CN1326359A

CN1326359A - 人绒膜促性腺激素疫苗

Info

Publication number: CN1326359A
Application number: CN99813381A
Authority: CN
Inventors: J·哈里斯; M·马蒂尼兹
Original assignee: Zonagen Inc
Current assignee: Repros Therapeutics Inc
Priority date: 1998-09-17
Filing date: 1999-09-16
Publication date: 2001-12-12
Also published as: EP1113814A1; WO2000015253A1; AU6049099A

Abstract

一种应用重组技术获得人绒膜促性腺激素蛋白β亚基(βhCG)的方法,编码该蛋白,片段以及它类事物的新DNA序列并且用这些重组蛋白并加上佐剂通过免疫灭活怀孕激素从而干扰哺乳动物怀孕。

Description

人绒膜促性腺激素疫苗

发明背景

一种努力缓和人口增长的有效方法是应用抗参与生殖生理的激素的免疫原。可以相信，将免疫原注射到哺乳动物体内会导致哺乳动物产生特异性的抗体，使这些激素失活，从而阻碍它们的功能。至少有6种人生殖激素的免疫原制剂已经或正在进行临床试验：一种抗滤泡刺激激素(follicle-stimulating hormone，FSH)[Moudgal，NR.等，Prospectives in Primate Reproductive Biology，297-306(1991)]；两种抗促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone GnRH)[Ladd，A.等，Biol.Reprod.，1076-1083(1994)；Jayashankar，R.等，Prostate，14，3-11(1989)]；和三种抗绒膜促性腺激素(chorionic gonadtropin CG)[Jones，W.R.等，Lancet，8598，1295-1298(1988)；Talwar，G.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，8532-8536(1994)；和Dirnhofer，S.等，Immun.Today，15，469-474(1994)]。

有以下几个原因，人绒膜促性腺激素尤其是一个免疫生殖干扰的有吸引力的靶点。首先，这个激素的生理化学背景十分清楚，是维持怀孕的基本物质。第二，它的氨基酸序列已经阐明，由一个α和β亚基构成的异二聚体。每个单体由单独一个基因编码，该基因位于不同的染色体上[Dirnhofer，S.等，J.Endovrin.，141，153-162(1994)]。第三，表明，人绒膜促性腺激素由于循环存在的抗体导致的免疫失活并不会显著干扰妇女的其他生理过程，例如排卵作用。

人绒膜促性腺激素的生理特性，例如所提到的，已经被广泛研究。这个糖蛋白有一个相对分子量(Mr)，大约38,000，其中分为大约14,500的α亚基和大约22,000的β亚基。人绒膜促性腺激素的α亚基在结构上和三种脑垂体激素(滤泡刺激激素FSH，黄体激素LH和甲状腺刺激激素TSH)是一致的。例外，虽然β亚基对于靶组织来说，是受体特异性的，但是α亚基没有激素特异性。人绒膜促性腺激素的α亚基为其他激素所共有，因此对于完整人绒膜促性腺激素的抗血清可以和其他的激素产生交叉反应，然而只针对人绒膜促性腺激素β亚基的抗血清产生较少的交叉反应。这些结果已经表明人绒膜促性腺激素的β亚基是一种有效的高特异性的免疫试剂，可调节哺乳动物的生殖。

已经测试三种以β人绒膜促性腺激素为基础的免疫原。世界健康组织(World Health Organization WHO)评价一种β人绒膜促性腺激素C末端37个氨基酸的多肽(βhCG-CTP)它在佐剂中偶联一种白喉类毒素载体，该佐剂包含一种合成的胞壁酰二肽[Jones，W.R.等.，(1988)Supra]。在这种制剂中，因为β人绒膜促性腺激素βhCG通常是机体自身分子，没有免疫原性，因而运用例如白喉类毒素载体是必需的。这个研究的最初结果表明在小鼠子宫重量获得试验中，浓度升高的抗βhCG-CTP抗体，可以抵制hCG的生物活性。[Stevens，V.C.等，Am J.Reprod Immunol.，1,307-314(1981)]，一种含有βhCG的相似免疫原制剂显示，有效降低一群雌性狒狒的生育率，从70％降到低于5％[Stevens，V.C等Fertil Steril.，36，98-105(1981)]。然而，由于事实上，并不是所有的个体对这种制剂能产生免疫反应，并且既使产生了免疫反应，抗体滴度也太低，世界健康组织已经将这个方面的工作搁置。

以前或现在进行临床试验的第二种β人绒膜促性腺激素制剂由国家免疫研究所，新德里完成。由β人绒膜促性腺激素连结绵羊黄体激素α亚基，在邻苯二甲酰脂多糖钠佐剂中连到白喉-破伤风类毒素载体上。[Talwar，G.P.等，supra(1994)]。虽然，预测这种免疫复合物能有效人绒膜促性腺激素hCG，但是由于α亚基的存在，也会与其它激素产生交叉反应。

以前或现在正在临床试验的第三种免疫原制剂，由人口委员会，纽约完成。它是以整个β人绒膜促性腺激素亚基为基础的。[Tsong，Y，等75th Annual Meeting Endocrine Society，拉斯维加基，282(1993)]。β人绒膜促性腺激素在氧化铝的佐剂中连到破伤风类毒素载体上。在这种制剂，存在着潜在的问题，由破伤风类毒素导致的载体诱导抗人绒膜促性腺激素抗体产生的抑制。

这些βhCG免疫原的制剂没有一种被认为可以适合广泛的商业用途。首先，获得合成的或来源于生物组织或液体的βhCG的过程十分繁琐，需要一组纯化步骤，通常会导致低产出、高成本和交叉感染其它蛋白尤其是α人绒膜促性腺激素。

Mukhopadhyhy等，Am J.Reprod，Immunol.，39,172-182(1998)描述了一种用重组DNA方法产生有免疫原性的β人绒膜促性腺激素。Mukhopadhyay和他的伙伴将重组的β人绒膜促性腺激素和氢氧化铝佐剂，单独或结合破伤风类毒素载体，给小鼠和猴子注射评价它作为一种出生控制疫苗的免疫原性的潜能。虽然，β人绒膜促性腺激素单独可以引起免疫反应，但重组β人绒膜促性腺激素需和破伤风类毒素结合，这样能增加抗体滴度。

在这种技术中存在着一个问题。由于事实上β人绒膜促性腺激素是一个“自身”抗原，因而，当注射时，并不能被免疫系统识别，即免疫系统对于注射的抗原不会产生抗体。一种载体，例如破伤风或白喉类毒素对于产生一个免疫反应是基本的。将这样的载体连接到βhCG上使βhCG更加异源化，诱使免疫系统产生较强的反应。然而联合载体产生免疫反应存在着载体导致的抑制问题。在接受者免疫系统曾经接触过载体的情况下，免疫系统对载体的反应要远大于对于联结到载体上的抗原反应。

同样，在技术上还存在着其它未解决的问题。举例来说，当前所运用的佐剂例如合成的胞壁酰二肽，邻苯二甲酰脂多糖钠或明矾能产生副反应，例如当注射时产生红斑、皮下节结、接触超敏性或肉芽肿炎症。因而，一种更好的可忍受的佐剂是需要的。另外，许多个体不能对现有的疫苗和免疫治疗方法产生反应。因而，需要一种免疫治疗方法和适当制剂的免疫疫苗，它们对所有治疗的人们能有效的免疫反应同时避免上述存在的技术问题。

该发明可解决这个问题，通过提供一种疫苗，它包含βhCG，以一种良好耐受的脱乙酰壳多糖为基础的佐剂，诱导宿主哺乳动物产生抗hcG抗体，并且克服了许多个体不反应的问题。

发明摘要

该发明提供了改进的组合物，诱导雌性哺乳动物包括人类的不育。依照该发明，优选的以注射制剂给药方式给予有效剂量的组合物诱导不育。现在优选的注射制剂包含，以组合制剂，βhCG蛋白和/或它的融合物，片段或类似物和脱乙酰壳多糖为基础的佐剂。在一种优选的实施方案，脱乙酰壳多糖佐剂包含了脱乙酰壳多糖乳壳多糖乳剂、氢氧化钠、一种生物可降解油，表面活性剂和一种水溶性缓冲液。(已批准的美国专利申请第08/823,143，在此引入，作为参考)，其中βhCG蛋白和/或其融合蛋白，片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到1∶1500(重量/重量)范围之间。现优选的可生物降解的油是鲨烯。在另一种优选的实施方案中，脱乙酰壳多糖佐剂包含，以组合制剂，脱乙酰壳多糖，一种金属盐和水溶性缓冲液(美国专利第5,912,000该专利已经详述，作为参考)。其中βhCG蛋白和/或其融合蛋白、片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到1∶1500(重量/重量)范围之间。现在优选的金属盐是乙酸锌、硫酸镍和硫酸铜，在另外一种优选的实施方案中，重组βhCG包含一种融合蛋白，其中βhCG蛋白，或其片段或其类似物被连在任何非hCG多肽上。在现在优选的实施方案中，βhCG蛋白或其片段或其类似物是连在β-半乳糖苷酶蛋白或它的片段上，与上述任何一种以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂联合使用。

现在的发明也是针对诱导雌性哺乳动物包括人类不育的方法，通过对哺乳动物注射一种疫苗，它包含βhCG蛋白和/或其融合蛋白、片段或类似物，联合脱乙酰壳多糖为基础的佐剂。疫苗的剂量是如此，可以有效刺激哺乳动物产生抗体，这种抗体识别哺乳动物天然循环存在的hCG蛋白并且或阻止怀孕。优选的哺乳动物包括，但不是仅限于此，人类、狗、猫、牛、马、猪、猴、啮齿动物，大象和兔类动物。

在该发明实践中有用的蛋白包含βhCG蛋白和/或其融合物、类似物和有免疫学活性的片段(注射到哺乳动物中仍保留刺激抗hCG抗体产生的能力)。这样的有免疫学活性片段能够被定义为至少包含一个抗原决定簇，注射到哺乳动物体内有效刺激抗体产生(根据该发明)或者是它被直接与hCG相关的抗体识别。

一种优选的注射疫苗方式是肌肉注射，腹腔注射或皮下注射。

该发明也针对用一种交叉免疫方法来诱导哺乳动物不育，其中，注射由一种含有在宿主细胞表达的重组βhCG的疫苗，，随后又注射第二种疫苗，包含由另一种宿主细胞中表达的重组βhCG。优选地，疫苗均是通过注射的。注射的顺序是多种多样的。用于表达βhCG的优选的表达系统包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞。作为选择，可使用交叉免疫方法，每种疫苗包含重组βhCG并使用脱乙酰壳多糖为基础的佐剂。

该发明的另一特点是针对诱导抗原的形成，通过连续给药，先是一种表达系统获得的抗原，随后再给在第二种表达系统获得的相同或相似的重组蛋白抗原。优选的表达系统包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物表达系统。优选的佐剂包括脱乙酰壳多糖为基础的佐剂。

发明详述

该发明是针对于组合物，它包含βhCG蛋白，并联合脱乙酰壳多糖为基础的佐剂，将它们用于哺乳动物，刺激抗哺乳动物内源性βhCG的抗体产生并诱导暂时的不育。另外，该发明的组合物可用于交叉免疫体系来克服许多哺乳动物对于特定抗原，特别是自身抗原不能引起免疫反应的问题。

术语“核苷酸序列”是指核苷酸多聚物或这些核苷酸的序列，“核酸”和“多聚核苷酸”也可在这互换使用，指核苷酸的多聚物。总的来说，该发明中提供的核酸片段，可从基因组片段和短的寡聚核苷酸衔接物，或一系列寡聚核苷酸或个体的核苷酸中装配产生一种合成的核酸。它可在一个重组转录单位(包含来源于微生物或病毒操纵子或真核基因的调控元件)中被表达。

术语“重组体”这里用于指一种多肽或蛋白，它是来源于重组的(例如微生物的或哺乳动物的)表达系统。“微生物的”是指重组多肽或蛋白在细菌或真菌(例如酵母)表达系统中表达获得。作为一种产物，“微生物重组体”定义为一种蛋白或多肽基本上不是天然内源物质，并且没有相关天然的糖基化。在多数细菌环境下例如大肠杆菌表达的多肽或蛋白不能进行糖基化修饰，在酵母中表达的蛋白，总的来说有糖基化制剂，但不同于那些在哺乳动物细菌中表达蛋白的糖基化制剂。

术语“重组表达载体”是指一种质粒，噬菌体或病毒或载体，用来表达一种DNA(RNA)序列获得多肽。一种表达载体包含一个转录单元，该单元包含一个组合(1)一个或多个遗传元件，在基因表达中有调控作用，例如启动子或增强子；(2)一个结构或编码序列，可以转录成mRNA，并可翻译成蛋白和(3)合适的转录起始和终止序列。用于酵母或真核表达系统中的结构单元最好包括一个引导序列，使宿主细胞将翻译好的蛋白分泌到胞外，作为选择，当重组蛋白表达时没有引导或转运序列，它也可包含N末端甲硫氨酸残基。该残基在产生最终产物时也许能或也许不能随后从表达的重组蛋白中切除。

术语“重组表达系统”意思是宿主细胞已经将重组转录单元稳定地整合到染色体DNA上或是在染色体外携带重组转录单元。重组表达系统在这定义为一旦诱导连在cDNA片段或合成的基因上的调控元件，则可表达异源多肽或蛋白。这个术语也同样意味着宿主细胞已经稳定地整合了一个或多个重组遗传元件，它们在基因表达中有调控作用，例如启动子或增强子。在这定义的重组表达系统一旦诱发连在内源的DNA片段或被表达基因上的调控序列则要表达多肽或蛋白。这些细胞是原核的或真核的细胞。

术语“天然存在的多肽”是指未经遗传工程的由细胞产生，并且特异地预期有各种各样的多肽，后翻译修饰引起的，包括但不只局限于此，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化、酰化。

术语“类似物(或变异体)是指任何一种多肽，通过重组DNA技术产生氨基酸插入，缺失和替换而导致的不同于天然存在的多肽。比较同源人的或其他哺乳动物的特定多肽序列，使高度同源的区域(高度保守区域)改变的氨基酸数目最小或用共用序列来替换，从而确定哪个氨基酸也许被替换，增加或缺失而不破坏感兴趣的活性(例如可以刺激抗体的产生)的原则。

氨基酸“替换”也许是用另一个氨基酸代替-氨基酸后，仍有相似的结构和/或化学特性，即保守性氨基酸替换。另外，氨基酸“替换”也许是用另一个氨基酸替代后导致所感兴趣的活性增加，即非保守性氨基酸替换。

“保守性”氨基酸替代基于所涉及的氨基酸残基相似性质：极性，电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，带正电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸和负电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。典型的插入或缺失在1到5个氨基酸，允许变化能用实验方法进行测定。可系统的用重组DNA技术在多肽分子中插入，缺失或替换氨基酸，然后再分析各突变体的活性。

术语“片段”是指一段氨基酸残基，至少大约5个氨基酸，常常是大约7个氨基酸，典型地是大约9-13个氨基酸，在一些变化的制剂中，至少大约17或更多氨基酸。

术语“活性”是指多肽的制剂，包括任何天然存在多肽的生物学和免疫学活性。依照该发明，术语“免疫学活性”涉及βhCG是指多肽至少包含其免疫学活部位中的一个，优选地是在注射到哺乳动物后能够刺激对抗hCG抗体的产生。依照该发明，一个免疫学活性片段至少包含一个抗原决定簇，在对哺乳动物给药以后能有效刺激抗体的产生或者是被直接与hCG相关的抗体识别。

术语“感染”指的是通过病毒或病毒性载体将核酸引入到一个合适的宿主细胞中。

术语“转化”意思是将DNA引入到一个合适的宿主细胞中，从而DNA作为染色体外成份或作为染色体整合成份可进行复制，。

术语“转染”指的是适合的宿主细胞吸收一种表达载体，不论编码序列是否被表达。

该发明的多肽包括，但不局限于此，一种含有SEQ ID No：2的氨基酸序列的多肽(见SEQ ID No：2)或者是由一种含有pZ179载体的克隆TOPP2中的(见SEQ ID No：1)cDNA插入片段编码的氨基酸序列的多肽、另外发明的实施方案包括，但不局限于此，是一种多肽，其含有SEQ ID No：4氨基酸序列或者是由在SEQ ID No：3中的cDNA编码的氨基酸序列，该cDNA插入到PZ500载体中。该发明中的多肽同样也包含SEQ ID No：2或4中βhCG蛋白序列的活性片段或类似物。该发明的多肽更包含βhCG的融合或修饰物，其中βhCG或类似物融合到其它部分获得一个更为稳定的蛋白或者使它的表达量达到最高。

该发明蛋白组合物还包含一种脱乙酰壳多糖为基础的佐剂，优选的实施方案包含一脱乙酰壳多糖为基础的佐剂，由脱乙酰壳多糖乳剂、氢氧化钠，生物可降解油表面活性剂和水溶性缓冲液组成。另一种脱乙酰壳多糖为基础的佐剂，包含脱乙酰壳多糖、一种金属盐和一种水溶性缓冲液。βhCG蛋白和/或其融合蛋白、片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到大约1∶1500(重量/重量)之间，优选的生物可降解油是鲨烯。优选的金属盐包括，但不局限于此，乙酸锌、硫酸镍和硫酸铜。

许多类型的细胞可以作为表达蛋白合适的宿主细胞。哺乳动物宿主细胞包括，例如猴COS细胞，中国仓鼠细胞(CHO)，人肾293细胞，人表皮A431细胞，人结肠205细胞，3T3细胞，CV－1细胞，其它变形的灵长类细胞系，正常双倍染色体细胞，体外来源于原代组织的细胞系，原代移植体，Hela细胞，小鼠L细胞，BHK、HL-60，U937、HaK和Jurkat细胞。

作为选择，也可在较低等真核生物例如酵母或原核生物例如细菌中产生蛋白，合适的酵母包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，Schizosaccharomyces pombe，克鲁维氏酵母(kluyveromyces)株，假丝酵母(Candida)或任何可以表达异源蛋白的酵母株系。潜在的合适的细菌株包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或任何可以表达异源蛋白的细菌株。优选地，表达βhCG蛋白的或它的融合物、类似物或片段的宿主细胞或表达系统是细菌、酵母、哺母动物或杆状病毒来源的体系。特别优选的是酵母和细菌宿主细胞。

正在考虑一种治疗方法，将βhCG联合使用脱乙酰壳多糖为基础的佐剂注射给哺乳动物，从而产生抗哺乳动物内源βhCG的抗体和/或控制哺乳动物的生育，诱导雌性哺乳动物暂时不育。虽然基于目前目的，天然蛋白也可以使用，但是用于免疫的βhCG优选的是重组来源的蛋白。重组蛋白有它优势，它们不象天然存在蛋白那样，可以大规模较经济的制备。

该发明的治疗方法包括将一种疫苗，包含有效剂量该发明中的多肽，并结合脱乙酰壳多糖为基础的佐剂给药到哺乳动物体内，从而诱导暂时不育。优选的给药方式，但不避限于此。有肌肉、腹腔内或皮下注射。疫苗可以以单剂量注射，然而优选两个或更多剂量。疫苗除了其它可能情况外，可用于诱导较高浓度的抗hCG抗体的产生。

该发明的治疗方法进一步包括交叉免疫体系，它包含一种βhCG蛋白疫苗的组合。由一种宿主细胞产生的重组βhCG疫苗注射到哺乳动物体内，随后又注射由另一种宿主细胞产生的重组βhCG疫苗。这种交叉免疫体系可以克服许多哺乳动物对于某些抗原，特别是“自身”抗原不能引起免疫反应的问题。在一种优选的实施方案中，注射前，重组βhCG要与脱乙酰壳多糖为基础的佐剂联合使用。

重组的βhCG蛋白和/或它的融合物、片段、或类似物，由已经十分清楚的技术获得。总的来说，βhCG基因插入到载体质粒中，然后被转化或转染到宿主细胞中。虽然不是必需的，为了便于表达蛋白的纯化可将多聚组氨酸标记的编码序列加到βhCG基因上。其它修饰可在编码序列进行，从而获得类似物，片段和融合物蛋白，转化后的宿主细胞在适合的培养基中生长，被诱导产生所需要的βhCG蛋白，它的类似物或片段和/或融合蛋白。所需的βhCG蛋白用层析方法进行分离。用现代分子生物学所知技术中普通和常见技术载体构建，蛋白表达和蛋白纯化，一个更为详细的规则在随后例子中给出。

实施例1

在细菌表达βhCG蛋白

βhCG蛋白的细菌表达是通过构建一种载体，pZ179，它包含DNA插入序列具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，载体pZ179来源于PZ98(Gupta，等Biol Reprod.，55：410-415(1996))还携带编码β—半乳糖苷酶前20个氨基酸(β—gal)密码子。在限制性酶切位点Smal和Sall之间的DNA序列为编码βhCG的第22-165氨基酸的密码子所替代。一个衔接子(adptor)DNA序列，携带限制性酶切位点Smal，Pstl和Bg111，添加在βhCG的DNA 5’末端，这个衔接子序列包括四个编码子，不是βgal或βhCG天然成份，这些改变提供了一个更加稳定的蛋白和使蛋白表达量在大肠杆菌中表达达到最大值。因而，SEQ ID No：1中的DNA编码了一种βhCG/β-gal融合蛋白，无前导序列的βhCG连β-gal片段上，该编码的融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID No：2。

其它对天然βhCG核苷酸序列的改变包括，用Spel限制性酶切位点替换终止密码子，从而在该蛋白的C末端加上一个多聚组氨酸标记序列。运用pTAC启动子，因而可添加异丙基β-D-硫代-半乳糖苷(IPTG)来诱导表达。用来表达的宿主菌是TOPP2(Stratagene)。用标准方法将pZ179载体DNA转化到TOPP2载体细胞中。含有pZ179载体DNA的TOPP2克隆(用氨苄青霉素筛选)，在小范围内筛选，得到一个有高表达的克隆。

表达流程，需将一个pZ179/TOPP2克隆接种到一升100毫克/毫升氨苄青霉素的LB肉汤中。培养基置于大约30℃，以大约250rpm的转速振荡培养，直至光密度值为0.4(OD₆₀₀)，再添加IPTG，浓度约为3mm，诱导重组蛋白表达。诱导大约4个小时，离心，收获细胞。

为了获得βhCG融合蛋白，细胞沉淀以大约1克/6毫升的浓度重溶于6M盐酸胍，100mMNaH₂PO₄和10mMTris，pH大约8的变性缓冲液中。细胞粘稠悬液在室温下，振荡过夜。大约4℃下，17,000rpm转速，离心大约20分钟，将去除细胞碎片，含有所需βhCG融合蛋白的上清进一步纯化。

分离βhCG/β-gal融合蛋白，大约每分钟10毫升的流速将上清上样到金属镍柱。首先，准备好金属螯合琼脂糖快速流动树脂(pharmacia)，用水冲洗树脂，将树脂装柱，大约5倍柱体积的100mMNiSO₄洗柱，更多水洗柱，变性缓冲液洗柱。有βhCG/β-gal融合蛋白的上清上柱后，按下面缓冲液的顺序六次洗脱，可获高纯的βhCG/β-gal融合蛋白，各步洗脱组分收集好，并且用紫外280nm波长鉴定。

冼脱液是：

(1)6M脲素＋20MmTris，pH8

(2)6M脲素＋20mMTris＋25mM咪唑，pH8

(3)6M脲素＋20mmTris＋25mM咪唑＋300mMNaCl，pH8

(4)6M脲素＋20mmTris＋300mMNaCl，pH8

(5)6M脲素＋20mM乙酸＋300mMNaCl，pH6

(6)6M脲素＋20mM乙酸＋300mMNaCl，pH3.9

2-4级分有所需βhCG/P-gal融合蛋白，将其合并，然后加入DTT浓度至10mM，以防止蛋白氧化。将级分上G-25葡聚糖凝胶(pharmacia)柱，并用6M脲素50mMTris＋10mMDTT，pH8的缓冲液进行洗脱，脱盐。用聚丙烯酰胺电泳标准技术分析蛋白。脱盐后蛋白以相同缓冲液上样到Sepharose-Q柱(Pharmacia)，并用100mMNaCl洗脱，从而浓缩，纯的βhCG/β-gal融合蛋白-70℃保存。

实施例2

βhCG蛋白在酵母中表达

βhCG在酵母中的表达开始于克隆一段770碱基对的BamH I片段，它包括βhCG序列，在酵母表达载体YEpFLAG-1(Sigma)N末端的Bg111/BamH1位点上融合了α-成熟因子前导序列。载体唯一的Nrul和Smal位点之间的区域被去除，并且载体重新连接后，缺失编码FLAG肽的DNA序列，最终载体命名为PZ500，包含的DNA序列见SEQ ID No：3，其编码的蛋白序列见SEQ ID No：4。

将PZ500质粒转化到S.cerevisiae BJ3505(Sigma)中，首先将100μg鲑鱼测试载体DNA和0.1μgPZ500表达载体DNA加到1.5毫升微量离心管中，然后加入100微升BJ3505酵母感受态细胞，旋转振荡5秒钟。加入600微升PLATE缓冲液(4％PEG3350,100mM Lithiumactate，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5)，旋转振荡。30℃温育，同时放在轨道平台上，以250rpm振荡。加入80微升DMSO，42℃，15分钟热休克细胞。离心3秒钟，去除上清，用无菌水重悬细胞，转化的细胞在没有色氨酸的平板上培养，进行筛选。

表达βhCG的酵母克隆在YPD培养基中生长直至平台期(其密度不再增加)。载体运用ADH-2启动子，不需要添加诱导剂，一旦培养基中的碳源被耗尽时由碳饥饿激发，48小时后，离心去除细胞，上清存于-20℃至纯化。

从上清中纯化βhCG，加入2倍体积的稀释液(30mM NaOAC，23mMEDTA，pH4.8)，稀释后的上清上样到SP柱(Pharmicia)，该柱已经预先用10倍柱体积的平衡液平衡好(20mM NaOAC，40mM NaCl，15mMEDTA，pH4.8)。

10体积冲洗缓冲液(20mM NaOAC，40mM NaCl，pH4.8)清洗后，再10体积平衡缓冲液洗柱，用金属钴柱结合缓冲液(50mMNaH₂PO₄，20mM Tris，0.1M NaCl，pH8.0)洗脱蛋白，所获得的洗脱液上样到一个金属钴柱，10倍结合缓冲液洗柱，再用100mM咪唑的结合缓冲液2-3倍柱体积洗脱蛋白，最后PBS pH8.0中透析去除咪唑，纯化的蛋白-20℃保存。

实施例3

βhCG抗原决定簇的定位

为了鉴定抗细菌和酵母表达βhCG的多克隆抗体可识别的βhCG抗原决定簇，合成一组有重叠的小肽，依照商家指导用试剂盒(来于Genosys，The Woodlands，Texas)将小肽点在SPOTS膜上。从SEQ IDNo：2的βhCG第一个氨基酸开始合成小肽，每段10个氨基酸。随后的小肽有3个氨基酸的相同段，导致相邻小肽之间有3个氨基酸重复。抗细菌和酵母中表达的βhCG兔多克隆抗血清，进行探测。用现已经十分清楚的技术鉴定被各自的抗血清识别的抗原决定簇。

分析的结果表明，抗血清识别抗原决簇相应于βhCG的67-76位氨基酸和124-139位氨基酸，其中67-76抗原决定簇残基位于受体结合结构域(βhCG的62-81位氨基酸)，另外一个抗原决定簇(124-139位氨基酸)与C末端生物中和小肽(135-169位氨基酸)部分重叠。同样的方法鉴定被抗βhCG抗体识别的其它βhCG抗原决定簇，和鉴定该发明实际用时的有用片段。

实施例4

βhCG掺入到脱乙酰壳多糖/油乳剂中的制备

2％脱乙酰壳多糖，0.5M乙酸钠溶液的制备是将4.1克乙酸钠(Sigma Chemical Co.，St louis，MO)溶于50毫升去离子水(18mOhm：d1)用大约7毫升冰乙酸(Mallinkrodt Chemical.Paris，KY)将溶液pH调到4.5，再加1.5毫升冰乙酸，补偿脱乙酰壳多糖对溶液pH的影响。补加去离子水，使溶液体积至100毫升。大约2克的脱乙酰壳多糖(Sigma Chemical CO，St Louis MO)慢慢加到乙酸钠溶液中，不停搅拌2-3小时。在IEC临床离心机(InternationalEquipment Co.Needham Hts.，MA)上离心，第7档5分钟，得到澄清的脱乙酰壳多糖溶液。其中上清轻轻倒出，沉淀是含有不可溶的脱乙酰壳多糖/壳质和杂质。大约有87到90％(重量)的脱乙酰壳多糖在上清中。

50％氢氧化钠溶液的制备是将50克氢氧化钠(Sigma Chemical Co.St Louis，MO)溶于100毫升去离子水。鲨烯/表面活性剂溶液的制备是将1500微升鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯(tetracosahexaene)SigmaChemical Co.St Louis MO)用600微升表面活性剂PluronicL121(BASF Corp Parsippany，NJ)旋转振荡直至均一。

脱乙酰壳多糖/鲨烯/表面活性剂/抗原乳剂的典型制备是添加大约420微升(溶于水或脲中)的抗原到大约370微升2％脱乙酰壳多糖(0.5M乙酸钠中)，旋转振荡，实际用的抗原量可以从低于1微克到几毫克范围之间，再将大约10微升50％氢氧化钠加到抗原/脱乙酰壳多糖中，旋转振荡。加入大约10微升50％氢氧化钠的时候，要到有稳定的絮状沉淀形成。再将大约140μl先前制备的鲨烯/表面活性剂溶液添加到上述抗原—脱乙酰壳多糖溶液中。旋转振荡几分钟，在免疫研究，注射前，需再旋转振荡或抽射器抽吸重新混合。

实施例5

含有锌或铜或镍的金属/脱乙酰壳多糖/抗原复合物的制备

制备含有锌或铜或镍的脱乙酰壳多糖/金属复合物佐剂，首先要制备2％脱乙酰壳多糖溶液，将2克脱乙酰壳多糖(CTC Organics，Atlanta，GA)溶于100毫升2％乙酸中。获得的溶液用高压蒸汽灭菌。做为选择，还可以通过将2克脱乙酰壳多糖溶于100毫升0.5MpH为4.5的乙酸钠中。乙酸锌、硫酸镍或硫酸铜溶液的制备是将其溶于去离子水，其摩尔浓度在0.001至0.2M之间，过滤灭菌。2％的脱乙酰壳多糖用去离子水1∶1稀释，4ml稀释后的1％脱乙酸壳多糖溶液加到10毫升所需金属盐溶液中。产生的悬浮液在室温下搅拌2到4小时，混和物用Branson Sonifier250超声破碎仪超声处理3到5分钟，并且混和物PH在超声过程中用10N NaOH调到12.0-12.5。如果是锌盐时，有白色沉淀生成，镍盐时有亮绿色沉淀，铜盐时，有蓝色沉淀。超声处理后，混合物以2000rpm(即1000×g)离心10分钟，然后去除上清。含有脱乙酰壳多糖螯合盐的沉淀用PBS，pH7.2洗2次，每次洗后离心。测定湿的沉淀重量，并用8M脲，pH7.8到8.0，重溶金属/脱乙酰壳多糖复合物，存在8M脲素中或PBS中。在室温下，表明贮存的金属/脱乙酰壳多糖可以稳定存在直至六个月。

抗原与金属/脱乙酰壳多糖复合物连结是通过以下过程：含有6个组氨酸的重组蛋白平衡于8M脲素中，然后以大约100∶1的比例与脱乙酰壳多糖金属复合物加到一个塑料管中，在室温下温育1到3小时。温育后蛋白/金属/脱乙酰壳多糖复合物以1000Kg速度，离心10分钟，沉淀下来。结合蛋白的含量可由测定沉淀后上清中蛋白的含量，从原先加入到结合反应中总蛋白量中扣除，即可得到。总的来说，抗原：金属/脱乙酰壳多糖的比例是1∶500(2毫升/克，湿重)。脱乙酰壳多糖蛋白沉淀用PBS冲洗两次，再用PBS重悬，浓度调到1毫克抗原/毫升缓冲液，用于下面的注射。

实施例6

将重组βhCG给雌性小鼠注射

雌性小鼠腹腔注射细菌和酵母重组βhCG(实施例1和2产生的，结合实施例5佐剂)进行免疫。在首次免疫前，动物进行采血获得对照血清。经过首次免疫，动物在所定间隙进行采血，所诱导产生的抗βhCG抗体用ELISA方法测定(该方法在技术上已经十分清楚)。评价抗体抵制注射的天然hCG生物活性的能力。

更为特异性地，十只小鼠注射3次，每次3星期间隔，用25微克纯化酵母表达的βhCG以脱乙酰壳多糖和乙酸锌佐剂(如上制备)，总体积100微升，血清中抗天然hCG的抗体用ELISA测定(在三次疫苗最后一次注射的一个月后)如下表示：

小鼠号滴度

161-1 16000

161-2 2000

161-3 32000

161-4 16000

161-5 8000

80-1 4000

80-2 8000

80-3 ＜250

80-4 8000

80-5 ＜250

小鼠80-3和80-5最初并没有对由酵母表达的βhCG疫苗产生免疫反应。结果，这些小鼠在2个星期内用25μg细菌表达的βhCG疫苗免疫。这种交叉免疫导致注射疫苗三个星期后，ELISA测定抗天然hCG的抗体数值为4000。在注射疫苗六星期后升高12800，这些结果阐明了，对酵母βhCG疫苗不产生免疫反应的动物可通过用细菌表达的βhCG疫苗来交叉免疫，诱导产生免疫反应。

上述数据表明，对于酵母中制备的疫苗不能产生抗体的动物在注射不同宿主细胞产生相同或相似抗原后能产生足够抗βhCG的抗体量。

实施例7

给人注射βhCG

虽然前面例子中对小鼠注射的组合物和发明方法同样对其他哺乳动物，包括人类有用，用来给人注射的合适的有效试剂，可轻易的用技术中常用方法确定。

该发明的有效剂量的组合组可以肌肉、皮下或其他已知方法注射到人体，从而诱导不育或刺激抗体的产生。

如果有人易于在第一次注射该发明组合物后不产生免疫反应，则可以运用交叉免疫方法。一种由其它宿主细胞产生的βhCG有效剂量通过肌肉或皮下注射。在优选的实施方案中，交叉免疫规则可作为首先规则。

该发明并不是局限于所举的各实施方案，这只是为了解释该发明，由同等功能的组合物和方法也在该发明范围内。真正地，对于技术精通的人来说，在依照现优选的实施方案后，可以预计在发明实践中会产生数目众多的修饰物和突变体。在该发明范围内的限制仅仅是那些在申请的权利要求中。

序列表<110>ZONAGEN，INC.<120>人绒毛膜促性腺激素<130>27779/35932<140><141><150>60/100,766<151>1998-09-17<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>534<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(534)<400>1atg acc atg att acg gat tcg cta gcc gtc gtt ctg cag cgt cgc gac 48Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp1 5 10 15tgg gaa aac ccg ggc tgc aga gat ctc aag gag ccg ctt cgg cca cgg 96Trp Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp Leu Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg

20 25 30tgc cgc ccc atc aat gcc acc ctg gct gtg gag aag gag ggc tgc ccc 144Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro

35 40 45gtg tgc atc acc gtc aac acc acc atc tgt gcc ggc tac tgc ccc acc 192Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr

50 55 60atg acc cgc gtg ctg cag ggg gtc ctg ccg gcc ctg cct cag gtg gtg 240Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val65 70 75 80tgc aac tac cgc gat gtg cgc ttc gag tcc atc cgg ctc cct ggc tgc 288Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys

85 90 95ccg cgc ggc gtg aac ccc gtg gtc tcc tac gcc gtg gct ctc agc tgt 336Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys

100 105 110caa tgt gca ctc tgc cgc cgc agc acc act gac tgc ggg ggt ccc aag 384Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys

115 120 125gac cac ccc ttg acc tgt gat gac ccc cgc ttc cag gac tcc tct tcc 432Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser

130 135 140tca aag gcc cct ccc ccc agc ctt cca agc cca tcc cga ctc ccg ggg 480Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly145 150 155 160ccc tcg gac acc ccg atc ctc cca caa act agt cac cac cat cac cac 528Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Thr Ser His His His His His

165 170 175cat taa 534His<210>2<211>177<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp1 5 10 15Trp Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp Leu Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg

20 25 30Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro

35 40 45Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr

50 55 60Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val65 70 75 80Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys

85 90 95Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys

100 105 110Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys

115 120 125Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser

130 135 140Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly145 150 155 160Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Thr Ser His His His His His

165 170 175His<210>3<211>773<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(7)..(765)<400>3cgaacg atg aga ttt cct tca att ttt act gca gtt tta ttc gca gca 48

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala

1 5 10tcc tcc gca tta gct gct cca gtc aac act aca aca gaa gat gaa acg 96Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr15 20 25 30gca caa att ccg gct gaa gct gtc atc ggt tac tca gat tta gaa ggg 144Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly

35 40 45gat ttc gat gtt gct gtt ttg cca ttt tcc aac agc aca aat aac ggg 192Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly

50 55 60tta ttg ttt ata aat act act att gcc agc att gct gct aaa gaa gaa 240Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu

65 70 75ggg gta tct ctc gag aaa aga gag gct gaa gct tac gta gaa ttc gac 288Gly Val Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Tyr Val Glu Phe Asp

80 85 90ccg ggc tgc aga gat Gtc aag gag ccg ctt cgg cca cgg tgc cgc ccc 336Pro Gly Cys Arg Asp Leu Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro95 100 105 110atc aat gcc acc ctg gct gtg gag aag gag ggc tgc ccc gtg tgc atc 384Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile

115 120 125acc gtc aac acc acc atc tgt gcc ggc tac tgc ccc acc atg acc cgc 432Thr Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg

130 135 140gtg ctg cag ggg gtc ctg ccg gcc ctg cct cag gtg gtg tgc aac tac 480Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr

145 150 155cgc gat gtg cgc ttc gag tcc atc cgg ctc cct ggc tgc ccg cgc ggc 528Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly

160 165 170gtg aac ccc gtg gtc tcc tac gcc gtg gct ctc agc tgt caa tgt gca 576Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala175 180 185 190ctc tgc cgc cgc agc acc act gac tgc ggg ggt ccc aag gac cac ccc 624Leu Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro

195 200 205ttg acc tgt gat gac ccc cgc ttc cag gac tcc tct tcc tca aag gcc 672Leu Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala

210 215 220cct ccc ccc agc ctt cca agc cca tcc cga ctc ccg ggg ccc tcg gac 720Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp

225 230 235acc ccg atc ctc cca caa act agt cac cac cat cac cac cat taa 765Thr Pro Ile Leu Pro Gln Thr Set His His His His His His

240 245 250taggatcc 773<210>4<211>252<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Tyr Val Glu Phe Asp Pro Gly

85 90 95Cys Arg Asp Leu Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn

100 105 110Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val

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130 135 140Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp145 150 155 160Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn

165 170 175Pro Val val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys

180 185 190Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr

195 200 205Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro

210 215 220Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro225 230 235 240Ile Leu Pro Gln Thr Ser His His His His His His

245 250

Claims

1.组合物，它包含β人绒膜促性腺激素蛋白(βhumanchorionic gonadotropin protein βhCG)和/或它的融合物，片段或类似物和一种以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂。

2.权利要求1的组合物，其中β人绒膜促性腺激素蛋白(βhCG)含量在大约10微克到大约500微克之间。

3.权利要求2的组合物，其中β人绒膜促性腺激素蛋白(βhCG)含量大约是250微克。

4.权利要求1-3组合物，其中β人绒膜促性腺激素蛋白包含一种重组多肽。

5.权利要求4组合物，其中一个重组多肽进一步包含SEQ IDNo：2或4的氨基酸序列。

6.权利要求1的组合物，其中以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂，它包含脱乙酰壳多糖乳剂，氢氧化钠，一种生物可降解油，一种表面活性剂和一种水溶性缓冲液。

7.权利要求6的组合物，其中生物可降解的油是鲨烯。

8.权利要求6的组合物，其中βhCG蛋白和/或它的融合物，片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到大约1∶1500(重量/重量)之间。

9.权利要求1的组合物，其中佐剂包含脱乙酰壳多糖乳剂，一种金属盐和一种水溶性的缓冲液。

10.权利要求9的组合物，其中金属盐是醋酸锌，硫酸镍和硫酸铜其中的一种。

11.权利要求9的组合物，其中β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到大约1∶1500(重量/重量)之间。

12.权利要求4的组合物，其中一种重组β人绒膜促性腺激素蛋白，它包含一种融合蛋白，基本上由β人绒膜促性腺激素蛋白或它的片段或类似物融合β-半乳糖苷酶蛋白或β-半乳糖苷酶蛋白的片段所组成。

13.导致雌性哺乳动物不育的方法，它包含给药至少一份剂量的疫苗，该疫苗包含β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的片段，类似物并与一种以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂合用，其剂量足以刺激抗体的产生，此抗体可以识别天然循环存在的人绒膜促性腺激素蛋白(hCG)。

14.权利要求13的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白的含量在10微克到500微克之间。

15.权利要求14的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白的含量是大约250微克。

16.权利要求13-15的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白包含一种重组多肽。

17.权利要求16的方法，其中一个重组多肽包含SEQ ID No：2和4的氨基酸序列。

18.权利要求13的组合物中以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂，它包含脱乙酰壳多糖乳剂，氢氧化钠，一种生物可降解的油，一种表面活性剂和一种水溶性缓冲液。

19.权利要求18的方法，其中生物可降解的油是鲨烯。

20.权利要求18的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到大约1∶1500(重量/重量)之间。

21.权利要求13的方法，其中佐剂包含脱乙酰壳多糖乳剂，一种金属盐和一种水溶性的缓冲液。

22.权利要求21的方法，其中金属盐是醋酸锌，硫酸镍和硫酸铜其中的一种。

23.权利要求21的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到大约1∶1500(重量/重量)之间。

24.权利要求16的方法，其中一种重组β人绒膜促性腺激素蛋白，它包含一种融合蛋白，基本上由β人绒膜促性腺激素蛋白或它的片段或类似物融合β-半乳糖苷酶蛋白或β-半乳糖苷酶蛋白的片段所组成。

25.一种导致雌性哺乳动物不育的方法，它包含

a)给药一种宿主细胞表达的重组β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或它的类似物，可有可无地，与以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂联合施用；

并且

b)注射由其他不同于步骤(a)的给药的重组βhCG宿主细胞表达的重组β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或它的类似物，可有可无地，与一种以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂合用；并且其中步骤b)中β人绒膜促性腺激素蛋白的量足以有效的刺激抗体的产生，此抗体可以识别天然循环存在的人绒膜促性腺激素蛋白(hCG)。

26.权利要求25的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白的含量在大约10微克到大约500微克之间。

27.权利要求26的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白的含量是大约250微克。

28.权利要求25的方法，其中一个重组多肽包含SEQ ID No：2或4的氨基酸序列。

29.权利要求25的方法，其中以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂包含脱乙酰壳多糖乳剂，氢氧化钠，一种生物可降解的油，一种表面活性剂和一种水溶性缓冲液。

30.权利要求29的方法，其中生物可降解的油是鲨烯。

31.权利要求29的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到大约1∶1500(重量/重量)之间。

32.权利要求25的方法，其中佐剂包含脱乙酰壳多糖，一种金属盐和一种水溶性的缓冲液。

33.权利要求32的方法，其中金属盐是醋酸锌，硫酸镍和硫酸铜其中一种。

34.权利要求32的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到大约1∶1500(重量/重量)之间。

35.权利要求25的方法，其中重组β人绒膜促性腺激素蛋白，它包含一种融合蛋白，基本上由β人绒膜促性腺激素蛋白或它的片段或类似物结合β-半乳糖苷酶蛋白或β-半乳糖苷酶蛋白的片段所组成。

36.在哺乳动物体内诱导抗体产生的方法包含：

a)给药由一种宿主细胞表达的重组β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或它的类似物，并可有可无地，与一种以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂合用；

并且

b)给药由其他不同于步骤a中给药重组βhCG的宿主细胞表达的重组β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或它的类似物，可有可无地，与一种以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂合用；并且其中步骤b)中β人绒膜促性腺激素蛋白给药量足以刺激抗体的产生，此抗体可以识别天然循环存在的人绒膜促性腺激素蛋白(hCG)。

37.权利要求36的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白的含量在大约10微克到大约500微克之间。

38.权利要求37的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白的含量是大约250微克。

39.权利要求37的方法，其中一个重组多肽另外包含SEQ IDNo：2或4的氨基酸序列。

40.权利要求36的方法，其中以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂，它包含脱乙酰壳多糖乳剂，氢氧化钠，一种生物可降解的油，一种表面活性剂和一种水溶性缓冲液。

41.权利要求40的方法，其中生物可降解的油是鲨烯。

42.权利要求40的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到大约1∶1500(重量/重量)之间。

43.权利要求36的方法，其中佐剂包含脱乙酰壳多糖，一种金属盐和一种水溶性的缓冲液。

44.权利要求43的方法，其中金属盐是醋酸锌，硫酸镍和硫酸铜其中一种。

45.权利要求43的方法，其中β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到大约1∶1500(重量/重量)之间。

46.权利要求36的方法，其中重组β人绒膜促性腺激素蛋白，它包含一种融合蛋白，基本上由β人绒膜促性腺激素蛋白或它的片段或类似物连接到β-半乳糖苷酶蛋白或β-半乳糖苷酶蛋白的片段所组成。

47.β人绒膜促性腺激素蛋白在导致哺乳动物暂时性的不育的药物合成中的应用，其中该药物为一种可注射的制剂，包含β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的片段，类似物，可有可无地，与一种以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂合用，其剂量足以刺激抗体的产生，此抗体可以识别天然循环存在的人绒膜促性腺激素蛋白(hCG)。

48.权利要求47的用途，其中β人绒膜促性腺激素蛋白的含量在大约10微克到大约500微克之间。

49.权利要求48的用途，其中β人绒膜促性腺激素蛋白的含量是250微克。

50.权利要求47的用途，其中β人绒膜促性腺激素蛋白包含一种重组多肽。

51.权利要求50的用途，其中重组多肽包含氨基酸序列SEQ IDNo：2和4。

52.权利要求47的用途，其中以脱乙酰壳多糖为基础的佐剂包含脱乙酰壳多糖乳剂，氢氧化钠，一种生物可降解的油，一种表面活性剂和一种水溶性缓冲液。

53.权利要求52的用途，其中生物可降解的油是鲨烯。

54.权利要求52的用途，其中β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到大约1∶1500(重量/重量)之间。

55.权利要求47的用途，其中佐剂包含乙酰甲壳质乳剂，一种金属盐和一种水溶性的缓冲液。

56.权利要求55的用途，其中金属盐是醋酸锌，硫酸镍和硫酸铜其中一种。

57.权利要求55的用途，其中β人绒膜促性腺激素蛋白和/或它的融合物，片段或类似物与佐剂的比例在大约1∶20(重量/重量)到大约1∶1500(重量/重量)之间。

58.权利要求50的用途，其中重组β人绒膜促性腺激素蛋白包含一种融合蛋白，基本上由β人绒膜促性腺激素蛋白或它的片段或类似物融合β-半乳糖苷酶蛋白或β-半乳糖苷酶蛋白的片段所组成。