EA045837B1 - ANTIGENIC VARIANT OF VARICELLA ZOSTER VIRUS AND ITS APPLICATION - Google Patents
ANTIGENIC VARIANT OF VARICELLA ZOSTER VIRUS AND ITS APPLICATION Download PDFInfo
- Publication number
- EA045837B1 EA045837B1 EA202092828 EA045837B1 EA 045837 B1 EA045837 B1 EA 045837B1 EA 202092828 EA202092828 EA 202092828 EA 045837 B1 EA045837 B1 EA 045837B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- amino acid
- zoster virus
- varicella zoster
- acid residue
- truncation
- Prior art date
Links
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title claims description 69
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 title claims description 59
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 76
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 41
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 claims description 35
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 29
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 28
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 28
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 claims description 26
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 claims description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 18
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 16
- 101710160102 Outer membrane protein B Proteins 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 60
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 60
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 51
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 18
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 13
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 11
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 206010036376 Postherpetic Neuralgia Diseases 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000131482 Bifidobacterium sp. Species 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 2
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 2
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 2
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 241000194022 Streptococcus sp. Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 101900123149 Varicella-zoster virus Envelope glycoprotein E Proteins 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 2
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[5-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CC=1OC(=NN=1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-N-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)acetamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)NC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NN=C(O1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 6-[(5S)-5-[[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]methyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C[C@H]1CN(C(O1)=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000186018 Bifidobacterium adolescentis Species 0.000 description 1
- 241000901050 Bifidobacterium animalis subsp. lactis Species 0.000 description 1
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 description 1
- 241000186012 Bifidobacterium breve Species 0.000 description 1
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 1
- 241000186015 Bifidobacterium longum subsp. infantis Species 0.000 description 1
- 206010006784 Burning sensation Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000698776 Duma Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- 244000199885 Lactobacillus bulgaricus Species 0.000 description 1
- 235000013960 Lactobacillus bulgaricus Nutrition 0.000 description 1
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 description 1
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 description 1
- 241001468157 Lactobacillus johnsonii Species 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010037898 Rash vesicular Diseases 0.000 description 1
- 206010038743 Restlessness Diseases 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000720795 Schizosaccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940083268 Toll-like receptor (TLR) antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 229940124863 Varicella-zoster virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940124924 Varivax Drugs 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 229940124925 Zostavax Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000008350 antigen-specific antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 description 1
- 229940004120 bifidobacterium infantis Drugs 0.000 description 1
- 229940009289 bifidobacterium lactis Drugs 0.000 description 1
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027499 body ache Diseases 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003792 cranial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- CGMRCMMOCQYHAD-UHFFFAOYSA-J dicalcium hydroxide phosphate Chemical compound [OH-].[Ca++].[Ca++].[O-]P([O-])([O-])=O CGMRCMMOCQYHAD-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 229940004208 lactobacillus bulgaricus Drugs 0.000 description 1
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 229940001882 lactobacillus reuteri Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- VMPHSYLJUKZBJJ-UHFFFAOYSA-N lauric acid triglyceride Natural products CCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCC VMPHSYLJUKZBJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960003511 macrogol Drugs 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 229940042472 mineral oil Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 208000035824 paresthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Настоящее изобретение относится к антигенному варианту вируса Varicella zoster и его применению, и более конкретно к варианту антигена Varicella zoster, имеющему высокий уровень экспрессии и высокую иммуногенность, который выбран среди антигенных вариантов поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster, и вакцинной композиции для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего герпеса, которая содержит антигенный вариант вируса Varicella zoster в качестве активного ингредиента.The present invention relates to an antigenic variant of the Varicella zoster virus and its use, and more particularly to a variant of the Varicella zoster antigen having a high level of expression and high immunogenicity, which is selected from antigenic variants of the surface protein (gE) of the Varicella zoster virus, and a vaccine composition for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster, which contains an antigenic variant of the Varicella zoster virus as an active ingredient.
Уровень техникиState of the art
Вирус Varicella zoster (VZV) представляет собой вирус, который вызывает ветряную оспу, и в основном у детей и подростков. Как только происходит заражение, VZV остается в спящем состоянии в сенсорных корешках и ганглиях черепных нервов в течение нескольких лет, и реактивируется и вызывает опоясывающий лишай уже во взрослом возрасте, когда снижается иммунитет. Ветряная оспа является очень контагиозным заболеванием; и как только происходит заражение, она вызывает появление везикулезной сыпи по всему телу с лихорадкой и недомоганием. У большинства нормальных детей ветряная оспа редко переходит в тяжелое состояние и в конечном итоге переходит в самокупируемое заболевание. Однако известно, что во многих случаях ветряная оспа прогрессирует до тяжелых симптомов, которые возникают у пациентов, перенесших трансплантацию органов или химиотерапию (Adriana Weinberg et al., J. Infectious Diseases, 200(7): 1068, 2009; Judith Breuer et al., Expert Review of Vaccines, 2017, DOI:10.1080/14760584.2017.13948433).Varicella zoster virus (VZV) is a virus that causes chickenpox, primarily in children and adolescents. Once infection occurs, VZV remains dormant in sensory roots and cranial nerve ganglia for several years, and is reactivated to cause herpes zoster in adulthood when immunity declines. Chickenpox is a highly contagious disease; and once infection occurs, it causes a vesicular rash to appear over the entire body, with fever and malaise. In most normal children, chickenpox rarely becomes severe and eventually becomes a self-limiting disease. However, it is known that in many cases, chickenpox progresses to severe symptoms that occur in patients undergoing organ transplantation or chemotherapy (Adriana Weinberg et al., J. Infectious Diseases, 200(7): 1068, 2009; Judith Breuer et al. , Expert Review of Vaccines, 2017, DOI:10.1080/14760584.2017.13948433).
Первоначальные симптомы опоясывающего лишая проявляются в виде ломоты и болей во всем теле, таких как ломота в теле, или ощущение сильного зуда, покалывания и жжения, с сильной болью, как от удара ножом. Опоясывающий лишай представляет заболевание, при котором через несколько дней появляются волдыри, боль усиливается по мере увеличения кожных поражений, и пациенты пожилого возраста, как правило, жалуются на более сильную боль. Даже в случае излечения опоясывающего лишая, невралгия может остаться как последствие инфекции. Известно, что у людей в возрасте 60 лет и старше невралгия может вызывать беспокойный сон, жаловаться на хроническую усталость, вызывать сильную боль даже при легком контакте или трении, или даже вызывать депрессию, хотя такая невралгия бывает относительно редко у взрослых в возрасте 40 лет и моложе.The initial symptoms of shingles include aches and pains throughout the body, such as body aches or intense itching, tingling and burning sensations, with severe pain like being stabbed. Shingles is a disease in which blisters appear after a few days, the pain increases as the skin lesions enlarge, and older patients tend to complain of more severe pain. Even if shingles is cured, neuralgia may remain as a consequence of the infection. It is known that in people aged 60 years and older, neuralgia can cause restless sleep, complain of chronic fatigue, cause severe pain even with light contact or friction, or even cause depression, although such neuralgia is relatively rare in adults aged 40 years and over. younger.
Репрезентативные профилактические вакцины против ветряной оспы включают такие продукты, как VARIVAX (Merck & Со, Inc.) и VARILRIX (GlaxoSmithKline Biologicals SA), которые были разработаны с использованием штамма Oka, аттенуированного штамма, полученного в 1970 году. В Корее такой продукт, как Suduvax (Green Cross), который был получен с использованием штамма MAV/06, разработанного в 1980 году, является коммерчески доступным. Рассматриваемые коммерчески доступные живые вакцины проявляют в среднем 80% протективную эффективность, означая, что у 20% вакцинированных субъектов заражение может иметь место даже после вакцинации. Постоянно отмечались проблемы со стабильностью, такие как развитие ветряной оспы и опоясывающего лишая, вызванных живыми вирусами, входящими в состав вакцин.Representative prophylactic vaccines against varicella include products such as VARIVAX (Merck & Co, Inc.) and VARILRIX (GlaxoSmithKline Biologicals SA), which were developed using the Oka strain, an attenuated strain obtained in 1970. In Korea, a product such as Suduvax (Green Cross), which was derived from the MAV/06 strain developed in 1980, is commercially available. The commercially available live vaccines in question exhibit an average of 80% protective efficacy, meaning that 20% of vaccinated subjects may still become infected even after vaccination. There have been persistent problems with stability, such as the development of chickenpox and shingles caused by live viruses contained in vaccines.
ZOSTAVAX (Merck & Co, Inc.), которая представляет собой живую аттенуированную вакцину, полученную с использованием штамма Ока, была разработана в качестве профилактической вакцины против опоясывающего лишая. Эта вакцина была разрешена к применению и продается в США и Корее при условии, что ее можно использовать для взрослых в возрасте 50 лет и старше, а не для детей или подростков, поскольку в вакцине содержится большое количество вируса. Недавно компания GlaxoSmithKline Biologicals SA разработала вакцину, состоящую из поверхностного вирусного белка (gE) и адъюванта, которая предназначена для взрослых в возрасте 50 лет и старше, и в клинических испытаниях она доказала свою профилактическую эффективность (патент США № 7939084, от 7 января 2011 г.).ZOSTAVAX (Merck & Co, Inc.), which is a live attenuated vaccine produced using the Oka strain, was developed as a preventive vaccine against herpes zoster. This vaccine has been approved and sold in the United States and Korea under the condition that it can be used in adults aged 50 years and older and not in children or teenagers because the vaccine contains large amounts of virus. GlaxoSmithKline Biologicals SA recently developed a gE and adjuvant vaccine for adults aged 50 years and older that has been shown to be prophylactic in clinical trials (US Patent No. 7,939,084, January 7, 2011). .).
На ранних этапах разработки вакцин в качестве антигенов в основном использовались живые аттенуированные клетки или убитые клетки. Однако за счет проблем с безопасностью и наличием иммуносупрессивных соединений в патогенах, разработка таких антигенов смещается в сторону разработки белковых антигенов, которые имеют структуру и состав в чистом виде и могут индуцировать иммунитет, необходимый для защиты от болезней.In the early stages of vaccine development, live attenuated cells or killed cells were mainly used as antigens. However, due to safety concerns and the presence of immunosuppressive compounds in pathogens, the development of such antigens is shifting towards the development of protein antigens that have the structure and composition in their pure form and can induce immunity necessary for protection against disease.
Следовательно, авторы настоящего изобретения предприняли интенсивные усилия для разработки белковых антигенов с высоким уровнем экспрессии в клетках-хозяевах, которые могут способствовать повышению продукции, не влияя на иммуногенность, из антигенов поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster. В результате заявители изобретения получили антигенные варианты поверхностного белка вируса Varicella zoster разной длины и оценили уровни их экспрессии, тем самым идентифицируя специфические аминокислотные последовательности с высоким уровнем экспрессии среди антигенных вариантов; и таким образом, осуществили настоящее изобретение.Therefore, the inventors of the present invention have made intensive efforts to develop protein antigens with high levels of expression in host cells that can enhance the production, without affecting the immunogenicity, of surface protein (gE) antigens of the Varicella zoster virus. As a result, the inventors obtained antigenic variants of the surface protein of the Varicella zoster virus of different lengths and assessed their expression levels, thereby identifying specific amino acid sequences with high levels of expression among the antigenic variants; and thus carried out the present invention.
ОписаниеDescription
Техническая задачаTechnical problem
Целью настоящего изобретения является получение специфического антигенного варианта, имеющего высокий уровень экспрессии и высокую иммуногенность, который выбран из антигенных вариантов поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster.The purpose of the present invention is to obtain a specific antigenic variant having a high level of expression and high immunogenicity, which is selected from the antigenic variants of the surface protein (gE) of the Varicella zoster virus.
- 1 045837- 1 045837
Другой целью настоящего изобретения является получение гена, кодирующего антигенный вариант, рекомбинантного вектора, содержащего ген, и клетки-хозяина, трансформированной рекомбинантным вектором.Another object of the present invention is to provide a gene encoding an antigenic variant, a recombinant vector containing the gene, and a host cell transformed with the recombinant vector.
Еще одной целью настоящего изобретения является получение вакцинной композиции для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая, содержащей антигенный вариант в качестве активного ингредиента.Another object of the present invention is to provide a vaccine composition for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster containing an antigenic variant as an active ingredient.
Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая с использованием вакцинной композиции, которая содержит антигенный вариант в качестве активного ингредиента.Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating chickenpox or herpes zoster using a vaccine composition that contains an antigenic variant as an active ingredient.
Еще одной целью настоящего изобретения является разработка применения вакцинной композиции, которая содержит антигенный вариант в качестве активного ингредиента, для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.Another object of the present invention is to provide the use of a vaccine composition that contains an antigenic variant as an active ingredient for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster.
Еще одной целью настоящего изобретения является разработка применения вакцинной композиции, которая содержит антигенный вариант в качестве активного ингредиента, для производства лекарственного средства для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.Another object of the present invention is to provide the use of a vaccine composition that contains an antigenic variant as an active ingredient for the production of a medicament for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster.
Решение технической задачиSolving a technical problem
Для достижения вышеуказанных целей изобретение относится к антигенному варианту поверхностного белка вируса Varicella zoster, который отличается тем, что антигенный вариант включает вариацию, которая представляет собой собой усечение карбоксиконца от любого аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящий из аминокислотных остатков 525-543 в антигене поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.To achieve the above objectives, the invention relates to an antigenic variant of the surface protein of the Varicella zoster virus, which is characterized in that the antigenic variant includes a variation that is a carboxy-terminal truncation from any amino acid residue selected from the group consisting of amino acid residues 525-543 in the surface antigen protein (gE) of the Varicella zoster virus, represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
Кроме того, настоящее изобретение относится к гену, кодирующему антигенный вариант, рекомбинантному вектору, содержащему ген, и клетке-хозяину, трансформированной рекомбинантным вектором.In addition, the present invention relates to a gene encoding an antigenic variant, a recombinant vector containing the gene, and a host cell transformed with the recombinant vector.
Кроме того, изобретение относится к вакцинной композиции для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая, содержащей антигенный вариант в качестве активного ингредиента.In addition, the invention relates to a vaccine composition for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster, containing an antigenic variant as an active ingredient.
Кроме того, изобретение относится к способу профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая с использованием вакцинной композиции, которая содержит антигенный вариант в качестве активного ингредиента.In addition, the invention relates to a method for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster using a vaccine composition that contains an antigenic variant as an active ingredient.
Кроме того, изобретение относится к применению вакцинной композиции, которая включает антигенный вариант в качестве активного ингредиента, для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.The invention further relates to the use of a vaccine composition that includes an antigenic variant as an active ingredient for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster.
Кроме того, изобретение относится к применению вакцинной композиции, которая содержит антигенный вариант в качестве активного ингредиента, для производства лекарственного средства для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.The invention further relates to the use of a vaccine composition that contains an antigenic variant as an active ingredient for the production of a medicament for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
На фиг. 1 схематично показан экспериментальный процесс по настоящему изобретению.In fig. 1 is a schematic diagram of the experimental process of the present invention.
На фиг. 2 показаны аминокислотные последовательности антигенов поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster разной длины.In fig. Figure 2 shows the amino acid sequences of surface protein antigens (gE) of the Varicella zoster virus of different lengths.
На фиг. 3 приведены результаты вестерн-блоттинга, проведенного для сравнения уровней экспрессии фрагментов gE, которые являются антигенами вируса Varicella zoster.In fig. Figure 3 shows the results of Western blotting performed to compare the expression levels of gE fragments, which are antigens of the Varicella zoster virus.
На фиг. 4 приведены результаты вестерн-блоттинга, проведенного для сравнения уровней экспрессии поверхностного белкового антигена (GSK gE 546 аа), который входит в состав продукта Shingrix, представляющего вакцину против вируса Varicella zoster производства компании GlaxoSmithKline Biologicals SA, и антигенного варианта (mogam gE 537 аа), полученного заявителями настоящего изобретения.In fig. Figure 4 shows the results of Western blotting performed to compare the expression levels of the surface protein antigen (GSK gE 546 aa), which is part of the Shingrix product, which is a vaccine against the Varicella zoster virus manufactured by GlaxoSmithKline Biologicals SA, and the antigenic variant (mogam gE 537 aa) obtained by the applicants of the present invention.
На фиг. 5 приведены результаты анализа gE-специфического IgG с использованием ELISA, проведенного для сравнения гуморального иммунного ответа на поверхностный белковый антиген (GSK gE 546 аа), который входит в состав продукта Shingrix, представляющего вакцину против вируса Varicella zoster производства компании GlaxoSmithKline Biologicals SA, и антигенного варианта (mogam gE 537 аа), полученного заявителями настоящего изобретения.In fig. Figure 5 shows the results of a gE-specific IgG ELISA analysis performed to compare the humoral immune response to the surface protein antigen (GSK gE 546 aa), which is part of the Shingrix product, a vaccine against the Varicella zoster virus manufactured by GlaxoSmithKline Biologicals SA, and the antigen variant (mogam gE 537 aa) obtained by the applicants of the present invention.
На фиг. 6 приведены результаты определения мышиного IFN-γ с использованием ELISA, проведенного для сравнения клеточно-опосредованного иммунного ответа (CMI) на поверхностный белковый антиген (GSK gE 546 аа), который входит в состав продукта Shingrix, представляющего вакцину против вируса Varicella zoster производства компании GlaxoSmithKline Biologicals SA, и антигенного варианта (mogam gE 537 аа), полученного заявителями настоящего изобретения.In fig. Figure 6 shows the results of murine IFN-γ using ELISA, conducted to compare the cell-mediated immune response (CMI) to the surface protein antigen (GSK gE 546 aa), which is part of the Shingrix product, which is a vaccine against Varicella zoster virus manufactured by GlaxoSmithKline Biologicals SA, and an antigenic variant (mogam gE 537 aa) obtained by the applicants of the present invention.
На фиг. 7 показаны результаты анализа анти-gE-специфического IgG с использованием ELISA, проведенного для сравнения гуморального иммунного ответа на фрагменты gE, которые являются антигенами вируса Varicella zoster.In fig. 7 shows the results of an anti-gE-specific IgG ELISA assay performed to compare the humoral immune response to gE fragments that are Varicella zoster virus antigens.
На фиг. 8 приведены результаты, полученные при выполнении анализа анти-gE-специфического IgG с использованием ELISA для сравнения гуморального иммунного ответа на фрагменты gE, которые являются антигенами вируса Varicella zoster, с последующим обобщением числа респондеров, которые демонстрируют антигенспецифическую ответную продукцию антител.In fig. 8 shows the results obtained by performing an anti-gE-specific IgG assay using an ELISA to compare the humoral immune response to gE fragments that are Varicella zoster virus antigens, followed by a summary of the number of responders that exhibit antigen-specific antibody responses.
- 2 045837- 2 045837
Описание предпочтительного варианта осуществления изобретенияDescription of the Preferred Embodiment of the Invention
Если не указано иное, то все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистами в области, к которой относится настоящее изобретение. В общем, номенклатура, использованная здесь, хорошо известна и широко используется в данной области.Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by those skilled in the art to which the present invention relates. In general, the nomenclature used here is well known and widely used in the art.
В настоящем изобретении для разработки антигенов с высоким уровнем экспрессии в клеткаххозяевах, что может способствовать повышению продукции, не влияя на иммуногенность, из белковых антигенов вируса Varicella zoster, был проведен эксперимент, в котором получали антигенные варианты поверхностного белка (gE) различной длины, и затем определяли уровни их экспрессии. В результате было установлено, что среди антигенных вариантов поверхностного белка вируса Varicella zoster, полученных заявителями настоящего изобретения, антигены, представленные специфическими аминокислотными последовательностями, проявляли более высокий уровень экспрессии, чем другие антигены (фиг. 3).In the present invention, to develop antigens with high levels of expression in host cells, which can enhance the production, without affecting immunogenicity, from Varicella zoster virus protein antigens, an experiment was conducted in which antigenic variants of the surface protein (gE) of various lengths were obtained, and then their expression levels were determined. As a result, it was found that among the antigenic variants of the surface protein of the Varicella zoster virus obtained by the applicants of the present invention, antigens represented by specific amino acid sequences exhibited a higher level of expression than other antigens (Fig. 3).
Кроме того, для выбора антигенных вариантов, обладающих высокой иммуногенностью, проводили определение титра антител (фиг. 7) и оценку антигенспецифических респондеров (фиг. 8). В результате было идентифицировано, что антигены от mogam gE 534 аа до gE 540 аа имели более высокую иммуногенность.In addition, to select antigenic variants that are highly immunogenic, antibody titers were determined (Fig. 7) and antigen-specific responders were assessed (Fig. 8). As a result, it was identified that antigens from mogam gE 534 aa to gE 540 aa had higher immunogenicity.
Следовательно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к антигенному варианту поверхностного белка вируса Varicella zoster, который включает вариацию, представляющую усечение карбоксиконца от любого аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из аминокислотных остатков 525-543 в антигене поверхностного белка (gE) вируса Varicella zoster, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.Therefore, in one aspect, the present invention relates to an antigenic variant of the surface protein of Varicella zoster virus, which includes a variation representing a truncation of the carboxy terminus from any amino acid residue selected from the group consisting of amino acid residues 525-543 in the surface protein antigen (gE) of Varicella zoster virus , represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
В частности, изобретение относится к антигенному варианту поверхностного белка вируса Varicella zoster, отличающемуся тем, что антигенный вариант включает вариацию, выбранную из группы, состоящей из:In particular, the invention relates to an antigenic variant of the surface protein of the Varicella zoster virus, characterized in that the antigenic variant includes a variation selected from the group consisting of:
a) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 525;a) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 525;
b) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 526;b) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 526;
c) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 527;c) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 527;
d) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 528;d) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 528;
e) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 529;e) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 529;
f) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 530;f) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 530;
g) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 531;g) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 531;
h) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 532;h) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 532;
i) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 533;i) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 533;
j) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 534;j) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 534;
k) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 535;k) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 535;
l) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 536;l) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 536;
m) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 537;m) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 537;
n) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 538;n) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 538;
о) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 539;o) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 539;
р) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 540;p) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 540;
q) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 541;q) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 541;
r) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 542; иr) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 542; And
s) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 543.s) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 543.
Антигенный вариант может отличаться тем, что он предпочтительно включает вариацию, выбранную из группы, состоящей из:The antigenic variant may be distinguished in that it preferably includes a variation selected from the group consisting of:
j) усечения карбоксиконца от аминокислотного остатка 534;j) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 534;
k) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 535;k) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 535;
l) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 536;l) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 536;
m) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 537;m) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 537;
n) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 538;n) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 538;
о) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 539; иo) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 539; And
р) усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 540; однако вариация этим не ограничивается.p) truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 540; however, the variation does not stop there.
SEQ Ш NO: 1: mgtvnkpvvg vlmgfgiitg tlritnpvra svlryddfhXl dedkldtnsv yepyyhsdha esswvnrges srkaydhnsp yiwprndydg flenahehhg vynqgrgids gerlmqptqm saqedlgddt gihviptlng ddrhkivnvd qrqygdvfkg dlnpkpqgqr lievsveenh pftlrapiqr iygvrytetw sflpsltctg daapaiqhic Ikhttcfqdv vvdvdcaent kedqlaeisy rfqgkkeadq pwivvntstl fdeleldppe iepgvlkvlr tekqylgvyi wnmrgsdgts tyatflvtwk gdektrnptp avtpqprgae fhmwnyhshv fsvgdtfsla mhlqykihea pfdlllewly vpidptcqpm rlystclyhp napqclshmn sgctftsphl aqrvastvyq ncehadnyta yclgishmep sfglilhdgg ttlkfvdtpe slsglyvfvv yfnghveava ytvvstvdhf vnaieergfp ptagqppatt kpkeitpvnp gtsplX2ryaa wtgglaavvl Iclviflict akrmrvkayr vdkspynqsm yyaglpvddf edsestdtee efgnaiggsh ggssytvyid ktr где X1 представляет собой Т или I, и Х2 представляет собой L или I.SEQ Ш NO: 1: mgtvnkpvvg vlmgfgiitg tlritnpvra svlryddfhXl dedkldtnsv yepyyhsdha esswvnrges srkaydhnsp yiwprndydg flenahehhg vynqgrgids gerlmqptqm saqedlgddt gihviptlng ddrhkivnv d qrqygdvfkg dlnpkpqgqr lievsveenh pftlrapiqr iygvrytetw sflpsltctg daapaiqhic Ikhttcfqdv vvdvdcaent kedqlaeisy rfqgkkeadq pwivvntstl fdeleldppe iepgvlkvlr tekqylgvyi wnmrgsdgts tyat flvtwk gdektrnptp avtpqprgae fhmwnyhshv fsvgdtfsla mhlqykihea pfdlllewly vpidptcqpm rlystclyhp napqclshmn sgctftsphl aqrvastvyq ncehadnyta yclgishmep sfglilhdgg ttlkfvdtpe slsglyvfvv yfnghveava ytvvstvdhf vnaieergfp ptagqppatt kpkeitpvnp gtsplX2ryaa wtgglaavvl Iclviflict akrmrvkayr vdkspynqsm yyaglpvddf edsestdtee efgnai ggsh ggssytvyid ktr where X 1 represents T or I, and X 2 represents L or I.
- 3 045837- 3 045837
В настоящем изобретении антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster может отличаться тем, что он представляет собой антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster, состоящий из 534-540 аминокислот, который получен из антигена поверхностного белка вируса Varicella zoster, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, состоящей из 623 аминокислот, или вариацию, которая представляет собой усечение некоторых карбоксиконцевых аминокислотных остатков. Например, как здесь используется, термин вариация, которая представляет собой усечение карбоксиконца от аминокислотного остатка 534 означает, что в направлении от аминоконца (N-конец) к карбоксиконцу (С-конец), аминокислотные остатки с 1 по 534 остаются, а смежные аминокислотные остатки от аминокислотного остатка 535 до карбоксиконца усекаются.In the present invention, the antigenic variant of the surface protein of the Varicella zoster virus may be characterized in that it is an antigenic variant of the surface protein of the Varicella zoster virus consisting of 534-540 amino acids, which is derived from the antigen of the surface protein of the Varicella zoster virus represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, consisting of 623 amino acids, or a variation that is a truncation of some carboxy-terminal amino acid residues. For example, as used herein, the term variation, which is a truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 534, means that in the direction from the amino terminus (N-terminus) to the carboxy terminus (C-terminus), amino acid residues 1 to 534 remain, and adjacent amino acid residues from amino acid residue 535 to the carboxy terminus are truncated.
Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения аминокислотный остаток 40 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 представляет собой треонин.According to a specific embodiment of the present invention, amino acid residue 40 in the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is threonine.
Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения аминокислотный остаток 536 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 представляет собой лейцин.According to a specific embodiment of the present invention, amino acid residue 536 in the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is leucine.
В настоящем изобретении антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster может отличаться тем, что он представлен любой аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2-8 и SEQ ID NO: 21-23, а именно:In the present invention, the antigenic variant of the surface protein of the Varicella zoster virus may be characterized in that it is represented by any amino acid sequence of SEQ ID NO: 2-8 and SEQ ID NO: 21-23, namely:
a) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 534;a) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 534;
b) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 535;b) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 535;
c) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 536;c) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 536;
d) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 537;d) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 5, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 537;
e) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, которая получена усечением карбоксиконца аминокислотного остатка 538;e) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 6, which is obtained by truncation of the carboxy terminus of amino acid residue 538;
f) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 539;f) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 7, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 539;
g) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, которая получена усечением карбоксиконца аминокислотного остатка 540;g) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 8, which is obtained by truncation of the carboxy terminus of amino acid residue 540;
h) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 525;h) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 21, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 525;
i) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 530; илиi) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 22, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 530; or
j) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 543.j) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 23, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 543.
Поверхностный белок по настоящему изобретению происходит из гликопротеина, составляющего оболочку вируса Varicella zoster, происходящего из клады 1, и представляет собой пептидный фрагмент (усеченный белок), состоящий из 534-540 аминокислот, который получают усечением части карбоксильного конца.The surface protein of the present invention is derived from the envelope glycoprotein of the clade 1-derived Varicella zoster virus and is a peptide fragment (truncated protein) consisting of 534-540 amino acids, which is obtained by truncation of a portion of the carboxyl terminus.
С учетом биологически эквивалентных аминокислотных вариаций аминокислотная последовательность, использованная в настоящем изобретении, интерпретируется как включающая последовательности, имеющие существенную идентичность с последовательностями SEQ ID NO: 2-8 и SEQ ID NO: 2123. Вышеуказанная существенная идентичность означает, что в случае, когда последовательность по настоящему изобретению, как здесь описано выше, и любая другая последовательность выравниваются для максимального соответствия и выровненные последовательности анализируются с использованием алгоритма, обычно используемого в данной области, то другая последовательность имеет, по меньшей мере, 70% гомологию, более конкретно 80% гомологию, еще более конкретно 90% гомологию и наиболее конкретно 95% гомологию с последовательностью по настоящему изобретению, при этом обладая той же функцией.Taking into account biologically equivalent amino acid variations, the amino acid sequence used in the present invention is interpreted to include sequences having substantial identity with the sequences of SEQ ID NO: 2-8 and SEQ ID NO: 2123. The above significant identity means that in the case where the sequence the present invention, as described above, and any other sequence are aligned for maximum consistency and the aligned sequences are analyzed using an algorithm commonly used in the art, then the other sequence has at least 70% homology, more specifically 80% homology, yet more specifically 90% homology and most particularly 95% homology to the sequence of the present invention while having the same function.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения было установлено, что следующий антигенный вариант обладает высокой иммуногенностью:In one embodiment of the present invention, the following antigenic variant has been found to be highly immunogenic:
а) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 534;a) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 534;
b) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 535;b) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 3, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 535;
с) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 536;c) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 536;
d) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 537;d) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 5, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 537;
е) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 538;e) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 6, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 538;
- 4 045837- 4 045837
f) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 539; илиf) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 7, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 539; or
g) антигенный вариант, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, которая получена усечением карбоксиконца от аминокислотного остатка 540.g) an antigenic variant represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 8, which is obtained by truncation of the carboxy terminus from amino acid residue 540.
На ранних этапах разработки вакцин в качестве антигенов в основном использовали живые аттенуированные клетки или убитые клетки. Однако за счет проблем с безопасностью разработка таких антигенов смещается в сторону разработки белковых антигенов, имеющих структуру и состав в чистом виде. Однако белковые антигены обычно проблематичны в том отношении, что они обладают низкой иммуногенностью по сравнению с обычными вакцинами. С точки зрения превосходной стабильности и иммуногенности, а также высокой экспрессии в клетках-хозяевах антигенный вариант по настоящему изобретению можно эффективно использовать в качестве вакцины для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая, вызванных вирусом Varicella zoster.In the early stages of vaccine development, live attenuated cells or killed cells were mainly used as antigens. However, due to safety concerns, the development of such antigens is shifting towards the development of protein antigens that have the structure and composition in their pure form. However, protein antigens are usually problematic in that they have low immunogenicity compared to conventional vaccines. From the viewpoint of excellent stability and immunogenicity, as well as high expression in host cells, the antigenic variant of the present invention can be effectively used as a vaccine for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster caused by the Varicella zoster virus.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к гену, кодирующему антигенный вариант, рекомбинантному вектору, содержащий его, и клетке-хозяину, трансформированной рекомбинантным вектором.In yet another aspect, the present invention relates to a gene encoding an antigenic variant, a recombinant vector containing it, and a host cell transformed with the recombinant vector.
В настоящем изобретении ген может отличаться тем, что он представлен любой нуклеотидной последовательностью из SEQ ID NO: 9-15.In the present invention, the gene may be characterized in that it is represented by any nucleotide sequence from SEQ ID NO: 9-15.
В рамках изобретения, термин вектор относится к ДНК конструкции, содержащей последовательность ДНК, которая функционально связана с соответствующей контрольной последовательностью, способной оказывать влияние на экспрессию последовательности ДНК в подходящем хозяине. Вектор может представлять собой плазмиду, фаговую частицу или просто потенциальную геномную вставку. После трансформации в подходящего хозяина вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина или может, в некоторых случаях, интегрировать в геном. В настоящем описании плазмида и вектор иногда используются взаимозаменяемо, поскольку плазмида в настоящее время является наиболее часто используемой формой вектора. Для целей настоящего изобретения предпочтительно использовать плазмидный вектор. Типичные плазмидные векторы, которые можно использовать для этой цели, имеют структуру, включающую (а) ориджин репликации, который обеспечивает эффективную репликацию, так что продуцируется несколько сотен плазмидных векторов на одну клеткухозяина, (b) ген устойчивости к антибиотикам, который обеспечивает селекцию клетки-хозяина, трансформированной плазмидным вектором, и (с) сайт расщепления рестриктазой, который обеспечивает вставку чужеродного фрагмента ДНК. Даже если подходящий сайт расщепления рестриктазой отсутствует в векторе, то использование синтетического олигонуклеотидного адаптера или линкера в соответствии с обычным способом позволяет легко лигировать вектор и чужеродную ДНК.As used herein, the term vector refers to a DNA construct containing a DNA sequence that is operably linked to an appropriate control sequence capable of influencing the expression of the DNA sequence in a suitable host. The vector may be a plasmid, a phage particle, or simply a potential genomic insert. Once transformed into a suitable host, the vector can replicate and function independently of the host genome or can, in some cases, integrate into the genome. In the present description, plasmid and vector are sometimes used interchangeably, since plasmid is currently the most commonly used form of vector. For the purposes of the present invention, it is preferable to use a plasmid vector. Typical plasmid vectors that can be used for this purpose have a structure that includes (a) an origin of replication, which ensures efficient replication, so that several hundred plasmid vectors are produced per host cell, (b) an antibiotic resistance gene, which ensures cell selection - host transformed with a plasmid vector, and (c) a restriction enzyme cleavage site that allows for the insertion of a foreign DNA fragment. Even if a suitable restriction enzyme cleavage site is not present in the vector, the use of a synthetic oligonucleotide adapter or linker in accordance with a conventional method allows easy ligation of the vector and foreign DNA.
В рамках изобретения, термин рекомбинантный вектор обычно относится к рекомбинантному носителю, в который вставлен фрагмент гетерологичной ДНК, где рекомбинантный носитель обычно находится в форме фрагмента двухцепочечной ДНК. В данном случае гетерологичная ДНК относится к чужеродной ДНК, которая в природе не встречается в клетке-хозяине. Рекомбинантный вектор, попав в клетку-хозяин, может реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина, так что можно получить несколько копий вектора и (гетерологичной) ДНК, вставленной в него.As used herein, the term recombinant vector generally refers to a recombinant carrier into which a fragment of heterologous DNA is inserted, wherein the recombinant carrier is typically in the form of a double-stranded DNA fragment. Here, heterologous DNA refers to foreign DNA that does not naturally occur in the host cell. The recombinant vector, once in the host cell, can replicate independently of the host's chromosomal DNA, so that multiple copies of the vector and the (heterologous) DNA inserted into it can be obtained.
После лигирования ген или рекомбинантный вектор трансформируют или трансфектируют в клетку-хозяин. Для трансформации или трансфекции можно использовать несколько типов различных методов, обычно применяемых для введения экзогенной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, и их примеры включают электропорацию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию с DEAE- декстраном и липофекцию.After ligation, the gene or recombinant vector is transformed or transfected into a host cell. For transformation or transfection, several types of different methods can be used, commonly used to introduce exogenous nucleic acid (DNA or RNA) into prokaryotic or eukaryotic host cells, and examples include electroporation, calcium phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection and lipofection.
Как хорошо известно в данной области, для повышения уровня экспрессии трансфектированного гена в клетке-хозяине рассматриваемый ген должен быть операбельно связан с последовательностью транскрипционного и трансляционного контроля экспрессии, которая выполняет свою функцию в выбранном экспрессирующем хозяине.As is well known in the art, to increase the level of expression of a transfected gene in a host cell, the gene in question must be operably linked to a transcriptional and translational expression control sequence that performs its function in the chosen expression host.
В рамках изобретения, термин трансформация относится к введению ДНК в хозяина таким образом, чтобы ДНК могла реплицироваться в виде внехромосомного фактора или посредством хромосомной интеграции. Конечно, следует понимать, что не все векторы одинаково функционируют в экспрессии последовательности гена по настоящему изобретению. Аналогично не все хозяева одинаково функционируют по отношению к одной и той же экспрессионной системе. Однако специалисты в данной области могут сделать соответствующий выбор среди различных векторов, контрольных последовательностей экспрессии и хозяев, не выходя за рамки настоящего изобретения, и без чрезмерной экспериментальной нагрузки. Например, вектор должен быть выбран с учетом хозяина, потому что вектор должен реплицироваться в нем. В этом отношении необходимо также учитывать количество копий вектора, его способность регулировать число копий и экспрессию других белков, кодированных вектором.As used herein, the term transformation refers to the introduction of DNA into a host such that the DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or through chromosomal integration. Of course, it should be understood that not all vectors function equally in expressing the gene sequence of the present invention. Likewise, not all hosts function equally in relation to the same expression system. However, those skilled in the art can make appropriate selections among various vectors, expression control sequences, and hosts without departing from the scope of the present invention and without undue experimental burden. For example, a vector must be selected with the host in mind because the vector must replicate within it. In this regard, the copy number of the vector, its ability to regulate copy number, and the expression of other proteins encoded by the vector must also be considered.
В настоящем изобретении клетка-хозяин, подлежащая трансформации, предпочтительно выбрана из группы, без ограничения, состоящей из клеток животных, клеток растений, дрожжей, E.coli и клеток насекомых.In the present invention, the host cell to be transformed is preferably selected from the group, but not limited to, animal cells, plant cells, yeast, E. coli and insect cells.
В частности, в настоящем изобретении в качестве микроорганизма, используемого в качестве клет- 5 045837 ки-хозяина, подлежащей трансформации, можно использовать любой микроорганизм при условии, что он является нетоксичным или аттенуированным микроорганизмом при применении к живому организму. Их примеры могут включать грамотрицательные бактерии, такие как Е. coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Mycobacterium bovis и Shigella; и грамположительные бактерии, такие как Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Listeria monocytogenes и Streptococcus. Их предпочтительный пример может включать молочнокислые бактерии, которые являются съедобными микроорганизмами. Однако микроорганизм этим не ограничивается.Particularly, in the present invention, any microorganism can be used as the microorganism used as the host cell to be transformed, provided that it is a non-toxic or attenuated microorganism when applied to a living body. Examples thereof may include gram-negative bacteria such as E. coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Mycobacterium bovis and Shigella; and gram-positive bacteria such as Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Listeria monocytogenes and Streptococcus. A preferred example thereof may include lactic acid bacteria, which are edible microorganisms. However, the microorganism is not limited to this.
Молочнокислые бактерии могут включать Lactobacillus sp., Streptococcus sp. и Bifidobacterium sp. Репрезентативные примеры Lactobacillus sp. могут включать Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus bulgaricus и Lactobacillus casei; репрезентативные примеры Streptococcus sp. могут включать термофилы Streptococcus thermophiles; и репрезентативные примеры Bifidobacterium sp. могут включать Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium lactis и Bifidobacterium adolescentis, где Lactobacillus casei являются более предпочтительными. Однако молочнокислые бактерии указанными видами не ограничиваются.Lactic acid bacteria may include Lactobacillus sp., Streptococcus sp. and Bifidobacterium sp. Representative examples of Lactobacillus sp. may include Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus casei; representative examples of Streptococcus sp. may include thermophiles Streptococcus thermophiles; and representative examples of Bifidobacterium sp. may include Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium lactis and Bifidobacterium adolescentis, where Lactobacillus casei is more preferred. However, lactic acid bacteria are not limited to these species.
Микроорганизм также может представлять собой эукариотические клетки, включая грибы, такие как Aspergillus sp., дрожжи, такие как Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp. и Neurospora crassa, другие низшие эукариотические клетки и высшие эукариотические клетки, такие как клетки насекомых.The microorganism may also be a eukaryotic cell, including fungi such as Aspergillus sp., yeast such as Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp. and Neurospora crassa, other lower eukaryotic cells and higher eukaryotic cells such as insect cells.
Микроорганизм может происходить от растений или млекопитающих. Их предпочтительные примеры могут включать клетки почки обезьяны (клетки COS-7), клетки NS0, SP2/0, клетки яичника китайского хомячка (СНО), W138, клетки почки новорожденного хомячка (BHK), MDCK, линии миеломных клеток, клетки HuT78 и клетки HEK293, где предпочтительными являются клетки СНО. Однако микроорганизм этим не ограничивается.The microorganism may originate from plants or mammals. Preferred examples thereof may include monkey kidney cells (COS-7 cells), NS0 cells, SP2/0 cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, W138 cells, newborn hamster kidney (BHK) cells, MDCK, myeloma cell lines, HuT78 cells and HEK293, where CHO cells are preferred. However, the microorganism is not limited to this.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антигена вируса Varicella zoster, включающему стадию культивирования клетки-хозяина.In yet another aspect, the present invention relates to a method for producing Varicella zoster virus antigen, comprising the step of culturing a host cell.
В случае, когда рекомбинантный вектор, способный экспрессировать антиген вируса Varicella zoster, вводится в клетку-хозяин, то антиген можно получить культивированием клетки-хозяина в течение периода, достаточного для обеспечения экспрессии антигена в ней, или, более предпочтительно, в течение периода времени, достаточного для обеспечения секреции антигена в культуральную среду, в которой культивируется клетка-хозяин.In the case where a recombinant vector capable of expressing a Varicella zoster virus antigen is introduced into a host cell, the antigen can be obtained by culturing the host cell for a period sufficient to allow expression of the antigen therein, or, more preferably, for a period of time sufficient to ensure secretion of the antigen into the culture medium in which the host cell is cultured.
В некоторых случаях экспрессированный антиген можно выделить из клетки-хозяина и очистить до гомогенности. Выделение или очистка антигена может выполняться обычными методами выделения и очистки, используемыми для белков, например хроматографией. Примеры хроматографии могут включать аффинную хроматографию, включая хроматографию на колонке с протеином А или колонке с протеином G, ионообменную хроматографию и гидрофобную хроматографию. Антиген может быть выделен и очищен дополнительным комбинированием фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа и т.п. в дополнение к вышеуказанной хроматографии.In some cases, the expressed antigen can be isolated from the host cell and purified to homogeneity. Isolation or purification of the antigen can be accomplished by conventional isolation and purification methods used for proteins, such as chromatography. Examples of chromatography may include affinity chromatography, including protein A column chromatography or protein G column chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The antigen can be isolated and purified by further combinations of filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, and the like. in addition to the above chromatography.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вакцинной композиции для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая, содержащей в качестве активного ингредиента антигенный вариант вируса Varicella zoster.In yet another aspect, the present invention relates to a vaccine composition for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster comprising an antigenic variant of the Varicella zoster virus as an active ingredient.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая с использованием вакцинной композиции, которая содержит в качестве активного ингредиента антигенный вариант вируса Varicella zoster.In yet another aspect, the present invention provides a method for preventing or treating chickenpox or herpes zoster using a vaccine composition that contains an antigenic variant of the Varicella zoster virus as an active ingredient.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению вакцинной композиции, которая содержит в качестве активного ингредиента антигенный вариант вируса Varicella zoster, для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.In yet another aspect, the present invention relates to the use of a vaccine composition that contains an antigenic variant of the Varicella zoster virus as an active ingredient for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению вакцинной композиции, которая содержит в качестве активного ингредиента антигенный вариант, для производства лекарственного средства для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая.In yet another aspect, the present invention relates to the use of a vaccine composition that contains an antigenic variant as an active ingredient for the production of a medicament for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster.
В рамках изобретения, термин профилактика означает подавление развития патологического состояния или заболевания у субъекта, у которого не было диагностировано патологическое состояние или заболевание, и который, вероятно, может иметь такое патологическое состояние или заболевание.As used herein, the term prevention means suppressing the development of a condition or disease in a subject who has not been diagnosed with the condition or disease and who is likely to have such condition or disease.
В рамках изобретения, термин лечение означает (а) ингибирование прогрессирования патологического состояния или заболевания или его симптомов; (b) облегчение патологического состояния или заболевания или его симптомов; или (с) устранение патологического состояния или заболевания или его симптомов. Композиция по настоящему изобретению активирует иммунный ответ против вируса Varicella zoster у субъекта, страдающего ветряной оспой или опоясывающим лишаем, которые являются заболеванием, вызванным инфекцией, вызванной вирусом Varicella zoster, тем самым подавляя прогрессирование, устраняя или облегчая симптомы заболевания. Следовательно, композиция по настоящему изобретению сама может представлять собой терапевтическую композицию для лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая или может применяться в качестве терапевтического средства для лечения забо- 6 045837 левания, которую вводят в комбинации с другими фармакологическими ингредиентами.As used herein, the term treatment means (a) inhibiting the progression of a pathological condition or disease or its symptoms; (b) alleviation of a condition or disease or its symptoms; or (c) eliminating a pathological condition or disease or its symptoms. The composition of the present invention activates an immune response against the Varicella zoster virus in a subject suffering from chickenpox or herpes zoster, which are diseases caused by infection with the Varicella zoster virus, thereby inhibiting the progression, eliminating or alleviating the symptoms of the disease. Therefore, the composition of the present invention may itself be a therapeutic composition for the treatment of chickenpox or herpes zoster, or may be used as a therapeutic agent for the treatment of the disease, which is administered in combination with other pharmacological ingredients.
Таким образом, в настоящем описании термин лечение или терапевтическое средство также включает значение адъювантное лечение или лечебное средство.Thus, as used herein, the term treatment or therapeutic agent also includes the meaning of adjuvant treatment or therapeutic agent.
В рамках изобретения, термин активный ингредиент относится к вакцинной композиции, достаточной для получения желаемого эффекта, который включает, не ограничиваясь этим, индукцию или усиление иммунного ответа против вируса Varicella zoster у пациента, предупреждение, ослабление или устранение реактивации вируса Varicella zoster у пациента, инфицированного этим вирусом или которому была введена живая вакцина против вируса Varicella zoster, предупреждение опоясывающего лишая (HZ) и/или постгерпетической невралгии (PHN), а также снижение тяжести или продолжительности HZ и/или PHN. Специалисты в данной области понимают, что уровень такого желаемого эффекта может варьироваться.As used herein, the term active ingredient refers to a vaccine composition sufficient to produce a desired effect, which includes, but is not limited to, inducing or enhancing an immune response against the Varicella zoster virus in a patient, preventing, attenuating or eliminating reactivation of the Varicella zoster virus in a patient infected with with this virus or who have received live Varicella zoster virus vaccine, prevention of herpes zoster (HZ) and/or postherpetic neuralgia (PHN), and reduction in the severity or duration of HZ and/or PHN. Those skilled in the art will appreciate that the level of such desired effect may vary.
В рамках изобретения, термин иммунный ответ относится к клеточно-опосредованному (Тклеточному) иммунному ответу и/или ответной продукции антител (В-клетками).As used herein, the term immune response refers to a cell-mediated (T cell) immune response and/or antibody response (B cells).
Вакцинная композиция по настоящему изобретению пригодна для профилактики ветряной оспы, и/или HZ, и/или PHN, или уменьшения тяжести или продолжительности ветряной оспы, и/или HZ, и/или PHN в популяциях иммунокомпетентных пациентов и пациентов с ослабленным иммунитетом, которые включают, не ограничиваясь ими, здоровых субъектов и пациентов с ослабленным иммунитетом, которые перенесли трансплантацию гемопоэтических клеток (НСТ) или трансплантацию солидных органов (SOT), ВИЧ-инфицированных пациентов, пациентов с аутоиммунным заболеванием и субъектов с раком крови; субъектов, которые проходят химиотерапию по поводу широкого ряда солидных злокачественных новообразований; и пациентов, которые проходят хроническую иммуносупрессивную терапию по поводу широкого ряда патологических состояний, включая ревматоидный артрит (RA), системную красную волчанку (SLE), болезнь Крона, псориаз и рассеянный склероз.The vaccine composition of the present invention is useful for preventing varicella and/or HZ and/or PHN, or reducing the severity or duration of varicella and/or HZ and/or PHN in populations of immunocompetent and immunocompromised patients, which include but not limited to, healthy subjects and immunocompromised patients who have undergone hematopoietic cell transplantation (HCT) or solid organ transplantation (SOT), HIV-infected patients, patients with autoimmune disease and subjects with blood cancer; subjects who are undergoing chemotherapy for a wide range of solid malignancies; and patients undergoing chronic immunosuppressive therapy for a wide range of pathological conditions, including rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus erythematosus (SLE), Crohn's disease, psoriasis and multiple sclerosis.
В настоящем изобретении вакцинная композиция может отличаться тем, что она дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.In the present invention, the vaccine composition may be characterized in that it further contains a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
Вакцинную композицию по настоящему изобретению можно получить в виде разовой лекарственной формы посредством ее формуляции с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или эксципиента в соответствии со способом, который может легко осуществить специалист в области, к которой относится настоящее изобретение, или может быть приготовлена в виде помещения в контейнер с множеством доз. В данном случае лекарственная форма может быть составлена в виде препаратов для перорального введения, таких как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропы и аэрозоли, препаратов для наружного применения, суппозиториев и стерильных растворов для инъекций в соответствии с общепринятыми и используемыми методами. Подходящие составы, известные в данной области, могут представлять собой составы, описанные в монографии Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.The vaccine composition of the present invention can be prepared in unit dosage form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient in accordance with a method that can be easily carried out by a person skilled in the art to which the present invention relates, or can be prepared in bulk into a multi-dose container. In this case, the dosage form can be formulated in the form of preparations for oral administration, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups and aerosols, preparations for external use, suppositories and sterile solutions for injections in accordance with generally accepted and used methods. Suitable formulations known in the art may be those described in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.
Твердые препараты для перорального введения включают таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы и т.п., и эти твердые препараты получают смешиванием по меньшей мере с одним эксципиентом, таким как крахмал, карбонат кальция, сахароза, лактоза и желатин. В дополнение к простым вспомогательным веществам для твердых препаратов также используются смазывающие вещества, такие как стеарат магния и тальк.Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, and these solid preparations are prepared by mixing with at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose and gelatin. In addition to simple excipients for solid preparations, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
Жидкие препараты для перорального введения включают суспензии, жидкости для перорального введения, эмульсии, сиропы и т.п., и эти жидкие препараты могут содержать различные вспомогательные вещества, такие как смачивающие агенты, подсластители, ароматизаторы и консерванты, в дополнение к воде и вазелиновому маслу, которые представляют обычно используемые простые разбавители.Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral liquids, emulsions, syrups and the like, and these liquid preparations may contain various excipients such as wetting agents, sweeteners, flavorings and preservatives, in addition to water and petroleum jelly. , which represent commonly used simple diluents.
Препараты для парентерального введения включают стерильные водные растворы, неводные растворители, суспензии, эмульсии, лиофилизированные препараты и суппозитории. В качестве основы для суппозиториев можно использовать витепсол, макрогол, твин 61, какао-масло, лаурин, глицерожелатин и тому подобное.Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous diluents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. Witepsol, macrogol, Tween 61, cocoa butter, laurin, glycerogelatin and the like can be used as a base for suppositories.
В настоящем изобретении вакцинная композиция может отличаться тем, что она дополнительно содержит адъювант. Как правило, иммунный ответ не индуцируется эффективно одним белковым антигеном, и таким образом, эффект вакцинной композиции усиливается при смешивании с адъювантом.In the present invention, the vaccine composition may be characterized in that it further contains an adjuvant. Typically, an immune response is not effectively induced by a single protein antigen, and thus the effect of the vaccine composition is enhanced when mixed with an adjuvant.
В рамках изобретения, термин адъювант относится к веществу, которое неспецифически способствует развитию иммунного ответа на антиген в процессе начальной активации иммунных клеток, включая агент, молекулу и т.п., каждое из которых не является иммуногеном для хозяина и усиливает иммунитет за счет повышения активности клеток иммунной системы (Warren et al., Annu. Rev. Immunol., 4: 369, 1986). Адъювант, используемый в настоящем изобретении, который может усиливать иммунный ответ, можно вводить одновременно с вакцинной композицией или можно вводить последовательно через определенный интервал времени.As used herein, the term adjuvant refers to a substance that non-specifically promotes the development of an immune response to an antigen during the initial activation of immune cells, including an agent, molecule, etc., each of which is not an immunogen for the host and enhances immunity by increasing activity cells of the immune system (Warren et al., Annu. Rev. Immunol., 4: 369, 1986). The adjuvant used in the present invention, which can enhance the immune response, can be administered simultaneously with the vaccine composition or can be administered sequentially at a certain time interval.
Адъювант по настоящему изобретению может отличаться тем, что он выбран, не ограничиваясь этим, из группы, состоящей из гидроксид-фосфата кальция, минерального масла, сквалена, антагониста Toll-подобных рецепторов (TLR), детергента, липосом, сапонина, цитокина и их комбинации.The adjuvant of the present invention may be characterized in that it is selected from, but is not limited to, calcium hydroxide phosphate, mineral oil, squalene, Toll-like receptor (TLR) antagonist, detergent, liposomes, saponin, cytokine, and combinations thereof .
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики забо- 7 045837 левания или расстройства у пациента, включающему стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества вакцинной композиции.In yet another aspect, the present invention provides a method of treating or preventing a disease or disorder in a patient, comprising the step of administering to the patient a therapeutically effective amount of a vaccine composition.
Оптимальную дозу вакцинной композиции по настоящему изобретению можно определить стандартными исследованиями, включающими наблюдение за соответствующим иммунным ответом у субъекта. После первоначальной вакцинации субъект может быть подвергнут одной или более бустериммунизациям через соответствующие интервалы времени.The optimal dose of the vaccine composition of the present invention can be determined by standard studies involving monitoring of the appropriate immune response in the subject. After the initial vaccination, the subject may be given one or more booster immunizations at appropriate intervals.
Подходящая доза вакцинной композиции по настоящему изобретению варьирует в зависимости от таких факторов, как способ формуляции, способ введения, возраст пациента, масса тела, пол, патологическое состояние, диета, время введения, путь введения, скорость выведения и ответная чувствительность, и может быть надлежащим образом определена специалистами в данной области техники с учетом вышеуказанных факторов.The suitable dosage of the vaccine composition of the present invention varies depending on factors such as the method of formulation, route of administration, age of the patient, body weight, sex, pathological condition, diet, time of administration, route of administration, elimination rate and response sensitivity, and may be appropriate as determined by those skilled in the art taking into account the above factors.
Вакцинную композицию по настоящему изобретению можно вводить путем, обычно используемым в области медицины. Парентеральное введение является предпочтительным, и введение может осуществляться, например, внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриартериальным, пероральным, внутрисердечным, интрамедуллярным, интрадуральным, трансдермальным, энтеральным, подкожным, сублингвальным или местным путем. В общем, вакцинная композиция по настоящему изобретению может отличаться тем, что она содержит в качестве активного ингредиента антигенный вариант поверхностного белка вируса Varicella zoster по настоящему изобретению в терапевтически эффективном количестве.The vaccine composition of the present invention can be administered by a route commonly used in the medical field. Parenteral administration is preferred, and administration may be by, for example, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, oral, intracardiac, intramedullary, intradural, transdermal, enteral, subcutaneous, sublingual, or topical routes. In general, the vaccine composition of the present invention may be characterized in that it contains as an active ingredient an antigenic variant of the surface protein of the Varicella zoster virus of the present invention in a therapeutically effective amount.
Способ по изобретениюMethod according to the invention
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров. Эти примеры предназначены только для иллюстративных целей, и специалистам в данной области техники будет очевидно, что объем настоящего изобретения не истолковывается как ограничиваемый этими примерами.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with the help of examples. These examples are for illustrative purposes only, and those skilled in the art will appreciate that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
Пример 1: получение конструкций поверхностного белка (gE).Example 1: Preparation of surface protein (gE) constructs.
Для получения конструкций поверхностного белка (gE) проводили ПЦР для получения желаемых фрагментов gE. Затем каждый из фрагментов gE расщепляли рестриктазой и вставляли в вектор pcDNA3.1. Последовательность фрагмента gE, вставленного в вектор pcDNA3.1, идентифицировали секвенированием. ДНК-вектор pcDNA3.1, содержащий идентифицированную последовательность фрагмента gE, получали с использованием набора midiprep. Аминокислотные последовательности фрагментов поверхностного белка (gE) приведены в табл. 1 ниже.To generate surface protein (gE) constructs, PCR was performed to obtain the desired gE fragments. Each of the gE fragments was then digested with a restriction enzyme and inserted into the pcDNA3.1 vector. The sequence of the gE fragment inserted into the pcDNA3.1 vector was identified by sequencing. The pcDNA3.1 DNA vector containing the identified gE fragment sequence was prepared using the midiprep kit. The amino acid sequences of surface protein fragments (gE) are given in Table. 1 below.
Таблица 1Table 1
Пример 2: транзиентная трансфекция.Example 2: transient transfection.
Для определения уровней экспрессии фрагментов gE выполняли транзиентную трансфекцию в клетки 293 с использованием липофектамина 3000. В каждую лунку 6-луночного планшета вносили 5x105 клеток и проводили культивирование. Затем, на следующий день, готовили образцы для трансфекTo determine the expression levels of gE fragments, transient transfection was performed into 293 cells using Lipofectamine 3000. 5x105 cells were added to each well of a 6-well plate and cultured. Transfect samples were then prepared the next day.
- 8 045837 ции. 0,2 мкг ДНК и 0,4 мкг Р3000 добавляли в пробирку и затем разбавляли 125 мкл среды optiMEM; и 3,75 мкл липофектамина 3000 вносили в другую пробирку и затем разводили 125 мкл среды optiMEM. Разбавленную ДНК переносили в пробирку с равным количеством разведенного липофектамина 3000. Затем пробирку инкубировали при перемешивании при комнатной температуре в течение 10 мин для приготовления смеси ДНК-липофектамин. После завершения инкубации смесь ДНК-липофектамин добавляли в 6-луночный планшет, содержащий клетки 293, и затем проводили культивирование в термостате с СО2 в течение 2 суток. После завершения культивирования получали супернатант, к нему добавляли 4 мкл буфера для образцов, содержащего b-меркаптоэтанол, и затем нагревали при 100°С в течение 5 мин. После нагревания полученный продукт хранили замороженным до проведения вестерн-блоттинга.- 8 045837 tion. 0.2 μg DNA and 0.4 μg P3000 were added to the tube and then diluted with 125 μl optiMEM medium; and 3.75 μl of Lipofectamine 3000 was added to another tube and then diluted with 125 μl of optiMEM medium. The diluted DNA was transferred to a tube containing an equal amount of diluted Lipofectamine 3000. The tube was then incubated with stirring at room temperature for 10 min to prepare the DNA-Lipofectamine mixture. After completion of incubation, the DNA-Lipofectamine mixture was added to a 6-well plate containing 293 cells, and then cultured in a CO 2 incubator for 2 days. After completion of the culture, the supernatant was obtained, 4 μL of sample buffer containing b-mercaptoethanol was added to it, and then heated at 100°C for 5 min. After heating, the resulting product was kept frozen until Western blotting.
Пример 3: вестерн-блоттинг.Example 3: Western blotting.
Проводили вестерн-блоттинг для сравнения уровней экспрессии фрагментов gE. Проводили электрофорез каждого образца в геле NuPAGE 4-12% Bis-Tris, и затем переносили на PVDF-мембрану. Мембрану блокировали в течение 1 ч 5% обезжиренным молоком, инкубировали с моноклональным антителом к gE (1 мкг/мл) в течение 2 ч, промывали TBST (твин 0,05%), и затем инкубировали в течение 1 ч с козьим антимышиным IgG-HRP, разбавленным 5000х. Инкубированную мембрану промывали TBST и затем проявляли субстратом ECL. Детектирование проводили на приборе Chemidoc. В результате выполнения вестерн-блоттинга, результаты которого приведены на фиг. 3, было обнаружено, что антигены gE 534 аа, gE 537 аа и gE 540 аа демонстрируют более высокий уровень экспрессии.Western blotting was performed to compare the expression levels of gE fragments. Each sample was electrophoresed on a NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel and then transferred to a PVDF membrane. The membrane was blocked for 1 h with 5% skim milk, incubated with anti-gE monoclonal antibody (1 μg/ml) for 2 h, washed with TBST (0.05% Tween), and then incubated for 1 h with goat anti-mouse IgG- HRP diluted 5000x. The incubated membrane was washed with TBST and then developed with ECL substrate. Detection was carried out on a Chemidoc device. As a result of Western blotting, the results of which are shown in FIG. 3, gE 534 aa, gE 537 aa and gE 540 aa antigens were found to exhibit higher levels of expression.
Пример 4: сравнение по уровню экспрессии с поверхностным белковым антигеном вируса Varicella zoster, входящего в состав вакцины производства GlaxoSmithKline Biologicals SA.Example 4: comparison in terms of expression level with the surface protein antigen of the Varicella zoster virus, which is part of the vaccine produced by GlaxoSmithKline Biologicals SA.
Для сравнения, в отношении уровня экспрессии, поверхностного белкового антигена (GSK gE 546 аа), входящего в состав продукта Shingrix, который в настоящее время является коммерциализированной вакциной против вируса Varicella zoster GlaxoSmithKline Biologicals SA, и антигена (mogam gE 537 аа), полученного заявителями настоящего изобретения, проводили вестерн-блоттинг аналогично тому, как описано в примере 3. Различия между поверхностным белковым антигеном (GSK gE 546 аа), входящим в состав Shingrix производства компании GlaxoSmithKline Biologicals SA, и антигеном (mogam gE 537 аа), полученным заявителями настоящего изобретения, показаны в табл. 2 ниже. В результате выполнения вестерн-блоттинга, результаты которого приведены на фиг. 4, было обнаружено, что антиген, полученный заявителями настоящего изобретения, проявлял более высокий уровень экспрессии, чем поверхностный белковый антиген GlaxoSmithKline Biologicals SA.For comparison, in terms of expression level, the surface protein antigen (GSK gE 546 aa) contained in the product Shingrix, which is currently a commercialized vaccine against Varicella zoster virus by GlaxoSmithKline Biologicals SA, and the antigen (mogam gE 537 aa) produced by the applicants of the present invention, Western blotting was performed in the same manner as described in Example 3. Differences between the surface protein antigen (GSK gE 546 aa) included in Shingrix manufactured by GlaxoSmithKline Biologicals SA and the antigen (mogam gE 537 aa) obtained by the applicants of the present inventions are shown in table. 2 below. As a result of Western blotting, the results of which are shown in FIG. 4, it was found that the antigen produced by the present inventors exhibited a higher level of expression than the surface protein antigen of GlaxoSmithKline Biologicals SA.
Таблица 2table 2
Пример 5: сравнение по иммуногенности с поверхностным белковым антигеном вируса Varicella zoster, входящего в состав вакцины производства GlaxoSmithKline Biologicals SA.Example 5: comparison of immunogenicity with the surface protein antigen of the Varicella zoster virus, which is part of the vaccine produced by GlaxoSmithKline Biologicals SA.
Для сравнения, в отношении иммуногенности, поверхностного белкового антигена (GSK gE 546 аа), входящего в состав продукта Shingrix, который в настоящее время является коммерциализированной вакциной против вируса Varicella zoster GlaxoSmithKline Biologicals SA, и антигена (mogam gE 537 аа), полученного заявителями настоящего изобретения, проводили эксперимент на животных. С учетом того, что у людей в анамнезе бывает ветряная оспа, для имитации ветряной оспы у мышей, самок мышей C57BL/6 подвергали прайм-иммунизации (праймирование LAV) однократной подкожной инъекцией живой аттенуированной вакцины (LAV, 3000 БОЕ). Через 28 суток после праймирования LAV (сутки 0) мышей подвергали вторичной иммунизации внутримышечной инъекцией антигенной композиции mogam gE или GSK gE с адъювантом или без него. Образцы крови отбирали через 42 суток (на сутки 42) после праймирования LAV для оценки гуморального иммунного ответа на gE; и собирали лейкоциты из образцов селезенки через 42 суток (на сутки 42) после праймирования LAV для оценки клеточноопосредованного иммунного ответа (CMI) на gE или VZV. День иммунизации и день отбора образцов крови и селезенки определяли, исходя из дня праймирования LAV, который принимали за сутки 0. Общий экспериментальный метод на животных приведен в табл. 3 ниже.In comparison, with respect to immunogenicity, the surface protein antigen (GSK gE 546 aa) contained in the product Shingrix, which is currently a commercialized vaccine against Varicella zoster virus by GlaxoSmithKline Biologicals SA, and the antigen (mogam gE 537 aa) produced by the present applicants inventions, conducted an experiment on animals. Given the history of varicella in humans, to mimic varicella in mice, female C57BL/6 mice were primed (LAV priming) with a single subcutaneous injection of live attenuated vaccine (LAV, 3000 PFU). 28 days after LAV priming (day 0), mice were subjected to secondary immunization with an intramuscular injection of the antigenic composition of mogam gE or GSK gE with or without adjuvant. Blood samples were collected 42 days (day 42) after LAV priming to assess the humoral immune response to gE; and collected leukocytes from spleen samples 42 days (day 42) after LAV priming to assess cell-mediated immune response (CMI) to gE or VZV. The day of immunization and the day of collection of blood and spleen samples were determined based on the day of LAV priming, which was taken on day 0. The general experimental method in animals is given in Table. 3 below.
- 9 045837- 9 045837
Таблица 3Table 3
*Прайм-иммунизация (праймирование LAV): доза 100 мкл/голову. 3000 БОЕ *Вторичная иммунизация: доза 100 мкл/голову*Prime immunization (LAV priming): dose 100 µl/head. 3000 PFU *Secondary immunization: dose 100 µl/head
Пример 5-1: сравнение гуморальных иммунных ответов.Example 5-1: Comparison of Humoral Immune Responses.
После выполнения первичной и вторичной иммунизации проводили твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) для оценки активности gE антиген-специфического IgG. Рекомбинантные белки gE (1 мкг/мл) вносили в планшеты для постановки ELISA и проводили инкубацию в течение ночи при 4°С для обеспечения их покрытия белковыми антигенами. Каждый из покрытых антигеном планшетов для ELISA промывали три раза и затем блокировали фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 2% бычий сывороточный альбумин (BSA), в течение 1 ч. После завершения реакции блокирования с помощью BSA планшет для ELISA промывали. Затем в него добавляли разбавленный образец сыворотки и проводили инкубацию в течение 2 ч. В планшеты добавляли козьи антимышиные IgG, IgG1 или IgG2c антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), и инкубацию проводили в течение 1 ч. После последней инкубации планшет для ELISA промывали и реакцию HRP развивали добавлением 3,3',5,5'тетраметилбензидина (ТМВ, производство KPL), который является субстратом для HRP. Затем добавляли стоп-раствор ТМВ для остановки реакции HRP, и измеряли оптическую плотность (OD) при 450 нм с использованием ридера для микропланшетов ELISA (Spectramax 250, Molecular Device) для определения количества продуцированных антител. В результате, как показано на фиг. 5, было установлено, что G6, содержащий антиген (mogam gE 537 аа), полученный заявителями настоящего изобретения, и адъювант, имел самую высокую интенсивность люминесценции. На основании этих результатов было обнаружено, что самый высокий гуморальный иммунный ответ был индуцирован на G6.After primary and secondary immunization, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to evaluate the gE activity of antigen-specific IgG. Recombinant gE proteins (1 μg/ml) were added to ELISA plates and incubated overnight at 4°C to ensure coverage of protein antigens. Each of the antigen-coated ELISA plates was washed three times and then blocked with phosphate-buffered saline (PBS) containing 2% bovine serum albumin (BSA) for 1 hour. After completion of the BSA blocking reaction, the ELISA plate was washed. The diluted serum sample was then added and incubated for 2 hours. Goat anti-mouse IgG, IgG1, or IgG2c antibodies conjugated to horseradish peroxidase (HRP) were added to the plates and incubated for 1 hour. After the last incubation, the ELISA plate was washed and the HRP reaction was developed by adding 3,3',5,5'tetramethylbenzidine (TMB, produced by KPL), which is a substrate for HRP. TMB stop solution was then added to stop the HRP reaction, and the optical density (OD) was measured at 450 nm using an ELISA microplate reader (Spectramax 250, Molecular Device) to determine the amount of antibody produced. As a result, as shown in FIG. 5, it was found that G6 containing the antigen (mogam gE 537 aa) obtained by the present inventors and an adjuvant had the highest luminescence intensity. Based on these results, it was found that the highest humoral immune response was induced by G6.
Пример 5-2: сравнение клеточно-опосредованных иммунных ответов.Example 5-2: Comparison of Cell-Mediated Immune Responses.
После выполнения первичной и вторичной иммунизации проводили анализ ELISA IFN-γ для определения секретированного количества IFN-γ, который является репрезентативным цитокином, секретируемым Т-клетками при стимуляции антигеном. Лейкоциты, отобранные у мышей, стимулировали лизатом VZV в течение 3 суток. Затем проводили центрифугирование для получения супернатанта, и супернатант анализировали с помощью набора для определения мышиного IFN-γ ELISA. Захватывающее IFNγ антитело (4 мкг/мл) вносили в планшеты для ELISA и проводили инкубацию в течение ночи при комнатной температуре для обеспечения их покрытия захватывающим IFN-γ антителом. Каждый из покрытых антителами планшетов для ELISA промывали три раза и затем блокировали PBS, содержащим 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), в течение 1 ч. После завершения реакции блокирования с помощью BSA планшет для ELISA промывали. Затем в него добавляли супернатант, полученный после стимуляции лейкоцитов, и проводили инкубацию при комнатной температуре в течение 2 ч. После завершения инкубации планшет для ELISA промывали и проводили инкубацию с биотинилированным антителом для детектирования мышиного IFN-γ (400 нг/мл) при комнатной температуре в течение 2 ч. Проводили промывание, и затем инкубацию со стрептавидином-HRP еще в течение 20 мин. После последней инкубации планшет для ELISA промывали и затем подвергали взаимодействию с раствором субстрата в течение 20 мин при комнатной температуре. В планшет добавляли стоп-раствор для остановки реакции, и затем измеряли оптическую плотность (OD) при 450 нм с использованием ридера для микропланшетов ELISA (Spectramax 250, Molecular Device) для определения количества продуцированного цитокина IFNγ. В результате, как показано на фиг. 6, было установлено, что G6, содержащий антиген (mogam gE 537After primary and secondary immunizations, an IFN-γ ELISA was performed to determine the secreted amount of IFN-γ, which is a representative cytokine secreted by T cells upon antigen stimulation. Leukocytes collected from mice were stimulated with VZV lysate for 3 days. Centrifugation was then performed to obtain the supernatant, and the supernatant was analyzed using a mouse IFN-γ ELISA kit. IFN-γ capture antibody (4 μg/ml) was added to ELISA plates and incubated overnight at room temperature to ensure coverage with IFN-γ capture antibody. Each of the antibody-coated ELISA plates was washed three times and then blocked with PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) for 1 hour. After completion of the BSA blocking reaction, the ELISA plate was washed. Then the supernatant obtained after stimulation of leukocytes was added to it and incubated at room temperature for 2 hours. After completion of incubation, the ELISA plate was washed and incubated with a biotinylated antibody for detecting mouse IFN-γ (400 ng/ml) at room temperature for 2 hours. Washing was carried out, and then incubation with streptavidin-HRP for another 20 minutes. After the last incubation, the ELISA plate was washed and then exposed to the substrate solution for 20 min at room temperature. Stop solution was added to the plate to stop the reaction, and then the optical density (OD) was measured at 450 nm using an ELISA microplate reader (Spectramax 250, Molecular Device) to determine the amount of IFNγ cytokine produced. As a result, as shown in FIG. 6, it was found that G6 containing antigen (mogam gE 537
- 10 045837 аа), полученный заявителями настоящего изобретения, и адъювант, демонстрировал наибольшее количество цитокина IFN-γ. На основании этих результатов было установлено, что самый высокий клеточноопосредованный иммунный ответ был индуцирован на G6.- 10 045837 aa), obtained by the applicants of the present invention, and the adjuvant, showed the highest amount of the cytokine IFN-γ. Based on these results, it was determined that the highest cell-mediated immune response was induced on G6.
Пример 6: идентификация антигенспецифической иммуногенности фрагментов антигена gE.Example 6: Identification of antigen-specific immunogenicity of gE antigen fragments.
Пример 6-1: транзиентная трансфекция для продукции антигена.Example 6-1: Transient transfection for antigen production.
Для экспрессии фрагментов gE выполняли транзиентную трансфекцию в клетки 293 с использованием набора для трансфекции Expifectamine™ 293. Клетки с титром 2x106 клеток/мл помещали в колбу емкостью на 125 мл и культивировали. Затем, на следующий день проводили трансфекцию. Клетки 293 разводили до объема 25,5 мл с титром 2,9x106 клеток/мл и готовили комплексы для трансфекции. 30 мкг ДНК отбирали в пробирку емкостью 15 мл и доводили до объема 1,5 мл средой Opti-MEM. Таким образом, был приготовлен комплекс 1. 81 мкл реагента ExpiFectamine™ 293 помещали в другую пробирку емкостью 15 мл и доводили до 1,5 мл с помощью среды Opti-MEM. Таким образом, был приготовлен комплекс 2. Инкубацию проводили при комнатной температуре в течение 5 мин. Через 5 мин комплекс 1 переносили в пробирку, содержащую комплекс 2, и перемешивали. Затем пробирку инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин для приготовления комплекса ДНК-липид. После завершения инкубации весь комплекс ДНК-липид помещали в колбу емкостью 125 мл, содержащую клетки 293, и проводили культивирование в термостате. Через 20 ч проводили обработку усилителями. 150 мкл усилителя трансфекции 1 ExpiFectamine™ 293 помещали в пробирку емкостью 1,5 мл и добавляли в нее усилитель трансфекции 2 ExpiFectamine™ 293 до 1,5 мл. Затем полученный продукт добавляли к клеткам 293 и проводили инкубацию в термостате в течение 5 суток. Через 5 суток получали культуральный супернатант, фильтровали через фильтр 0,45 мкм и хранили замороженным до очистки.To express gE fragments, transient transfection was performed into 293 cells using the Expifectamine™ 293 transfection kit. Cells at a titer of 2x106 cells/ml were placed in a 125 ml flask and cultured. Then, the next day, transfection was carried out. 293 cells were diluted to a volume of 25.5 ml with a titer of 2.9x106 cells/ml and complexes were prepared for transfection. 30 µg of DNA was collected into a 15 ml tube and diluted to 1.5 ml with Opti-MEM. Complex 1 was thus prepared. 81 µl of ExpiFectamine™ 293 reagent was placed in another 15 ml tube and diluted to 1.5 ml with Opti-MEM media. Thus, complex 2 was prepared. Incubation was carried out at room temperature for 5 min. After 5 min, complex 1 was transferred to a test tube containing complex 2 and mixed. The tube was then incubated at room temperature for 20 min to prepare the DNA-lipid complex. After completion of incubation, the entire DNA-lipid complex was placed in a 125 ml flask containing 293 cells and cultured in an incubator. After 20 hours, treatment with amplifiers was carried out. 150 µl of Transfection Enhancer 1 ExpiFectamine™ 293 was placed in a 1.5 ml tube and Transfection Enhancer 2 ExpiFectamine™ 293 was added to 1.5 ml. Then the resulting product was added to 293 cells and incubated in a thermostat for 5 days. After 5 days, the culture supernatant was obtained, filtered through a 0.45 μm filter, and stored frozen until purification.
Пример 6-2: очистка для получения антигенов.Example 6-2: Purification for antigen production.
Культуральный раствор, который хранился в замороженном состоянии, оттаивали, и к культуральному раствору добавляли равное количество PBS. Фильтрацию проводили с использованием фильтра 0,22 мкм, и затем проводили анионообменную хроматографию. К элюату добавляли 5 М NaCl и проводили хроматографию гидрофобных взаимодействий. Элюат, прошедший хроматографию, фильтровали через фильтр 0,22 мкм и хранили замороженным до проведения экспериментов на животных.The culture solution, which was kept frozen, was thawed, and an equal amount of PBS was added to the culture solution. Filtration was performed using a 0.22 μm filter, followed by anion exchange chromatography. 5 M NaCl was added to the eluate and hydrophobic interaction chromatography was performed. The chromatographic eluate was filtered through a 0.22 μm filter and stored frozen until animal experiments were performed.
Пример 6-3: иммунизация.Example 6-3: Immunization.
Проводили эксперименты на животных для оценки иммуногенности фрагментов антигена gE. Самкам мышей C57BL/6 внутримышечно вводили фрагменты антигена gE с интервалом в 2 недели, и образцы крови отбирали у мышей через 2 недели после вторичной иммунизации. Сыворотки отделяли от собранных образцов крови и хранили замороженными до измерения титра антител.Animal experiments were performed to evaluate the immunogenicity of gE antigen fragments. Female C57BL/6 mice were injected intramuscularly with gE antigen fragments at 2-week intervals, and blood samples were collected from mice 2 weeks after the booster immunization. Sera were separated from collected blood samples and kept frozen until antibody titer was measured.
Пример 6-4: измерение антигенспецифической активности IgG и оценка респондеров.Example 6-4: Measurement of antigen-specific IgG activity and assessment of responders.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) проводили для оценки антигенспецифической активности IgG. Поверхностные белки VZV (1 мкг/мл) вносили в планшеты для постановки ELISA, проводили инкубацию в течение ночи при 4°С, и каждый из планшетов для ELISA промывали 3 раза. Затем планшет для ELISA блокировали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), содержащим 2% бычий сывороточный альбумин (BSA), в течение 1 ч. Планшет для ELISA промывали. Затем в планшет добавляли разбавленный образец сыворотки и проводили инкубацию в течение 2 ч. В планшет добавляли козьи антитела против мышиного IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), и проводили инкубацию в течение 1 ч. После последней инкубации планшет для ELISA промывали и реакцию HRP развивали добавлением 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом. Затем в планшет для ELISA добавляли стоп-раствор для остановки реакции HRP, и измеряли оптическую плотность (OD) с использованием спектрометра при 450 нм.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to evaluate antigen-specific IgG activity. VZV surface proteins (1 μg/ml) were added to ELISA plates, incubated overnight at 4°C, and each ELISA plate was washed 3 times. The ELISA plate was then blocked with phosphate buffered saline (PBS) containing 2% bovine serum albumin (BSA) for 1 hour. The ELISA plate was washed. The diluted serum sample was then added to the plate and incubated for 2 hours. Goat anti-mouse IgG conjugated to horseradish peroxidase (HRP) was added to the plate and incubated for 1 hour. After the last incubation, the ELISA plate was washed and the HRP reaction was performed. developed by adding 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), which is a substrate. Stop solution was then added to the ELISA plate to stop the HRP reaction, and the optical density (OD) was measured using a spectrometer at 450 nm.
Для определения различий в антигенспецифической иммуногенности, индуцированной последовательностями фрагментов антигена gE, животных иммунизировали, как описано в примере 6-3. Титр антигенспецифических антител измеряли с использованием сывороток, полученных в экспериментах на животных, в соответствии с вышеописанным методом измерения титра антител. В результате, как показано на фиг. 7, значение OD после иммунизации gE 534 аа или gE 543 аа было выше, чем значение OD после иммунизации gE 500 аа, gE 510 аа, gE 525 аа или gE 546 аа.To determine differences in antigen-specific immunogenicity induced by gE antigen fragment sequences, animals were immunized as described in Example 6-3. Antigen-specific antibody titers were measured using sera obtained from animal experiments according to the antibody titer measurement method described above. As a result, as shown in FIG. 7, the OD value after immunization with gE 534 aa or gE 543 aa was higher than the OD value after immunization with gE 500 aa, gE 510 aa, gE 525 aa, or gE 546 aa.
После измерения титра антител особи со значением OD 0,6 или выше считались респондерами, и результаты обобщали. В результате отсутствовал антигенспецифический респондер на gE 500 аа, и количество респондеров после иммунизации gE 510 аа было таким же, как после иммунизации gE 546 аа. Число респондеров после иммунизации gE 525 аа, gE 534 аа, gE 537 аа или gE 540 аа было выше, чем количество респондеров после иммунизации gE 510 аа или gE 546 аа. То есть, было установлено, что для фрагментов от gE 525 аа до gE 540 аа проявляется большее количество респондеров (фиг. 8).After antibody titer measurements, individuals with an OD value of 0.6 or higher were considered responders and the results were summarized. As a result, there was no antigen-specific responder to gE 500 aa, and the number of responders after immunization with gE 510 aa was the same as after immunization with gE 546 aa. The number of responders after immunization with gE 525 aa, gE 534 aa, gE 537 aa or gE 540 aa was higher than the number of responders after immunization with gE 510 aa or gE 546 aa. That is, it was found that for fragments from gE 525 aa to gE 540 aa, a greater number of responders appears (Fig. 8).
В результате, фрагменты от gE 534 аа до gE 543 аа показали более высокие значения при измерении титра антител, и фрагменты от gE 525 аа до gE 540 аа показали более высокие значения у антигенспецифических респондеров. Следовательно, в случае, когда два вышеуказанных результата объединяются, то можно определить, что gE 534 аа - 540 аа демонстрируют более высокую иммуногенность.As a result, fragments gE 534 aa to gE 543 aa showed higher values when measuring antibody titer, and fragments gE 525 aa to gE 540 aa showed higher values in antigen-specific responders. Therefore, in the case where the above two results are combined, it can be determined that gE 534 aa - 540 aa exhibit higher immunogenicity.
- 11 045837- 11 045837
Промышленная применимостьIndustrial applicability
Антигенный вариант поверхностного белка (gE) вируса ветряной оспы по настоящему изобретению представляет собой собой белковый антиген. В случае применения в качестве вакцинной композиции антигенный вариант демонстрирует превосходную безопасность и высокий уровень экспрессии в клетках-хозяевах по сравнению с живой противовирусной вакциной. Таким образом, данный антигенный вариант пригоден в качестве вакцины для профилактики или лечения ветряной оспы или опоясывающего лишая, вызванных вирусом Varicella zoster.The varicella zoster virus surface protein (gE) antigenic variant of the present invention is a protein antigen. When used as a vaccine composition, the antigenic variant demonstrates superior safety and high levels of expression in host cells compared to a live antiviral vaccine. Thus, this antigenic variant is suitable as a vaccine for the prevention or treatment of chickenpox or herpes zoster caused by the Varicella zoster virus.
Как указано выше, конкретные части настоящего изобретения были описаны подробно. Однако специалистам в данной области техники должно быть понятно, что такое конкретное описание предназначено только для иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления, и объем настоящего изобретения этим не ограничивается. Следовательно, фактический объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.As stated above, specific portions of the present invention have been described in detail. However, it will be understood by those skilled in the art that such specific description is intended to illustrate preferred embodiments only, and the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, the actual scope of the present invention will be determined by the appended claims and their equivalents.
Свободный текст перечня последовательностей:Free text list of sequences:
прилагаемый электронный файл.attached electronic file.
Claims (12)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2018-0058219 | 2018-05-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045837B1 true EA045837B1 (en) | 2023-12-29 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11642408B2 (en) | Antigen variant of Varicella Zoster virus and use thereof | |
| Handman et al. | Protective vaccination with promastigote surface antigen 2 from Leishmania major is mediated by a TH1 type of immune response | |
| CN102666575B (en) | Mycobacterial vaccines | |
| CN110035772B (en) | Varicella zoster virus vaccine | |
| US20060121052A1 (en) | Recombinant vaccine from gE, gI, and gB proteins of the varicella-zoster virus for the treatment and prevention of multiple sclerosis | |
| US11925685B2 (en) | DNA antibody constructs encoding anti-ZIKV envelope antibodies | |
| CN109456393B (en) | Application of streptococcus pneumoniae protein in resisting streptococcus pneumoniae infection | |
| US20230330214A1 (en) | Improved dna vaccine for sars-cov-2 | |
| KR102075393B1 (en) | Vaccine composition for preventing or treating infection due to severe fever with thrombocytopenia syndrome virus | |
| EP2104512A2 (en) | Streptococcus proteins, and their use in vaccination | |
| US20230136602A1 (en) | Use of the Salmonella SPP Type III Secretion Proteins as a Protective Vaccination | |
| EA045837B1 (en) | ANTIGENIC VARIANT OF VARICELLA ZOSTER VIRUS AND ITS APPLICATION | |
| Ludwig-Portugall et al. | Prevention of long-term IgE antibody production by gene gun–mediated DNA vaccination | |
| US9950053B2 (en) | Use of the Salmonella SPP type III secretion proteins as a protective vaccination | |
| CN110573179A (en) | Pharmaceutical compositions comprising weakly-poisoned streptococcus pneumoniae strains and uses thereof | |
| JP2002524469A (en) | Peptide fragment of cholera toxin B or enterotoxin B as vaccine adjuvant | |
| US9446112B2 (en) | Clostridium difficile DNA vaccine | |
| US20240131154A1 (en) | Combination of novel vaccines against zika virus and dna antibody constructs for use against zika virus | |
| TW202345912A (en) | Composition comprising antigen and dna and use thereof | |
| KR20220139810A (en) | Neutralization-enhancing vaccine composition for preventing sars coronavirus 2 infection disease | |
| WO2023161649A1 (en) | Rhinovirus vaccine |