EA045837B1 - Антигенный вариант вируса varicella zoster и его применение - Google Patents
Антигенный вариант вируса varicella zoster и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA045837B1 EA045837B1 EA202092828 EA045837B1 EA 045837 B1 EA045837 B1 EA 045837B1 EA 202092828 EA202092828 EA 202092828 EA 045837 B1 EA045837 B1 EA 045837B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- amino acid
- zoster virus
- varicella zoster
- acid residue
- truncation
- Prior art date
Links
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title claims description 69
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 title claims description 59
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 76
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 41
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 claims description 35
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 29
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 28
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 28
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 claims description 26
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 claims description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 18
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 16
- 101710160102 Outer membrane protein B Proteins 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 60
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 60
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 51
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 18
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 13
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 11
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 206010036376 Postherpetic Neuralgia Diseases 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000131482 Bifidobacterium sp. Species 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 2
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 2
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 2
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 101900123149 Varicella-zoster virus Envelope glycoprotein E Proteins 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 2
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[5-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CC=1OC(=NN=1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-N-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)acetamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)NC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NN=C(O1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 6-[(5S)-5-[[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]methyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C[C@H]1CN(C(O1)=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000186018 Bifidobacterium adolescentis Species 0.000 description 1
- 241000901050 Bifidobacterium animalis subsp. lactis Species 0.000 description 1
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 description 1
- 241000186012 Bifidobacterium breve Species 0.000 description 1
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 1
- 241000186015 Bifidobacterium longum subsp. infantis Species 0.000 description 1
- 206010006784 Burning sensation Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000698776 Duma Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- 244000199885 Lactobacillus bulgaricus Species 0.000 description 1
- 235000013960 Lactobacillus bulgaricus Nutrition 0.000 description 1
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 description 1
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 description 1
- 241001468157 Lactobacillus johnsonii Species 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010037898 Rash vesicular Diseases 0.000 description 1
- 206010038743 Restlessness Diseases 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000720795 Schizosaccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940083268 Toll-like receptor (TLR) antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 229940124863 Varicella-zoster virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940124924 Varivax Drugs 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 229940124925 Zostavax Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000008350 antigen-specific antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 description 1
- 229940004120 bifidobacterium infantis Drugs 0.000 description 1
- 229940009289 bifidobacterium lactis Drugs 0.000 description 1
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027499 body ache Diseases 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003792 cranial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- CGMRCMMOCQYHAD-UHFFFAOYSA-J dicalcium hydroxide phosphate Chemical compound [OH-].[Ca++].[Ca++].[O-]P([O-])([O-])=O CGMRCMMOCQYHAD-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 229940004208 lactobacillus bulgaricus Drugs 0.000 description 1
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 229940001882 lactobacillus reuteri Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- VMPHSYLJUKZBJJ-UHFFFAOYSA-N lauric acid triglyceride Natural products CCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCC VMPHSYLJUKZBJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960003511 macrogol Drugs 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 229940042472 mineral oil Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 208000035824 paresthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Настоящее изобретение относится к антигенному варианту вируса Varicella zoster и его применению, и более конкретно к варианту антигена Varicella zoster, имеющему высокий уровень экспрессии и высокую иммуногенность, который выбран среди антигенных вариантов поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster, и вакцинной композиции для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего герпеса, которая содержит антигенный вариант вируса Varicella zoster в качестве активного ингредиента.
Уровень техники
Вирус Varicella zoster (VZV) представляет собой вирус, который вызывает ветряную оспу, и в основном у детей и подростков. Как только происходит заражение, VZV остается в спящем состоянии в сенсорных корешках и ганглиях черепных нервов в течение нескольких лет, и реактивируется и вызывает опоясывающий лишай уже во взрослом возрасте, когда снижается иммунитет. Ветряная оспа является очень контагиозным заболеванием; и как только происходит заражение, она вызывает появление везикулезной сыпи по всему телу с лихорадкой и недомоганием. У большинства нормальных детей ветряная оспа редко переходит в тяжелое состояние и в конечном итоге переходит в самокупируемое заболевание. Однако известно, что во многих случаях ветряная оспа прогрессирует до тяжелых симптомов, которые возникают у пациентов, перенесших трансплантацию органов или химиотерапию (Adriana Weinberg et al., J. Infectious Diseases, 200(7): 1068, 2009; Judith Breuer et al., Expert Review of Vaccines, 2017, DOI:10.1080/14760584.2017.13948433).
Первоначальные симптомы опоясывающего лишая проявляются в виде ломоты и болей во всем теле, таких как ломота в теле, или ощущение сильного зуда, покалывания и жжения, с сильной болью, как от удара ножом. Опоясывающий лишай представляет заболевание, при котором через несколько дней появляются волдыри, боль усиливается по мере увеличения кожных поражений, и пациенты пожилого возраста, как правило, жалуются на более сильную боль. Даже в случае излечения опоясывающего лишая, невралгия может остаться как последствие инфекции. Известно, что у людей в возрасте 60 лет и старше невралгия может вызывать беспокойный сон, жаловаться на хроническую усталость, вызывать сильную боль даже при легком контакте или трении, или даже вызывать депрессию, хотя такая невралгия бывает относительно редко у взрослых в возрасте 40 лет и моложе.
Репрезентативные профилактические вакцины против ветряной оспы включают такие продукты, как VARIVAX (Merck & Со, Inc.) и VARILRIX (GlaxoSmithKline Biologicals SA), которые были разработаны с использованием штамма Oka, аттенуированного штамма, полученного в 1970 году. В Корее такой продукт, как Suduvax (Green Cross), который был получен с использованием штамма MAV/06, разработанного в 1980 году, является коммерчески доступным. Рассматриваемые коммерчески доступные живые вакцины проявляют в среднем 80% протективную эффективность, означая, что у 20% вакцинированных субъектов заражение может иметь место даже после вакцинации. Постоянно отмечались проблемы со стабильностью, такие как развитие ветряной оспы и опоясывающего лишая, вызванных живыми вирусами, входящими в состав вакцин.
ZOSTAVAX (Merck & Co, Inc.), которая представляет собой живую аттенуированную вакцину, полученную с использованием штамма Ока, была разработана в качестве профилактической вакцины против опоясывающего лишая. Эта вакцина была разрешена к применению и продается в США и Корее при условии, что ее можно использовать для взрослых в возрасте 50 лет и старше, а не для детей или подростков, поскольку в вакцине содержится большое количество вируса. Недавно компания GlaxoSmithKline Biologicals SA разработала вакцину, состоящую из поверхностного вирусного белка (gE) и адъюванта, которая предназначена для взрослых в возрасте 50 лет и старше, и в клинических испытаниях она доказала свою профилактическую эффективность (патент США № 7939084, от 7 января 2011 г.).
На ранних этапах разработки вакцин в качестве антигенов в основном использовались живые аттенуированные клетки или убитые клетки. Однако за счет проблем с безопасностью и наличием иммуносупрессивных соединений в патогенах, разработка таких антигенов смещается в сторону разработки белковых антигенов, которые имеют структуру и состав в чистом виде и могут индуцировать иммунитет, необходимый для защиты от болезней.
Следовательно, авторы настоящего изобретения предприняли интенсивные усилия для разработки белковых антигенов с высоким уровнем экспрессии в клетках-хозяевах, которые могут способствовать повышению продукции, не влияя на иммуногенность, из антигенов поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster. В результате заявители изобретения получили антигенные варианты поверхностного белка вируса Varicella zoster разной длины и оценили уровни их экспрессии, тем самым идентифицируя специфические аминокислотные последовательности с высоким уровнем экспрессии среди антигенных вариантов; и таким образом, осуществили настоящее изобретение.
Описание
Техническая задача
Целью настоящего изобретения является получение специфического антигенного варианта, имеющего высокий уровень экспрессии и высокую иммуногенность, который выбран из антигенных вариантов поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster.
- 1 045837
Другой целью настоящего изобретения является получение гена, кодирующего антигенный вариант, рекомбинантного вектора, содержащего ген, и клетки-хозяина, трансформированной рекомбинантным вектором.
Еще одной целью настоящего изобретения является получение вакцинной композиции для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая, содержащей антигенный вариант в качестве активного ингредиента.
Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая с использованием вакцинной композиции, которая содержит антигенный вариант в качестве активного ингредиента.
Еще одной целью настоящего изобретения является разработка применения вакцинной композиции, которая содержит антигенный вариант в качестве активного ингредиента, для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.
Еще одной целью настоящего изобретения является разработка применения вакцинной композиции, которая содержит антигенный вариант в качестве активного ингредиента, для производства лекарственного средства для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.
Решение технической задачи
Для достижения вышеуказанных целей изобретение относится к антигенному варианту поверхностного белка вируса Varicella zoster, который отличается тем, что антигенный вариант включает вариацию, которая представляет собой собой усечение карбоксиконца от любого аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящий из аминокислотных остатков 525-543 в антигене поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
Кроме того, настоящее изобретение относится к гену, кодирующему антигенный вариант, рекомбинантному вектору, содержащему ген, и клетке-хозяину, трансформированной рекомбинантным вектором.
Кроме того, изобретение относится к вакцинной композиции для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая, содержащей антигенный вариант в качестве активного ингредиента.
Кроме того, изобретение относится к способу профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая с использованием вакцинной композиции, которая содержит антигенный вариант в качестве активного ингредиента.
Кроме того, изобретение относится к применению вакцинной композиции, которая включает антигенный вариант в качестве активного ингредиента, для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.
Кроме того, изобретение относится к применению вакцинной композиции, которая содержит антигенный вариант в качестве активного ингредиента, для производства лекарственного средства для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 схематично показан экспериментальный процесс по настоящему изобретению.
На фиг. 2 показаны аминокислотные последовательности антигенов поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster разной длины.
На фиг. 3 приведены результаты вестерн-блоттинга, проведенного для сравнения уровней экспрессии фрагментов gE, которые являются антигенами вируса Varicella zoster.
На фиг. 4 приведены результаты вестерн-блоттинга, проведенного для сравнения уровней экспрессии поверхностного белкового антигена (GSK gE 546 аа), который входит в состав продукта Shingrix, представляющего вакцину против вируса Varicella zoster производства компании GlaxoSmithKline Biologicals SA, и антигенного варианта (mogam gE 537 аа), полученного заявителями настоящего изобретения.
На фиг. 5 приведены результаты анализа gE-специфического IgG с использованием ELISA, проведенного для сравнения гуморального иммунного ответа на поверхностный белковый антиген (GSK gE 546 аа), который входит в состав продукта Shingrix, представляющего вакцину против вируса Varicella zoster производства компании GlaxoSmithKline Biologicals SA, и антигенного варианта (mogam gE 537 аа), полученного заявителями настоящего изобретения.
На фиг. 6 приведены результаты определения мышиного IFN-γ с использованием ELISA, проведенного для сравнения клеточно-опосредованного иммунного ответа (CMI) на поверхностный белковый антиген (GSK gE 546 аа), который входит в состав продукта Shingrix, представляющего вакцину против вируса Varicella zoster производства компании GlaxoSmithKline Biologicals SA, и антигенного варианта (mogam gE 537 аа), полученного заявителями настоящего изобретения.
На фиг. 7 показаны результаты анализа анти-gE-специфического IgG с использованием ELISA, проведенного для сравнения гуморального иммунного ответа на фрагменты gE, которые являются антигенами вируса Varicella zoster.
На фиг. 8 приведены результаты, полученные при выполнении анализа анти-gE-специфического IgG с использованием ELISA для сравнения гуморального иммунного ответа на фрагменты gE, которые являются антигенами вируса Varicella zoster, с последующим обобщением числа респондеров, которые демонстрируют антигенспецифическую ответную продукцию антител.
- 2 045837
Описание предпочтительного варианта осуществления изобретения
Если не указано иное, то все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистами в области, к которой относится настоящее изобретение. В общем, номенклатура, использованная здесь, хорошо известна и широко используется в данной области.
В настоящем изобретении для разработки антигенов с высоким уровнем экспрессии в клеткаххозяевах, что может способствовать повышению продукции, не влияя на иммуногенность, из белковых антигенов вируса Varicella zoster, был проведен эксперимент, в котором получали антигенные варианты поверхностного белка (gE) различной длины, и затем определяли уровни их экспрессии. В результате было установлено, что среди антигенных вариантов поверхностного белка вируса Varicella zoster, полученных заявителями настоящего изобретения, антигены, представленные специфическими аминокислотными последовательностями, проявляли более высокий уровень экспрессии, чем другие антигены (фиг. 3).
Кроме того, для выбора антигенных вариантов, обладающих высокой иммуногенностью, проводили определение титра антител (фиг. 7) и оценку антигенспецифических респондеров (фиг. 8). В результате было идентифицировано, что антигены от mogam gE 534 аа до gE 540 аа имели более высокую иммуногенность.
Следовательно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к антигенному варианту поверхностного белка вируса Varicella zoster, который включает вариацию, представляющую усечение карбоксиконца от любого аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из аминокислотных остатков 525-543 в антигене поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
В частности, изобретение относится к антигенному варианту поверхностного белка вируса Varicella zoster, отличающемуся тем, что антигенный вариант включает вариацию, выбранную из группы, состоящей из:
a) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 525;
b) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 526;
c) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 527;
d) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 528;
e) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 529;
f) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 530;
g) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 531;
h) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 532;
i) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 533;
j) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 534;
k) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 535;
l) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 536;
m) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 537;
n) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 538;
о) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 539;
р) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 540;
q) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 541;
r) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 542; и
s) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 543.
Антигенный вариант может отличаться тем, что он предпочтительно включает вариацию, выбранную из группы, состоящей из:
j) усечения карбоксиконца от аминокислотного остатка 534;
k) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 535;
l) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 536;
m) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 537;
n) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 538;
о) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 539; и
р) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 540; однако вариация этим не ограничивается.
SEQ Ш NO: 1: mgtvnkpvvg vlmgfgiitg tlritnpvra svlryddfhXl dedkldtnsv yepyyhsdha esswvnrges srkaydhnsp yiwprndydg flenahehhg vynqgrgids gerlmqptqm saqedlgddt gihviptlng ddrhkivnvd qrqygdvfkg dlnpkpqgqr lievsveenh pftlrapiqr iygvrytetw sflpsltctg daapaiqhic Ikhttcfqdv vvdvdcaent kedqlaeisy rfqgkkeadq pwivvntstl fdeleldppe iepgvlkvlr tekqylgvyi wnmrgsdgts tyatflvtwk gdektrnptp avtpqprgae fhmwnyhshv fsvgdtfsla mhlqykihea pfdlllewly vpidptcqpm rlystclyhp napqclshmn sgctftsphl aqrvastvyq ncehadnyta yclgishmep sfglilhdgg ttlkfvdtpe slsglyvfvv yfnghveava ytvvstvdhf vnaieergfp ptagqppatt kpkeitpvnp gtsplX2ryaa wtgglaavvl Iclviflict akrmrvkayr vdkspynqsm yyaglpvddf edsestdtee efgnaiggsh ggssytvyid ktr где X1 представляет собой Т или I, и Х2 представляет собой L или I.
- 3 045837
В настоящем изобретении антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster может отличаться тем, что он представляет собой антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster, состоящий из 534-540 аминокислот, который получен из антигена поверхностного белка вируса Varicella zoster, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, состоящей из 623 аминокислот, или вариацию, которая представляет собой усечение некоторых карбоксиконцевых аминокислотных остатков. Например, как здесь используется, термин вариация, которая представляет собой усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 534 означает, что в направлении от аминоконца (N-конец) к карбоксиконцу (С-конец), аминокислотные остатки с 1 по 534 остаются, а смежные аминокислотные остатки от аминокислотного остатка 535 до карбоксиконца усекаются.
Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения аминокислотный остаток 40 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 представляет собой треонин.
Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения аминокислотный остаток 536 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 представляет собой лейцин.
В настоящем изобретении антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster может отличаться тем, что он представлен любой аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2-8 и SEQ ID NO: 21-23, а именно:
a) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 534;
b) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 535;
c) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 536;
d) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 537;
e) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, которая получена усечением карбоксиконца аминокислотного остатка 538;
f) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 539;
g) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, которая получена усечением карбоксиконца аминокислотного остатка 540;
h) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 525;
i) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 530; или
j) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 543.
Поверхностный белок по настоящему изобретению происходит из гликопротеина, составляющего оболочку вируса Varicella zoster, происходящего из клады 1, и представляет собой пептидный фрагмент (усеченный белок), состоящий из 534-540 аминокислот, который получают усечением части карбоксильного конца.
С учетом биологически эквивалентных аминокислотных вариаций аминокислотная последовательность, использованная в настоящем изобретении, интерпретируется как включающая последовательности, имеющие существенную идентичность с последовательностями SEQ ID NO: 2-8 и SEQ ID NO: 2123. Вышеуказанная существенная идентичность означает, что в случае, когда последовательность по настоящему изобретению, как здесь описано выше, и любая другая последовательность выравниваются для максимального соответствия и выровненные последовательности анализируются с использованием алгоритма, обычно используемого в данной области, то другая последовательность имеет, по меньшей мере, 70% гомологию, более конкретно 80% гомологию, еще более конкретно 90% гомологию и наиболее конкретно 95% гомологию с последовательностью по настоящему изобретению, при этом обладая той же функцией.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения было установлено, что следующий антигенный вариант обладает высокой иммуногенностью:
а) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 534;
b) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 535;
с) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 536;
d) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 537;
е) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 538;
- 4 045837
f) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 539; или
g) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 540.
На ранних этапах разработки вакцин в качестве антигенов в основном использовали живые аттенуированные клетки или убитые клетки. Однако за счет проблем с безопасностью разработка таких антигенов смещается в сторону разработки белковых антигенов, имеющих структуру и состав в чистом виде. Однако белковые антигены обычно проблематичны в том отношении, что они обладают низкой иммуногенностью по сравнению с обычными вакцинами. С точки зрения превосходной стабильности и иммуногенности, а также высокой экспрессии в клетках-хозяевах антигенный вариант по настоящему изобретению можно эффективно использовать в качестве вакцины для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая, вызванных вирусом Varicella zoster.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к гену, кодирующему антигенный вариант, рекомбинантному вектору, содержащий его, и клетке-хозяину, трансформированной рекомбинантным вектором.
В настоящем изобретении ген может отличаться тем, что он представлен любой нуклеотидной последовательностью из SEQ ID NO: 9-15.
В рамках изобретения, термин вектор относится к ДНК конструкции, содержащей последовательность ДНК, которая функционально связана с соответствующей контрольной последовательностью, способной оказывать влияние на экспрессию последовательности ДНК в подходящем хозяине. Вектор может представлять собой плазмиду, фаговую частицу или просто потенциальную геномную вставку. После трансформации в подходящего хозяина вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина или может, в некоторых случаях, интегрировать в геном. В настоящем описании плазмида и вектор иногда используются взаимозаменяемо, поскольку плазмида в настоящее время является наиболее часто используемой формой вектора. Для целей настоящего изобретения предпочтительно использовать плазмидный вектор. Типичные плазмидные векторы, которые можно использовать для этой цели, имеют структуру, включающую (а) ориджин репликации, который обеспечивает эффективную репликацию, так что продуцируется несколько сотен плазмидных векторов на одну клеткухозяина, (b) ген устойчивости к антибиотикам, который обеспечивает селекцию клетки-хозяина, трансформированной плазмидным вектором, и (с) сайт расщепления рестриктазой, который обеспечивает вставку чужеродного фрагмента ДНК. Даже если подходящий сайт расщепления рестриктазой отсутствует в векторе, то использование синтетического олигонуклеотидного адаптера или линкера в соответствии с обычным способом позволяет легко лигировать вектор и чужеродную ДНК.
В рамках изобретения, термин рекомбинантный вектор обычно относится к рекомбинантному носителю, в который вставлен фрагмент гетерологичной ДНК, где рекомбинантный носитель обычно находится в форме фрагмента двухцепочечной ДНК. В данном случае гетерологичная ДНК относится к чужеродной ДНК, которая в природе не встречается в клетке-хозяине. Рекомбинантный вектор, попав в клетку-хозяин, может реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина, так что можно получить несколько копий вектора и (гетерологичной) ДНК, вставленной в него.
После лигирования ген или рекомбинантный вектор трансформируют или трансфектируют в клетку-хозяин. Для трансформации или трансфекции можно использовать несколько типов различных методов, обычно применяемых для введения экзогенной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, и их примеры включают электропорацию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию с DEAE- декстраном и липофекцию.
Как хорошо известно в данной области, для повышения уровня экспрессии трансфектированного гена в клетке-хозяине рассматриваемый ген должен быть операбельно связан с последовательностью транскрипционного и трансляционного контроля экспрессии, которая выполняет свою функцию в выбранном экспрессирующем хозяине.
В рамках изобретения, термин трансформация относится к введению ДНК в хозяина таким образом, чтобы ДНК могла реплицироваться в виде внехромосомного фактора или посредством хромосомной интеграции. Конечно, следует понимать, что не все векторы одинаково функционируют в экспрессии последовательности гена по настоящему изобретению. Аналогично не все хозяева одинаково функционируют по отношению к одной и той же экспрессионной системе. Однако специалисты в данной области могут сделать соответствующий выбор среди различных векторов, контрольных последовательностей экспрессии и хозяев, не выходя за рамки настоящего изобретения, и без чрезмерной экспериментальной нагрузки. Например, вектор должен быть выбран с учетом хозяина, потому что вектор должен реплицироваться в нем. В этом отношении необходимо также учитывать количество копий вектора, его способность регулировать число копий и экспрессию других белков, кодированных вектором.
В настоящем изобретении клетка-хозяин, подлежащая трансформации, предпочтительно выбрана из группы, без ограничения, состоящей из клеток животных, клеток растений, дрожжей, E.coli и клеток насекомых.
В частности, в настоящем изобретении в качестве микроорганизма, используемого в качестве клет- 5 045837 ки-хозяина, подлежащей трансформации, можно использовать любой микроорганизм при условии, что он является нетоксичным или аттенуированным микроорганизмом при применении к живому организму. Их примеры могут включать грамотрицательные бактерии, такие как Е. coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Mycobacterium bovis и Shigella; и грамположительные бактерии, такие как Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Listeria monocytogenes и Streptococcus. Их предпочтительный пример может включать молочнокислые бактерии, которые являются съедобными микроорганизмами. Однако микроорганизм этим не ограничивается.
Молочнокислые бактерии могут включать Lactobacillus sp., Streptococcus sp. и Bifidobacterium sp. Репрезентативные примеры Lactobacillus sp. могут включать Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus bulgaricus и Lactobacillus casei; репрезентативные примеры Streptococcus sp. могут включать термофилы Streptococcus thermophiles; и репрезентативные примеры Bifidobacterium sp. могут включать Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium lactis и Bifidobacterium adolescentis, где Lactobacillus casei являются более предпочтительными. Однако молочнокислые бактерии указанными видами не ограничиваются.
Микроорганизм также может представлять собой эукариотические клетки, включая грибы, такие как Aspergillus sp., дрожжи, такие как Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp. и Neurospora crassa, другие низшие эукариотические клетки и высшие эукариотические клетки, такие как клетки насекомых.
Микроорганизм может происходить от растений или млекопитающих. Их предпочтительные примеры могут включать клетки почки обезьяны (клетки COS-7), клетки NS0, SP2/0, клетки яичника китайского хомячка (СНО), W138, клетки почки новорожденного хомячка (BHK), MDCK, линии миеломных клеток, клетки HuT78 и клетки HEK293, где предпочтительными являются клетки СНО. Однако микроорганизм этим не ограничивается.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антигена вируса Varicella zoster, включающему стадию культивирования клетки-хозяина.
В случае, когда рекомбинантный вектор, способный экспрессировать антиген вируса Varicella zoster, вводится в клетку-хозяин, то антиген можно получить культивированием клетки-хозяина в течение периода, достаточного для обеспечения экспрессии антигена в ней, или, более предпочтительно, в течение периода времени, достаточного для обеспечения секреции антигена в культуральную среду, в которой культивируется клетка-хозяин.
В некоторых случаях экспрессированный антиген можно выделить из клетки-хозяина и очистить до гомогенности. Выделение или очистка антигена может выполняться обычными методами выделения и очистки, используемыми для белков, например хроматографией. Примеры хроматографии могут включать аффинную хроматографию, включая хроматографию на колонке с протеином А или колонке с протеином G, ионообменную хроматографию и гидрофобную хроматографию. Антиген может быть выделен и очищен дополнительным комбинированием фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа и т.п. в дополнение к вышеуказанной хроматографии.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вакцинной композиции для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая, содержащей в качестве активного ингредиента антигенный вариант вируса Varicella zoster.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая с использованием вакцинной композиции, которая содержит в качестве активного ингредиента антигенный вариант вируса Varicella zoster.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению вакцинной композиции, которая содержит в качестве активного ингредиента антигенный вариант вируса Varicella zoster, для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению вакцинной композиции, которая содержит в качестве активного ингредиента антигенный вариант, для производства лекарственного средства для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.
В рамках изобретения, термин профилактика означает подавление развития патологического состояния или заболевания у субъекта, у которого не было диагностировано патологическое состояние или заболевание, и который, вероятно, может иметь такое патологическое состояние или заболевание.
В рамках изобретения, термин лечение означает (а) ингибирование прогрессирования патологического состояния или заболевания или его симптомов; (b) облегчение патологического состояния или заболевания или его симптомов; или (с) устранение патологического состояния или заболевания или его симптомов. Композиция по настоящему изобретению активирует иммунный ответ против вируса Varicella zoster у субъекта, страдающего ветряной оспой или опоясывающим лишаем, которые являются заболеванием, вызванным инфекцией, вызванной вирусом Varicella zoster, тем самым подавляя прогрессирование, устраняя или облегчая симптомы заболевания. Следовательно, композиция по настоящему изобретению сама может представлять собой терапевтическую композицию для лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая или может применяться в качестве терапевтического средства для лечения забо- 6 045837 левания, которую вводят в комбинации с другими фармакологическими ингредиентами.
Таким образом, в настоящем описании термин лечение или терапевтическое средство также включает значение адъювантное лечение или лечебное средство.
В рамках изобретения, термин активный ингредиент относится к вакцинной композиции, достаточной для получения желаемого эффекта, который включает, не ограничиваясь этим, индукцию или усиление иммунного ответа против вируса Varicella zoster у пациента, предупреждение, ослабление или устранение реактивации вируса Varicella zoster у пациента, инфицированного этим вирусом или которому была введена живая вакцина против вируса Varicella zoster, предупреждение опоясывающего лишая (HZ) и/или постгерпетической невралгии (PHN), а также снижение тяжести или продолжительности HZ и/или PHN. Специалисты в данной области понимают, что уровень такого желаемого эффекта может варьироваться.
В рамках изобретения, термин иммунный ответ относится к клеточно-опосредованному (Тклеточному) иммунному ответу и/или ответной продукции антител (В-клетками).
Вакцинная композиция по настоящему изобретению пригодна для профилактики ветряной оспы, и/или HZ, и/или PHN, или уменьшения тяжести или продолжительности ветряной оспы, и/или HZ, и/или PHN в популяциях иммунокомпетентных пациентов и пациентов с ослабленным иммунитетом, которые включают, не ограничиваясь ими, здоровых субъектов и пациентов с ослабленным иммунитетом, которые перенесли трансплантацию гемопоэтических клеток (НСТ) или трансплантацию солидных органов (SOT), ВИЧ-инфицированных пациентов, пациентов с аутоиммунным заболеванием и субъектов с раком крови; субъектов, которые проходят химиотерапию по поводу широкого ряда солидных злокачественных новообразований; и пациентов, которые проходят хроническую иммуносупрессивную терапию по поводу широкого ряда патологических состояний, включая ревматоидный артрит (RA), системную красную волчанку (SLE), болезнь Крона, псориаз и рассеянный склероз.
В настоящем изобретении вакцинная композиция может отличаться тем, что она дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
Вакцинную композицию по настоящему изобретению можно получить в виде разовой лекарственной формы посредством ее формуляции с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или эксципиента в соответствии со способом, который может легко осуществить специалист в области, к которой относится настоящее изобретение, или может быть приготовлена в виде помещения в контейнер с множеством доз. В данном случае лекарственная форма может быть составлена в виде препаратов для перорального введения, таких как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропы и аэрозоли, препаратов для наружного применения, суппозиториев и стерильных растворов для инъекций в соответствии с общепринятыми и используемыми методами. Подходящие составы, известные в данной области, могут представлять собой составы, описанные в монографии Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.
Твердые препараты для перорального введения включают таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы и т.п., и эти твердые препараты получают смешиванием по меньшей мере с одним эксципиентом, таким как крахмал, карбонат кальция, сахароза, лактоза и желатин. В дополнение к простым вспомогательным веществам для твердых препаратов также используются смазывающие вещества, такие как стеарат магния и тальк.
Жидкие препараты для перорального введения включают суспензии, жидкости для перорального введения, эмульсии, сиропы и т.п., и эти жидкие препараты могут содержать различные вспомогательные вещества, такие как смачивающие агенты, подсластители, ароматизаторы и консерванты, в дополнение к воде и вазелиновому маслу, которые представляют обычно используемые простые разбавители.
Препараты для парентерального введения включают стерильные водные растворы, неводные растворители, суспензии, эмульсии, лиофилизированные препараты и суппозитории. В качестве основы для суппозиториев можно использовать витепсол, макрогол, твин 61, какао-масло, лаурин, глицерожелатин и тому подобное.
В настоящем изобретении вакцинная композиция может отличаться тем, что она дополнительно содержит адъювант. Как правило, иммунный ответ не индуцируется эффективно одним белковым антигеном, и таким образом, эффект вакцинной композиции усиливается при смешивании с адъювантом.
В рамках изобретения, термин адъювант относится к веществу, которое неспецифически способствует развитию иммунного ответа на антиген в процессе начальной активации иммунных клеток, включая агент, молекулу и т.п., каждое из которых не является иммуногеном для хозяина и усиливает иммунитет за счет повышения активности клеток иммунной системы (Warren et al., Annu. Rev. Immunol., 4: 369, 1986). Адъювант, используемый в настоящем изобретении, который может усиливать иммунный ответ, можно вводить одновременно с вакцинной композицией или можно вводить последовательно через определенный интервал времени.
Адъювант по настоящему изобретению может отличаться тем, что он выбран, не ограничиваясь этим, из группы, состоящей из гидроксид-фосфата кальция, минерального масла, сквалена, антагониста Toll-подобных рецепторов (TLR), детергента, липосом, сапонина, цитокина и их комбинации.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики забо- 7 045837 левания или расстройства у пациента, включающему стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества вакцинной композиции.
Оптимальную дозу вакцинной композиции по настоящему изобретению можно определить стандартными исследованиями, включающими наблюдение за соответствующим иммунным ответом у субъекта. После первоначальной вакцинации субъект может быть подвергнут одной или более бустериммунизациям через соответствующие интервалы времени.
Подходящая доза вакцинной композиции по настоящему изобретению варьирует в зависимости от таких факторов, как способ формуляции, способ введения, возраст пациента, масса тела, пол, патологическое состояние, диета, время введения, путь введения, скорость выведения и ответная чувствительность, и может быть надлежащим образом определена специалистами в данной области техники с учетом вышеуказанных факторов.
Вакцинную композицию по настоящему изобретению можно вводить путем, обычно используемым в области медицины. Парентеральное введение является предпочтительным, и введение может осуществляться, например, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриартериальным, пероральным, внутрисердечным, интрамедуллярным, интрадуральным, трансдермальным, энтеральным, подкожным, сублингвальным или местным путем. В общем, вакцинная композиция по настоящему изобретению может отличаться тем, что она содержит в качестве активного ингредиента антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster по настоящему изобретению в терапевтически эффективном количестве.
Способ по изобретению
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров. Эти примеры предназначены только для иллюстративных целей, и специалистам в данной области техники будет очевидно, что объем настоящего изобретения не истолковывается как ограничиваемый этими примерами.
Пример 1: получение конструкций поверхностного белка (gE).
Для получения конструкций поверхностного белка (gE) проводили ПЦР для получения желаемых фрагментов gE. Затем каждый из фрагментов gE расщепляли рестриктазой и вставляли в вектор pcDNA3.1. Последовательность фрагмента gE, вставленного в вектор pcDNA3.1, идентифицировали секвенированием. ДНК-вектор pcDNA3.1, содержащий идентифицированную последовательность фрагмента gE, получали с использованием набора midiprep. Аминокислотные последовательности фрагментов поверхностного белка (gE) приведены в табл. 1 ниже.
Таблица 1
| Антигенный вариант VZV gE | Вариация в антигене VZV gE с SEQ Ш NO: 1 | SEQ ГО NO |
| gE 534 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 534 | 2 |
| gE 535 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 535 | 3 |
| gE 536 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 536 | 4 |
| gE 537 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 537 | 5 |
| gE 538 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 538 | 6 |
| gE 539 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 539 | 7 |
| gE 540 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 540 | 8 |
| gE 500 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 500 | 16 |
| gE 505 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 505 | 17 |
| gE 510 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 510 | 18 |
| gE 515 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 515 | 19 |
| gE 520 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 520 | 20 |
| gE 525 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 525 | 21 |
| gE 530 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 530 | 22 |
| gE 543 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 543 | 23 |
| gE 546 аа | Усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 546 | 24 |
Пример 2: транзиентная трансфекция.
Для определения уровней экспрессии фрагментов gE выполняли транзиентную трансфекцию в клетки 293 с использованием липофектамина 3000. В каждую лунку 6-луночного планшета вносили 5x105 клеток и проводили культивирование. Затем, на следующий день, готовили образцы для трансфек
- 8 045837 ции. 0,2 мкг ДНК и 0,4 мкг Р3000 добавляли в пробирку и затем разбавляли 125 мкл среды optiMEM; и 3,75 мкл липофектамина 3000 вносили в другую пробирку и затем разводили 125 мкл среды optiMEM. Разбавленную ДНК переносили в пробирку с равным количеством разведенного липофектамина 3000. Затем пробирку инкубировали при перемешивании при комнатной температуре в течение 10 мин для приготовления смеси ДНК-липофектамин. После завершения инкубации смесь ДНК-липофектамин добавляли в 6-луночный планшет, содержащий клетки 293, и затем проводили культивирование в термостате с СО2 в течение 2 суток. После завершения культивирования получали супернатант, к нему добавляли 4 мкл буфера для образцов, содержащего b-меркаптоэтанол, и затем нагревали при 100°С в течение 5 мин. После нагревания полученный продукт хранили замороженным до проведения вестерн-блоттинга.
Пример 3: вестерн-блоттинг.
Проводили вестерн-блоттинг для сравнения уровней экспрессии фрагментов gE. Проводили электрофорез каждого образца в геле NuPAGE 4-12% Bis-Tris, и затем переносили на PVDF-мембрану. Мембрану блокировали в течение 1 ч 5% обезжиренным молоком, инкубировали с моноклональным антителом к gE (1 мкг/мл) в течение 2 ч, промывали TBST (твин 0,05%), и затем инкубировали в течение 1 ч с козьим антимышиным IgG-HRP, разбавленным 5000х. Инкубированную мембрану промывали TBST и затем проявляли субстратом ECL. Детектирование проводили на приборе Chemidoc. В результате выполнения вестерн-блоттинга, результаты которого приведены на фиг. 3, было обнаружено, что антигены gE 534 аа, gE 537 аа и gE 540 аа демонстрируют более высокий уровень экспрессии.
Пример 4: сравнение по уровню экспрессии с поверхностным белковым антигеном вируса Varicella zoster, входящего в состав вакцины производства GlaxoSmithKline Biologicals SA.
Для сравнения, в отношении уровня экспрессии, поверхностного белкового антигена (GSK gE 546 аа), входящего в состав продукта Shingrix, который в настоящее время является коммерциализированной вакциной против вируса Varicella zoster GlaxoSmithKline Biologicals SA, и антигена (mogam gE 537 аа), полученного заявителями настоящего изобретения, проводили вестерн-блоттинг аналогично тому, как описано в примере 3. Различия между поверхностным белковым антигеном (GSK gE 546 аа), входящим в состав Shingrix производства компании GlaxoSmithKline Biologicals SA, и антигеном (mogam gE 537 аа), полученным заявителями настоящего изобретения, показаны в табл. 2 ниже. В результате выполнения вестерн-блоттинга, результаты которого приведены на фиг. 4, было обнаружено, что антиген, полученный заявителями настоящего изобретения, проявлял более высокий уровень экспрессии, чем поверхностный белковый антиген GlaxoSmithKline Biologicals SA.
Таблица 2
| mogam gE 537 аа | GSK gE 546 аа | |
| Источник | Клада (дикого типа, штамм Dumas) | Клада 3 (дикого типа) |
| аминокислота 40 | Т | I |
| аминокислота 536 | L | I |
| С-концевая | в/м YAAWTGGLA | YAAWTGGLA |
Пример 5: сравнение по иммуногенности с поверхностным белковым антигеном вируса Varicella zoster, входящего в состав вакцины производства GlaxoSmithKline Biologicals SA.
Для сравнения, в отношении иммуногенности, поверхностного белкового антигена (GSK gE 546 аа), входящего в состав продукта Shingrix, который в настоящее время является коммерциализированной вакциной против вируса Varicella zoster GlaxoSmithKline Biologicals SA, и антигена (mogam gE 537 аа), полученного заявителями настоящего изобретения, проводили эксперимент на животных. С учетом того, что у людей в анамнезе бывает ветряная оспа, для имитации ветряной оспы у мышей, самок мышей C57BL/6 подвергали прайм-иммунизации (праймирование LAV) однократной подкожной инъекцией живой аттенуированной вакцины (LAV, 3000 БОЕ). Через 28 суток после праймирования LAV (сутки 0) мышей подвергали вторичной иммунизации внутримышечной инъекцией антигенной композиции mogam gE или GSK gE с адъювантом или без него. Образцы крови отбирали через 42 суток (на сутки 42) после праймирования LAV для оценки гуморального иммунного ответа на gE; и собирали лейкоциты из образцов селезенки через 42 суток (на сутки 42) после праймирования LAV для оценки клеточноопосредованного иммунного ответа (CMI) на gE или VZV. День иммунизации и день отбора образцов крови и селезенки определяли, исходя из дня праймирования LAV, который принимали за сутки 0. Общий экспериментальный метод на животных приведен в табл. 3 ниже.
- 9 045837
Таблица 3
| Группа | Праймиммунизация (праймирование LAV*) | Вторичная иммунизация | День вторичной иммунизации | День отбора образцов крови и селезенки | |
| антиген | адъювант | ||||
| PBS | только PBS | X | X | Сутки 28 | Сутки 42 |
| LAV | LAV | LAV (15000 БОЕ) | X | ||
| gE (GSK) | LAV | gE (5 мкг) | X | ||
| gE (mogam) | LAV | gE (5 мкг) | X | ||
| gE (GSK) + адъювант A | LAV | gE (5 мкг) | Адъювант А | ||
| gE (mogam) + адъювант A | LAV | gE (5 мкг) | Адъювант А |
*Прайм-иммунизация (праймирование LAV): доза 100 мкл/голову. 3000 БОЕ *Вторичная иммунизация: доза 100 мкл/голову
Пример 5-1: сравнение гуморальных иммунных ответов.
После выполнения первичной и вторичной иммунизации проводили твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) для оценки активности gE антиген-специфического IgG. Рекомбинантные белки gE (1 мкг/мл) вносили в планшеты для постановки ELISA и проводили инкубацию в течение ночи при 4°С для обеспечения их покрытия белковыми антигенами. Каждый из покрытых антигеном планшетов для ELISA промывали три раза и затем блокировали фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 2% бычий сывороточный альбумин (BSA), в течение 1 ч. После завершения реакции блокирования с помощью BSA планшет для ELISA промывали. Затем в него добавляли разбавленный образец сыворотки и проводили инкубацию в течение 2 ч. В планшеты добавляли козьи антимышиные IgG, IgG1 или IgG2c антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), и инкубацию проводили в течение 1 ч. После последней инкубации планшет для ELISA промывали и реакцию HRP развивали добавлением 3,3',5,5'тетраметилбензидина (ТМВ, производство KPL), который является субстратом для HRP. Затем добавляли стоп-раствор ТМВ для остановки реакции HRP, и измеряли оптическую плотность (OD) при 450 нм с использованием ридера для микропланшетов ELISA (Spectramax 250, Molecular Device) для определения количества продуцированных антител. В результате, как показано на фиг. 5, было установлено, что G6, содержащий антиген (mogam gE 537 аа), полученный заявителями настоящего изобретения, и адъювант, имел самую высокую интенсивность люминесценции. На основании этих результатов было обнаружено, что самый высокий гуморальный иммунный ответ был индуцирован на G6.
Пример 5-2: сравнение клеточно-опосредованных иммунных ответов.
После выполнения первичной и вторичной иммунизации проводили анализ ELISA IFN-γ для определения секретированного количества IFN-γ, который является репрезентативным цитокином, секретируемым Т-клетками при стимуляции антигеном. Лейкоциты, отобранные у мышей, стимулировали лизатом VZV в течение 3 суток. Затем проводили центрифугирование для получения супернатанта, и супернатант анализировали с помощью набора для определения мышиного IFN-γ ELISA. Захватывающее IFNγ антитело (4 мкг/мл) вносили в планшеты для ELISA и проводили инкубацию в течение ночи при комнатной температуре для обеспечения их покрытия захватывающим IFN-γ антителом. Каждый из покрытых антителами планшетов для ELISA промывали три раза и затем блокировали PBS, содержащим 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), в течение 1 ч. После завершения реакции блокирования с помощью BSA планшет для ELISA промывали. Затем в него добавляли супернатант, полученный после стимуляции лейкоцитов, и проводили инкубацию при комнатной температуре в течение 2 ч. После завершения инкубации планшет для ELISA промывали и проводили инкубацию с биотинилированным антителом для детектирования мышиного IFN-γ (400 нг/мл) при комнатной температуре в течение 2 ч. Проводили промывание, и затем инкубацию со стрептавидином-HRP еще в течение 20 мин. После последней инкубации планшет для ELISA промывали и затем подвергали взаимодействию с раствором субстрата в течение 20 мин при комнатной температуре. В планшет добавляли стоп-раствор для остановки реакции, и затем измеряли оптическую плотность (OD) при 450 нм с использованием ридера для микропланшетов ELISA (Spectramax 250, Molecular Device) для определения количества продуцированного цитокина IFNγ. В результате, как показано на фиг. 6, было установлено, что G6, содержащий антиген (mogam gE 537
- 10 045837 аа), полученный заявителями настоящего изобретения, и адъювант, демонстрировал наибольшее количество цитокина IFN-γ. На основании этих результатов было установлено, что самый высокий клеточноопосредованный иммунный ответ был индуцирован на G6.
Пример 6: идентификация антигенспецифической иммуногенности фрагментов антигена gE.
Пример 6-1: транзиентная трансфекция для продукции антигена.
Для экспрессии фрагментов gE выполняли транзиентную трансфекцию в клетки 293 с использованием набора для трансфекции Expifectamine™ 293. Клетки с титром 2x106 клеток/мл помещали в колбу емкостью на 125 мл и культивировали. Затем, на следующий день проводили трансфекцию. Клетки 293 разводили до объема 25,5 мл с титром 2,9x106 клеток/мл и готовили комплексы для трансфекции. 30 мкг ДНК отбирали в пробирку емкостью 15 мл и доводили до объема 1,5 мл средой Opti-MEM. Таким образом, был приготовлен комплекс 1. 81 мкл реагента ExpiFectamine™ 293 помещали в другую пробирку емкостью 15 мл и доводили до 1,5 мл с помощью среды Opti-MEM. Таким образом, был приготовлен комплекс 2. Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 5 мин. Через 5 мин комплекс 1 переносили в пробирку, содержащую комплекс 2, и перемешивали. Затем пробирку инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин для приготовления комплекса ДНК-липид. После завершения инкубации весь комплекс ДНК-липид помещали в колбу емкостью 125 мл, содержащую клетки 293, и проводили культивирование в термостате. Через 20 ч проводили обработку усилителями. 150 мкл усилителя трансфекции 1 ExpiFectamine™ 293 помещали в пробирку емкостью 1,5 мл и добавляли в нее усилитель трансфекции 2 ExpiFectamine™ 293 до 1,5 мл. Затем полученный продукт добавляли к клеткам 293 и проводили инкубацию в термостате в течение 5 суток. Через 5 суток получали культуральный супернатант, фильтровали через фильтр 0,45 мкм и хранили замороженным до очистки.
Пример 6-2: очистка для получения антигенов.
Культуральный раствор, который хранился в замороженном состоянии, оттаивали, и к культуральному раствору добавляли равное количество PBS. Фильтрацию проводили с использованием фильтра 0,22 мкм, и затем проводили анионообменную хроматографию. К элюату добавляли 5 М NaCl и проводили хроматографию гидрофобных взаимодействий. Элюат, прошедший хроматографию, фильтровали через фильтр 0,22 мкм и хранили замороженным до проведения экспериментов на животных.
Пример 6-3: иммунизация.
Проводили эксперименты на животных для оценки иммуногенности фрагментов антигена gE. Самкам мышей C57BL/6 внутримышечно вводили фрагменты антигена gE с интервалом в 2 недели, и образцы крови отбирали у мышей через 2 недели после вторичной иммунизации. Сыворотки отделяли от собранных образцов крови и хранили замороженными до измерения титра антител.
Пример 6-4: измерение антигенспецифической активности IgG и оценка респондеров.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) проводили для оценки антигенспецифической активности IgG. Поверхностные белки VZV (1 мкг/мл) вносили в планшеты для постановки ELISA, проводили инкубацию в течение ночи при 4°С, и каждый из планшетов для ELISA промывали 3 раза. Затем планшет для ELISA блокировали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), содержащим 2% бычий сывороточный альбумин (BSA), в течение 1 ч. Планшет для ELISA промывали. Затем в планшет добавляли разбавленный образец сыворотки и проводили инкубацию в течение 2 ч. В планшет добавляли козьи антитела против мышиного IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), и проводили инкубацию в течение 1 ч. После последней инкубации планшет для ELISA промывали и реакцию HRP развивали добавлением 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом. Затем в планшет для ELISA добавляли стоп-раствор для остановки реакции HRP, и измеряли оптическую плотность (OD) с использованием спектрометра при 450 нм.
Для определения различий в антигенспецифической иммуногенности, индуцированной последовательностями фрагментов антигена gE, животных иммунизировали, как описано в примере 6-3. Титр антигенспецифических антител измеряли с использованием сывороток, полученных в экспериментах на животных, в соответствии с вышеописанным методом измерения титра антител. В результате, как показано на фиг. 7, значение OD после иммунизации gE 534 аа или gE 543 аа было выше, чем значение OD после иммунизации gE 500 аа, gE 510 аа, gE 525 аа или gE 546 аа.
После измерения титра антител особи со значением OD 0,6 или выше считались респондерами, и результаты обобщали. В результате отсутствовал антигенспецифический респондер на gE 500 аа, и количество респондеров после иммунизации gE 510 аа было таким же, как после иммунизации gE 546 аа. Число респондеров после иммунизации gE 525 аа, gE 534 аа, gE 537 аа или gE 540 аа было выше, чем количество респондеров после иммунизации gE 510 аа или gE 546 аа. То есть, было установлено, что для фрагментов от gE 525 аа до gE 540 аа проявляется большее количество респондеров (фиг. 8).
В результате, фрагменты от gE 534 аа до gE 543 аа показали более высокие значения при измерении титра антител, и фрагменты от gE 525 аа до gE 540 аа показали более высокие значения у антигенспецифических респондеров. Следовательно, в случае, когда два вышеуказанных результата объединяются, то можно определить, что gE 534 аа - 540 аа демонстрируют более высокую иммуногенность.
- 11 045837
Промышленная применимость
Антигенный вариант поверхностного белка (gE) вируса ветряной оспы по настоящему изобретению представляет собой собой белковый антиген. В случае применения в качестве вакцинной композиции антигенный вариант демонстрирует превосходную безопасность и высокий уровень экспрессии в клетках-хозяевах по сравнению с живой противовирусной вакциной. Таким образом, данный антигенный вариант пригоден в качестве вакцины для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая, вызванных вирусом Varicella zoster.
Как указано выше, конкретные части настоящего изобретения были описаны подробно. Однако специалистам в данной области техники должно быть понятно, что такое конкретное описание предназначено только для иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления, и объем настоящего изобретения этим не ограничивается. Следовательно, фактический объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
Свободный текст перечня последовательностей:
прилагаемый электронный файл.
Claims (12)
1. Антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster, который включает вариацию, которая представляет собой усечение карбоксиконца от любого аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из аминокислотных остатков 525-536, 538 и 540-543 антигена поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
2. Антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster по п.1, где аминокислотный остаток 40 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 представляет собой треонин.
3. Антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster по п.1, где аминокислотный остаток 536 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 представляет собой лейцин.
4. Антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster по п.1, где антигенный вариант представлен любой аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2-4, 6 и 8 и SEQ ID NO: 21-23.
5. Ген, кодирующий антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster по любому из пп.1-4.
6. Ген по п.5, где ген представлен любой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9-11, 13 и 15.
7. Рекомбинантный вектор, содержащий ген по п.5.
8. Клетка-хозяин, трансформированная рекомбинантным вектором по п.7.
9. Вакцинная композиция для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая, содержащая в качестве активного ингредиента антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster, который включает вариацию, которая представляет собой усечение карбоксиконца от любого аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из аминокислотных остатков 525-543 антигена поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, причем поверхностный белок вируса Varicella zoster происходит из гликопротеина, составляющего оболочку вируса Varicella zoster, происходящего из клады 1.
10. Способ профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая, включающий стадию введения пациенту вакцинной композиции по п.9.
11. Применение вакцинной композиции по п.9 для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.
12. Применение вакцинной композиции по п.9 для получения лекарственного средства для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2018-0058219 | 2018-05-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045837B1 true EA045837B1 (ru) | 2023-12-29 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11642408B2 (en) | Antigen variant of Varicella Zoster virus and use thereof | |
| CN110035772B (zh) | 水痘带状疱疹病毒疫苗 | |
| Handman et al. | Protective vaccination with promastigote surface antigen 2 from Leishmania major is mediated by a TH1 type of immune response | |
| CN102666575B (zh) | 分枝杆菌疫苗 | |
| US20060121052A1 (en) | Recombinant vaccine from gE, gI, and gB proteins of the varicella-zoster virus for the treatment and prevention of multiple sclerosis | |
| US20240226291A9 (en) | Combination of novel vaccines against zika virus and dna antibody constructs for use against zika virus | |
| US20230330214A1 (en) | Improved dna vaccine for sars-cov-2 | |
| KR102075393B1 (ko) | 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물 | |
| EP2104512A2 (en) | Streptococcus proteins, and their use in vaccination | |
| CN108503696B (zh) | 一种酵母细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗 | |
| US20230136602A1 (en) | Use of the Salmonella SPP Type III Secretion Proteins as a Protective Vaccination | |
| CN108503697B (zh) | 一种果蝇细胞表达的寨卡病毒亚单位疫苗 | |
| EA045837B1 (ru) | Антигенный вариант вируса varicella zoster и его применение | |
| KR20200046059A (ko) | 그룹 a 스트렙토코쿠스에 대한 면역원성 펩티드 | |
| US9950053B2 (en) | Use of the Salmonella SPP type III secretion proteins as a protective vaccination | |
| JP2002524469A (ja) | ワクチンアジュバントとしてのコレラ毒素ｂまたは腸毒素ｂのペプチドフラグメント | |
| TWI843471B (zh) | 含抗原和dna之組成物及其用途 | |
| US9446112B2 (en) | Clostridium difficile DNA vaccine | |
| KR20220139810A (ko) | 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 감염 질환 예방용 중화능 개량 백신 조성물 | |
| AU2023224417A1 (en) | Rhinovirus vaccine |