이 명확하고 질병 방어에 필수적인 면역을 형성할 수 있는 단백질 항원으로의 개발로 전환되는 추세이다.
이에, 본 발명자들은 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질(gE) 항원 중에서 면역원성에는 영향을 주지 않으면서도 생산성 향상에 기여할 수 있는 숙주세포 내에서 발현량이 높은 단백질 항원을 개발하고자 예의 노력한 결과, 다양한 길이의 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원 변이체를 제작하고 그 발현량을 측정하여 항원 변이체 중에서 발현량이 높은 특정 아미노산 서열을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은, 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus)의 표면 단백질(gE) 항원 변이체 중에서 발현량 및 면역원성이 높은 특정 항원 변이체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 항원 변이체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 이용한 수두 또는 대상포진의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 사용을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus)의 표면 단백질(gE) 항원에서,
525번째 내지 543번째 아미노산 잔기로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항원 변이체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 이용한 수두 또는 대상포진의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 사용을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 실험 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 다양한 길이의 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus) 표면 단백질(gE) 항원의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
도 3은 바리셀라 조스터 바이러스의 항원인 gE 단편의 발현량을 비교하기 위해 수행한 Western blot의 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 글락소스미스클라인사의 바리셀라 조스터 바이러스의 백신인 Shingrix에 포함되어 있는 표면 단백질 항원(GSK gE 546 aa)과 본 발명자들이 제작한 항원 변이체(mogam gE 537 aa)의 발현량을 비교하기 위해 수행한 Western blot의 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 글락소스미스클라인사의 바리셀라 조스터 바이러스의 백신인 Shingrix에 포함되어 있는 표면 단백질 항원(GSK gE 546 aa)과 본 발명자들이 제작한 항원(mogam gE 537 aa)의 체액성 면역반응(humoral immune response)을 비교하기 위해 수행한 anti-gE specific IgG ELISA 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 글락소스미스클라인사의 바리셀라 조스터 바이러스의 백신인 Shingrix에 포함되어 있는 표면 단백질 항원(GSK gE 546 aa)과 본 발명자들이 제작한 항원(mogam gE 537 aa)의 세포 매개성 면역반응(CMI, cell-mediated immune response)을 비교하기 위해 수행한 mouse IFN-γ ELISA 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 바리셀라 조스터 바이러스의 항원인 gE 단편의 체액성 면역반응(humoral immune response)을 비교하기 위해 수행한 anti-gE specific IgG ELISA 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 바리셀라 조스터 바이러스의 항원인 gE 단편의 체액성 면역반응(humoral immune response)을 비교하기 위해 anti-gE specific IgG ELISA를 수행 후 항원 특이적인 항체 반응을 보이는 responder의 수를 정리한 도면이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus)의 단백질 항원 중에서 면역원성에는 영향을 주지 않으면서도 생산성 향상에 기여할 수 있는 숙주세포 내에서 발현량이 높은 항원을 개발하고자, 다양한 길이의 표면 단백질(gE) 항원 변이체를 제작한 후에 발현량을 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들이 제작한 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원 변이체 중에서 특정 아미노산 서열로 표시되는 항원이 다른 항원에 비해 높은 발현량을 나타내는 것을 확인하였다(도 3).
또한, 면역원성이 높은 항원 변이체를 선별하기 위해 항체가 측정(도 7) 및 항원 특이적인 responder를 측정한 결과(도 8), mogam gE 534 aa 내지 540 aa의 면역원성이 높은 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus)의 표면 단백질 항원에서,
525번째 내지 543번째 아미노산 잔기로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 변이를 포함하는 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체에 관한 것이다.
구체적으로는,
a) 525번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
b) 526번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
c) 527번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
d) 528번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
e) 529번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
f) 530번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
g) 531번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
h) 532번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
i) 533번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
j) 534번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
k) 535번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
l) 536번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
m) 537번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
n) 538번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
o) 539번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
p) 540번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
q) 541번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단;
r) 542번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단; 및
s) 543번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단으로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체에 관한 것이다.
상기 항원 변이체는 바람직하게는 j) 534번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단; k) 535번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단; l) 536번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단; m) 537번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단; n) 538번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단; o) 539번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단; p) 540번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단으로 구성된 군에서 선택되는 변이를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Figure PCTKR2019006113-appb-I000001
본 발명에 있어서, 상기 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체는 623개의 아미노산으로 이루어진 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원에서, 일부 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 변이를 포함하여 534 내지 540개의 아미노산으로 이루어진 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 용어 "534번째 아미노산 잔기 카르복시 말단의 절단된 변이"란 아미노 말단(N-말단)으로부터 카르복시(C-말단) 방향으로 1 내지 534번째 아미노산 잔기가 존속하고, 535번째 아미노산 잔기부터 카르복시 말단까지의 연속된 아미노산 잔기가 절단된 변이를 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 40번째 아미노산 잔기는 트레오닌이다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기는 류신이다.
본 발명에 있어서, 상기 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체는 서열번호 2 내지 8 및 서열번호 21 내지 23 중에서 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으며,
a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 534번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체;
b) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 535번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체;
c) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 536번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체;
d) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 537번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체;
e) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 538번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체;
f) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 539번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체;
g) 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 540번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체;
h) 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 525번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체;
i) 서열번호 22의 아미노산 서열로 표시되는 530번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체; 또는
j) 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 543번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 표면 단백질은 Clade 1 유래의 바리셀라 조스터 바이러스의 외피(envelop)를 구성하는 당 단백질(glycoprotein) 유래이며, 카르복시 말단의 일부가 제거된 534개 내지 540개의 아미노산으로 구성된 펩티드 단편(truncated protein)이다.
생물학적으로 균등한 아미노산 변이를 고려한다면, 본 발명에서 사용되는 아미노산 서열은 서열번호 2 내지 8 및 서열번호 21 내지 23의 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상술한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 70%의 상동성, 보다 구체적으로는 80%의 상동성, 보다 더 구체적으로는 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 95%의 상동성을 나타내면서, 동일한 기능을 가지는 서열을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 534번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체; b) 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 535번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체; c) 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 536번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체; d) 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 537번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체; e) 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 538번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체; f) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 539번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체; 또는 g) 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 540번째 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 항원 변이체의 면역원성이 높은 것을 확인하였다.
백신 개발 초기에 사용된 항원은 주로 약독화 생균 또는 사균을 사용하였으나, 안정성 문제로 인하여, 구조와 성분이 명확한 단백질 항원으로의 개발로 전환되는 추세이다. 그러나, 단백질 항원은 일반적으로 기존의 백신에 비하여 면역원성이 낮은 문제가 있다. 본 발명에 따른 항원 변이체는 안정성 및 면역원성이 모두 우수하며, 숙주세포 내에서 발현량이 높기 때문에 바리셀라 조스터 바이러스에 의한 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항원 변이체를 코딩하는 유전자, 이를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 9 내지 15 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물 일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점(replication origin), (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation) 할 수 있다.
본 발명에서 용어 "재조합 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 재조합 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된(이종) DNA가 생성될 수 있다.
라이게이션 후에, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터는 숙주세포에 형질전환 또는 트랜스펙션(transfection)된다. "형질전환" 또는 "트랜스펙션"시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 물론 모든 벡터가 본 발명의 유전자 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질의 발현 또한 고려되어야만 한다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환 숙주세포는 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균 및 곤충세포로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로 본 발명에 있어서, 상기 형질전환 숙주세포로 사용되는 미생물은 생체 적용시 독성이 없거나 약독화된(attenuated) 미생물이라면 그람음성균(Gram negative bacteria)인 대장균, 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 타이피미리움(Salmonella typhimurium), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 마이코박테리움 보비스(Micobacterium bovis), 시겔라(Shigella) 등을 사용할 수 있으며, 그람양성균(Gram positive bacteria)인 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스(Streptococcus) 등을 어느 것이라도 사용 가능하며, 바람직하게는 식용이 가능한 미생물인 유산균을 사용 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유산균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 및 비피도 박테리움(Bifido bacterium) 속을 포함할 수 있으며, 대표적으로 락토바실러스 속은 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 델브릭키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락코바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei); 스트랩토코커스 속은 스트랩토코커스 서모필러스(Streptococcus thermophiles); 비피도 박테리움 속은 비피도 박테리움 인판티스(Bifido bacterium infantis), 비피도박테리움 비피덤(Bifido bacterium bifidum), 비피도 박테리움 롱검(Bifido bacterium longum), 비피도 박테리움 브레브(Bifido bacterium breve), 비피도 박테리움 락티스(Bifido bacterium lactis) 및 비피도 박테리움 아돌레센티스(Bifido bacterium adolescentis) 등을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 락토바실러스 속 락토바실러스 카제이를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵세포일 수 있다.
식물이나 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장 세포7(COS7:monkey kidney cells)세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO:chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK:baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT78 세포 및 HEK293 세포 등을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 CHO 세포가 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 숙주세포를 배양하여 바리셀라 조스터 바이러스의 항원을 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 바리셀라 조스터 바이러스의 항원을 발현할 수 있는 재조합 벡터가 숙주세포 내로 도입될 경우 항체는 숙주세포에서 항원이 발현되게 하기에 충분한 기간 동안, 또는 더 바람직하게는 숙주세포가 배양되는 배양 배지 내로 항원이 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 숙주세포를 배양함으로써 제조될 수 있다.
경우에 따라서, 발현된 항원은 숙주세포로부터 분리하여 균일하도록 정제할 수 있다. 상기 항원의 분리 또는 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 프로틴 A 컬럼, 프로틴 G 컬럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피 이외에, 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합함으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 바리셀라 조스터 바이러스의 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 바리셀라 조스터 바이러스의 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 이용한 수두 또는 대상포진의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 바리셀라 조스터 바이러스의 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 사용에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "치료"는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 바리셀라 조스터 바이러스 감염을 원인으로 하는 질환인 수두 또는 대상포진에 걸린 개체에서 바리셀라 조스터 바이러스에 대한 면역반응을 활성화시킴으로써 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 수두 또는 대상포진의 치료 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다.
이에, 본 명세서에서 용어 "치료" 또는 "치료제"는 "치료 보조" 또는 "치료 보조제"의 의미를 포함한다.
본 발명에서의 용어, "유효성분"은 환자에서 바리셀라 조스터 바이러스에 대한 면역 반응을 유도/증가시키는 것, 바리셀라 조스터 바이러스로 감염되거나 바리셀라 조스터 바이러스 생백신을 투여받은 환자에서 해당 바이러스의 재활성화를 예방, 완화 또는 제거하는 것, 대상포진(Herpes Zoster, HZ) 및/또는 대상포진 후 통증(Post-herpetic neuralgia, PHN)을 예방하는 것, HZ 및/또는 PHN의 중증도 또는 지속기간을 감소시키는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 목적하는 효과를 낳기에 충분한 백신 조성물을 의미한다. 당업자는 이러한 수준이 달라질 수 있음을 인식하고 있다.
본 발명에서의 용어 "면역 반응"은 세포-매개된(T-세포) 면역 반응 및/또는 항체(B-세포) 반응을 지칭한다.
본 발명의 백신 조성물은 건강한 환자 및 조혈모세포 이식(HCT) 또는 고형 기관 이식(SOT)을 받은 면역 제한된 환자, HIV-감염된 환자, 자가면역 질환에 걸린 환자, 혈액 암을 갖는 개체; 광범위한 고형 악성 종양에 걸쳐 화학요법을 받는 개체; 류마티스 관절염(RA), 전신성 루푸스(SLE), 크론병, 건선 및 다발성 경화증을 비롯한 광범위한 상태에 걸쳐 만성 면역억제 요법을 받는 환자를 포함하나 이에 제한되지 않는 면역적격 및 면역저하된 환자 집단에서, 수두 및/또는 HZ 및/또는 PHN을 예방하거나, 수두 및/또는 HZ 및/또는 PHN의 중증도 또는 지속기간을 감소시키는데 유용하다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제형화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때의 제형은 통상의 방법에 따라 산제(powders), 과립제(granules), 정제(tablet), 캡슐제(capsules), 현탁액(suspension), 에멀젼(emulsion), 시럽(syrup), 에어로졸(aerosol) 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, EastonPA)에 개시되어 있는 것을 사용할 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제(pill), 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium Carbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트(Magnesium Stearate), 탈크(talc) 같은 윤활제들도 사용된다.
경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(Macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지(laurinum), 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 면역증강제(adjuvant)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 통상적으로 단백질 항원 단독으로는 면역 반응이 강하게 유도되지 않기 때문에, 면역증강제를 혼합하여 백신 조성물의 효과를 증가시키는 것이다.
본 발명에서, 용어 "면역증강제"는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자 등을 의미한다(Warren et al., Annu.Rev.Immunol, 4:369, 1986). 본 발명에서 사용되는 면역 반응을 증강할 수 있는 면역증강제는 백신 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 면역증강제는 칼슘 포스페이트 하이드록사이드(calcium phosphate hydroxide), 미네랄 오일(mineral oil), 스쿠알렌(squalene), 톨유사수용체(Toll-like receptor, TLR)의 길항제(agonist), 계면 활성제(detergent), 리포좀(liposome), 사포닌(Saponin), 사이토카인(cytokine) 또는 이의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 백신 조성물의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자의 질병 또는 장애의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명의 백신 조성물의 최적의 투여량은 피검체에서 적합한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신화 후, 피검체는 적당한 간격을 두고 1회 또는 수 차례의 부스터 면역화 처리될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 그 범위가 다양하며, 상기 사항을 고려하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고, 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여용 경로를 통하여 투여할 수 있으며, 일반적으로 활성 성분으로서 본 발명에 따른 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체를 치료 유효량으로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 표면 단백질(gE) construct 제작
표면 단백질(gE) construct을 제작하고자 PCR을 수행하여 원하는 gE 단편을 얻은 후 제한 효소로 절단하여 pcDNA3.1 벡터(vector)에 삽입하였다. pcDNA3.1 벡터에 삽입한 gE 단편은 시퀀싱(sequencing)을 통하여 서열 확인을 수행하였다. 서열이 확인된 gE 단편을 포함하는 pcDNA3.1 벡터의 DNA는 midiprep으로 수득하였다. 표면 단백질(gE) 단편의 아미노산 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2019006113-appb-T000001
실시예 2: transient transfection 수행
gE 단편의 발현량을 확인하고자 293 세포에 lipofectamine 3000을 사용하여 transient transfection을 수행하였다. 6 웰(well) 플레이트(plate)의 웰 하나 당 5X105 세포를 넣어 배양을 수행한 후, 다음날 transfection을 위해 샘플을 준비하였다. 튜브에 DNA 0.2 ㎍과 P3000 0.4 ㎍을 넣은 후에 optiMEM 125 μL으로 희석하고, 다른 튜브에 lipofectamine 3000 3.75 μL를 넣고 optiMEM 125 μL으로 희석하였다. 희석한 DNA를 같은 양의 희석된 lipofectamine 3000 튜브로 옮긴 후 섞어주며 10분간 상온에서 인큐베이션(incubation)하여 DNA-lipofectamine mix를 제조하였다. 인큐베이션이 끝난 후에 293 세포가 있는 6 well plate에 넣어준 후 2일간 CO2 인큐베이터에서 배양을 수행하였다. 배양이 끝난 후 상청액을 수득하여 b-mercaptoethanol이 포함된 4X sample buffer을 넣은 후 100 ℃에서 5분간 가열하였다. 가열 후, Western blot 수행 전까지 냉동보관을 하였다.
실시예 3: Western blot 수행
gE 단편의 발현량을 비교하고자 Western blot을 수행하였다. NuPAGE 4-12% bis-tris gel에 샘플을 러닝한 후 PVDF membrane에 transfer하여 5% skim milk로 1시간 동안 blocking을 수행한 후 monoclonal gE antibody(1 ㎍/mL)을 2시간 동안 인큐베이션 하였으며 TBST(tween 0.05%)으로 세척한 후 goat anti-mouse IgG-HRP을 5000X로 희석하여 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션이 끝난 membrane은 TBST로 세척한 후 ECL substrate로 발색하여 chemidoc 기계로 검출(detection)하였다. Western blot을 수행한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 gE 534 aa, gE 537 aa 및 gE 540 aa의 항원에서 높은 발현량을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)사의 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원과의 발현량 비교
현재, 상용화된 글락소스미스클라인사의 바리셀라 조스터 바이러스의 백신인 Shingrix에 포함되어 있는 표면 단백질 항원(GSK gE 546 aa)과 본 발명자들이 제작한 항원(mogam gE 537 aa)과의 발현량을 비교하고자 상기 실시예 3에 기재되어 있는 방법과 동일한 방법으로 Western blot을 수행하였다. 글락소스미스클라인사의 Shingrix에 포함되어 있는 표면 단백질 항원(GSK gE 546 aa)과 본 발명자들이 제작한 항원(mogam gE 537 aa)과의 차이점은 하기의 표 2에 기재되어 있는 바와 같다. Western blot을 수행한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 글락소스미스클라인사의 표면 단백질 항원에 비해 본 발명자들이 제작한 항원에서 보다 높은 발현량을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2019006113-appb-T000002
실시예 5: 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)사의 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원과의 면역원성 비교
현재, 상용화된 글락소스미스클라인사의 바리셀라 조스터 바이러스의 백신인 Shingrix에 포함되어 있는 표면 단백질 항원(GSK gE 546 aa)과 본 발명자들이 제작한 항원(mogam gE 537 aa)과의 면역원성을 비교하고자 동물 실험을 수행하였다. 사람의 경우 수두감염이력을 가지고 있으므로, 쥐에서 수두 감염을 모방하고자 약독화된 생백신(LAV. 3,000 pfu)을 C57BL/6 쥐 암컷에 1회 피하주사(subcutaneous injection) 하여 1차 면역접종(LAV priming)을 수행하였다. LAV priming(Day 0)으로부터 28일 후 면역증강제를 포함하거나 포함하지 않는 mogam gE 또는 GSK gE 항원 조성물을 근육주사(intramuscular injection)로 투여하여 2차 면역접종(immunization)을 수행하였다. gE에 대한 체액성 면역 반응(humoral immune response)을 측정하기 위하여 LAV priming 시점으로부터 42일 후(Day 42) 혈액 샘플을 채취하였으며, gE 혹은 VZV에 대한 세포 매개성 면역 반응(CMI, cell-mediated immune response)을 측정하기 위하여 LAV priming 시점으로부터 42일 후(Day 42) 비장 샘플로부터 백혈구를 채취하였다. 면역접종일, 혈액 및 비장 샘플 채취일은 LAV priming 실시일을 Day 0으로 하여 이로부터 계산한 것이다. 전체적인 동물 실험 방법은 하기의 표 3에 기재되어 있는 바와 같다.
Figure PCTKR2019006113-appb-T000003
실시예 5-1: 체액성 면역반응의 비교
1차 면역접종 및 2차 면역접종을 수행한 후, gE 항원 특이적인 IgG 역가(potency) 측정을 위하여 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 수행하였다. 재조합 gE 단백질(1 ㎍/mL)을 ELISA 기판(plates)에 분주하고, 4 ℃에서 오버나이트 인큐베이션(overnight incubation) 하여 단백질 항원이 코팅되도록 하였다. 항원이 코팅된 ELISA 기판을 3회 세척(washing)한 후, BSA(Bovine serum albumin)을 2% 함유하는 PBS(Phosphate-buffered saline) 용액으로 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. BSA에 의한 블로킹 반응이 종료되면 ELISA 기판을 세척한 후, 희석된 샘플(diluted serum sample)를 첨가하여 2시간 동안 인큐베이션 하고, HRP(Horseradish peroxidase)-conjugated goat anti-mouse IgG, IgG1 또는 IgG2c 항체를 첨가하여 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 최종 인큐베이션 후, ELISA 기판을 세척하고, HRP 기질인 TMB(3,3',5,5'-TETRAMETHYLBENZIDINE, KPL)을 첨가하여 HRP 반응을 유도하였다. 그 후에, TMB stop solution을 첨가하여 HRP 반응을 정지시키고, ELISA microplate reader(Spectramax 250, Molecular Device)를 사용하여 450 nm의 파장에서 흡광도(optical density, OD)를 측정하여, 생성된 항체의 양을 확인하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 본 발명자들이 제작한 항원(mogam gE 537 aa)에 면역증강제를 포함하는 G6에서 발광 강도가 가장 높은 것으로 나타났으며, 이를 통해 G6에서 가장 높은 체액성 면역반응이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5-2: 세포 매개성 면역반응의 비교
1차 면역접종 및 2차 면역접종을 수행한 후 항원 자극에 의해 T 세포가 분비하는 대표적인 사이토카인인 IFN-γ의 분비양을 확인하고자 IFN-γ ELISA 방법을 수행하였다. 생쥐에서 채취한 백혈구를 VZV lysate로 3일간 자극 후 원심분리하여 상청액을 얻어 마우스 IFN-γ ELISA 키트로 분석을 수행하였다. IFN-γ capture 항체(4 μg/mL)을 ELISA 기판(plates)에 분주하고, 상온에서 오버나이트 인큐베이션(overnight incubation) 하여 IFN-γ capture 항체가 코팅되도록 하였다. 항체가 코팅된 ELISA 기판을 3회 와싱(washing)한 후, BSA(bovine serum albumin)를 1% 함유하는 PBS로 1시간 동안 블로킹(blocking) 하였다. BSA에 의한 블로킹 반응이 종료되면 ELISA 기판을 세척한 후, 백혈구를 자극하여 얻은 상청액을 첨가하여 2시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 종료된 후, ELISA 기판을 세척하고, biotinylated mouse IFN-γ detection 항체(400 ng/mL)을 2시간 동안 상온에서 인큐베이션하고, 와싱한 후에 streptavidin-HRP을 다시 20분 동안 인큐베이션하였다. 최종 인큐베이션이 끝난 ELISA 기판을 세척한 후, substrate solution으로 20분 동안 상온에서 반응시켰으며, stop solution으로 반응을 정지시킨 후 ELISA microplate reader(Spectramax 250, Molecular Device)를 사용하여 450 nm의 파장에서 흡광도(optical density, OD)를 측정하여, 생성된 IFN-γ 사이토카인의 양을 확인하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 본 발명자들이 제작한 항원(mogam gE 537 aa)에 면역증강제를 포함하는 G6에서 생성된 IFN-γ 사이토카인의 양이 가장 많은 것으로 나타났으며, 이를 통해 G6에서 가장 높은 세포 매개성 면역반응이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: gE 항원 단편들의 항원 특이적인 면역원성 확인
실시예 6-1: 항원 생산을 위한 transient transfection 수행
gE 단편을 발현하고자 293 세포에 ExpifectamineTM 293 transfection kit를 사용하여 transient transfection을 수행하였다. 125 mL 플라스크에 2X106 cells/mL의 세포를 넣어 배양한 후, 다음날 transfection을 진행하였다. 293 세포를 2.9X106 cells/mL으로 총 25.5 mL이 되도록 희석하고, transfection을 위한 complex들을 준비하였다. 15 mL 튜브에 DNA 30 ㎍을 취하고 Opti-MEM을 이용하여 1.5 mL이 되도록 맞추어 complex 1을 준비하였다. 다른 15 mL 튜브에 ExpiFectamineTM 293 Reagent 81 μL을 넣고 Opti-MEM을 이용하여 1.5 mL이 되도록 맞추어 complex 2를 준비하였고, 5분간 상온에서 인큐베이션하였다. 5분 후 complex 1을 complex 2가 들어있는 튜브로 옮겨 섞은 후, 상온에서 20분간 인큐베이션하여 DNA-lipid complex를 제조하였다. 인큐베이션이 끝난 후 DNA-lipid complex를 293 세포가 들어있는 125 mL 플라스크에 모두 넣어준 후 인큐베이터에서 배양하였고, 20시간 뒤에 Enhancer를 처리하였다. 1.5 mL 튜브에 ExpiFectamineTM 293 Transfection Enhancer 1 150 μL을 넣고, ExpiFectamineTM 293 Transfection Enhancer 2를 이용하여 1.5 mL이 되도록 한 후, 293 세포에 넣어준 후 5일간 인큐베이터에서 배양하였다. 5일 후 배양 상청액을 수득하여 0.45 μm 필터로 여과한 후 정제를 수행하기 전까지 냉동보관하였다.
실시예 6-2: 항원 확보를 위한 정제 수행
냉동보관된 배양액을 해동하여 배양액에 동량의 PBS를 첨가하여 0.22 μm 필터로 여과한 후 Anion Exchange Chromatography를 수행하였으며 용출액에 5M NaCl을 첨가하여 Hydrophobic Interaction Chromatography를 수행하였다. Chromatography를 거친 용출액을 0.22 μm 필터로 여과한 후 동물실험 수행 전까지 냉동보관하였다.
실시예 6-3: 면역 접종
gE 항원 단편들의 면역원성을 확인하고자 동물실험을 수행하였다. C57BL/6 쥐 암컷에 gE 항원 단편들을 2주 간격으로 근육주사(intramuscular injection)로 투여하였으며, 2차 면역접종 후 2주에 쥐로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 채취한 혈액에서 혈청을 분리한 후 항체가 측정 전까지 냉동보관하였다.
실시예 6-4: 항원 특이적 IgG 역가 및 responder 측정
항원 특이적인 IgG 역가 측정을 위한 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하였다. VZV 표면단백질(1 ㎍/mL)을 ELISA 기판(plates)에 코팅하고, 4 ℃에서 오버나이트 인큐베이션(overnight incubation)하고, ELISA 기판을 3회 와싱(washing)한 후, BSA(Bovine serum albumin)을 2% 함유하는 PBS(Phosphate-buffered saline) 용액으로 1시간 동안 블로킹(blocking)하고, ELISA 기판을 와싱(washing)한 후, 희석된 샘플(diluted serum sample)을 첨가하여 2시간 동안 인큐베이션 하고, HRP(Horseradish peroxidase)-conjugated goat anti-mouse IgG 체를 첨가하여 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 인큐베이션 후, ELISA 기판을 와싱하고, TMB(3, 3', 5, 5' - 테트라메틸 벤지딘) 기질을 첨가하여 HRP 반응을 유도한 후, ELISA stop solution을 첨가하여 HRP 반응을 정지시키고, 450 nm 파장의 분광기를 사용하여 발광 강도(optical density, OD)를 측정하였다.
gE 항원 단편 간 서열의 차이가 항원 특이적인 면역원성에 차이를 나타내는지 확인하고자, 상기 실시예 6-3의 방법으로 동물 면역접종을 수행하였으며, 동물실험에서 확보한 혈청으로 상기 항체가 측정 방법에 따라 항원 특이적인 항체가를 측정하였다. 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, gE 534 aa, 543 aa을 면역한 후의 O.D.값이 gE 500 aa, 510 aa, 525 aa 또는 546 aa를 면역한 후의 O.D.값보다 높은 결과를 나타내었다.
항체가 측정 후 O.D.값이 0.6 이상인 개체들을 responder로 간주하여 결과를 정리한 결과, gE 500 aa에서는 항원 특이적인 responder가 없었으며 gE 510 aa와 gE 546 aa 면역 후의 responder 수는 동일하였다. gE 525 aa, 534 aa, 537 aa, 540 aa를 면역한 후의 responder 수가 gE 510 aa, 546 aa 면역 후의 responder 수보다 많았다. 즉 gE 525 aa - 540 aa에서 높은 responder 수를 나타냄을 확인하였다(도 8).
결과적으로, 항체가 측정에서 gE 534 aa 내지 543 aa에서 높은 결과를 나타내었고, 항원 특이적인 responder에서 gE 525 aa 내지 540 aa에서 높은 결과를 나타내었다. 따라서, 상기 두 결과를 종합하여 보면, gE 534 aa 내지 540 aa에서 면역원성이 높은 결과를 나타냄을 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus)의 표면 단백질(gE) 항원 변이체는 단백질 항원이므로 백신 조성물로 사용하는 경우, 생바이러스 백신보다 안전성이 우수하며 숙주세포 내에서 발현량이 높기 때문에 바리셀라 조스터 바이러스에 의한 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 백신으로 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus)의 표면 단백질(gE) 항원에서,
    525번째 내지 543번째 아미노산 잔기로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 잔기 카르복시 말단이 절단된 변이를 포함하는 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 40번째 아미노산 잔기가 트레오닌인 것을 특징으로 하는 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 536번째 아미노산 잔기가 류신인 것을 특징으로 하는 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항원 변이체는 서열번호 2 내지 8 및 서열번호 21 내지 23 중에서 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원 변이체를 코딩하는 유전자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 9 내지 15 중 어느 하나의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
  7. 제5항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
  8. 제7항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 수두 또는 대상포진의 예방 또는 치료방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료 용도.
  12. 수두 또는 대상포진 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바리셀라 조스터 바이러스의 표면 단백질 항원 변이체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 사용.
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