CN1046189A - 羊生长激素 - Google Patents
羊生长激素 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1046189A CN1046189A CN89108362A CN89108362A CN1046189A CN 1046189 A CN1046189 A CN 1046189A CN 89108362 A CN89108362 A CN 89108362A CN 89108362 A CN89108362 A CN 89108362A CN 1046189 A CN1046189 A CN 1046189A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- growth hormone
- animal
- sheep growth
- sheep
- dna sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101000868138 Ovis aries Somatotropin Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 81
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 60
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 46
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 40
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims abstract description 32
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims abstract description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 22
- 235000020995 raw meat Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 32
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 29
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 27
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 16
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 16
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 15
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 12
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 11
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 10
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 10
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 claims description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002363 auxin Substances 0.000 claims description 5
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 claims description 5
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 claims description 4
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 4
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 claims description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 2
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 claims 1
- 101100443630 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) dni1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 claims 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract 1
- 230000008676 import Effects 0.000 abstract 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000002585 base Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- -1 inorganic acid salt Chemical class 0.000 description 3
- 235000020997 lean meat Nutrition 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 3
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000612118 Samolus valerandi Species 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000002650 habitual effect Effects 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000004132 lipogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- QGMGHALXLXKCBD-UHFFFAOYSA-N 4-amino-n-(2-aminophenyl)benzamide Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1N QGMGHALXLXKCBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N Ala-Phe-Pro Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)C(=O)N1[C@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 229920001634 Copolyester Polymers 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010016825 Flushing Diseases 0.000 description 1
- 102100036717 Growth hormone variant Human genes 0.000 description 1
- CTCFZNBRZBNKAX-YUMQZZPRSA-N His-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 CTCFZNBRZBNKAX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 241000274177 Juniperus sabina Species 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012952 Resampling Methods 0.000 description 1
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- OTJMMKPMLUNTQT-AVGNSLFASA-N Val-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N OTJMMKPMLUNTQT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical class N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000013569 fruit product Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010066198 glycyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 231100000652 hormesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002684 recombinant hormone Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 239000012747 synergistic agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
- A61K9/0068—Rumen, e.g. rumen bolus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/184—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请公开了一种重组羊生长激素,一种羊生长 激素基因的生产方法,和用于在原核生物内表达和纯 化高水平羊生长激素的质粒表达载体的构建方法。 本发明包括将一种编码具有羊生长激素活性的重组 多肽的互补DNA顺序与克隆载体连接,构成克隆分 子,将重组质粒表达载体导入单细胞后,培养所得到 的生物体,从该培养物中分离得到具有羊生长激素活 性的多肽。含有本发明羊生长激素的组合物可用于 提高牛羊一类动物的食物转化率和生肉质量。
Description
本发明涉及一种重组羊生长激素,一种羊生长激素基因的生产方法,和用于在原核生物内表达和纯化高水平羊生长激素的质粒表达载体的构建方法。
生长激素(一种多肽激素)是在垂体前叶中以大的前体分子形式合成的,由酶从该前体上切割下单肽,产生具有生物活性的成熟生长激素。生长激素,更恰当地说是一种全身组织代谢因子,可以在哺乳动物和其他脊椎动物体内产生大量的生理效应。它是一种骨骼生长促进因子和一种蛋白合成增效剂。生长激素还表现出胰岛素强化特性,具有弱的催乳活性,并且在脂类代谢和保持自身稳定方面起着一定的作用。关于生长激素,有一定程度的种族特异性,如牛的生长激素在人或猴体内不具有活性,但在鼠和山羊体内会产生效应。
在羊饲养业中,使用生长激素可以提高食物转化率,从而增加体重并改善生肉的质量。这可以从共同未决澳大利亚专利申请62522/86中得到解释,为了便于参考,该申请的整个公开技术列入本申请,不过,尽管在羊饲养业中生长激素的使用尚存在经济方面可行性的困难,但现有自然的、从垂体中提取的羊生长激素仍远远供不应求。如果产品具有种族特异性,就不能使用其他自然产生的生长促进多肽。尽管如此,重组DNA技术的发展及应用可以对编码羊生长激素的DNA顺序进行操作,并在原核生物(如细菌)内生产高水平的这种蛋白。
因此,本发明的目的就是解决,或者至少缓解现有技术中的一个或几个困难。尤其是我们已经能够运用后面所描述的方法较大量地生产具有良好羊生长激素活性的重组多肽。这些多肽具有良好的生物活性,而且可以在体内做为自然激素的有效代用品。
因此,本发明的第一个方面是提供一种制备分子克隆的方法,该方法包括:
提供
一种用于编码具有羊生长激素活性的重组多肽的互补DNA(cDNA)顺序;和
一种合适的克隆载体;
连接该DNA顺序和克隆载体,使该DNA顺序置于克隆载体内形成一个分子克隆。
如此形成的载体包括该羊生长激素多肽编码区的完整或部分拷贝(它包括成熟的激素)并延伸超出该3′末端密码子。
用于编码具有羊生长激素活性多肽的DNA顺序可从由羊垂体腺中分离出的多腺苷酸信使RNA中提取。
因此,本发明的另一方面是,提供了一种用于编码具有羊生长激素活性多肽的DNA顺序的制备方法,该方法包括下列主要步骤:
提供羊垂体腺源;
从中分离多腺苷酸信使RNA(mRNA);
在寡聚dT引物存在下用反转录酶处理mRNA以合成第一条互补DNA(cDNA)链;
用RNA酶H除去mRNA,然后用DNA聚合酶Ⅰ合成第二条互补DNA链;和
用T4DNA聚合酶处理如此形成的双链互补DNA(cDNA)以产生平(钝)端分子。
从羊垂体腺中分离多腺苷酸RNA的步骤可以采用任何合适的方法,例如,运用胍硫氰酸盐处理法和亲和层析法。
可以从许多原核克隆载体中选择适合本发明的克隆载体。已经发现噬菌体病毒载体λgt 10和类似物适合于本发明。
连接步骤可以采用合适的形式,克隆反应步骤可以是通过加上合成DNA衔接物进行的连接作用,在这种情况下,用T4DNA连接酶在钝端cDNA分子的任何一端上,连上与Eco RⅠ限制酶识别顺序相应的衔接物。
用酶Eco RⅠ对前面所述的cDNA进行消化,可以产生带有5′Eco RⅠ粘着悬突端的cDNA分子。
然后可以通过连接作用将这些分子克隆到gt 10里的合适Eco RⅠ DNA位点中去;然后将这种DNA“在体外”包进病毒颗粒中,再用它感染合适的细菌微生物,以产生一个重组cDNA库,从该重组cDNA库中可以选择含有可编码羊GH cDNA顺序的重组克隆。
因而,本发明的一个优选方案是,该分子克隆可以从如后面描述的称为OGH1-12和OGH1-14的克隆中选择的一种噬菌体克隆。
这些噬菌体克隆样本已在保藏中心进行了保藏,该保藏机构是Bunge(Australia)Pty.Ltd.North Melbourne,Victoria,Australia。
优选克隆是噬菌体克隆OGH12,该指定克隆包含有一个完整拷贝的羊生长激素多肽编码区(其中包括不翻译的5′和3′侧翼顺序)。已经测定了OGH12的完整DNA顺序,由图1表示。
应当明白,尽管这些噬菌体载体可以作为编码具有羊生长激素活性多肽的DNA顺序稳定保持的有用载体,但这些载体不能作为在原核细胞内进行真核基因表达的载体。在原核细胞内进行真核基因的表达需一种表达载体,该载体采用所述调节顺序调控外来基因的转录和翻译,以使在由该载体转化的原核细胞内进行该基因的合适表达。
因此,本发明的再一方面是,提供一种质粒的制备方法,该质粒带有一个能编码具有羊生长激素活性的重组多肽只能够在单细胞生物中复制、转录和翻译的顺序,该方法包括:
提供
一种已经去除预定长度DNA顺序的限制性质粒表达载体;和
一种DNA序列,该序列编码具有羊生长激素活性重组多肽、或它的一部分,而且包括一个可满足在单细胞生物内转录和翻译调节需要的合成末端顺序;和
将该DNA顺序连接到限制性质粒表达载体上
根据本发明的这个方面,该限制性质粒表达载体可以是任何适宜类型的,最好是一种双起点载体,双起点载体是这样一种载体,其中复制的一个起点可使质粒稳定地保持在低数量的拷贝,而另一起点可随着温度的变化而开关,与克隆基因的组成性表达和增加拷贝数有关。因此,在大量培养时诱导拷贝数量扩增和基因表达是相对便宜和简单的。
限制性质粒表达载体可以由质粒pMG197-pMG411的衍生物(如Yarrington等,1984年,《基因》一书中描述)制得。pMG197是一个双起点质粒,它可从色氨酸启动子开始表达met-胃脂肪酶,该启动子AUG起始密码的上游有一个14个碱基对处的Shine-Dalgarno(SD)顺序。
可将pMG197修饰为一个限制性质粒表达载体,通过在par位点c1857顺序之间去掉EcoRⅠ位点,以及除去met-胃脂肪酶做为BglⅡ-Eco RⅠ片段,以此来修饰pMG197。
为了得到合适的构建,需要一种包括多个步骤的方法,这就必需要求:
(ⅰ)合成与成熟羊GH多肽的5′编码顺序相关的合成寡聚核苷酸,以促进向限制性pMG197的BglⅡ位点进行克隆。此外,选择用于合成寡聚核苷酸的密码子(同时满足相应羊GH氨基酸)应当是那些与存在于大肠杆菌内的最丰富的tRNA相对应的密码子。
因此,在本发明的这方面的一个优选方案中,用于编码重组多肽的DNA顺序包括仅仅用于编码羊生长激素一部分的DNA顺序,它由一个含有合成的5′端顺序和一个3′端顺序,所说的方法还包括:
提供另一种DNA顺序,它包括用于编码羊生长激素的完整DNA顺序的剩余部分;
在合成的5′端顺序和3′端顺序之间的限制性位点处切割所说的DNA顺序;和
将此种DNA顺序连接到限制性位点上。
最好是用两种普通类型寡聚核苷酸中的一种做为所说DNA顺序的合成5′端顺序。
因此可以用两种普通类型的寡聚核苷酸,取代用来编码该oGH编码顺序的前14个氨基酸的DNA。
该oGH cDNA的5′翻译区包括有在真核细胞中将该激素运送穿过内质网的真核信号顺序。用于编码成熟蛋白的顺序起始于信号肽内所使用的第一个核苷酸下游79碱基对处,以致在原核生物的表达系统中必须去除掉真核信号肽。用于编码成熟蛋白的oGH cDNA的5′端起始于编码丙氨酸的密码子,GCC。但是,细菌表达需要从密码子ATG开始,它编码蛋氨酸,于是细菌表达所产生的成熟蛋白是以蛋氨酸开始,而不是丙氨酸。进行这种改变的效果尚不清楚,因此,制备了两个替代的寡聚核苷酸对来修饰该5′端,每个寡聚核苷酸对提供一个ATG开始密码子。其中一个寡聚核苷酸对自然地编码成熟蛋白的NH2端的丙氨酸前面的蛋氨酸。另一对则约去4个NH2末端氨基酸,从而以第5个氨基酸开始,第一个自然是蛋氨酸。将它们设计为Met:1-15和Met:5-15,分别编码OGH氨基酸1-15和5-15。因此,本发明的另一方面,还可提供一个从寡聚核苷酸Met:1-15和Met:5-15中选择的寡聚核苷酸顺序。
第一个的寡聚核苷酸,寡聚核苷酸Met:1-15(包括一个5′Bgl Ⅱ粘着端)具有一个与在成熟羊生长激素多肽中没有的NH2一末端蛋氨酸残基相应的起始密码子(ATG)和与自然激素(成熟形式)的氨基酸1-14相应的密码子,于核苷酸160的一个Hgi AI位点相应的3′悬突处终止。Met:1-15具有如下结构:
5′GATCTATGGCTTTTCCAGCTATGTCTCTTTCTGGTCTGTTCGCTAACGCTGTGCT
55 聚体
3′ATACCGAAAAGGTCGATACAGAGAAAGACCAGACAAGCGATTGCGAC 5′
47 聚体
第二寡聚核苷酸,寡聚核苷酸Met:5-15既有5′Bgl Ⅱ又有3′Hgi AⅠ粘着端,但是它从一个与自然出现的蛋氨酸残基(氨基酸5,成熟激素)相应的密码子起始,后面跟着代表氨基酸6-14的密码子。
Met:5-15具有如下结构:
5′GATCTATGTCTCTTTCTGGTCTGTTCGCTAACGCTGTGCT 3′
40 聚体
3′ATACAGAGAAAGACCAGACAAGCGATTGCGAC 5′
32 聚体
除提供一个ATG密码子外,该寡聚核苷酸顺序还在5′端带有一个Bgl Ⅱ位点,以使其克隆到载体内的相应位点。再者,当设计寡聚物时,要选择这样的密码子,即当保持oGH氨基酸顺序时,这种密码子要与存在于大肠杆菌的最丰富的tRNA的密码子相应。进一步考虑是,尽可能少地使用G-C碱基对,并在可能的地方用A-T碱基对取代,以去掉信使RNA的核糖体粘合点内的潜在二级结构,如果不这样,就会反过来影响转录。
两种寡聚物都在带有一个HgiAⅠ3′悬突的3′端终止,以使每种寡聚物都能通过这点连接到oGH cDNA的残基上。
各种调节成份都与在细菌中表达有关,而且必须存在于最终构建中。它们会象启动子那样影响转录或翻译(需要一个Shine-Dalgarno(SD)位点和ATG起始密码子)。该起始密码子-mRNA的AUG在与f-met tRNA配对时起始作用,并因此促进翻译。细菌内一个mRNA的翻译效率关键取决于核糖体粘合位点-SD顺序,一个6-8个嘌呤核苷酸组的存在;以及取决于这个位点和AUG起始密码子之间的距离。为了有效地运用表达载体表达真核蛋白,该SD顺序一般包括在载体本身里面。鉴于AUG和这个位点之间距离的重要性,因此,对该载体进行了设计,当用BglⅡ位点连接cDNA的5′端时,ATG(当它直接在这个限制性顺序下游时)位于离开SD顺序14个碱基对以远处,这是通过经验发现的,最适于从双起点载体中表达的各种真核蛋白。
该oGH cDNA的不翻译3′端,在EcoR1位点之前,包含有聚A信号顺序和大约200碱基对的腺嘌呤核苷酸。恰好在编码区下游,即邻接最后一个密码三联体处是一个终止密码子TAG,和另一个在聚A信号以前的再向下游40个碱基对处的密码三联体。
因此,根据本发明的另一个方面,可提供一种具有羊生长激素活性的重组多肽的生产方法,该方法包括下列步骤:
提供
一种包含有一个DNA顺序的重组质粒表达载体,该DNA顺序编码具有羊生长激素活性的多肽,并能在单细胞生物内复制、转录和翻译,和
一种单细胞生物;
通过选自转化、转导或转染的一种方法,将所述的重组质粒表达载体导入单细胞生物内;
培养所得到的生物体;
表达由所说DNA顺序编码的重组多肽;和有选择地
从培养物中分离所说的多肽。
在本发明的方法中,单细胞生物可以是一种原核生物,例如一种象大肠杆菌菌株之类的细菌菌株。已经发现大肠杆菌DH1和大肠杆菌1B392尤为适宜。
本发明所使用的重组质粒表达载体,可以是用上述方法制备的任何合适的载体,具体的优选载体有pMGoGH1和pMGoGH2。
本发明的方法尤其适用于制备本文所述的重组多肽oGH1-191和oGH5-191。
本发明方法的步骤(1)-(4)可以通过已知技术方法实现,例如后面所述的实施例。如果想分离步骤(5)中的多肽产品,也可以使用惯用常规技术。因此,在细胞破碎之后,如通过细胞溶解,多肽的分离可通过使用涉及到离子交换、亲和或筛析树脂的色谱法,和/或通过沉淀如离心,或通过其他用于纯化多肽的已知技术来实现。
如果将重组多肽表达为一种不溶性的聚集物和/或变性的物质,可使用常规技术影响溶解性能和变性,如国际专利说明书WO83/04418,英国专利说明书2138004和欧洲专利说明书226448中所述。
本发明方法的步骤(3)中所用的特别有用的生物体包括大肠杆菌菌株,尤其是含有重组质粒表达载体pMGoGH1和pMGoGH2之一的大肠杆菌1B392,而这些菌株、加上突变体、重组体和它们的遗传工程衍生物组成本发明的另一个内容。
表达水平与质粒拷贝数量直接相关。羊生长激素基本上是从色氨酸启动子开始表达,这样从oGH cDNA产生的oGH的最终产量取决于细胞内的拷贝数。在未诱导的细胞内存在一定的漏失量,但是当生长细胞达到所需要的未诱导生物量时这还尚未表现成为一个问题。在200L发酵中,诱导之前可获得一个O.D.=107。
我们用本发明的方法所制备的特别有用的重组多肽包括羊生长激素 变体oGH1-191和oGH5-191。两种重组多肽相对于自然产生的激素而言,在体内具有惊人的良好活性,而且可以在动物体内使用,尤其是羊和牛,可以改善生肉质量和/或增加体重。在这种使用过程中,可以兽医制备物给动物施用oGH1-191和oGH5-191。
因此,根据本发明,我们还可提供一种兽药组合物,该组合物包括从oGH1-191和oGH5-191中选择的具有羊生长激素活性的重组体多肽和它的兽医药上可接受的盐以及一种或几种兽医药上可接受的载体。
这里所用术语oGH1-191是指一种具有自然产生的羊生长激素的氨基酸顺序,N末端的一个附加蛋氨酸残基如下面所述已被去掉的重组体多肽。术语oGH5-191是指除了不含前四个N-末端氨基酸(Ala-Phe-Pro-Ala)外而具有自然产生的羊生长激素的氨基酸顺序的重组多肽。
兽医药上可接受的oGH1-191和oGH5-191的盐包括酸或碱的盐,如象盐酸盐那样的无机酸盐,或象碱金属盐(如钠盐)那样的无机碱盐。
根据本发明的组合物可以采用任何合适的给药形式,包括经口、直肠或非肠道(包括埋入)途径的适当给药方式。若经口给药,该组合物可采用通过常规方法制备的溶液、糖浆或悬浮液如在水缓冲液中,或固体组合物象片剂或胶囊。若是非肠道使用,该组合物可采用如适合于注射的剂型,象悬浮液、水溶液或存在于水以及存在于另外含有赋型剂(象悬浮、稳定、溶解和/或分散剂)的油性载体中的乳剂。
根据本发明的组合物中,有效成分的浓度可根据所需治疗的动物性质及所希望的效果而有所不同,但是一般情况下要使用足够的量,即在0.01至0.2mg/kg活体重/ 天的范围内使用有效成份给药量。
本发明的组合物可以通过常规方法制备,而本发明还可提供一种生产兽医药组合物的方法,该组合物包括一部分从oGH1-191和oGH5-191中选择的具有羊生长激素活性的重组多肽和它的兽医药上可接受的盐以及一种或几种兽医药上可接受的载体。
如上所述,我们发现,在羊和牛体内使用重组羊生长激素而增加的生长激素水平,可以改善生肉质量,这可通过后背脂肪厚度、脂肪与瘦肉的比率,或瘦眼区,另外加上改进的食物转化率而得到证实。
没有发现对动物的健康有什么副作用,这可通过对动物的全身组织进行的病理试验而得到证实。
因此,本发明还可提供一种处理动物的方法,以改善生肉质量和食物转化率,该方法包括:
提供
一种选自完全雄性、雌性和阉割的雄性的羊和牛的动物;
一种外源重组羊生长激素,及其类似物、衍生物、或它们的片段;和
在根据动物的性别预选好活体重和恒量剂量率的情况下;从大约35到100kg的活体重开始给动物使用所说的外源重组羊生长激素,如果是雌性或阉割的雄性动物,剂量率大约是0.06到0.10mg/kg活体重/天;而如果是完全雄性的动物,该剂量率大约是0.01到0.15mg/kg活体重/天。
重组羊生长激素最好是从oGH1-191和oGH5-191中选择。
所处理的动物最好是羊。
在一个优选实施方案中,重组生长激素的给药从活体重约15到50公斤时开始。
在这个优选开始范围中,生肉质量的改善基本上类似于通过超出较长一段时期后所达到的效果。在食物转化率方面表现出较大的改进。
鉴于瘦肉总含量的增加和瘦肉含量比率的增加可以认为是总生长率的增加以及与此结合的组织代谢作用而引起的,因而生肉质量的改进是可以测量的。
瘦肉组织与脂肪组织比率的增加可以认为是组织代谢的作用和脂肪组织含量的减少。
特别是,我们惊奇地发现在生长激素的剂量、开始处理的时间、处理时间的长短、食谱中能量的供给和动物的性别之间,存在着事先没有预想到的很大的相互作用。所改进的雌性和阉割雄性的羊和牛的生肉质量尤其令人意外,因为一般情况下它们比完全雄性更容易蓄积脂肪而产生劣质生肉。
我们的研究表明,根据本发明进行的处理相对于对照动物而言,可以增加被处理动物的生长率。再者,由于用GH处理的动物更有效地利用了食物,生肉质量则大大的改善而动物对食物的消耗量则减少。在超最适度的GH剂量时,生长率不再增加,因为食欲抑制作用显然是有限的。
本发明还可提供一种减少动物生肉脂肪含量的方法,该方法包括:
提供
一种从完全雄性、雌性和阉割雄性的羊和牛这样一组动物中选择的动物。
一种外源重组羊生长激素、及其类似物、衍生物或它们的片段;
按一般恒定剂量率给动物使用所说的外源重组羊生长激素;其中当动物是雌性或阉割雄性时,剂量率大约是0.06到0.1mg/Kg活体重/天,并且在宰杀之前这种处理要求连续约25天;如果动物是完全雄性,剂量率大约是0.1到0.15mg/Kg活体重/天,并且在宰杀之前这种处理要连续约20天。
在一个特别优选的实施方案中,处理的给药形式采用一种慢速释放形式,例如采用可埋入的小丸或可注射的小丸或可注射的乳剂。
尽管上述方法可以大大地改善生肉质量特性,但使用重组羊生长激素是非常昂贵和费时的,因为一般需要每天以单位剂量的合成猪生长激素量给药,并且需要用药约30天的时间或更长。
因此,本发明进一步提供一种改善生肉质量和/或食物转化率的动物处理方法,该方法包括
提供
一种从完全雄性、雌性和阉割雄性的羊和牛这样一组动物中选择的动物;
一种外源重组羊生长激素,及其类似物、衍生物或它们的片段;和
按照根据动物的性别而预选好的活体重和一般恒定剂量,给动物使用所说的外源重组羊生长激素,给药间隔至少一天。
已经惊奇地发现改变给药的周期性,与对照组比较可以引起生长行为的明显改进。虽然我们不希望局限于理论,但是可以假设,对于给药周期的调节可以改变重组生长激素分别对脂肪和肌肉组织的相对抗脂肪生成和蛋白刺激作用。还可以进一步假设,每天给以高剂量的合成生长激素可以使脂肪长成和食物摄取量降低到这样一种程度,以致于与之相关的生长率的改进一般很小而且常常不可测定。
通过将周期性改为每第二、第三或第四天给药,也就是给药间隔为1、2或3天,那么蛋白刺激作用-它是通过另外激素(胰岛素样生长因子1)而间接实现的-还可维持,但是直接的抗脂肪生成作用则减小了。
较为优选方案是,给药剂量为每第二、第三天或第四天给以大约10mg的外源重组羊生长激素,用药时间约为10到30天,最好是30天。
为把生长率增加到最大限度,最好是每第二天以约为10mg的剂量给药。每第四天给药可以引起与对照组相比生长率的显著增加,但不如更频繁给药所引起的生长率增加量大。不过与对照组相比,通过每第四天给药还可增加食物转化率。
本发明的另一个问题是,所使用的预选的一般恒定剂量可以是相对于现有技术中的常用量而减小的量。
例如,如果工业中普遍使用的标准剂量率是约每天10mg,该剂量可以减少到标准剂量的约50%或更少。惊奇地发现,这种剂量的减少与上述大量使用的对照组相比,对于生长率具有类似甚至更强的影响。另外,食物转化率可以大大地增加。
因此,可以结合使用剂量的改变和剂量周期性的改变,以改变合成生长激素对于生长率、食物转化率和生肉质量(脂肪水平等)的相对影响。因而可以为各种不同类型(基因型种和性别)包括羊和牛的动物制定处理方案。
因此,本发明还可提供一种进一步增加所处理动物生长的方法,该方法包括:
接着再在一个预选好的阶段内继续以一个增大的剂量每天给动物使用外源重组羊生长激素。
尤其优选的给药形式是,开始以剂量约4至8mg每间隔1、2或3天给动物使用外源重组羊生长激素约10至25天的时间;和
接着再继续以每天约6至10mg的增大剂量给药5至15天。
已经惊奇地发现,上述给药方式可以进一步引起整个生长过程中生长率和食物转化率的显著增加,而在每天给药的后期阶段也可使脂肪水平的进一步显著减小,从而在宰杀之前大大地改善生肉质量。
处理的初期阶段可以延长约10到25天,更好是15至20天,整个给药的后期阶段可以再延长约5到15天,最好10天。
上述处理方法可以使用一种兽医药组合物,该组合物包括一种约含有3.3至6.6mg/ml的重组羊生长激素、类似物及其盐的衍生物的水缓冲溶液。
在本发明的一个优选方案中,重组羊生长激素的给药可以用持续释放形式。任何可提供持续释放的适宜传递系统都可采用。因此,本发明提供一种持续释放兽医药颗粒,该颗粒包括:
一种至少部分溶解的载体,
在其中埋入一些至少部分溶解的微胶囊,和
微胶囊内有一定有效量的合成生长激素或它的类似物、衍生物、片段或盐。
这种至少部分溶解的持续释放兽医药颗粒的载体可以是一种聚合颗粒。该聚合颗粒可以采用一种植入物或药团的形式。
可以使用一种能够充当合成生长激素佐剂的聚合物,可用一种水溶性聚合物,该聚合物颗粒最好在进入动物体后约8到24小时降解。可以使用一种聚乙烯吡咯烷酮型聚合物,可以用一种聚乙烯吡咯烷酮聚合物或共聚物。应当对该聚合物进行选择,以提供足够的冲压强度,来耐受所选择的传递系统的冲压。可以将普通化合物成份结合到聚合物基质上去。这些化合物成份包括填充剂和膨胀剂。该聚合物还可包括其他活性成份,还包括抗菌素、食物添加剂、兽用顿服药及其类似物。
可以用任何合适的方法制成聚合颗粒,可以利用注射成形技术制备聚合颗粒。
如上所述,根据本发明的持续释放植入物还可包括一些至少部分溶解的埋在载体内的微胶囊。
在聚合作用的步骤中,可以将一些微胶囊掺入聚合颗粒里面去。也可以在成形阶段将微胶囊掺入进去。例如可以利用压片技术将聚合颗粒压缩成所要求的形状。可以利用药片挤压,在成形之前将微胶囊和聚合物混合。
可以利用任何适宜的至少部分溶解的聚合原料制备微胶囊。可以使用聚酯聚合物。最好使用羟基酸及其衍生物的聚合物和共聚物。
在一个优选方案中,可以用羟基乙酸、乳酸及其衍生物或其具有相对低分子量的混合物的第一聚合物或共聚物,和羟基乙酸、乳酸及其衍生物或其具有相对高分子量的混合物的第二聚合物或共聚物制备微胶囊。最好以至少两种颗粒大小形成一些可生物降解的微胶囊。
在另一个优选方案中,那些可生物降解的微胶囊为具有一个相对低的降解率的、一个中等降解率的、或一个相对长的降解率的、或其混合的微胶囊。如上面所讨论的,降解率和反过来被掺入的生理活性成份的释放率可通过使用不同聚合组合物和/或调节所用聚合物的分子量而进行调节。
重组羊生长激素可以通过任何适当的方法裹入微胶囊内。裹胶囊方法包括在一种适宜的溶剂中将聚酯或共聚酯与重组羊生长激素混合;引起聚酯沉淀。
因此,比如重组多肽可以用惯用技术与一种理想载体混合或混和成悬浮于或溶于该载体中。
本发明可通过附带实施例而得到更为全面地描述。然而,应当明白,下面的叙述只是对本发明的解释,不应以任何形式对本发明的一般原则有所限制。
实施例1
方法和结果
质粒pMGoGH1的构建方法见图2的图解。
(ⅰ)制备表达载体pMG197
最终的表达构建物是一个用于在宿主内稳定地保持cDNA并且能有效地进行转录和翻译的适宜载体。这些功能由质粒表达载体pMG197提供。将pMG939(用于编码来自Celltech Limited的猪生长激素的pMG197的一种衍生物)在中性盐限制性缓冲液:50mMNaCl,10mM TrisHCl,pH7.5,10mM MgCl2,1mM二硫苏糖醇(DTT)中用EcoRⅠ和BglⅡ限制性消化,然后用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行磷酸酶处理,去除磷酸基团可以使载体自身的再连接降到最低限度。用0.8%低熔点温度(LMT)琼脂凝胶电泳法将主要的载体片段从pGH cDNA中纯化出来,从凝胶中切下一个含有6.5千碱基对(kb)载体片段的琼脂切片,并通过在50℃熔解和用石炭酸在干冰中萃取将DNA洗提出来。用QIAGEN将存在于水相中的限制载体pMG197纯化。
(ⅱ)制备用于再构建编码成熟oGH蛋白的oGH基因5′端的寡聚物
用Bresatec Ltd.,Adelaide,South Australia的磷酸三酯化学合成法将设计的两种不同的寡聚核苷酸对连接到5′HgiA1位点上。
5′GATCTATGGCTTTTCCAGCTATGTCTCTTTCTGGTCTGTTCGCTAACGCTGTGCT
55 聚体
3′ATACCGAAAAGGTCGATACAGAGAAAGACCAGACAAGCGATTGCGAC 5′
47 聚体
5′ GATCTATGTCTCTTTCTGGTCTGTTCGCTAACGCTGTGCT 3′
4.0 聚体
3′ ATACAGAGAAAGACCAGACAAGCGATTGCGAC 5′
32 聚体
Met 1-15包含有55聚体和47聚体,并且按下述方法构建,为将三段寡聚物连接作用的效率增加到最大限度,55聚体要在被退火到互补47聚体上之前被激活。尽管该寡聚物还可能会通过Bgl Ⅱ位点形成二聚体,但该三段连接作用的磷酸化类型会增加他们以正确顺序装配的几率。用10单位的T4多核苷酸激酶在10mM Tris·HCl pH7.5,10mM MgCl2,10mMDTT,1mMATP中于37℃保持2小时,激活55聚体,然后通过在65℃保温10分钟并在室温下使之慢慢冷却而将55聚体退火到47聚体上。用乙酸铵/乙醇使该退火寡聚物沉淀,以去除未结合的32-P,然后再悬浮于10mM Tris HCl pH8,1mM EDTA,(TE)中供连接用。同样,可通过先激活40聚体寡聚核苷酸,然后与30聚体寡聚核苷酸一起退火,来制备Met 5-15寡聚核苷酸二聚体。
(ⅲ)制备oGH cDNA
用Hgi AI和EcoR1(在150mM NaCl,10mM Tris HCl pH8.0,10mM MgCl2,10mM巯基乙醇,100μg/ml BSA中)限制性切割pOGH12以得到一个与氨基酸16-191相应的650bp片段。通过LMT1%琼脂电泳对此进行纯化,然后从凝胶中切下一含有650碱基对(bp)片段的琼脂切片,并在60℃熔解10分钟,用石炭酸在干冰中提取,并用QAIGEN对此进行纯化。
(ⅳ)连接EcoR1/BglⅡ限制载体,退火寡聚核苷酸和oGHcDNA的HgiAl/EcoR1限制性切割片段
在5UT4DNA连接酶的存在下,将约超出10倍体积克分子浓度的oGH cDNA末端和5′寡聚核苷酸二聚物与载体在12℃且在10mM Tris·HCl pH7.5,10mM MgCl2,50mM NaCl,10mMDTT,1mATP中过夜进行连接,运用Met:1-15进行的连接反应举例如下:
质粒pMGoGH1的限制性切割图见图3。
(ⅴ)连接产物向活性大肠杆菌DH1的转化作用
用下述方法制备活性大肠杆菌DH1细胞。将细胞在Luria肉汤培养基(LB)中进行培养至OD为0.3,并且在3000g下离心收集,再将细胞颗粒悬浮于0.4体积的冷却的50mM CaCl2中,并置于冰上40分钟,然后将它们在150g下离心沉淀,再悬浮于0.04体积的50mM CaCl2中,在用pMGoGH2连接产物转化之前要将它们在冰上储存40分钟。
将连接产物轻微地加在活性大肠杆菌DH1上,并置于冰上20分钟,然后在42℃下震荡加热90秒。使这些细胞在Luria肉汤培养基(LB)中生长45分钟,使抗菌素抗性标记表达,并在由氨苄青霉素(Amp)的选择的LB培养平板上培养,将平板于30℃培养过夜。
(ⅵ)细菌转化体的寡聚核苷酸筛选
将转化体进行复制平板培养,以使将未诱导的和诱导的转化体区分开并加以比较,从主培养平板中取出一点置于一张Amersham Hybond滤纸上并且方向与平板一致。在第一张滤纸上放上第二张滤纸,将两张滤纸置于两个玻璃平板之间。第二张滤纸方向与第一张方向一致。将滤纸置于新鲜LB Amp培养基上,菌落面向上,在30℃下培养至细菌菌落再长出来。然后将一张滤纸在42℃培养30分钟,再转移到37℃培养3小时,这一步骤为诱导过程。然后对两套滤纸进行同等处理。
滤纸预先在50mM Tris·HCl pH8.0,1M NaCl,1mMEDTA,0.1%SDS中在42℃下冲洗1小时。再将它们在含有5×SSPE(0.75M NaCl,0.05M NaH2PO4·H2O,0.005M EDTA,pH7.4),5×Denhardts溶液(0.5%聚乙烯吡咯烷酮,0.5%牛血清白蛋白,0.5% Ficoll400),0.5%SDS,20μg/ml变性鲑精DNA的溶液中在65℃下预先杂交4小时。通过运用γ32P-标记的ATP(Amersham Pty Ltd.)激活55聚体寡聚核苷酸和一个17聚体(见下面)制备放射性标记的探针,如Maniatis等在“Molecular Cloning,A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,New York中描述。先用32-P55聚体在上述预杂交溶液中于65℃下对滤纸进行过夜筛选。将另一个探针储存于4℃下以备使用。
5′GATTTCTGGATGGAGTA 3′ OGH 17-聚体
将滤纸在0.1×SSC/0.1%SDS中在65℃下冲洗4次,露置于X光胶片上过夜,将滤纸在蒸馏水中煮沸30分钟以去掉前面的探针,然后与oGH32p17聚体在65℃再杂交过夜。在5×SSC/0.1%SDS中将滤纸冲洗4次,在45℃下洗两次,在50℃下洗两次,将他们全部暴光胶片过夜。
(ⅶ)对通过用放射标记的寡聚核苷酸筛选而检出的重组大肠杆菌DH1进行培养
选出对两个探针均显示阳性信号的6个菌落,放于10ml LB Amp中,使之在30℃下生长。将这些培养物接种了200ml LB Amp培养基,制成甘油原种,保存于-70℃下。大部分培养物在30℃生长至中间对数期(OD=0.5),取样本用于DNA和蛋白分析。然后将它们在42℃下先诱导30分钟,再于37℃下生长4小时,再取样本。
(ⅷ)从未诱导和诱导的大肠杆菌DH1转化体培养物中分离和纯化重组DNA
用SDS-碱溶解方法从未诱导和诱导的大肠杆菌DH1培养物中分离重组DNA。在该方法中,将细胞溶解,并将DNA在1%SDS/0.2M NaOH中变性。加入5M乙酸钾使小质粒DNA复性,但是染色体DNA太大,在这种情况下不能完全复性。通过离心沉淀将一些细胞碎片沉淀成小团,而将可溶性核酸留于溶液中,这些是异丙醇沉淀物质,而DNA可通过CsCl梯度法从RNA中纯化出来。通过琼脂凝胶电泳表明有诱导作用的DNA产量较高。
用EcoRⅠ和BglⅡ限制性切割纯化的质粒,结果证明有5个克隆含有650 bp oGH插入物。
(ⅸ)粗制DH1/pMGoGH细胞提取物的SDS-pAGE
将从未诱导和诱导的培养物中得到的细胞小团再悬浮于电泳样本缓冲液中,将样本在两个相同的12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。其中一个用考马斯染色,而对另一个用Western印迹分析法(见下)进行分析,以确定免疫反应的生长激素的存在。染色凝胶表明对于和纯化的oGH共同迁移的蛋白的诱导并不显著。
(ⅹ)DH1/pMGoGH的SDS-pAGE的Western印迹分析
将电泳的蛋白电吸收到硝化纤维滤纸上并进行如下处理,将该滤纸置于磷酸盐缓冲液/1%吐温/0.5%BSA中,然后在PBS/Tween/BSA中和抗PGH21-25的生物素化单克隆抗体一起培养。然后再在PBS/Tween/BSA中通过生物素部分和结合在辣根过氧化酶的抗生物素蛋白反应,用双苯胺和过氧化氢展开,对从Met:1-15和5-15的连接反应中得到的与单克隆抗体结合的一些细菌转化体进行选择,并转化到大肠杆菌1B392中以作进一步的表达。
(ⅹⅰ)测定pMGoGH克隆顺序以确定读码
采用根据生产厂家的建议和质粒模板本身修改的Sanger方法,用SEQUENASE(U.S.Biochemicals)测定CsCl纯化的pMGoGH质粒DNA顺序,用40聚体、32聚体和17聚体做为引物通过BglⅡ和HgiAl位点,进行顺序测定和确定读码。
将pMGoGH质粒DNA在室温下置于0.2MNaOH中5分钟使之变性,再在1.5M的乙酸铵/乙醇中沉淀。将3μg的质粒DNA和0.5pmole的寡聚核苷酸引物在37℃下退火20分钟。在室温下进行35-S放射性标记反应5分钟,然后在42℃下终止反应约5分钟,将样本在70℃下变性10分钟,并置于5%丙烯酰胺顺序测定凝胶上,将该凝胶于10%乙酸/10%甲醇中固定30分钟,并取出晾干,使胶片曝光一夜。质粒pMGoGH1和pMGoGH2的顺序见图4。
(ⅹⅱ)大肠杆菌IB392的转化和oGH的表达
用CsCl纯化的pMGoGH1质粒DNA转化活性大肠杆菌IB392细胞,用PEG-2价阳离子方法制备细胞。在这个过程中使细胞生长到O.D=0.3。然后将它们在500g下离心沉淀10分钟,并再悬浮于1/10体积的冷却的转化和储存溶液中(TSS)。TSS包括含有10%w/vpEG-8000,5%v/vDMSO,20mM MgCl2的LB,pH为6.5。用转化质粒在冰上将100μl细胞保温30分钟。加入0.9ml TSS,并在37℃将转化细胞摇动1小时,抗菌素抗性得以表达,再置于LBAmp(100μg/ml)琼脂平板上进行平板培养。将平板在30℃下培养过夜。如上所述,从未诱导和诱导的菌落中取下复制部分置于Hybond上,用32-P放射性标记的55聚体进行筛选。杂交和冲洗条件与用于大肠杆菌DH1转化的条件相同。
将所有菌落和探针进行杂交,并选出三个置于10ml LBAmp中使之在30℃下生长过夜。用它们接种进行大量培养,并制备如前所述的甘油原种。按照用于大肠杆菌DH1的方法分析DNA和蛋白质。
对从诱导培养基中得到的蛋白进行考马斯染色,表明全部三个克隆中与纯化oGH共同迁移的蛋白有少量增加。Western印迹分析表明,可显著地诱导出一种能够结合21-51抗体的蛋白,DNA和蛋白质数据表明oGH1-191真正地得以表达,在一个200L的发酵罐中培养pMGoGH1,在Bunge(Australia)Pty.Ltb.中纯化和溶解oGH1-191。
实施例2
生物学活性
对从大肠杆菌的重组质粒中得到的羊生长激素进行生物学活性测定,将100μg/天蛋白注射到8只切除垂体的小鼠/组中,用4天。在最后一次注射24小时后处死小鼠并分离下右胫骨。将骨骼洗净,并在近端沿正中矢状平面使之分离。用硝酸银染色可以将骨后软骨与周围骨骼区分开来。结果用百分比增加表示。
对照组 重组体组
-ve 01-191
均值 5.34 8.73
%增加 0 63%
-ve对照:切除垂体的小鼠+盐水
01-191:来自pMGoGH1的重组生长激素
实施例3
重组oGH1-191的N-末端氨基酸顺序
运用一种最后一步为反相高效液相色谱法(HPLC)的方法从诱导的pMGoGH+IB392细菌中纯化重组oGH1-191,利用自动Edman降解分析重组oGH1-191的N-末端氨基酸顺序。该重组蛋白的前30个氨基酸的氨基酸顺序如下:
1
Ala - Phe - Pro - Ala - Met -Ser - Leu -
10
Ser - Gly - Leu - Phe - Ala - Asn - Ala -
20
Val - Leu - Arg - Ala - Gln - His - Leu -
His - Gln - Lue - Ala - Ala - Asp - Thr -
30
Phe - Lys
这个顺序与从羊垂体腺中提取的成熟羊生长激素的N-末端顺序相同(Fernandex et al.,FEBS Letters 25∶265-270)。奇怪的是,前面所说的N-末端的蛋氨酸残基不存在。可以认为重组oGH1-191的N-末端蛋氨酸残基的去除是由细菌的蛋氨酸氨基肽酶(MAP)的作用而引起的,该酶可以有效地切割下N-末端的连接在丙氨酸残基上的蛋氨酸(Sabin et al,Biotechnology7∶705-709,1989)。因此,该重组激素与从垂体中提取的成熟羊生长激素是相同的。
最后,应当指出,只要不违背本文所陈述的本发明的精神,可以进行各种其他的修改或/和变更。
Claims (27)
1、一种制备分子克隆的方法,该方法包括:
提供
一种编码具有羊生长激素活性的重组多肽的互补DNA(cDNA)顺序;和
一种适当的克隆载体;
连接该DNA顺序和克隆载体,以将该DNA顺序插入克隆载体内形成一个分子克隆。
2、根据权利要求1所述的方法,其中编码重组多肽的互补DNA顺序包括全部或部分拷贝的含有成熟激素的羊生长激素重组多肽编码区,并延伸超出3′端终止密码子。
3、根据权利要求2所述的方法,包括下列主要步骤:
提供一个羊垂体腺源;
从中分离多腺苷酸信使RNA(mRNA);
在寡聚dT引物存在下用反转录酶处理mRNA,以合成第一条互补DNA链(cDNA);
运用酶学方法用核糖核酸酶H除去mRNA,并接着用DNA聚合酶Ⅰ合成第二条互补DNA链;和
用T4DNA聚合酶处理如此形成的双链互补DNA(cDNA)以产生平(钝)端分子。
4、一种制备质粒的方法,该质粒带有一个能编码具有羊生长激素活性的重组多肽并能够在单细胞生物中复制、转录和翻译,此方法包括:
提供
一个已经去除预定长度DNA顺序的限制性质粒表达载体;和
一个用于编码具有羊生长激素活性的重组多肽、或其一部分的DNA顺序,而且包括一个可满足单细胞生物内转录和翻译调节需要的合成的5′端顺序;和
将该DNA顺序连接到限制性质粒表达载体上。
5、根据权利要求4所述的方法,其中限制性质粒表达载体来自双起点载体质粒pMG197。
6、根据权利要求5所述的方法,其中用于编码重组多肽的DNA顺序包括只有编码羊生长激素的一部分DNA顺序,它由一个合成的5′端顺序和一个3′端顺序组成,所说的方法还包括:
提供另一个包括编码羊生长激素的完整DNA顺序的剩余部分的DNA顺序:
在合成的5′端顺序和3′端顺序之间的限制性位点处切割所说的DNA顺序;和
再将所述的另一个DNA顺序连接到限制性位点上。
7、根据权利要求6所述的方法,其中合成的5′端顺序由第一个寡聚核苷酸和第二个寡聚核苷酸组成,所述第一个寡聚核苷酸选自包括一个 5′Bg l Ⅱ粘着端、一个与在成熟羊生长激素多肽中没有的NH2一末端蛋氨酸残基相应的起始密码子(ATG)、一些与自然激素(成熟形式)的氨基酸1-15相应的密码子和于核苷酸160的HgiAⅠ位点相应的3′悬突处终止的寡聚核苷酸;
所述第二个寡聚核苷酸带有5′Bgl Ⅱ和3′Hgi AI粘着端,但是它在一个与自然的蛋氨酸残基(氨基酸5,成熟激素)相应的密码子起始,后面跟着代表氨基酸6-15的密码子。
8、一种质粒表达载体,该载体包括一个可编码具有羊生长激素活性多肽的DNA顺序,选自如前所述的pMGoGH1和pMGoGH2。
9、一种具有羊生长激素活性的重组多肽的生产方法,该方法包括下列步骤:
提供
一种重组质粒表达载体,该载体包括一个可编码具有羊生长激素活性的多肽并能在单细胞生物中复制、转录和翻译的DNA顺序,和
一种单细胞生物;
通过转化、转导或转染中的一种方法,将所说的重组质粒表达载体导入单细胞生物内。
培养所得到的生物体;
表达由所说DNA顺序编码的重组多肽;和
从培养物中选择地分离所说的多肽。
10、根据权利要求9所述的方法,其中的单细胞生物是从大肠杆菌DNI1和大肠杆菌IB392中选择的一种大肠杆菌菌株。
11、根据权利要求10所述的方法,其中包括一个可编码具有羊生激素活性多肽的DNA顺序的重组质粒表达载体是pMGoGH1或pMGoGH2。
12、一种兽药用组合物,它包括从oGH1-191或oGH5-191中选择的具有羊生长激素活性的重组多肽及其兽医药上可接受的盐和一种或多种兽医药上可接受的载体。
13、一种可提高生肉质量和食物转化率的动物处理方法,该方法包括
提供
一种从完全雄性、雌性和阉割的雄性羊和牛这样一组动物中选择的动物;
一种外源重组羊生长激素及其类似物、衍生物或它们的片段;和
按照预选体重和按动物性别而预选的恒定剂量率,以约35至100公斤活体重时开始,给动物使用所说的外源重组羊生长激素,而当动物是雌性或阉割的雄性时,剂量率约为0.06到0.10mg/kg活体重/天;当动物是完全雄性时,剂量率约为0.01到0.15mg/kg活体重/天。
14、根据权利要求13所述的方法,其中外源重组羊生长激素选自oGH1-191和oGH5-191。
15、根据权利要求14所述的方法,其中给药是从约15到50kg活体重时开始。
16、一种减少动物生肉脂肪含量的方法,该方法包括
提供
一种从完全雄性、雌性和阉割的雄性羊和牛这样一组动物中
选择的动物,
一种外源重组羊生长激素及其类似物、衍生物或片段,和
按照一个普通恒定剂量率给动物施用所说的外源重组羊生长激素;其中当动物是雌性或阉割的雄性时,剂量率约为0.06至0.1mg/kg活体重/天,并且在宰杀之前连续用药约25天;当动物是完全雄性时,剂量率约为0.1至0.15mg/Kg活体重/天,并且在宰杀之前连续用药约20天。
17、根据权利要求16所述的方法,其中重组羊生长激素选自oGH1-191和oGH5-191。
18、一种提高生肉质量和/或食物转化率的动物处理方法,该方法包括
提供
一种从完全雄性、雌性和阉割的雄性羊或牛这样一组动物中选择的动物;
一种外源重组羊生长激素,及其类似物、衍生物或它们的片段;和
按照预选体重和依动物性别预选的一般恒定剂量,每间隔至少一天给动物使用所说的外源重组羊生长激素。
19、根据权利要求18所述的方法,其中外源羊生长激素的给药间隔1、2或3天。
20、根据权利要求19所述的方法,其中重组羊生长激素选自oGH1-191和oGH5-191。
21、根据权利要求19所述的方法,其中给药剂量是每第二、第三或第四天给约10mg的外源重组羊生长激素,用药约10到30天。
22、一种提高生肉质量和/或食物转化率的动物处理方法,该方法包括
提供
一种从完全雄性、雌性和阉割的雄性羊和牛这样一组动物中选择的动物;
一种外源重组羊生长激素及其类似物、衍生物或它们的片段;和
按照一个预选的活体重,开始以一个预选好的一般恒定减少了的剂量,给动物使用所说的外源重组羊生长激素,使用一段预选的时间;和
接着再以一个增加的剂量每天继续给动物使用外源重组羊生长激素,使用一段预选的时间。
23、根据权利要求22所述的方法,其中开始以一个每间隔1、2或3天给药约4-8mg的剂量,给动物使用外源重组羊生长激素,用药约10到25天;和
接着按每天约6-10mg的增加了的剂量再继续给药约5到15天。
24、根据权利要求23所述的方法,其中开始按每间隔1或2天给动物使用外源合成生长激素约20天;和
接着继续每天给药约10天。
25、一种持续释放性兽药用颗粒包括
一种至少部分溶解的载体;
一些埋入载体中的至少部分溶解的微胶囊;和
微胶囊内装有一定有效量的重组羊生长激素或它的类似物、衍生物、片段或盐。
26、根据权利要求25所述的持续释放性兽药用颗粒,其中的颗粒是一种埋入物或药团和至少部分溶解的载体是一种可在进入动物体后约8至24小时内降解的水溶性聚合物。
27、根据权利要求26所述的持续释放性兽药用颗粒,其中的聚合物是一种聚乙烯吡咯烷酮聚合物或它的共聚物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AUPJ068488 | 1988-09-29 | ||
AUPJ0684 | 1988-09-29 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1046189A true CN1046189A (zh) | 1990-10-17 |
Family
ID=3773407
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN89108362A Pending CN1046189A (zh) | 1988-09-29 | 1989-09-29 | 羊生长激素 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0363063A3 (zh) |
JP (1) | JPH02249487A (zh) |
CN (1) | CN1046189A (zh) |
DK (1) | DK472189A (zh) |
NZ (1) | NZ230797A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101107361B (zh) * | 2005-01-21 | 2013-07-17 | 莫茨药物股份两合公司 | 二硫桥连双链形式的蛋白质的重组表达 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6610496B1 (en) * | 1998-07-08 | 2003-08-26 | University Of Maryland, College Park | Prediction of growth performance and composition in animals, including cattle, from response to growth hormone releasing hormone |
JP2003534237A (ja) * | 1999-11-03 | 2003-11-18 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 食欲の抑制又は満腹の惹起のための成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進物質の使用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0103395A3 (en) * | 1982-08-17 | 1985-05-22 | Biogen N.V. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
JPS6011557A (ja) * | 1983-04-19 | 1985-01-21 | ジエネツクス・コ−ポレイシヨン | クロ−ンヒツジ成長ホルモン遺伝子 |
AU599922B2 (en) * | 1985-09-10 | 1990-08-02 | Natinco Nv | Improving carcass quality |
GB8701848D0 (en) * | 1987-01-28 | 1987-03-04 | Celltech Ltd | Polypeptides |
-
1989
- 1989-09-26 EP EP89309778A patent/EP0363063A3/en not_active Withdrawn
- 1989-09-26 DK DK472189A patent/DK472189A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-09-27 NZ NZ230797A patent/NZ230797A/xx unknown
- 1989-09-29 CN CN89108362A patent/CN1046189A/zh active Pending
- 1989-09-29 JP JP1255053A patent/JPH02249487A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101107361B (zh) * | 2005-01-21 | 2013-07-17 | 莫茨药物股份两合公司 | 二硫桥连双链形式的蛋白质的重组表达 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK472189A (da) | 1990-03-30 |
EP0363063A3 (en) | 1990-07-25 |
EP0363063A2 (en) | 1990-04-11 |
NZ230797A (en) | 1992-11-25 |
DK472189D0 (da) | 1989-09-26 |
JPH02249487A (ja) | 1990-10-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA1338981C (en) | Biologically active proteins and a method for their production | |
CN1178955C (zh) | 经修饰的TNFα分子和编码该TNFα分子的DNA以及含有该TNFα分子和该DNA的疫苗 | |
CN1157290A (zh) | 重组肥胖(ob)蛋白 | |
CN1226896A (zh) | 调制激素或其受体活性的肽、抗体、疫苗及其用途 | |
US5399489A (en) | Production of proteins in procaryotes | |
CN1264307A (zh) | 改善上胃肠道功能的方法 | |
CN101356191B (zh) | 用于水生生物培养的神经肽 | |
CN1231259C (zh) | 生产人胰岛素 | |
CN1560080A (zh) | 司登尼亚蛋白小体-司登尼亚钙蛋白 | |
CN1046189A (zh) | 羊生长激素 | |
US5141922A (en) | Biologically active proteins and a method for their use | |
EP0645454A2 (en) | Chimeric somatostatin containing protein and coding DNA, immunogenic compositions and method for increasing farm animal productivity | |
CN1924001A (zh) | 用甲基营养酵母生产人热休克蛋白70的方法 | |
CN1854295A (zh) | 卵巢癌抗独特型微抗体的生产方法 | |
CN1020923C (zh) | 利用dna重组技术生产抑制素的方法 | |
CN1313494C (zh) | 一种具有促增长作用的融合蛋白及其编码基因与应用 | |
CN1006903B (zh) | 白细胞介素-2的生产方法 | |
CN1597965A (zh) | 人血清白蛋白与人甲状旁腺激素(1-34)融合蛋白及用途 | |
CN1207389C (zh) | 生长抑素基因疫苗(dna疫苗)的基因工程体 | |
CN1188516C (zh) | 一种重组纳豆激酶的编码核苷酸序列及该酶的制备方法 | |
AU647374B2 (en) | Sheep growth hormone | |
CN88102023A (zh) | 猪生长激素类似物 | |
CN1326359A (zh) | 人绒膜促性腺激素疫苗 | |
TW200411053A (en) | Nucleic acid encoding recombinant salmon calcitionin, expression vector thereof, and method for producing recombinant salmon calcitonin therewith | |
CN1016795B (zh) | 促血红细胞生成素的生产 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |