JP2005535619A - 免疫寛容を誘導するための物質および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(i) 細胞集団を前述の試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii) 前述の細胞集団中でIL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(iii) ステップ(ii)の結果を、この配列の寛容原性と相関させるステップと
を含み、前述の細胞集団が、前述の感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む方法を提供する。
(i)(a) 前述の感染性物質に事前に感染していないドナーから得た類似の細胞集団を、前述の試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii)(a) 前述の細胞集団中でIL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、さらに場合により、
(ii)(b) ステップ(ii)による結果と、ステップ(ii)(a)による結果を比較するステップと
をさらに含むことができる。
(i) 細胞集団を、(a)前述の試験ペプチド配列、および(b)標的抗原と接触させて、試験組成物を生成するステップと、
(ii) 前述の試験組成物から得た細胞集団を、前述の標的抗原と再接触させるステップと
を含み、前述の細胞集団が、前述の感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む方法をさらに提供する。この細胞集団は、少なくとも1つのタイプのAPCを含むことが好ましく、このAPCは、上述のように、単核白血球でもよいし、そうでなくてもよい。
(iii) 前述の標的抗原に対する前述の細胞集団の応答を評価するステップと、
さらに場合により、
(iv) ステップ(iii)の結果を、試験ペプチド配列の寛容原性と相関させるステップと
をさらに含むことができる。
(a) 感染性物質由来の寛容原性ペプチド配列と、
(b) 標的抗原と
に接触させることを含み、前述の細胞集団が、前述の感染性物質に対して血清陽性であるドナーから得た単核白血球を含む方法を提供する。
(a) 前述の試験ペプチド配列が前述の細胞集団で発現されるように、前述の試験ペプチド配列をコードする核酸と接触させること、および
(b) 標的抗原と接触させること
を含み、前述の細胞集団が、前述の感染性物質に対して血清陽性であるドナーから得た単核白血球を含む方法を、さらに提供する。
(i) 第1細胞集団を前述の試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii) 第2細胞集団を対照ペプチド配列と接触させるステップと、
(iii) 前述の細胞集団のそれぞれでIL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(iv) ステップ(iii)の結果を、前述の試験ペプチド配列の寛容原性と相関させるステップと
を含み、前述の細胞集団のそれぞれが、感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含み、前述の対照ペプチド配列が前述の感染性物質に由来するものである方法を提供する。したがって、対照ペプチド配列は、通常、前述の感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む細胞集団において、IL-10の発現を誘導することが事前に示されているものであろう。
10人のEBV血清陽性ドナーからの得たPBMCが、精製されたLMP1に対して、Thサイトカイン分泌または増殖のいずれかで応答する能力について試験した。すべての血清陽性ドナーにおいて、主に測定されたサイトカインはIL-10であり、増殖応答、γ-IFN応答、またはIL-4応答は、有意に測定されなかった。図1は、2人の血清陽性ドナーから得られた代表的な結果を示す。観測された応答が、事前のEBV感染によって生じたものであることを確認するために、2人のEBV血清陰性ドナーから得たPBMCを、精製されたLMP1に対する応答性に関して試験した。図1から、これらのドナーにおいて、LMP1がIL-10分泌も、または有意の増殖およびγ-IFN応答も誘導しなかったことも見ることができる。T細胞マイトジェンであるコンカナバリンA(Con A)および対照リコール抗原である結核菌精製タンパク質誘導体(PPD)によって、EBVの血清学的な状態にかかわらず、増殖およびγ-IFN産生を主とした応答が誘導されたため、両ドナーグループにおける前述の結果はLMP1に特異的なものである。
LMP1に対する免疫応答をさらに特徴づけるために、LMP1の全配列にまたがる、20-merの合成ペプチドからなるパネルで、20人の健康なEBV血清陽性ドナーから得たPBMCをスクリーニングすることによって、IL-10分泌を誘導したエピトープのマッピングを行った。1人のドナー(図2)から得られた代表的な結果は、複数のLMP1ペプチドによって、高濃度のIL-10分泌が誘導されたことを実証する。対照的に、増殖を誘導したのは、3つのペプチドのみであり、γ-IFNは5つのペプチド、IL-4は2つのペプチド、そしてこれら後者の応答はすべて弱いものであった。同様の応答性パターンが、合計20人の血清陽性のドナーで見いだされた(図3に概要)。きわだったことに、特定のペプチドが異なったドナー(p=2.2.10-7、ポアソン異質性検定)で、共通にIL-10応答を誘導し、例えば、ペプチド4(aa16〜35)は80%の個体でIL-10を誘導した。その上、これらの優性なIL-10誘導性ペプチドは、多数のMHCクラスII分子に対する結合モチーフに富んだ、このタンパク質のN末端側半分内に集中している。(http://imtech.res.in/raghava/propred/index.html; http://www.csd.abdn.ac.uk/~gjlk/MHC-Thread) (Sturnioloら(1999年); SinghおよびRaghava(2001年))。
IL-10産生を行う細胞の表現型をフローサイトメトリーで測定し、4人の血清陽性個体に由来する、ペプチド刺激した培養と、刺激しなかった培養とを比較した。ほとんどのIL-10産生細胞は、T細胞のCD3マーカーを有し(平均= 83.9%、SD=9.4%)、これらの中では、大部分がCD4+ヘルパー表現型のものであった(平均= 90.6%、SD=8.9%)(図4)。同様に、CD69およびCD71の発現から判断されるところの活性化細胞も、ペプチドに応答して増殖したまれな培養においては、CD4+であった(データは示されていない)。
IL-10分泌の傾向があるCD4+T細胞はTr1細胞と呼ばれるが、これらTr1細胞は、免疫調節において重要な役割を果たしているという証跡があり(Grouxら、1997年; LevingsおよびRoncarolo、2000年)、また炎症応答を阻害することが示されている(Grouxら、1997年; RoncaroloおよびLevings、2000年)。本発明者らは、LMP1およびペプチドパネルに対する応答が主としてTr1 細胞によって媒介されていると結論し、これらの細胞が抑制を媒介できることの確認を試みた。試験された10人の血清陽性ドナー全員において、T細胞マイトジェンCon A、リコール抗原PPD、および初回抗原スカシガイヘモシアニン(KLH)に対する増殖応答およびγ-IFN応答が、LMP1の添加により、強く、56-99%阻害された(図5)。PBMCを2人の対照血清陰性ボランティアから得た際にはそのような効果が見られなかったため(図5)、LMP1に対するIL-10応答、および関連した阻害は、EBVに感染したことのあるドナーに依存したものであった。IL-10誘導性LMP1ペプチドを、5人の血清陽性ドナーから得たPBMCの培養に添加したとき、精製されたLMP1タンパク質で得られたものに類似の結果が見出され、PPDに対する増殖応答およびγ-IFN応答が41〜99%抑制された(図6)。平行実験では、このペプチドによって、マイトジェンCon Aまたは初回抗原KLHに対する増殖応答およびγ-IFN応答も阻害された(結果は示されていない)。このサイトカインを誘導しなかったLMP1由来ペプチドを、PPDで刺激した培養に添加した際、抑制が見られなかったため、図6 は、阻害作用がIL-10に依存していることも実証する。さらに、抗IL-10抗体で処理された培養では、LMP1ペプチド媒介性の抑制が71%まで戻された(図6)。
3人の血清陽性ドナーおよび1人の血清陰性ドナーから得たPBMCを、まず培養中で、マイトジェンCon A、リコール抗原PPD、初回抗原KLHによって、単独で、または精製されたLMP1と併用して、そして2つの場合ではLMP1誘導ペプチドと併用して刺激した。続いて細胞を7日間休息させ、抗原を除去するために洗浄し、抗原提示細胞の供給源として新しい照射された自己PBMCに添加した(Plebanskiら、1992年)。各グループの細胞を、その後、それぞれの刺激で再刺激した。結果を図7〜10に示す。
これらのLMP1ペプチドによって、CD4+T細胞からのIL-10分泌が誘導されることは、このタンパク質がプロセシングされ、抗原性ペプチドフラグメントとしてAPCによって提示された後に、LMP1全体がそのような応答を誘導する可能性があることが示唆される。しかし、他の病原体由来の分子は、プロセシングの後ではなく、生得的なパターン認識受容体との直接相互作用によってIL-10を誘導することが示されている(McGuirkら、2002年; Millsら、2002年; Urbanら、2001年)。
PPDおよびハウスダストマイト(HDM)アレルゲンに対する血清陽性PBMCの応答に対する、選択されたLMP1ペプチドおよびペプチドの組合せの効果を評価した。PPDは、Th1型応答の代表的応答を引き起こすため、これを選択し、一方HDMは、IL-4を主とする代表的な病原性アレルギー型Th2応答を引き起こすように選択した。ペプチド混合物は、その混合物で刺激した場合、所与のドナーでも、IL-10応答の産生を失敗する可能性ができるだけ低くなるように選択した。図12は1人の代表的ドナーからの結果を示す。予想されるように、PPDのみの投与は、IFN-γ分泌を伴う増殖を引き起こし、一方HDMのみでは増殖およびIL-4分泌を引き起こす。しかしどちらの場合でも、これらの反応は、3つのペプチド混合物すべてによって抑制された。
自己免疫応答および同種異系免疫応答に関連づけられている抗原に対する、2人の正常個体から得たPBMCの応答を調べ、図13に示す。これらのドナーは、PPD、ConA、およびKLHに対して、予想どおりの反応を示し(ただしこのアッセイでは、通常とは異なり、KLH単独の刺激によって、有意な量のIL-10産生が引き起こされた)、これらの応答は、LMP1ペプチド混合物で抑制された。
正常なドナーから得たPBMCを、アレルゲンであるHDMおよびTGによって、単独で、またペプチド混合物1〜3と併用して刺激した。他の様々な抗原を対照として用いた。応答を図14パネル(a)に示す。パネル(b)はHDM、TG、およびPPDで再刺激した結果を示す。すべての場合で、初回刺激への応答は抑制されたが、細胞は、他の抗原に正常に応答する能力を保持した。したがって、アレルゲンに対するIL-4駆動性Th2応答の抑制は、抗原特異的であり、LMP1ペプチドの不在下でも持続している。
自己免疫性溶血性貧血の患者から得た細胞をRhD抗原のみで刺激したところ、IFN-γの分泌を伴う強い増殖応答が得られた。この応答のこれらTh1コンポーネントは、上述した3つのLMP1ペプチド混合物すべてによって著しく阻害された(図15)。
HDMアレルゲンおよびTGアレルゲンに対する増殖応答およびIFN-γ応答は、花粉症および喘息を患っている患者から得たPBMCにおいて、LMP1ペプチド混合物によってほとんどバックグランドレベルまで減弱された(図16a)。これらの細胞では、IL-4分泌も阻害された。ただしこのアッセイで示されたIL-4バックグランドは非常に高い。ここでもまた、ペプチドの不在下に、これらの細胞をPPD、HDMおよびTGで再刺激したところ、初回刺激に対する細胞の応答は抑制されたが、他の抗原に応答する能力を保持していることが示された。
本明細書において仮定した新規の機構によって、エプスタイン-バーウイルス(EBV)は検出を回避するのではなく、代わりに、抑制サイトカインであるインターロイキン10(IL-10)を分泌する調節性CD4+T細胞を刺激することによって免疫応答を破壊する。そのような調節性T細胞は、十分に認識されているものだが(1〜3)、ウイルス持続(4〜6)における役割をもつことは知られていない。EBV血清陽性ドナーのすべてから得られたヒト末梢血単核細胞(PBMC)は、精製された潜伏性膜タンパク質1(LMP1)および対応する免疫優性ペプチドの両方に対して、CD4+T細胞による高レベルのIL-10分泌で応答し、しかし血清陰性ドナーからのものは応答しなかった。これらのIL-10応答は、T調節性1(Tr1)細胞に特有のものであるが、マイトジェンおよびリコール抗原の両方によって誘導されるT細胞増殖およびγ-インターフェロン(γ-IFN)分泌の阻害と同時に起こった。免疫応答を免疫寛容へと偏移させるこのウイルス抗原の能力は、潜伏性の維持、およびEBV関連腫瘍の維持にとって重要である可能性が高い。
ドナー
血液試料は、健常ボランティアのグループから静脈穿刺で得た。ドナーは、血清抗EBNA1 IgGに対するELISAによって、EBV血清陽性か、または血清陰性として分類した。陰性結果は、IgGおよびIgM抗ウィルスキャプシド抗体の免疫蛍光染色によって確認した。
LMP1は、抗マウスIgG1でコーティングされた磁性ビーズ(Biomag、PerSeptive Biosystems)に結合された抗LMP1抗体CS1-4(Novocastra Laboratories)を用いて、溶解したEBV形質転換B細胞から、免疫精製した。
P1 MEHDLERGPPGPRRPPRGPP P39 HSDEHHHDDSLPHPQQATDD
P2 ERGPPGPRRPPRGPPLSSSL P40 HHDDSLPHPQQATDDSGHES
P3 GPRRPPRGPPLSSSLGLALL P41 LPHPQQATDDSGHESDSNSN
P4 PRGPPLSSSLGLALLLLLLA P42 QATDDSGHESDSNSNEGRHH
P5 LSSSLGLALLLLLLALLFWL P43 SGHESDSNSNEGRHHLLVSG
P6 GLALLLLLLALLFWLYIVMS P44 DSNSNEGRHHLLVSGAGDGP
P7 LLLLALLFWLYIVMSDWTGG P45 EGRHHLLVSGAGDGPPLCSQ
P8 LLFWLYIVMSDWTGGALLVL P46 LLVSGAGDGPPLCSQNLGAP
P9 YIVMSDWTGGALLVLYSFAL P47 AGDGPPLCSQNLGAPGGGPD
P10 DWTGGALLVLYSFALMLIII P48 PLCSQNLGAPGGGPDNGPQD
P11 ALLVLYSFALMLIIIILIIF P49 NLGAPGGGPDNGPQDPDNTD
P12 YSFALMLIIIILIIFIFRRD P50 GGGPDNGPQDPDNTDDNGPQ
P13 MLIIIILIIFIFRRDLLCPL P51 NGPQDPDNTDDNGPQDPDNT
P14 ILIIFIFRRDLLCPLGALCI P52 PDNTDDNGPQDPDNTDDNGP
P15 IFRRDLLCPLGALCILLLMI P53 DNGPQDPDNTDDNGPHDPLP
P16 LLCPLGALCILLLMITLLLI P54 DPDNTDDNGPHDPLPQDPDN
P17 GALCILLLMITLLLIALWNL P55 DDNGPHDPLPQDPDNTDDNG
P18 LLLMITLLLIALWNLHGQAL P56 HDPLPQDPDNTDDNGPQDPD
P19 TLLLIALWNLHGQALFLGIV P57 QDPDNTDDNGPQDPDNTDDN
P20 ALWNLHGQALFLGIVLFIFG P58 TDDNGPQDPDNTDDNGPHDP
P21 HGQALFLGIVLFIFGCLLVL P59 PQDPDNTDDNGPHDPLPHSP
P22 FLGIVLFIFGCLLVLGIWIY P60 NTDDNGPHDPLPHSPSDSAG
P23 LFIFGCLLVLGIWIYLLEML P61 GPHDPLPHSPSDSAGNDGGP
P24 CLLVLGIWIYLLEMLWRLGA P62 LPHSPSDSAGNDGGPPQLTE
P25 GIWIYLLEMLWRLGATIWQL P63 SSGSGGDDDDPHGPVQLSYYD
P26 LLEMLWRLGATIWQLLAFFL P64 SDSAGNDGGPPQLTEEVENK
P27 WRLGATIWQLLAFFLAFFLD P65 NDGGPPQLTEEVENKGGDQG
P28 TIWQLLAFFLAFFLDLILLI P66 PQLTEEVENKGGDQGPPLMT
P29 LAFFLAFFLDLILLIIALYL P67 EVENKGGDQGPPLMTDGGGG
P30 AFFLDLILLIIALYLQQNWW P68 GGDQGPPLMTDGGGGHSHDS
P31 LILLIIALYLQQNWWTLLVD P69 PPLMTDGGGGHSHDSGHGGG
P32 IALYLQQNWWTLLVDLLWLL P70 DGGGGHSHDSGHGGGDPHLP
P33 QQNWWTLLVDLLWLLLFLAI P71 HSHDSGHGGGDPHLPTLLLG
P34 TLLVDLLWLLLFLAILIWMY P72 GHGGGDPHLPTLLLGSSGSG
P35 LLWLLLFLAILIWMYYHGQR P73 DPHLPTLLLGSSGSGGDDDD
P36 LFLAILIWMYYHGQRHSDEH P74 TLLLGSSGSGGDDDDPHGPV
P37 LIWMYYHGQRHSDEHHHDDS P75 LFLAILIWMYYHGQRHSDEH
P38 YHGQRHSDEHHHDDSLPHPQ
P1' MGSLEMVPMGAGPPSPGGDP P49' WRRLTVCGGIMFLACVLVLI
P2' MVPMGAGPPSPGGDPDGYDG P50' VCGGIMFLACVLVLIVDAVL
P3' AGPPSPGGDPDGYDGGNNSQ P51' MFLACVLVLIVDAVLQLSPL
P4' PGGDPDGYDGGNNSQYPSAS P52' VLVLIVDAVLQLSPLLGAVT
P5' DGYDGGMNSQYPSASGSSGN P53' VDAVLQLSPLLGAVTVVSMT
P6' GNNSQYPSASGSSGNTPTPP P54' QLSPLLGAVTVVSMTLLLLA
P7' YPSASGSSGNTPTPPMDEER P55' LGAVTVVSMTLLLLAFVLWL
P8' GSSGNTPTPPNDEERESNEE P56' VVSMTLLLLAFVLWLSSPGG
P9' TPTPPNDEERESNEEPPPPY P57' LLLLAFVLWLSSPGGLGTLG
P10' NDEERESNEEPPPPYEDPYW P58' FVLWLSSPGGLGTLGAALLT
P11' RESNEEPPPPYEDYWGNGD P59' SSPGGLGTLGAALLTLAAAL
P12' EPPPPYEDPYWGNGDRHSDY P60' LGTLGAALLTLAAALALLAS
P13' YEDPYWGNGDRHSDYQPLGT P61' AALLTLAAALALLASLILGT
P14' WGNGDRHSDYQPLGTQDQSL P62' LAAALALLASLILGTLNLTT
P15' RHSDYQPLGTQDQSLYLGLQ P63' ALLASLILGTLNLTTMFLLM
P16' QPLGTQDQSLYLGLQHDGND P64' LILGTLNLTTMFLLMLLWTL
P17' QDQSLYLGLQHDGNDGLPPP P65' LNLTTMFLLMLLWTLVVLLI
P18' LGLQHDGNDGLPPPPYSPRD P66' MFLLMLLWTLVVLLICSSCS
P19' DGNDGLPPPPYSPRDDSSQH P67' LLWTLVVLLICSSCSSCPLS
P20' LPPPPYSPRDDSSQHIYEEA P68' VVLLICSSCSSCPLSKILLA
P21' PPYSPRDDSSQHIYEEAGRG P69' CSSCSSCPLSKILLARLFLY
P22' RDDSSQHIYEEAGRGSMNPV P70' SCPLSKILLARLFLYALALL
P23' QHIYEEAGRGSMNPVCLPVI P71' KILLARLFLYALALLLLASA
P24' EAGRGSMMPVCLPVIVAPYL P72' RLFLYALALLLLASALIAGG
P25' SMNPVCLPVIVAPYLFWLAA P73' ALALLLLASALIAGGSILQT
P26' CLPVIVAPYLFWLAAIAASC P74' LLASALIAGGSILQTNFKSL
P27' VAPYLFWLAAIAASCFTASV P75' LIAGGSILQTNFKSLSSTEF
P28' FWLAAIAASCFTASVSTVVT P76' SILQTNFKSLSSTEFIPNLF
P29' IAASCFTASVSTVVTATGLA P77' NFKSLSSTEFIPNLFCMLLL
P30' FTASVSTVVTATGLALSLLL P78' SSTEFIPNLFCMLLLIVAGI
P31' STVVTATGLALSLLLLAAVA P79' IPNLFCMLLLIVAGILFILA
P32' ATGLALSLLLLAAVASSYAA P80' CMLLLIVAGILFILAILTEW
P33' LSLLLLAAVASSYAAAQRKL P81' IVAGILFILAILTEWGSGNR
P34' LAAVASSYAAAQRKLLTPVT P82' LFILAILTEWGSGNRTYGPV
P35' SSYAAAQRKLLTPVTVLTAV P83' ILTEWGSGNRTYGPVFMCLG
P36' AQRKLLTPVTVLTAVVTFFA P84' GSGNRTYGPVFMCLGGLLTM
P37' LTPVTVLTAVVTFFAICLTW P85' FMCLGGLLTMVAGAVWLTVM
P38' VLTAVVTFFAICLTWRIEDP P86' GLLTMVAGAVMLTVMSNTLL
P39' VTFFAICLTWRIEDPPFNSL P87' VAGAVWLTVMSNTLLSAWIL
P40' ICLTWRIEDPPFNSLLFALL P88' WLTVMSNTLLSAWILTAGFL
P41' RIEDPPFNSLLFALLAAAGG P89' SNTLLSAWILTAGFLIFLIG
P42' PFNSLLFALLAAAGGLQGIY P90' SAWILTAGFLIFLIGFALFG
P43' LFALLAAAGGLQGIYVLVML P91' TAGFLIFLIGFALFGVIRCC
P44' AAAGGLQGIYVLVMLVLLIL P92' IFLIGFALFGVIRCCRYCCY
P45' LQGIYVLVMLVLLILAYRRR P93' FALFGVIRCCRYCCYYCLTL
P46' VLVMLVLLILAYRRRWRRLT P94' VIRCCRYCCYYCLTLESEER
P47' VLLILAYRRRWRRLTVCGGI P95' RYCCYYCLTLESEERPPTPY
P48' AYRRRWRRLTVCGGIMFLAC P96' YYCLTLESEERPPTPYRNTV
他の記載(Stottら、2000年)にあるように、PBMCは、新しい血液試料から、密度勾配遠心で分離し、1ml容積中に、1.25×106細胞/mlの濃度で培養した。細胞増殖は、リコールT細胞応答が最大のとき(Plebanskiら、1992年)である抗原刺激5日後に、ウェルから採取した三重の100μlアリコート中での3H-チミジンの取込みから推算した。増殖結果は、三重の試料の平均毎分計数(CPM) +/- SDとして表示するか、または、刺激された培養対無刺激の対照培養の平均CPMの比として表される刺激指数(SI)として表示される。CPM>1000におけるSI>3は、有意の陽性応答を表すものと解釈される(Devereuxら、2000年)。Thサイトカインであるγ-IFN、IL-4、およびIL-10の産生は、培養の刺激5日後に採取した二重の100μlアリコートにおいて、高感度の細胞ELISA(Devereuxら、2000年)を用いて評価した。刺激されていない培養の2倍を越える産生を行ったサイトカイン応答を陽性であるとみなした(Devereuxら、2000年)。
抗原に応答して増殖するか、またはサイトカインを分泌する培養細胞の表現型はフローサイトメトリーで測定した。PBMCのアリコートを、応答性の培養から採取し、抗CD3-フィコエリトリン-テキサスレッド(登録商標)-Xおよび抗CD4-フルオレセインイソチオシアネートで、実験によっては、抗CD25フィコエリトリン-シアニン5.1(すべて、Beckman Coulter)で染色した。増殖培養中の活性化された細胞は、抗CD71-フィコエリトリン(PE)または抗CD69-PE(両方とも、Beckman Coulter)を用いて同定した。IL-10を合成する細胞は、ブレフェルジンA(Sigma)でタンパク質分泌を阻害し、イントラプレップ(商標)(Beckman Coulter)で透過化処理した後に、抗IL-10-PE(Pharmingen)とインキュベートすることによって標識した。染色した細胞は、EPICS XLサイトメータ(Beckman Coulter)および Expo v2分析ソフトウェア(Applied Cytometry Systems)を用いて分析した。
自己PBMCを照射し、その後37℃のPBS中で、10分間、100μMクロロキンとインキュベートした。細胞は、100μMクロロキン存在下のまま、LMP1またはIL-10誘導性LMP1ペプチドで3時間パルスし、その後3回洗浄した。次いでこれらの細胞を、増殖アッセイおよびサイトカインアッセイにおけるAPCの供給源として、106細胞/mlで用いた。
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Claims (55)
- 感染性物質由来の試験ペプチド配列の寛容原性を評価する方法であって、
(i) 細胞集団を前記試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii) 前記細胞集団中でIL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(iii) ステップ(ii)の結果を、前記配列の寛容原性と相関させるステップ
を含み、前記細胞集団が、前記感染性物質に事前に感染しているドナーから得た単核白血球を含む、前記方法。 - 上記細胞集団が少なくとも1つのタイプの抗原提示細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 上記単核白血球が少なくともTリンパ球、Bリンパ球、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、マクロファージまたは樹状細胞を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 上記単核白血球が少なくともCD4+Tリンパ球を含む、請求項3に記載の方法。
- 上記単核白血球がさらに抗原提示細胞の少なくとも1つのタイプを含む、請求項4に記載の方法。
- (i)(a) 上記感染性物質に事前に感染していないドナーから得た類似の細胞集団を、上記試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii)(a) 前記細胞集団中でIL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(ii)(b) ステップ(ii)による結果と、ステップ(ii)(a)による結果を比較するステップ
をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 上記感染性物質がウイルスである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 上記ウイルスがウイルスIL-10相同体をコードするヘルペスウイルスである、請求項7に記載の方法。
- 上記ウイルスがEBVである、請求項8に記載の方法。
- 上記試験ペプチド配列がEBV LMP1タンパク質またはLMP2タンパク質に由来するものである、請求項9に記載の方法。
- 上記試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列が、配列P1〜P75または配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含む、請求項10に記載の方法。
- 感染性物質由来の試験ペプチド配列の、標的抗原に対する寛容原性を評価する方法であって、
(i) 細胞集団を、(a)前記試験ペプチド配列、および(b) 標的抗原と接触させて、試験組成物を生成するステップと、
(ii) 前記試験組成物から得た細胞集団を、前記標的抗原と再接触させるステップと
を含み、前記細胞集団が、前記感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む、前記方法。 - (iii) 上記標的抗原に対する上記細胞集団の応答を評価するステップと、場合により、
(iv) ステップ(iii)の結果を、上記試験ペプチド配列の寛容原性と相関させるステップ
をさらに含む、請求項12に記載の方法。 - ステップ(iii)が細胞増殖の評価、またはIL-4、IL-2、IL-12、もしくはIFN-γの発現の評価を含む、請求項13に記載の方法。
- ステップ(ii)の前に、新たな抗原提示細胞を添加するステップをさらに含む、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 上記細胞集団を、上記試験配列にも、または上記標的抗原にも関係のない確認用抗原と接触させるステップをさらに含む、請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 上記感染性物質がウイルスである、請求項12〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 上記ウイルスがウイルスIL-10相同体をコードするヘルペスウイルスである、請求項17に記載の方法。
- 上記ウイルスがEBVである、請求項18に記載の方法。
- 上記試験ペプチド配列がEBV LMP1タンパク質またはLMP2タンパク質に由来するものである、請求項19に記載の方法。
- 上記試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列が、配列P1〜P75または配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含む、請求項20に記載の方法。
- 試験ペプチド配列の寛容原性を評価する方法であって、
(i) 第1細胞集団を前記試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii) 第2細胞集団を対照ペプチド配列と接触させるステップと、
(iii) 前記細胞集団のそれぞれで、IL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(iv) ステップ(iii)の結果を、前記試験ペプチド配列の寛容原性と相関させるステップと
を含み、前記細胞集団のそれぞれが、感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含み、前記対照ペプチド配列が前記感染性物質に由来するものである、前記方法。 - 上記対照ペプチド配列が上記感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む細胞集団においてIL-10の発現を誘導すると事前に同定されているものである、請求項22に記載の方法。
- 上記第1細胞集団および第2細胞集団が同一のドナーに由来するものである、請求項21または22に記載の方法。
- 上記第1細胞集団および第2細胞集団が対照ペプチドに応答して増殖できるT細胞クローンを含む、請求項24に記載の方法。
- 上記感染性物質がEBVである、請求項22〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 上記対照ペプチドがLMP1またはLMP2に由来するものである、請求項26に記載の方法。
- 上記対照ペプチドが配列P1〜P75および配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含む、請求項27に記載の方法。
- 細胞集団を標的抗原に対して免疫寛容にする方法であって、前記細胞集団を、
(a) 感染性物質由来の寛容原性ペプチド配列と接触させること、または、試験ペプチド配列が前記細胞集団で発現されるように前記試験ペプチド配列をコードする核酸と接触させること、および
(b) 標的抗原と接触させること、または試験ペプチド配列が前記細胞集団で発現されるように前記試験ペプチド配列をコードする核酸と接触させること
を含み、前記細胞集団が、前記感染性物質に対して血清陽性である被験者から得た単核白血球を含む、前記方法。 - 抗原提示細胞集団を、上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原と接触させるステップと、次いで上記細胞集団を前記抗原提示細胞集団と接触させるステップとを含む、請求項29に記載の方法。
- 上記単核白血球を、in vitroで上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原と接触させる、請求項29または30に記載の方法。
- 上記細胞集団またはそのサブセットを、上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原と接触させた後に、上記被験者に再投与する、請求項31に記載の方法。
- 上記抗原提示細胞集団を、in vitroで上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原と接触させ、さらに上記細胞集団を、in vivoで前記抗原提示細胞集団と接触させる、請求項30に記載の方法。
- 上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原を、上記被験者に直接投与する、請求項29に記載の方法。
- 上記感染性物質がウイルスである、請求項29〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 上記ウイルスがウイルスIL-10相同体をコードするヘルペスウイルスである、請求項35に記載の方法。
- 上記ウイルスがEBVである、請求項36に記載の方法。
- 上記寛容原性ペプチド配列がEBV LMP1タンパク質またはLMP2タンパク質に由来するものである、請求項37に記載の方法。
- 上記寛容原性ペプチド配列が、配列P1〜P75または配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含む、請求項38に記載の方法。
- 被験者を標的抗原に対して免疫寛容にするための医薬組成物であって、感染性物質由来の寛容原性ペプチド配列、または感染性物質由来の寛容原性ペプチド配列をコードする核酸を、薬学的に許容される担体との混合物として含む、前記医薬組成物。
- 上記寛容原性ペプチド配列がEBVに由来するものである、請求項40に記載の医薬組成物。
- 上記寛容原性ペプチド配列がLMP1またはLMP2に由来するものである、請求項41に記載の医薬組成物。
- 上記寛容原性ペプチド配列が、ペプチド配列P1〜P75またはペプチド配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含む、請求項42に記載の医薬組成物。
- 上記標的抗原をさらに含む、請求項40〜43のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- EBVに事前に感染した個体に投与するための、請求項41〜44のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 標的抗原に対して指向された免疫応答によって媒介される症状を予防または治療するための医薬の調製における、EBV LMP1、LMP2、またはそれらのフラグメントもしくはミメティクス、あるいはそれらをコードする核酸の使用。
- 標的抗原または標的抗原をコードする核酸との併用投与用に上記医薬を製剤化する、請求項46に記載の使用。
- 上記医薬が、標的抗原または標的抗原をコードする核酸を含む、請求項46または47に記載の使用。
- 上記症状が、1型糖尿病、腹腔疾患、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、血小板減少症、アトピー反応もしくはアレルギー、または治療用製品に対する応答である、請求項46〜48のいずれか1項に記載の使用。
- 上記標的抗原が細胞である、請求項46〜48のいずれか1項に記載の使用。
- 上記細胞が移植用細胞である、請求項50に記載の使用。
- 上記細胞が、寛容原性ペプチド配列をコードする核酸を含む、請求項48と組み合わせた請求項51に記載の使用。
- EBVに事前に感染した個体に投与するために上記医薬を製剤化する、請求項46〜52のいずれか1項に記載の使用。
- P1〜P75、およびP1'〜P96'のいずれか1つの配列を有するペプチド。
- P2、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P20、P22、P23、P24、P25、P26、P27、P29、P30、P32、P34、P35、P39、P68、P71、P72のいずれか1つの配列を有する、請求項54に記載のペプチド。
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