JP5979684B2 - 莢膜多糖の収量向上のための細菌培養方法 - Google Patents

Description

莢膜多糖(以下、ＣＰと略記する)は、各種細菌性疾患に関係する細菌の表面に見出される重要な免疫原である。この特徴により、ワクチンの設計において莢膜多糖が重要な要素となることに繋がる。莢膜多糖は、特に担体タンパク質に結合した場合に、免疫応答を誘発するのに有用であることが証明されている。

通常、莢膜多糖は、複合培地において回分培養(batch culture)を用いて生産される（非特許文献１〜６を参照）。栄養素流加の従来型ＤＯスタット（DO-stat）制御は、単に、栄養素の制限又は枯渇による（炭素基質の減少又は酸素消費若しくは酸素呼吸の停止に起因する）溶存酸素濃度（以下、ＤＯと略記する）の上昇(rise)／急上昇(spike)の概念に基づくものである。ＤＯスタット制御は、一定の制限値（ＤＯ設定値）以内の一定ＤＯレベルで培養物を維持しようとする制御である。ＤＯが該設定値を越えて上昇した場合には栄養素流加速度を増加させ、ＤＯが該設定値を下回った場合には栄養流加速度を低下させることにより、前述の通り一定ＤＯレベルで培養物を維持するものである。ＤＯスタット法は、通常、栄養素の枯渇が急激なＤＯ上昇に繋がる規定培地において、巧く機能する。しかしながら、ＤＯスタット法は、しばしば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、カザミノ酸又はハイソイ（Hy-Soy）等の栄養価の高い複合栄養素を添加した培地では機能しない。栄養価の高い複合栄養素によれば、炭素源の制限又は枯渇の下でさえも、ＤＯレベルが低く留まるように（つまり、明確なＤＯ急上昇が無い）、アミノ酸異化作用を介して細胞維持及び細胞呼吸を支持することが可能である。

培養増殖のために複合培地が用いられる場合、一旦炭素源が枯渇すると培養物ｐＨは増加する傾向にあるため、ＤＯスタットよりもｐＨスタット（pH-stat）法の方がより適当となり得る。ＤＯスタット制御と同様に、ｐＨスタット法は、ｐＨが設定値を越えて上昇した場合には栄養素流加速度を増加させ、ｐＨが設定値を下回った場合には栄養素流加速度を低下させることにより、設定値付近に培養物ｐＨを一定維持するものである。しかしながら、栄養素枯渇による培養物ｐＨの変化は、ＤＯの変化よりも反応性が低いことから、ｐＨスタットによる流加制御は、ＤＯスタットと比較すると相対的に反応が鈍いものとなり得る。

大抵の研究では、増殖速度、栄養素レベル及び代謝濃度が培養の際に変化する回分培養システムが用いられていた。このようなシステムでは、１つの因子が変化すると、増殖に関係したその他因子の変化を生じさせ、このようなその他因子の変化は生産量に予測し得ない影響を及ぼし得る。研究者は、連続培養（continuous culture）を用いることで、回分培養による増殖の際には相互に依存し合うパラメータ（例えば、増殖速度、栄養素濃度及び産物濃度、細胞密度等）をそれぞれ分離して定義することが可能になる。連続培養の際は、新鮮培地が固定速度で培養物に添加され、かつ細胞及び培地が一定の培養容量を維持する速度で除去される。

灌流培養(perfusion culture)では、新鮮培地が固定速度で培養物に添加され、かつ細胞非含有使用済み培地が一定の培養容量を維持する速度で除去される。しかしながら、連続培養及び灌流培養は、安定性の問題とコンタミネーションを悪化させる傾向があり、さらに培地及び栄養素を連続流加することから幾分費用を要する。従って、前述の連続培養に伴う問題を克服することを目的として、莢膜多糖を高収量で生産するための連続培養に代わる代替法を見出す必要がある。

連続培養の欠点を克服するための１つのアプローチが、特許文献１に例示されている。複合流加発酵プロセス(complex fed-batch fermentation process)が、莢膜多糖の生産に好ましい栄養環境及び増殖速度を維持するために開発された。このプロセスは、回分培養及び連続培養の手法の利点を組み合せたものであり、指数増殖期の拡張並びに発酵中の基質添加を制御する条件により高細胞密度を達成するものである。しかしながら、該複合流加発酵の手法は、複雑なアルゴリズムを有するソフトウェアを用いて発酵を管理するものである。

他のアプローチが、特許文献２に開示されている。細菌を培養するための方法であって、培養が、酵母エキスの２回の瞬時添加、並びにその後に続くグルコースの直線的添加を含む方法が開発された。それぞれの添加は、指定ＯＤ（光学濃度）レベルで開始される。従って、この方法では、アルゴリズムを用いずに炭素源を直線的に添加したことが、先の複合流加発酵プロセスに対する改善点である。しかしながら、この方法は、ＯＤの連続測定を必要とする極めて面倒な方法である。さらに、この方法は、常に変化する、生物体の必要条件（微小環境）を考慮していない。

本発明は、驚くべき発見に基づくものであり、流加発酵の際の流加培地の添加速度が、予め設定したｐＨを維持するためのアルカリ混合物の添加速度と同等であることにより、従来の回分発酵法と比較してＣＰ収量が容積測定上、増加する、新規流加方法に関する。

国際公開第２００７／０５２１６８号 国際公開第２０１０／０２７２７５５号

Shen et al. 2001 Vaccine 19: 850-61 Palazzi et al. 2004 J. Infect. Dis. 190:558-64 Merritt et al. 2000 J. Biotech. 81:189-97 Dassy & Fournier 1996 Infect. Immunol. 64:2408-14 Suarez et al. (2001) Appl . Env. Microbiol. 67:969-71 Wicken et al. (1983) J. Bact. 153:84-92

本発明は、回分方式発酵と比較して莢膜多糖の生産性が３〜５倍増加する新規流加発酵法を提供するものである。

特に、本方法は、容積測定上の莢膜多糖（ＣＰ）産生量をより高くするための莢膜形成細菌を培養する方法であって、以下を含む方法に関する：（ａ）前記ＣＰを発現する細菌株の接種源を提供すること；（ｂ）前記菌株を、ｐＨ７．２で発酵させることにより培養すること、但し、流加培地の添加速度が、予め設定したｐＨを維持するためのアルカリ混合物添加の速度と同等である；（ｃ）培地を３５〜３８℃、５０〜１５０ｒｐｍの攪拌下、０．１〜０．５ｖｖｍの空気流量で発酵させること。

各種流加法ごとの肺炎球菌血清型１多糖（流加発酵）の収量を示す図である。 ｐＨを維持するためのアルカリ混合物における様々な塩基比率に関する肺炎球菌血清型１多糖の収量（流加発酵）を示す図である。 回分発酵と比較した、流加発酵による肺炎球菌血清型１、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆ多糖の収量を示す図である。

本開示は、細菌を培養するプロセスであって、流加発酵の際の流加添加の速度が、予め設定したｐＨを維持するためのアルカリ混合物添加の速度と同等である、プロセスを提供する。

本発明のその他態様によれば、特定の比率のＮａＯＨ及びＮａ_２ＣＯ_３から成るアルカリ混合物が、ａ）予め設定したｐＨを維持するために、かつｂ）より高い莢膜多糖収量を得るために用いられ得る。Ｎａ_２ＣＯ_３単独の使用は、増殖及びｐＨ制御に好適な培地を提供し得るが、このようなＮａ_２ＣＯ_３の制限条件は、莢膜多糖を産生するのには過酷な条件であり、Ｎａ_２ＣＯ_３必要量を高くしてしまう。従って、ＮａＯＨとＮａ_２ＣＯ_３との混合物がｐＨを維持するために用いられる場合、増殖は低くなり得るが、アルカリ消費量がより少ないことに起因して、莢膜多糖の特異的生産性並びに容積測定上の生産性をより高める。

本発明によれば、グルコースが乳酸に変化し、ｐＨが低下し始めた際には、ｐＨは、アルカリ混合物を添加することにより維持することができ、それと同時に培地中の枯渇したグルコースを補給するためにグルコースが添加される。

本発明の好ましい実施形態では、発酵流加成分は、少なくとも１つの炭素源、少なくとも１つの窒素源、少なくとも１つのマグネシウム源を含むことができ、それら成分は、アルカリ混合物の添加速度と同等の流加速度で、特定の細胞密度の回分発酵に流加され得る。

本発明の一実施形態によれば、前記アルカリ混合物は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、及び水酸化カルシウムから成る群から選択される少なくとも２つの塩基を含有する。また、水酸化ナトリウムと炭酸ナトリウムとの指定比率が、容積測定上のＣＰ産生量をより高めるように選択される。

炭酸ナトリウムに対する水酸化ナトリウムの指定比率は、１：１〜４：１であり得る。

本発明によれば、ＮａＯＨは、ｐＨを維持するための混合物としてＮａ_２ＣＯ_３と共に用いられた場合に、ＣＰの生産性をさらに増強した。ｐＨを維持するためにＮａ_２ＣＯ_３を単独で用いた場合、増殖に好適な培地を提供した。しかしながら、Ｎａ_２ＣＯ_３の同制限条件では、莢膜多糖を産生するのには過酷な条件を提供するものであった。ｐＨを維持するためにＮａＯＨとＮａ_２ＣＯ_３との混合物を使用した場合、増殖は低かったが、ＣＰの生産性は増加した。

好ましくは、本発明によれば、流加培養においてストレプトコッカス属(Streptococcus)を培養する方法であって、高収量のＣＰが生産される、方法が提供される。好ましくは、培養培地からのＣＰの収量が、９００〜２０００ｍｇ／Ｌ、或いはそれ以上である。従って、本流加培養法によれば、容積測定上の収量におけるＣＰの生産が回分培養と比較して１５０〜３５０％増加することが可能になる。場合によっては、収量が、回分培養を用いて生産した量の少なくとも２倍、より好ましくは４倍になり得る。

本発明の他の実施形態によれば、前記流加培地は、少なくとも１つの炭素源、少なくとも１つの窒素源、少なくとも１つの塩、及び少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。
好ましくは、前記炭素源はグルコースである。窒素源は、酵母自己分解物、イースト・ナイトロジェン・ベース(yeast nitrogen base)、ペプトン、トリプトン、カザミノ酸、大豆粕、ハイソイ（Hy-Soy）、酵母エキス、及びトリプチック・ソイ・ブロス(tryptic soy broth)から選択され得る。塩は、硫酸カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、及びそれらの混合物から選択され得る。

本発明によれば、流加培地は、以下の成分を含み得る：１００〜５００ｇ／Ｌの範囲のグルコース、１〜７．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム、４０〜１５０ｇ／Ｌの範囲のハイソヤ(Hy-Soya)、５〜５０ｇ／Ｌの範囲の酵母エキス、０．００２〜０．００５ｇ／Ｌの範囲のチアミン塩酸塩、０．２〜０．５ｇ／Ｌの範囲のシステイン、０．２〜０．５ｇ／Ｌの範囲の塩化カルシウム。

また、流加培地は、以下の成分を含み得る：１００〜５００ｇ／Ｌの範囲のグルコース、５〜５０ｇ／Ｌの範囲の酵母エキス、０．００２〜０．００５ｇ／Ｌの範囲のチアミン塩酸塩、０．２〜０．５ｇ／Ｌの範囲のシステイン、０．２〜０．５ｇ／Ｌの範囲の塩化カルシウム。

或いは、前記流加培地は、以下の成分を含み得る：１００〜５００ｇ／Ｌの範囲のグルコース、０．５〜７．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム、４０〜１５０ｇ／Ｌの範囲のハイソヤ(Hy-Soya)、及び５〜５０ｇ／Ｌの範囲の酵母エキス。

本発明の好ましい実施形態によれば、流加培地は、以下の成分を含み得る：１００〜２００ｇ／Ｌの範囲のグルコース、１〜３ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム、５０〜１５０ｇ／Ｌの範囲のハイソヤ(Hy-Soya)、及び１５〜２５ｇ／Ｌの範囲の酵母エキス。

本発明によれば、前記新規流加培養プロセスが、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）、クレブシエラ属（Klebsiella）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）血清型Ａ、Ｃ、Ｗ_１３５、Ｙ及びＸ、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、サルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・パラチフィ（Salmonella paratyphi）、シゲラ・ディゼンテリエ（Shigella dysenteriae）、シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ソネイ（Shigella sonnei）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、Ａ群連鎖球菌(Group A Streptococcus)、Ｂ群連鎖球菌(Group B streptococcus)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）及びストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）から成る群から選択されるものの莢膜多糖を調製するために利用され得る。

＜実施例１＞ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１に関する流加培養開発の最適化のための流加法評価：
各種流加法を、流加について評価した。ＤＯスタット法は、ストレプトコッカス・ニューモニエの発酵には適用可能ではなかった。ストレプトコッカス・ニューモニエは、微好気性細菌であるので、発酵プロセスの際は、表面のみの曝気（エアレーション）が必要であった。回分方式発酵の際、発酵槽におけるストレプトコッカス・ニューモニエの部分的な増殖の後、溶存酸素は０付近であった。

５つの異なる流加法を流加発酵に試した。
１．ｐＨスタット法(pH stat method)：ｐＨスタット流加を、設定ｐＨポイントによって制御するものであり、培養物のｐＨが設定ｐＨを越えて上昇した場合には炭素源を培地に添加し、培養物のｐＨが設定ｐＨを下回った場合には、炭素流加を停止した。
２．定速流加法：本方法では、１Ｌの濃縮フィードが１．６Ｌのブロス培養物に４時間、４．２ｍＬ／分で与えた。
３．指数的流加法：流加速度は、１ｍＬ／分から開始し、ＯＤに伴って増加させた。流加速度は、ＯＤにおける１ユニット増分当たり０．５ｍＬ／分ずつ増加させた。
４．一定グルコース濃度：残留グルコース濃度を、流加発酵の際、０．５ｇ／Ｌ付近に維持するようにした。
５．ｐＨ依存流加法：本方法では、ｐＨは、Ｎａ_２ＣＯ_３を用いて維持した。培地中のグルコース枯渇に対して、ｐＨを維持するために培地に流加したＮａ_２ＣＯ_３と同じ速度で、グルコースを添加した。

エヌ・ビー・エス・バイオフロ115（NBS Bioflo 115）及びバイオエンジニアリング・エー・ジー発酵槽（Bioengineering AG fermenter）を、これら全ての実験に使用した。本試験は、３Ｌ型のエヌ・ビー・エス・バイオフロ115発酵槽モデルで実施し、３０Ｌ型のバイオエンジニアリング・エー・ジー発酵槽にスケールアップした。さらなるスケールアップは、４５０Ｌ型のバイオエンジニアリング発酵槽で実施できた。２００ｇ／Ｌのグルコース及び５ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４を、全ての流加発酵に流加培地として用いた。発酵条件は、全ての流加実験において同一とした。ｐＨは、発酵プロセスの間、２０％Ｎａ_２ＣＯ_３溶液で維持した。
流加発酵の際、以下のパラメータを維持した。
温度（３６．５±０．５）、ｐＨ（７．１±０．２）、ＲＰＭ：１００、気流（表面曝気）：０．５ｖｖｍ

表１：各種流加法に関する血清型１のＣＰ収量

＜実施例２＞ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１のＣＰの流加発酵のための流加培地の最適化：
以下の各種培地を発酵の際、流加に用いた。
１．グルコース：２００ｇ／Ｌ
２．グルコース（２００ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ_４（２．５ｇ／Ｌ）
３．グルコース：２００ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４：２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス：２５ｇ／Ｌ
４．グルコース：１００ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４：５ｇ／Ｌ、酵母エキス：１５ｇ／Ｌ、ハイソヤ（Ｈｙ−ｓｏｙａ）：５０ｇ／Ｌ
５．グルコース：２００ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４：２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス：２５ｇ／Ｌ、ハイソヤ（Ｈｙ−ｓｏｙａ）：１００ｇ／Ｌ
６．グルコース：２００ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４：２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス：２５ｇ／Ｌ、ハイソヤ（Ｈｙ−ｓｏｙａ）：１００ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩：０．０２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ：０．０．０２ｇ／Ｌ、システイン：０．２ｇ／Ｌ
７．グルコース：１００ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４：１ｇ／Ｌ、酵母エキス：１０ｇ／Ｌ、ハイソヤ（Ｈｙ−ｓｏｙａ）：４０ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩：０．０４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ：０．０４ｇ／Ｌ、システイン：０．４ｇ／Ｌ
全ての発酵条件を上述の通り維持した。ｐＨ依存流加法が、全てのバッチに対して流加発酵の流加のために用いられた。第４番目の流加培地をさらなる流加実験のために利用した。

表２：各種流加培地組成物に対する血清型１のＣＰ収量

＜実施例３＞ｐＨを維持するために用いたアルカリ混合物：
ＮａＯＨは、ｐＨを維持するための混合物としてＮａ_２ＣＯ_３と共に用いた場合に、ＣＰの生産性をさらに増強した。Ｎａ_２ＣＯ_３単独では、ｐＨを維持するために用いた場合、増殖に好適な培地を提供した。このようなＮａ_２ＣＯ_３の制限条件ではＣＰを産生するのには過酷な条件が提供された。ＮａＯＨとＮａ_２ＣＯ_３との混合物をｐＨを維持するために用いた場合、増殖は低かったが、ＣＰ生産性は増加した。８％ＮａＯＨと２０％Ｎａ_２ＣＯ_３を、１：１、２：１、３：１、及び４：１の比率で用いた。実施例２の流加培地組成物３を以下の流加培養に流加物として用いた。

表３：ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１の流加発酵に関しｐＨ維持のために用いたアルカリ混合物

＜実施例４＞
各種血清型のストレプトコッカス・ニューモニエを最適化した流加培養条件で試した。

血清型１のための流加培養条件を、その他血清型についても用いた。流加発酵を実施する上で、以下の条件を考慮した。
１．ｐＨ依存流加法
２．用いたアルカリ混合物
３．最適化流加培地
４．その他発酵は、上記と同様であった。

流加培養プロセスの新規に最適化した条件を利用し、血清型１、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆを用いた。

表４：各種血清型に関する流加発酵におけるＣＰ収量

このように、本発明の流加培養法は、１５０〜３５０％に渡りＣＰ収率の容積測定上の増加をもたらし、最終ＣＰ収量は９００〜２０００ｍｇ／Ｌに渡る。

本発明が前述の説明のための実施例の詳細に限定されるものではなく、かつ本発明が、その本質的な属性から逸脱することなくその他特定の形態に具体化され得ることは、当業者に明らかである。従って、本実施形態及び実施例は、あらゆる点で説明のためのものであって、前述の説明よりも添付の特許請求の範囲を参照すべきことが要求されており、特許請求の範囲と同等の意味ないし範囲内に入るあらゆる変更は包含され、或いはそれ故に包含されることが意図されている。

Claims (12)

1. 莢膜多糖（ＣＰ）の産生量をより高くするためのストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）を培養する細菌培養方法であって、以下を含む方法：
   （ａ）前記ＣＰを発現する細菌株の接種源を提供すること；
   （ｂ）前記細菌株を、ｐＨ６．９乃至７．３で流加培養により発酵させること、但し、流加培地の添加速度が、前記ｐＨを維持するためのアルカリ混合物の添加の速度と同等であり、かつ、前記アルカリ混合物がそれぞれ３対１の割合で８％の水酸化ナトリウム溶液及び２０％の炭酸ナトリウム溶液を含むこと；
   （ｃ）培地を３５〜３８℃、５０〜１５０ｒｐｍの攪拌下、０．１〜０．５ｖｖｍの空気流量で発酵させること。
2. 前記ＣＰの収量における容積測定上の増加率が、回分培養又は連続培養の条件と比較して１５０〜４００％である、請求項１に記載の細菌培養方法。
3. 前記ＣＰの収量が９００ｍｇ／Ｌ〜２０００ｍｇ／Ｌである、請求項２に記載の細菌培養方法。
4. 前記流加培地が、少なくとも一つの炭素源、少なくとも一つの窒素源、少なくとも一つの塩、及び少なくとも一つのアミノ酸を含む、請求項１に記載の細菌培養方法。
5. 前記炭素源がグルコースである、請求項４に記載の細菌培養方法。
6. 前記窒素源が、以下の組成から選択されてなる、請求項４に記載の細菌培養方法：
   酵母自己分解物、イースト・ナイトロジェン・ベース(yeast nitrogen base)、ペプトン、トリプトン、カザミノ酸、大豆粕、ハイソイ（Hy-Soy）、酵母エキス、及びトリプチック・ソイ・ブロス(tryptic soy broth)。
7. 前記塩が、硫酸カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、及びそれらの混合物から選択される、請求項４に記載の細菌培養方法。
8. 前記流加培地が、以下の成分を含む、請求項４に記載の細菌培養方法：１００〜５００ｇ／Ｌの範囲のグルコース、１〜７．５ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム、４０〜１５０ｇ／Ｌの範囲のハイソヤ（Ｈｙ−Ｓｏｙａ）、５〜５０ｇ／Ｌの範囲の酵母エキス、０．００２〜０．００５ｇ／Ｌの範囲のチアミン塩酸塩、０．２〜０．５ｇ／Ｌの範囲のシステイン、０．２〜０．５ｇ／Ｌの範囲の塩化カルシウム。
9. 前記流加培地が、以下の成分を含む、請求項８に記載の細菌培養方法：１００〜５００ｇ／Ｌの範囲のグルコース、５〜５０ｇ／Ｌの範囲の酵母エキス、０．００２〜０．００５ｇ／Ｌの範囲のチアミン塩酸塩、０．２〜０．５ｇ／Ｌの範囲のシステイン、０．２〜０．５ｇ／Ｌの範囲の塩化カルシウム。
10. 前記流加培地が、以下の成分を含む、請求項８に記載の細菌培養方法：１００〜２００ｇ／Ｌの範囲のグルコース、１〜３ｇ／Ｌの範囲の硫酸マグネシウム、５０〜１５０ｇ／Ｌの範囲のハイソヤ（Ｈｙ−Ｓｏｙａ）、及び１５〜２５ｇ／Ｌの範囲の酵母エキス。
11. 前記アルカリ混合物中の水酸化ナトリウムの濃度が１．５〜３．０Ｍである、請求項１に記載の細菌培養方法。
12. 前記アルカリ混合物中の炭酸ナトリウムの濃度が１０〜２０ｗ／ｖ％である、請求項１に記載の細菌培養方法。

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