BR112020023642A2

BR112020023642A2 - variante de antígeno de vírus de varicela zoster e uso da mesma

Info

Publication number: BR112020023642A2
Application number: BR112020023642-0A
Authority: BR
Inventors: Hyo Jung NAM; Ga Young Ji; Eunmi Kim
Original assignee: Mogam Institute For Biomedical Research
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2021-02-17
Also published as: ZA202006956B; WO2019225962A1; MA51945A1; MX2020012469A; PE20201415A1; JP2021525079A; EA202092828A1; AU2019272184A1; AU2019272184B2; CO2020015167A2; CN112189017A; PH12020552009A1; MA51945B2; EP3812394A1; EP3812394A4; IL278892A; US11642408B2; CA3100462A1; KR20210006460A; JP7247226B2

Abstract

A presente invenção se refere a uma variante de antígeno e a um uso do mesmo, a variante de antígeno sendo uma proteína, entre as proteínas de superfície (gE) do vírus da varicela zoster, exibindo um alto nível de expressão e alta imunogenicidade e, portanto, quando a variante de antígeno é usada como uma composição de vacina, a composição de vacina tem segurança mais excelente em comparação com uma vacina de vírus vivo, e a variante de antígeno exibe um nível de expressão mais alto em uma célula hospedeira em comparação com outros antígenos e, portanto, é útil como uma vacina para prevenção ou tratamento de catapora ou herpes zoster causado pelo vírus da varicela zoster.

Description

“VARIANTE DO ANTÍGENO DE PROTEÍNA DE SUPERFÍCIE DO VÍRUS DE VARICELA ZOSTER, GENE E COMPOSIÇÃO DE VACINA QUE COMPREENDE A MESMA, VETOR RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA E USO DA DITA

COMPOSIÇÃO PARA A PREVENÇÃO OU O TRATAMENTO DE VARICELA OU HERPES ZOSTER” Campo Técnico

[001] A presente invenção se refere a uma variante de antígeno do vírus da Varicela Zoster e a um uso do mesmo, e mais particularmente a uma variante de antígeno do vírus da Varicela Zoster com alto nível de expressão e alta imunogenicidade, que é selecionada entre as variantes do antígeno de proteína (gE) de superfície do vírus da Varicela Zoster, e uma composição de vacina para prevenção ou tratamento de varicela ou herpes zoster que compreende a variante do antígeno do vírus da Varicela Zoster como ingrediente ativo.

Antecedentes da Técnica

[002] O vírus da varicela zoster (VZV) é um vírus que causa a varicela principalmente em crianças e adolescentes. Uma vez que a infecção ocorre, o VZV permanece dormente na raiz sensorial e nas células ganglionares dos nervos cranianos por vários anos e é reativado e causa herpes zoster na idade adulta quando a imunidade diminui. A varicela é altamente contagiosa; e uma vez que a infecção ocorre, ela causa uma erupção em todo o corpo com febre e mal-estar. Na maioria das crianças normais, a varicela raramente progride para uma condição séria e, eventualmente, progride para uma doença autolimitada. No entanto, sabe-se que muitos casos em que a varicela progride para sintomas graves ocorrem em pacientes que foram submetidos a transplante de órgãos ou quimioterapia (Adriana Weinberg et al., J Infectious Diseases, 200(7):1068, 2009; Judith Breuer et al., Expert Review of Vaccines, 2017, DOI:10.1080/14760584.2017.1394843).

[003] O herpes zoster apresenta sintomas iniciais de dores de cabeça e dores por todo o corpo, como tensões no corpo, ou sensações de coceira intensa, formigamento e queimação, com dor intensa, como sendo apunhalado com uma facada. O herpes zoster é uma doença em que bolhas se desenvolvem após alguns dias, a dor aumenta à medida que as lesões cutâneas aumentam e os pacientes mais velhos tendem a se queixar de dor mais intensa. Mesmo em um caso em que o Herpes zoster é curado, ele pode deixar a neuralgia como uma sequela. Sabe-se que em pessoas com 60 anos ou mais, a neuralgia pode fazer com que durmam intermitentemente, que se queixem de fadiga crônica, que sintam dores intensas mesmo com contato leve ou atrito, ou até mesmo causar depressão, embora tal neuralgia seja relativamente rara em adultos com 40 anos ou menos.

[004] Vacinas preventivas representativas contra a varicela incluem produtos como VARIVAX (Merck & Co, Inc.) e VARILRIX (GlaxoSmithKline Biologicals SA), que foram desenvolvidas usando a cepa Oka, uma cepa atenuada desenvolvida em 1970.

Na Coréia, um produto como o Suduvax (Green Cross), que foi produzido com a cepa MAV/06 desenvolvida em 1980, está disponível comercialmente. As vacinas vivas comercialmente disponíveis em questão mostram uma eficácia protetora média de 80%, o que significa que a infecção ocorre em 20% dos vacinados mesmo após a vacinação. Problemas de estabilidade têm sido constantemente apontados, como a ocorrência de varicela e herpes zoster, causados pelos vírus vivos contidos nas vacinas.

[005] ZOSTAVAX (Merck & Co, Inc.), que é uma vacina viva atenuada produzida com a cepa Oka, foi desenvolvida como uma vacina preventiva contra o herpes zoster. Esta vacina foi aprovada e vendida nos EUA e na Coréia com a condição de que deve ser usada em adultos com 50 anos ou mais, não em crianças ou adolescentes, devido ao fato de que uma grande quantidade do vírus está contida na vacina. Recentemente, uma vacina composta por uma proteína de superfície viral (gE) e um adjuvante, que se destina a adultos com 50 anos ou mais, foi desenvolvida pela GlaxoSmithKline Biologicals SA, e provou ter eficácia preventiva em ensaios clínicos (Patente US nº 7.939.084, concedida em 7 de janeiro de 2011).

[006] Nos estágios iniciais do desenvolvimento da vacina, células vivas atenuadas ou células mortas eram usadas principalmente como antígenos. No entanto, devido a questões de segurança e substâncias imunossupressoras presentes em patógenos, o desenvolvimento de tais antígenos está mudando para o desenvolvimento de antígenos de proteína que têm uma estrutura e composição claras e podem estabelecer imunidade essencial para a defesa contra doenças.

[007] Consequentemente, os presentes inventores têm feito esforços intensivos para desenvolver antígenos de proteína com um alto nível de expressão em células hospedeiras, que podem contribuir para a melhoria da produtividade sem afetar a imunogenicidade, a partir de antígenos de proteína (gE) de superfície do vírus da Varicela Zoster. Como resultado, os inventores da presente invenção produziram variantes do antígeno da proteína de superfície do vírus da Varicela Zoster de vários comprimentos e mediram os níveis de expressão das mesmas, identificando assim sequências de aminoácidos específicas com um alto nível de expressão, entre as variantes do antígeno; e assim completaram a presente invenção.

Divulgação da Invenção Problema técnico

[008] Um objetivo da presente invenção é fornecer uma variante de antígeno específica com alto nível de expressão e alta imunogenicidade, que é selecionada entre as variantes do antígeno de proteína (gE) de superfície do vírus da Varicela Zoster.

[009] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um gene que codifica a variante do antígeno, um vetor recombinante compreendendo o gene e uma célula hospedeira transformada com o vetor recombinante.

[010] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição de vacina para prevenção ou tratamento de varicela ou herpes zoster, compreendendo a variante de antígeno como ingrediente ativo.

[011] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para prevenção ou tratamento de varicela ou herpes zoster, usando uma composição de vacina que compreende a variante de antígeno como ingrediente ativo.

[012] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer o uso de uma composição de vacina que compreende a variante do antígeno como um ingrediente ativo, para a prevenção ou tratamento da varicela ou herpes zoster.

[013] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer o uso de uma composição de vacina que compreende a variante de antígeno como um ingrediente ativo, para a fabricação de um medicamento para prevenção ou tratamento de varicela ou herpes zoster.

Solução para o Problema

[014] Para atingir os objetivos acima, na presente invenção, é fornecida uma variante de antígeno de proteína de superfície do vírus da Varicela Zoster que é caracterizada por a variante de antígeno incluir uma variação que é o truncamento do terminal carboxi de qualquer um dos resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste nos 525º a 543º resíduos de aminoácidos no antígeno da proteína (gE) de superfície do vírus da Varicela Zoster representado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[015] Além disso, na presente invenção, é fornecido um gene que codifica a variante do antígeno, um vetor recombinante que compreende o gene e uma célula hospedeira transformada com o vetor recombinante.

[016] Além disso, na presente invenção, é fornecida uma composição de vacina para prevenção ou tratamento de varicela ou herpes-zoster, compreendendo a variante do antígeno como ingrediente ativo.

[017] Além disso, na presente invenção, é fornecido um método para prevenção ou tratamento de varicela ou herpes zoster, usando uma composição de vacina que compreende a variante de antígeno como ingrediente ativo.

[018] Além disso, na presente invenção, é fornecido o uso de uma composição de vacina que compreende a variante do antígeno como um ingrediente ativo, para a prevenção ou tratamento da varicela ou herpes zoster.

[019] Além disso, na presente invenção, é fornecido o uso de uma composição de vacina que compreende a variante do antígeno como um ingrediente ativo, para a fabricação de um medicamento para prevenção ou tratamento de varicela ou herpes zoster.

Breve Descrição dos Desenhos

[020] A FIG. 1 ilustra esquematicamente um processo experimental de acordo com a presente invenção.

[021] A FIG. 2 ilustra as sequências de aminoácidos dos antígenos da proteína de superfície (gE) do vírus da Varicela Zoster de vários comprimentos.

[022] A FIG. 3 ilustra os resultados do Western blot realizado para comparar os níveis de expressão de fragmentos de gE que são antígenos do vírus da Varicela Zoster.

[023] A FIG. 4 ilustra os resultados do Western blot realizado para comparar os níveis de expressão de um antígeno de proteína de superfície (GSK gE 546 aa), que está contido em Shingrix que é uma vacina do vírus da Varicela Zoster fabricada por GlaxoSmithKline Biologicals SA e uma variante de antígeno (mogam gE 537 aa) produzida pelos presentes inventores.

[024] A FIG. 5 ilustra resultados de IgG ELISA específico para anti-gE realizado para comparar respostas imunes humorais de um antígeno de proteína de superfície (GSK gE 546 aa), que está contido em Shingrix que é uma vacina do vírus da Varicela Zoster fabricada por GlaxoSmithKline Biologicals SA e uma variante de antígeno (mogam gE 537 aa) produzida pelos presentes inventores.

[025] A FIG. 6 ilustra resultados de IFN-γ ELISA de camundongo realizado para comparar respostas imunes mediadas por células (CMI) de um antígeno de proteína de superfície (GSK gE 546 aa), que está contido em Shingrix que é uma vacina do vírus da Varicela Zoster fabricada por GlaxoSmithKline Biologicals SA, e uma variante de antígeno (mogam gE 537 aa) produzida pelos presentes inventores.

[026] A FIG. 7 ilustra os resultados de IgG ELISA específico para anti-gE realizado para comparar as respostas imunes humorais de fragmentos de gE que são antígenos do vírus da Varicela Zoster.

[027] A FIG. 8 ilustra os resultados obtidos através da realização de IgG ELISA específico para anti-gE para comparar respostas imunes humorais de fragmentos de gE que são antígenos do vírus da Varicela Zoster e, em seguida, resumir o número de responsivos que mostram uma resposta de anticorpo específica do antígeno.

Melhor Modo de Realização da Invenção

[028] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Em geral, a nomenclatura usada aqui é bem conhecida e comumente usada na técnica.

[029] Na presente invenção, para desenvolver antígenos com um alto nível de expressão em células hospedeiras, que podem contribuir para a melhoria da produtividade sem afetar a imunogenicidade, a partir dos antígenos da proteína do vírus da Varicela Zoster, foi realizado um experimento, no qual as variantes do antígeno da proteína de superfície (gE) de vários comprimentos são produzidas e, em seguida, os níveis de expressão dos mesmos são medidos. Como resultado, foi identificado que entre as variantes do antígeno da proteína de superfície do vírus da Varicela Zoster produzidas pelos presentes inventores, os antígenos representados por sequências de aminoácidos específicas exibiram um nível de expressão mais alto do que os outros antígenos (FIG. 3).

[030] Além disso, a medição da titulação de anticorpos (FIG. 7) e a medição de resposta específica do antígeno (FIG. 8) foram realizadas para selecionar variantes de antígenos com alta imunogenicidade. Como resultado, foi identificado que o mogam gE 534 aa a gE 540 aa apresentou maior imunogenicidade.

[031] Portanto, em um aspecto da presente invenção, é fornecida uma variante de antígeno da proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster que inclui uma variação que é o truncamento do terminal carboxi de qualquer um dos resíduos de aminoácido selecionados do grupo que consiste nos 525° a 543° resíduos de aminoácido no antígeno de proteína (gE) de superfície do vírus da Varicela Zoster representado pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[032] Especificamente, na presente invenção, é fornecida uma variante do antígeno de proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster que é caracterizada por a variante do antígeno incluir uma variação selecionada a partir do grupo que consiste em: a) truncamento do terminal carboxi do 525º resíduo de aminoácido; b) truncamento do terminal carboxi do 526º resíduo de aminoácido; c) truncamento do terminal carboxi do 527º resíduo de aminoácido; d) truncamento do terminal carboxi do 528º resíduo de aminoácido; e) truncamento do terminal carboxi do 529º resíduo de aminoácido; f) truncamento do terminal carboxi do 530º resíduo de aminoácido;

g) truncamento do terminal carboxi do 531° resíduo de aminoácido; h) truncamento do terminal carboxi do 532° resíduo de aminoácido; i) truncamento do terminal carboxi do 533° resíduo de aminoácido; j) truncamento do terminal carboxi do 534º resíduo de aminoácido; k) truncamento do terminal carboxi do 535º resíduo de aminoácido; l) truncamento do terminal carboxi do 536º resíduo de aminoácido; m) truncamento do terminal carboxi do 537º resíduo de aminoácido; n) truncamento do terminal carboxi do 538º resíduo de aminoácido; o) truncamento do terminal carboxi do 539º resíduo de aminoácido; p) truncamento do terminal carboxi do 540º resíduo de aminoácido; q) truncamento do terminal carboxi do 541° resíduo de aminoácido; r) truncamento do terminal carboxi do 542° resíduo de aminoácido; e s) truncamento do terminal carboxi do 543° resíduo de aminoácido.

[033] A variante antigênica pode ser caracterizada por incluir, de preferência, uma variação selecionada do grupo que consiste em j) truncamento do terminal carboxi do 534º resíduo de aminoácido; k) truncamento do terminal carboxi do 535º resíduo de aminoácido; l) truncamento do terminal carboxi do 536º resíduo de aminoácido; m) truncamento do terminal carboxi do 537º resíduo de aminoácido; n) truncamento do terminal carboxi do 538º resíduo de aminoácido; o) truncamento do terminal carboxi do 539º resíduo de aminoácido; e p) truncamento do terminal carboxi do 540º resíduo de aminoácido; no entanto, a variação não se limita a isso.

[034] SEQ ID NO: 1: mgtvnkpvvg vlmgfgiitg tlritnpvra svlryddfhX1 dedkldtnsv yepyyhsdha esswvnrges srkaydhnsp yiwprndydg flenahehhg vynqgrgids gerlmqptqm saqedlgddt gihviptlng ddrhkivnvd qrqygdvfkg dlnpkpqgqr lievsveenh pftlrapiqr iygvrytetw sflpsltctg daapaiqhic lkhttcfqdv vvdvdcaent kedqlaeisy rfqgkkeadq pwivvntstl fdeleldppe iepgvlkvlr tekqylgvyi wnmrgsdgts tyatflvtwk gdektrnptp avtpqprgae fhmwnyhshv fsvgdtfsla mhlqykihea pfdlllewly vpidptcqpm rlystclyhp napqclshmn sgctftsphl aqrvastvyq ncehadnyta yclgishmep sfglilhdgg ttlkfvdtpe slsglyvfvv yfnghveava ytvvstvdhf vnaieergfp ptagqppatt kpkeitpvnp gtsplX2ryaa wtgglaavvl lclviflict akrmrvkayr vdkspynqsm yyaglpvddf edsestdtee efgnaiggsh ggssytvyid ktr (em que X1 é T ou I, e X2 é L ou I).

[035] Na presente invenção, a variante do antígeno de proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster pode ser caracterizada por ser uma variante do antígeno de proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster consistindo nos 534 a 540 aminoácidos, que é derivada do antígeno da proteína de superfície do vírus da Varicela Zoster representado pelo sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 consistindo em 623 aminoácidos ou uma variação que é o truncamento do terminal carboxi em alguns resíduos de aminoácidos. Por exemplo, como usado na presente invenção, o termo “variação que é o truncamento do terminal carboxi do 534º resíduo de aminoácido” significa que na direção do terminal amino (terminal N) para terminal carboxi (terminal C), 1° a 534º resíduos de aminoácidos permanecem e resíduos de aminoácidos contíguos do 535º resíduo de aminoácidos no terminal carboxi estão truncados.

[036] De acordo com uma modalidade específica da presente invenção, o 40º resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é treonina.

[037] De acordo com uma modalidade específica da presente invenção, o 536º resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é leucina.

[038] Na presente invenção, a variante do antígeno de proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster pode ser caracterizada por ser representada por qualquer sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 a 8 é de SEQ ID NOs: 21 a 23, da seguinte forma: a) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 2, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 534º resíduo de aminoácido;

b) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 3, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 535º resíduo de aminoácido;

c) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 4, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 536º resíduo de aminoácido;

d) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 5, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 537º resíduo de aminoácido;

e) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 6, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 538º resíduo de aminoácido;

f) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 7, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 539º resíduo de aminoácido;

g) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 8, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 540º resíduo de aminoácido;

h) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 21, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 525º resíduo de aminoácido;

i) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 22, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 530º resíduo de aminoácido; ou j) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 543° resíduo de aminoácido.

[039] A proteína de superfície da presente invenção é derivada de uma glicoproteína que constitui o envelope do vírus da Varicela Zoster derivado do Clade 1, e é um fragmento de peptídeo (proteína truncada) consistindo em 534 a 540 aminoácidos que é obtido por truncamento de uma parte do terminal carboxi.

[040] Dadas as variações de aminoácidos biologicamente equivalentes, a sequência de aminoácidos usada na presente invenção é interpretada como incluindo sequências com identidade substancial com as sequências de SEQ ID NOs: 2 a 8 e SEQ ID NOs: 21 a 23. A identidade substancial acima mencionada significa que, em um caso em que a sequência da presente invenção como descrita acima e qualquer outra sequência são alinhadas para correspondência máxima e as sequências alinhadas são analisadas usando um algoritmo comumente usado na técnica, a outra sequência tem pelo menos 70% de homologia, mais particularmente 80% de homologia, ainda mais particularmente 90% de homologia e muito mais particularmente 95% de homologia com a sequência da presente invenção, embora tendo a mesma função.

[041] Em uma modalidade da presente invenção, foi identificado que a seguinte variante de antígeno tem alta imunogenicidade: a) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 534º resíduo de aminoácido; b) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 535º resíduo de aminoácido; c) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 536º resíduo de aminoácido; d) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 537º resíduo de aminoácido; e) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 538º resíduo de aminoácido; f) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 539º resíduo de aminoácido; ou g) uma variante de antígeno representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, que é obtida por truncamento do terminal carboxi do 540º resíduo de aminoácido.

[042] Nos estágios iniciais do desenvolvimento da vacina, células vivas atenuadas ou células mortas eram usadas principalmente como antígenos. No entanto, devido a questões de segurança, o desenvolvimento de tais antígenos está mudando para o desenvolvimento de antígenos de proteína que têm uma estrutura e composição claras. No entanto, os antígenos de proteína são geralmente problemáticos porque têm baixa imunogenicidade em comparação com as vacinas convencionais. Do ponto de vista ter excelente estabilidade e imunogenicidade e sendo expressa em um alto nível em células hospedeiras, a variante de antígeno de acordo com a presente invenção pode ser eficazmente usada como uma vacina para prevenção ou tratamento de varicela induzida pelo vírus varicela zoster ou herpes zoster.

[043] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um gene que codifica a variante antigênica, um vetor recombinante compreendendo o mesmo e uma célula hospedeira transformada com o vetor recombinante.

[044] Na presente invenção, o gene pode ser caracterizado por ser representado por qualquer sequência de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 9 a 15.

[045] Como usado na presente invenção, o termo "vetor" se refere a um construto de DNA contendo uma sequência de DNA que está operacionalmente ligada a uma sequência de controle adequada capaz de efetuar a expressão da sequência de DNA em um hospedeiro adequado. O vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago ou simplesmente uma inserção genômica potencial. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode se replicar e funcionar independentemente do genoma do hospedeiro ou pode, em alguns casos, se integrar ao próprio genoma.

Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" são algumas vezes usados indistintamente, visto que um plasmídeo é atualmente a forma de vetor mais comumente usada. Para o propósito da presente invenção, é preferido usar um vetor de plasmídeo. Os vetores de plasmídeo típicos, que podem ser usados para este fim, têm uma estrutura incluindo (a) uma origem de replicação que permite a replicação eficaz de modo que várias centenas de vetores de plasmídeo por célula hospedeira sejam produzidos, (b) um gene resistente a antibióticos que permite a seleção de uma célula hospedeira transformada com o vetor de plasmídeo, e (c) um sítio de clivagem de enzima de restrição que permite que um fragmento de DNA estranho seja inserido.

Mesmo que um sítio de clivagem de enzima de restrição apropriado não exista em um vetor, o uso de um adaptador ou ligante de oligonucleotídeo sintético de acordo com um método convencional permite a ligação fácil do vetor e do DNA estranho.

[046] Como usado na presente invenção, o termo "vetor recombinante" geralmente se refere a um transportador recombinante no qual um fragmento de DNA heterólogo é inserido, o transportador recombinante estando geralmente na forma de um fragmento de DNA de fita dupla. Aqui, o DNA heterólogo se refere a DNA estranho que não é encontrado naturalmente em uma célula hospedeira. O vetor recombinante, uma vez em uma célula hospedeira, pode se replicar independentemente do DNA cromossômico do hospedeiro de modo que várias cópias do vetor e do DNA (heterólogo) nele inseridas possam ser produzidas.

[047] Após a ligação, o gene ou o vetor recombinante é transformado ou transfectado em uma célula hospedeira. Para a "transformação" ou "transfecção", vários tipos de várias técnicas comumente usadas para introduzir um ácido nucleico exógeno (DNA ou RNA) em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas podem ser usados, e exemplos dos mesmos incluem eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrano e lipofecção.

[048] Como é bem conhecido na técnica, para aumentar um nível de expressão de um gene transfectado em uma célula hospedeira, o gene em questão deve estar operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão transcricional e translacional que exerce sua função em um hospedeiro de expressão selecionado.

[049] Como usado na presente invenção, o termo "transformação" se refere à introdução de DNA em um hospedeiro de modo que o DNA possa ser replicado como um fator extracromossômico ou por integração cromossômica. Naturalmente, deve ser entendido que nem todos os vetores funcionam igualmente na expressão da sequência do gene da presente invenção. Da mesma forma, nem todos os hospedeiros funcionam igualmente em relação ao mesmo sistema de expressão. No entanto, aqueles versados na técnica podem fazer uma seleção apropriada entre vários vetores, sequências de controle de expressão e hospedeiros sem se afastar do escopo da presente invenção sem carga experimental indevida. Por exemplo, um vetor deve ser selecionado em consideração a um hospedeiro, porque o vetor deve se replicar no mesmo. A este respeito, um número de cópias do vetor, sua capacidade de regular o número de cópias e a expressão de outras proteínas codificadas pelo vetor também devem ser considerados.

[050] Na presente invenção, a célula hospedeira a ser transformada é de preferência selecionada, mas não limitada a, o grupo que consiste em células de animais, células vegetais, levedura, E. coli e células de inseto.

[051] Especificamente, na presente invenção, como o microrganismo usado como a célula hospedeira a ser transformada, qualquer microrganismo pode ser usado, desde que seja um microrganismo não tóxico ou atenuado quando aplicado a um corpo vivo. Exemplos disso podem incluir bactérias Gram negativas, tais como E. coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Mycobacterium bovis e Shigella; e bactérias Gram-positivas, como Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Listeria monocytogenes e Streptococcus. Um exemplo preferido dos mesmos pode incluir bactérias de ácido láctico que são microrganismos comestíveis.

No entanto, o microrganismo não se limita aos mesmos.

[052] As bactérias de ácido láctico podem incluir Lactobacillus sp., Streptococcus sp. E Bifidobacterium sp. Exemplos representativos de Lactobacillus sp. podem incluir Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus bulgaricus e Lactobacillus casei; exemplos representativos de Streptococcus sp. podem incluir Streptococcus thermophiles; e exemplos representativos de Bifidobacterium sp. podem incluir Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium lactis e Bifidobacterium adolescentis, com Lactobacillus casei sendo mais preferido. No entanto, as bactérias lácticas não estão limitadas a estas.

[053] O microrganismo também pode ser células eucarióticas, incluindo fungos, como Aspergillus sp., Leveduras, como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp. e Neurospora crassa, outras células eucarióticas inferiores e células eucarióticas superiores, como células de insetos.

[054] O microrganismo pode ser derivado de plantas ou mamíferos. Exemplos preferidos dos mesmos podem incluir células de rim de macaco (células COS-7),

células NS0, SP2/0, células de ovário de hamster chinês (CHO), W138, células de rim de hamster bebê (BHK), MDCK, linhagens de células de mieloma, células HuT78, e células HEK293, sendo preferidas as células CHO. No entanto, o microrganismo não se limita aos mesmos.

[055] Em ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para a produção de um antígeno do vírus da Varicela Zoster, compreendendo uma etapa de cultura da célula hospedeira.

[056] Em um caso em que um vetor recombinante capaz de expressar o antígeno do vírus da Varicela Zoster é introduzido em uma célula hospedeira, o antígeno pode ser produzido cultivando a célula hospedeira por um período suficiente para permitir que o antígeno seja expresso na mesma, ou com mais preferência, por um período suficiente para permitir que o antígeno seja segregado para o meio de cultura no qual a célula hospedeira é cultivada.

[057] Em alguns casos, o antígeno expresso pode ser isolado da célula hospedeira e purificado até a homogeneidade. O isolamento ou purificação do antígeno pode ser realizado por métodos convencionais de isolamento e purificação usados para proteínas, por exemplo, cromatografia. Exemplos da cromatografia podem incluir cromatografia de afinidade incluindo coluna de proteína A ou coluna de proteína G, cromatografia de troca iônica e cromatografia hidrofóbica. O antígeno pode ser isolado e purificado por combinação adicional de filtração, ultrafiltração, salting-out, diálise e semelhantes, além da cromatografia acima.

[058] Em ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição de vacina para prevenção ou tratamento de varicela ou herpes zoster, compreendendo, como ingrediente ativo, a variante do antígeno do vírus da Varicela Zoster.

[059] Em ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para prevenção ou tratamento de varicela ou herpes zoster, usando uma composição de vacina que compreende, como um ingrediente ativo, a variante do antígeno do vírus da Varicela Zoster.

[060] Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido o uso de uma composição de vacina que compreende, como ingrediente ativo, a variante do antígeno do vírus varicela zoster, para prevenção ou tratamento de varicela ou herpes- zoster.

[061] Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido o uso de uma composição de vacina que compreende, como ingrediente ativo, a variante do antígeno, para a fabricação de um medicamento para prevenção ou tratamento de varicela ou herpes-zoster.

[062] Como usado na presente invenção, o termo "prevenção" significa inibir a ocorrência de uma condição ou doença em um sujeito que não foi diagnosticado como tendo a condição ou doença e é provável que tenha tal condição ou doença.

[063] Como usado na presente invenção, o termo "tratamento" significa (a) inibir o progresso de uma condição ou doença, ou sintomas da mesma; (b) aliviar uma condição ou doença, ou sintomas da mesma; ou (c) eliminar uma condição ou doença, ou sintomas da mesma. A composição da presente invenção ativa uma resposta imune contra o vírus da Varicela Zoster em um indivíduo que sofre de varicela ou herpes zoster, que é uma doença causada pela infecção por vírus da Varicela Zoster, funcionando assim para inibir o progresso da doença, eliminar ou aliviar os sintomas da doença. Consequentemente, a composição da presente invenção pode ela própria ser uma composição terapêutica para varicela ou herpes zoster, ou pode ser aplicada como um auxiliar terapêutico para a doença que é administrada em combinação com outros ingredientes farmacológicos.

[064] Assim, na presente especificação, o termo "tratamento" ou "agente terapêutico" também inclui o significado de "tratamento adjuvante" ou "auxiliar de tratamento".

[065] Como usado na presente invenção, o termo "ingrediente ativo" se refere a uma composição de vacina suficiente para produzir um efeito desejado que inclui, mas não está limitado a, induzir ou aumentar uma resposta imune contra o vírus da Varicela Zoster em um paciente, prevenir, aliviar ou eliminar reativação do vírus da Varicela Zoster em um paciente infectado com o mesmo vírus ou administrado com uma vacina viva do vírus da Varicela Zoster, prevenindo herpes zoster (HZ) e/ou neuralgia pós-herpética (PHN) e diminuindo a gravidade ou duração de HZ e/ou PHN.

Os versados na técnica reconhecem que um nível de tal efeito desejado pode variar.

[066] Como usado na presente invenção, o termo "resposta imune" se refere a uma resposta imune mediada por células (células T) e/ou uma resposta de anticorpos (células B).

[067] A composição da vacina da presente invenção é útil para prevenção da varicela e/ou HZ e/ou PHN, ou diminuição da gravidade ou duração da varicela e/ou HZ e/ou PHN, em populações de pacientes imunocompetentes e imunocomprometidos que incluem, mas não são limitado a indivíduos saudáveis e pacientes imunocomprometidos que se submeteram a transplante de células hematopoiéticas (HCT) ou transplante de órgão sólido (SOT), pacientes infectados com HIV, pacientes com uma doença autoimune e indivíduos com câncer de sangue; indivíduos submetidos à quimioterapia para uma ampla variedade de malignidades sólidas; e pacientes submetidos à terapia imunossupressora crônica para uma ampla variedade de condições, incluindo artrite reumatoide (RA), lúpus sistêmico eritematoso (SLE), doença de Crohn, psoríase e esclerose múltipla.

[068] Na presente invenção, a composição da vacina pode ser caracterizada por compreender ainda um veículo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[069] A composição de vacina da presente invenção pode ser preparada em uma forma de dosagem unitária sendo formulada usando um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável de acordo com um método que pode ser facilmente realizado por um versado na técnica ao qual a presente invenção pertence, ou pode ser preparado na forma de ser colocado em um recipiente de múltiplas doses. Aqui, a forma de dosagem pode ser formulada na forma de preparações orais, tais como pós, grânulos, comprimidos, cápsulas, suspensões, emulsões, xaropes e aerossóis, preparações para uso externo, supositórios e soluções injetáveis estéreis de acordo com métodos convencionais, e usados. As formulações adequadas conhecidas na técnica podem ser as divulgadas em Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.

[070] As preparações sólidas para administração oral incluem comprimidos, pílulas, pós, grânulos, cápsulas e semelhantes, e essas preparações sólidas são preparadas sendo misturadas com pelo menos um excipiente, como amido, carbonato de cálcio, sacarose, lactose e gelatina. Além de excipientes simples, lubrificantes como estearato de magnésio e talco também são usados para as preparações sólidas.

[071] As preparações líquidas para administração oral incluem suspensões, líquidos orais, emulsões, xaropes e semelhantes, e essas preparações líquidas podem conter vários excipientes, tais como agentes umectantes, agentes adoçantes, fragrâncias e conservantes, além de água e parafina líquida que são comumente usados como diluentes simples.

[072] As preparações para administração parenteral incluem soluções aquosas estéreis, solventes não aquosos, suspensões, emulsões, preparações liofilizadas e supositórios. Como uma base para supositórios, podem ser usados Witepsol, Macrogol, Tween 61, gordura de cacau, laurina, glicerogelatina e semelhantes.

[073] Na presente invenção, a composição da vacina pode ser caracterizada por compreender ainda um adjuvante. Em geral, uma resposta imune não é fortemente induzida por um antígeno de proteína sozinho e, portanto, um efeito da composição da vacina é aumentado ao ser misturado com o adjuvante.

[074] Como usado na presente invenção, o termo "adjuvante" se refere a uma substância que promove não especificamente uma resposta imune a um antígeno em um processo de ativação inicial de células imunes, incluindo um agente, uma molécula e semelhantes, cada um dos quais não é um imunogene a um hospedeiro e aumenta a imunidade ao aumentar a atividade das células no sistema imune (Warren et al., Annu. Rev. Immunol, 4:369, 1986). O adjuvante usado na presente invenção, que pode potenciar uma resposta imune, pode ser administrado simultaneamente com a composição da vacina ou pode ser administrado sequencialmente em um intervalo de tempo.

[075] O adjuvante da presente invenção pode ser caracterizado por ser selecionado a partir de, mas não limitado a, o grupo que consiste em hidróxido de fosfato de cálcio, óleo mineral, esqualeno, antagonista do receptor tipo toll (TLR), detergente, lipossoma, saponina, citocina, e combinações dos mesmos

[076] Ainda em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio em um paciente, compreendendo uma etapa de administração, ao paciente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição da vacina.

[077] Uma dose ótima da composição de vacina da presente invenção pode ser determinada por estudos padrão envolvendo a observação de uma resposta imune adequada em um sujeito. Após a vacinação inicial, o sujeito pode ser submetido a uma ou várias imunizações de reforço em intervalos apropriados.

[078] Uma dose adequada da composição de vacina da presente invenção varia dependendo de fatores como método de formulação, modo de administração, idade do paciente, peso, sexo, condição patológica, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção e sensibilidade à resposta, e pode ser determinada apropriadamente por aqueles versados na técnica em consideração aos fatores acima mencionados.

[079] A composição da vacina da presente invenção pode ser administrada através de uma via comumente usada no campo da medicina. A administração parenteral é preferida e a administração pode ser, por exemplo, feita por via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, oral, intracardíaca, intramedular, intradural, transdérmica, intestinal, subcutânea, sublingual ou tópica. Em geral, a composição de vacina da presente invenção pode ser caracterizada por compreender, como ingrediente ativo, a variante do antígeno de proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster de acordo com a presente invenção em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

Modo para a Invenção

[080] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes por meio de exemplos. Estes exemplos são apenas para fins ilustrativos, e será evidente para os versados na técnica que o escopo da presente invenção não é interpretado como sendo limitado por esses exemplos.

Exemplo 1 Produção de construtos de proteína de superfície (gE)

[081] Para produzir construtos de proteína de superfície (gE), a PCR foi realizada para obter os fragmentos de gE desejados. Em seguida, cada um dos fragmentos de gE foi clivado com uma enzima de restrição e inserido no vetor pcDNA3.1. Uma sequência do fragmento de gE inserido no vetor pcDNA3.1 foi identificada por meio de sequenciamento. O DNA do vetor pcDNA3.1 compreendendo o fragmento de gE com a sequência identificada foi obtido por midiprep. As sequências de aminoácidos dos fragmentos de proteína de superfície (gE) são mostradas na Tabela 1 abaixo.

[082] [Tabela 1] Variante de Variação no antígeno VZV gE da SEQ ID NO: 1 SEQ ID antígeno NO VZV gE Truncamento do terminal carboxi do 534º resíduo de gE 534 aa 2 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 535º resíduo de gE 535 aa 3 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 536º resíduo de gE 536 aa 4 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 537º resíduo de gE 537 aa 5 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 538º resíduo de gE 538 aa 6 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 539º resíduo de gE 539 aa 7 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 540º resíduo de gE 540 aa 8 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 500º resíduo de gE 500 aa 16 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 505º resíduo de gE 505 aa 17 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 510º resíduo de gE 510 aa 18 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 515º resíduo de gE 515 aa 19 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 520º resíduo de gE 520 aa 20 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 525º resíduo de gE 525 aa 21 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 530º resíduo de gE 530 aa 22 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 543°resíduo de gE 543 aa 23 aminoácido Truncamento do terminal carboxi do 546º resíduo de gE 546 aa 24 aminoácido Exemplo 2 Transfecção transiente

[083] Para identificar os níveis de expressão dos fragmentos de gE, a transfecção transitória dos mesmos em células 293 foi realizada usando lipofectamina

3000. 5  105 células foram adicionadas a cada poço da placa de 6 poços e a cultura foi realizada. Então, no dia seguinte, as amostras foram preparadas para transfecção.

0,2 μg de DNA e 0,4 μg de P3000 foram adicionados a um tubo e então diluídos com 125 μL de optiMEM; e 3,75 μL de lipofectamina 3000 foram adicionados a outro tubo e então diluídos com 125 μL de optiMEM. O DNA diluído foi transferido para o tubo com uma quantidade igual de lipofectamina 3000 diluída. Em seguida, o tubo foi incubado com mistura em temperatura ambiente por 10 minutos para preparar uma mistura de DNA-lipofectamina. Após a conclusão da incubação, a mistura de DNA- lipofectamina foi adicionada à placa de 6 poços contendo células 293 e, em seguida, a cultura foi realizada em uma incubadora de CO2 por 2 dias. Após a conclusão da cultura, um sobrenadante foi obtido, 4 de tampão de amostra contendo b- mercaptoetanol foi adicionado à mesma e, em seguida, o aquecimento foi realizado a 100C por 5 minutos. Após aquecimento, o resultante foi mantido congelado até que o Western blot fosse realizado.

Exemplo 3 Western blot

[084] Western blot foi realizado para comparar os níveis de expressão dos fragmentos de gE. Cada amostra foi executada em Gel Bis-Tris NuPAGE 4-12% e, em seguida, transferida para uma membrana de PVDF. A membrana foi bloqueada por 1 hora em leite desnatado a 5%, incubada com anticorpo monoclonal de gE (1 μg/mL) por 2 horas, lavada com TBST (Tween 0,05%) e, em seguida, incubada por 1 hora com IgG-HRP de cabra anti-camundongo diluído a 5000. A membrana incubada foi lavada com TBST e então desenvolvida com substrato de ECL. A detecção foi realizada com uma máquina Chemidoc. Como resultado da realização de Western blot, conforme ilustrado na FIG. 3, verificou-se que os antígenos, gE 534 aa, gE 537 aa e gE 540 aa, exibiram um nível de expressão mais alto.

Exemplo 4 Comparação, em termos de nível de expressão, com o antígeno de proteína de superfície do vírus da Varicela Zoster da GlaxoSmithKline Biologicals

SA

[085] Para comparar, em termos de nível de expressão, um antígeno de proteína de superfície (GSK gE 546 aa) contido no Shingrix, que é uma vacina do vírus da Varicela Zoster atualmente comercializada da GlaxoSmithKline Biologicals SA, e um antígeno (mogam gE 537 aa) produzido pelo presente inventores, o Western blot foi realizado da mesma maneira descrita no Exemplo 3. As diferenças entre o antígeno de proteína de superfície (GSK gE 546 aa) contido em Shingrix de GlaxoSmithKline Biologicals SA e o antígeno (mogam gE 537 aa) produzido pelos presentes inventores são como mostrado na Tabela 2 abaixo. Como resultado da realização de Western blot, conforme ilustrado na FIG. 4, verificou-se que o antígeno produzido pelos presentes inventores exibiu um nível de expressão mais alto do que o antígeno de proteína de superfície da GlaxoSmithKline Biologicals SA.

[086] [Tabela 2] mogam gE 537 aa GSK gE 546 aa Clade 1 (tipo selvagem, cepa Fonte Clade 3 (tipo selvagem) Dumas) 40° aminoácido T I 536º aminoácido L I Terminal C sem YAAWTGGLA YAAWTGGLA Exemplo 5 Comparação, em termos de imunogenicidade, com o antígeno de proteína de superfície do vírus da Varicela Zoster da GlaxoSmithKline Biologicals SA

[087] Para comparar, em termos de imunogenicidade, um antígeno de proteína de superfície (GSK gE 546 aa) contido em Shingrix, que é uma vacina do vírus da Varicela Zoster atualmente comercializada da GlaxoSmithKline Biologicals SA, e um antígeno (moga gE 537 aa) produzido pelos presentes inventores, um experimento com animais foi realizado. Do ponto de vista de que os humanos têm histórico de infecção por varicela, para simular a infecção por varicela em camundongos, camundongos fêmeas C57BL/6 foram submetidos à imunização primária (iniciação de LAV) sendo injetados subcutaneamente uma vez com uma vacina viva atenuada (LAV. 3.000 pfu). Após 28 dias da iniciação de LAV (Dia 0), os camundongos foram submetidos a imunização secundária sendo injetados intramuscularmente com uma composição de antígeno mogam gE ou GSK gE com ou sem um adjuvante. Amostras de sangue foram coletadas 42 dias (Dia 42) após a iniciação de LAV para medir uma resposta imune humoral a gE; e os leucócitos foram coletados de amostras de baço 42 dias (Dia 42) após a iniciação de LAV para medir uma resposta imune mediada por células (CMI) a gE ou VZV. O dia da imunização e o dia da coleta de amostras de sangue e baço foram calculados a partir do dia da iniciação de LAV, que foi considerado como Dia 0. O método experimental animal global é conforme descrito na Tabela 3 abaixo.

[088] [Tabela 3] Imunização secundária Dia da Imunização Dia da coleta de primária Grupo imunização amostras (iniciação de Antígeno Adjuvante secundária de sangue LAV*) e baço PBS Somente PBS X X LAV (15.000

LAV LAV X pfu) gE (GSK) LAV gE (5 g)

X gE (mogam) LAV gE (5 g) X Dia 28 Dia 42 gE (GSK) + LAV gE (5 g) Adjuvante A adjuvante A gE (mogam) + LAV gE (5 g) Adjuvante A adjuvante A *Imunização primária (iniciação de LAV): dose de 100 μL/cabeça. 3.000 pfu *Imunização secundária: dose de 100 μL/cabeça Exemplo 5-1: Comparação de respostas imunes humorais

[089] Após a realização das imunizações primária e secundária, o ensaio imunoenzimático (ELISA) foi realizado para medir a potência de IgG específica do antígeno de gE. Proteínas gE recombinantes (1 μg/mL) foram dispensadas em placas de ELISA e a incubação de um dia para o outro foi realizada em 4C para permitir que os antígenos de proteína sejam revestidos. Cada uma das placas de ELISA revestidas com antígeno foi lavada três vezes e, em seguida, bloqueada com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA) por 1 hora. Após a conclusão da reação de bloqueio com BSA, a placa de ELISA foi lavada.

Em seguida, uma amostra de soro diluída foi adicionada à mesma e a incubação foi realizada por 2 horas. Anticorpo de IgG, IgG1 ou IgG2c de cabra anti-canundongo conjugado com peroxidase de rábano (HRP) foi adicionado à mesma e a incubação foi realizada durante 1 hora. Após a incubação final, a placa de ELISA foi lavada e a reação de HRP foi induzida pela adição de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB, fabricada por KPL), que é um substrato de HRP. Em seguida, a solução de parada de TMB foi adicionada para interromper a reação de HRP, e a densidade óptica (OD) foi medida a 450 nm usando um leitor de microplaca de ELISA (Spectramax 250, Molecular Device) para verificar uma quantidade de anticorpo produzido. Como resultado, conforme ilustrado na FIG. 5, foi mostrado que G6 contendo o antígeno (mogam gE 537 aa) produzido pelos presentes inventores e um adjuvante tinha a maior intensidade de luminescência. A partir desses resultados, verificou-se que a maior resposta imune humoral foi induzida em G6.

Exemplo 5-2: Comparação de respostas imunes mediadas por células

[090] Depois de realizar as imunizações primária e secundária, IFN-γ ELISA foi realizado para verificar uma quantidade segregada de IFN-γ, que é uma citocina representativa secretada por células T após a estimulação do antígeno. Leucócitos coletados de camundongos foram estimulados com lisado de VZV por 3 dias. Em seguida, a centrifugação foi realizada para obter um sobrenadante, e o sobrenadante foi analisado com um kit de IFN-γ ELISA de camundongo. O anticorpo de captura de IFN-γ (4 μg/mL) foi dispensado em placas de ELISA e a incubação de um dia para o outro foi realizada à temperatura ambiente para permitir que o anticorpo de captura de IFN-γ fosse revestido nas mesmas. Cada uma das placas de ELISA revestidas com anticorpo foi lavada três vezes e, em seguida, bloqueada com PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) durante 1 hora. Após a conclusão da reação de bloqueio com BSA, a placa de ELISA foi lavada. Em seguida, o sobrenadante obtido após a estimulação dos leucócitos foi adicionado ao mesmo e a incubação foi realizada à temperatura ambiente por 2 horas. Após a conclusão da incubação, a placa de ELISA foi lavada e a incubação com anticorpo de detecção de IFN-γ de camundongo biotinilado (400 ng/mL) foi realizada em temperatura ambiente por 2 horas. A lavagem foi realizada e a então com estreptavidina-HRP foi realizada por mais 20 minutos. A placa de ELISA finalmente incubada foi lavada e, em seguida, reagiu com uma solução de substrato por 20 minutos à temperatura ambiente. Uma solução de interrupção foi adicionada para interromper a reação e, em seguida, a densidade óptica (OD) foi medida a 450 nm usando um leitor de microplaca de ELISA (Spectramax 250, Molecular Device) para verificar uma quantidade de citocina IFN-γ produzida. Como resultado, conforme ilustrado na FIG. 6, foi demonstrado que G6 contendo o antígeno (mogam gE 537 aa) produzido pelos presentes inventores e um adjuvante exibiu a maior quantidade de citocina IFN-γ. A partir desses resultados, verificou-se que a maior resposta imune mediada por células foi induzida em G6.

Exemplo 6 Identificação de imunogenicidade específica do antígeno de fragmentos de antígeno de gE Exemplo 6-1: Transfecção transitória para produção de antígeno

[091] Para expressar os fragmentos de gE, a transfecção transitória dos mesmos em células 293 foi realizada usando o kit de transfecção ExpifectamineTM 293.

As células em 2  106 células/mL foram colocadas em um frasco de 125 mL e cultivadas. Em seguida, no dia seguinte, foi realizada a transfecção. As células 293 foram diluídas para um total de 25,5 mL a 2,9  106 células/mL e complexos para transfecção foram preparados. 30 g de DNA foram colocados em um tubo de 15 mL e ajustados para 1,5 mL usando Opti-MEM. Desta forma, o Complexo 1 foi preparado.

81 µL de reagente ExpiFectamineTM 293 foram colocados em outro tubo de 15 mL e ajustados para 1,5 mL usando Opti-MEM. Desta forma, o Complexo 2 foi preparado.

A incubação foi realizada em temperatura ambiente por 5 minutos. Após 5 minutos, o Complexo 1 foi transferido para o tubo contendo o Complexo 2 e a mistura foi realizada.

Em seguida, o tubo foi incubado em temperatura ambiente por 20 minutos para preparar um complexo de DNA-lipídeo. Após a conclusão da incubação, o complexo de DNA-lipídeo foi todo colocado no frasco de 125 mL contendo células 293 e a cultura foi realizada em uma incubadora. 20 horas depois, foi realizado o tratamento com Potencializadores. 150 µL de Potencializador de Transfecção 1 ExpiFectamineTM 293 foi colocado em um tubo de 1,5 mL, e Potencializador de Transfecção 2 ExpiFectamineTM 293 foi adicionado a 1,5 mL. Em seguida, o resultante foi adicionado às células 293 e a incubação foi realizada em incubadora por 5 dias. Após 5 dias, o sobrenadante da cultura foi obtido, filtrado em filtro de 0,45 µm e armazenado congelado até a purificação.

Exemplo 6-2: Purificação para obter antígenos

[092] A solução de cultura, que havia sido armazenada congelada, foi descongelada e uma quantidade igual de PBS foi adicionada à solução de cultura. A filtração foi realizada usando um filtro de 0,22 µm e, em seguida, foi realizada a cromatografia de troca aniônica. Ao eluato foi adicionado NaCl 5 M e foi realizada cromatografia de interação hidrofóbica. O eluato submetido à cromatografia foi filtrado em filtro de 0,22 µm e armazenado congelado até a realização dos experimentos com animais.

Exemplo 6-3: Imunização

[093] Experimentos com animais foram realizados para identificar a imunogenicidade dos fragmentos do antígeno de gE. Camundongos C57BL/6 fêmeas foram injetados intramuscularmente com os fragmentos de antígeno de gE em um intervalo de 2 semanas, e amostras de sangue foram coletadas dos camundongos 2 semanas após a imunização secundária. Os soros foram separados das amostras de sangue coletadas e, em seguida, armazenados congelados até a titulação de anticorpos ser medida.

Exemplo 6-4: Medição da potência de IgG específica do antígeno e respondedores

[094] O ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) foi realizado para medir a potência de IgG específica do antígeno. As proteínas de superfície de VZV (1 μg/mL) foram revestidas em placas de ELISA, a incubação de um dia para o outro foi realizada a 4 °C e cada uma das placas de ELISA foi lavada 3 vezes. Em seguida, a placa de ELISA foi bloqueada com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA) por 1 hora. A placa de ELISA foi lavada. Em seguida, uma amostra de soro diluída foi adicionada à mesma e a incubação foi realizada por 2 horas. Anticorpo IgG de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (HRP) foi adicionado e a incubação foi realizada durante 1 hora. Após a incubação final, a placa de ELISA foi lavada e a reação de HRP foi induzida pela adição de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), que é um substrato. Em seguida, a solução de interrupção de ELISA foi adicionada para interromper a reação de HRP, e a densidade óptica (OD) foi medida usando um espectrômetro a 450 nm.

[095] Para identificar se uma diferença na sequência entre os fragmentos do antígeno de gE causa uma diferença na imunogenicidade específica do antígeno, a imunização animal foi realizada pelo método descrito no Exemplo 6-3. A titulação de anticorpo específico do antígeno foi medida usando soros obtidos nas experiências com animais de acordo com o método de medição de titulação de anticorpo acima.

Como resultado, conforme ilustrado na FIG. 7, o valor de OD após imunização com gE 534 aa ou gE 543 aa foi maior do que o valor de OD após imunização com gE 500 aa, gE 510 aa, gE 525 aa ou gE 546 aa.

[096] Após a medição da titulação de anticorpos, os indivíduos com um valor de OD de 0,6 ou superior foram considerados respondedores e os resultados foram resumidos. Como resultado, não houve resposta específica do antígeno para gE 500 aa, e o número de respondedores após imunização com gE 510 aa foi o mesmo que após imunização com gE 546 aa. O número de respondedores após imunização com gE 525 aa, gE 534 aa, gE 537 aa ou gE 540 aa foi maior do que o número de respondedores após imunização com gE 510 aa ou gE 546 aa. Ou seja, foi identificado que gE 525 aa a gE 540 aa exibiu um número maior de respondedores (FIG. 8).

[097] Como resultado, gE 534 aa a gE 543 aa mostraram valores mais altos na medição da titulação de anticorpo, e gE 525a a gE 540 aa mostraram valores mais altos em respondedores específicos ao antígeno. Portanto, em um caso em que os dois resultados acima são colocados juntos, pode ser identificado que gE 534 aa a 540 aa apresentam maior imunogenicidade.

Aplicabilidade Industrial

[098] A variante do antígeno da proteína de superfície (gE) do vírus da Varicela Zoster de acordo com a presente invenção é um antígeno de proteína. No caso de ser usada como uma composição de vacina, a variante de antígeno exibe excelente segurança e alto nível de expressão em células hospedeiras em comparação com uma vacina de vírus vivo. Assim, tal variante de antígeno é útil como uma vacina para prevenção ou tratamento de varicela ou herpes zoster induzida pelo vírus da Varicela Zoster.

[099] Como afirmado acima, partes específicas da presente invenção foram descritas em detalhes. No entanto, é evidente para aqueles versados na técnica que tal descrição específica é apenas para ilustrar modalidades preferidas, e o escopo da presente invenção não está limitado às mesmas. Consequentemente, o escopo substancial da presente invenção será definido pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.

Texto Sem Listagem de Sequência Arquivo eletrônico em anexo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Variante de antígeno de proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster, CARACTERIZADA pelo fato de que inclui uma variação que é o truncamento do terminal carboxi de qualquer um dos resíduos de aminoácido selecionados do grupo que consiste nos 525º a 543º resíduos de aminoácido no antígeno de proteína (gE) de superfície do Vírus da Varicela Zoster representado pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

2. Variante do antígeno de proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o 40º resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 é treonina.

3. Variante do antígeno de proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o 536º resíduo de aminoácido na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 é leucina.

4. Variante do antígeno de proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a variante do antígeno é representada por qualquer uma das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 2 a 8 e SEQ ID NOs: 21 a 23.

5. Gene, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica a variante do antígeno de proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Gene, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene é representado por qualquer uma das sequências de nucleotídeos da SEQ ID NOs: 9 a 15.

7. Vetor recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: o gene conforme definido na reivindicação 5.

8. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que é transformada com o vetor recombinante conforme definido na reivindicação 7.

9. Composição de vacina, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende como um ingrediente ativo: a variante do antígeno de proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

10. Uso de uma composição de vacina que compreende, como um ingrediente ativo, a variante do antígeno de proteína de superfície do Vírus da Varicela Zoster, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou o tratamento de varicela ou herpes zoster.