CN1187200A - 一种改良肽,免疫原性组合物和疫苗或医用制剂,一种针对激素lhrh免疫动物的方法,lhrh串联重复肽类似物及其作为疫苗的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种经修饰的串联LHRH肽疫苗制剂,其中组成串联单位的一个或两个LHRH十肽的第6位甘氨酸被含可偶联载体化合物的侧链的右旋氨基酸所取代。并且,串联LHRH肽能形成串联的二聚体形式,也适于生产有效针对LHRH(黄体生成激素释放激素)或称为GnRH(促性腺激素释放激素)的疫苗,以用于免疫阉割,抑制或影响脊椎动物特别是家畜,男性的行为或生殖功能。

Description

一种改良肽，免疫原性组合物和疫苗或医用制剂， 一种针对激素LHRH免疫动物的方法， LHRH串联重复肽类似物及其作为疫苗的用途
本发明涉及一种肽，它适于生产有效针对黄体生成激素释放激素(LHRH，也称为促性腺激素释放激素，GnRH)的疫苗。本发明还涉及以此肽为基础的免疫原性组合物和疫苗或药用制剂(疫苗和药物)以及使用此种疫苗或药用制剂针对LHRH免疫哺乳动物并因此影响其生殖或行为特征，增进猪肉质量的方法。
LHRH是来自下丘脑的具有10个氨基酸长度的小肽(十肽)。LHRH的氨基酸序列(氨基酸氨基端在左，羧基端在右)以三字母代码表示为：pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，以单字母代码表示为：#EHWSYGLRPG@；#E为焦谷氨酸，G@为甘氨酰胺。
LHRH作用于垂体，引起生物学活性FSH(促卵泡激素)和LH(黄体生成激素)更多地释放，进入血液，刺激生长中的雄性动物精巢发育及精巢类固醇合成。对于生长中的雌性动物，上述激素则刺激卵巢发育和其中的卵泡发育，卵巢类固醇合成及排卵。
已知偶联了载体蛋白的LHRH可以作为疫苗为动物接种。此种疫苗的不同用途均与LHRH的天然功能有关。已知血液中LH和FSH的大量减少会抑制精巢类固醇，雄激素，精子，以及卵巢类固醇、孕激素、雌激素、卵泡的形成或成熟。血液中雄激素、孕激素、雌激素可以通过针对LHRH有效免疫动物而达到与去除动物精巢或卵巢相当的较低水平。这样，大多数时候动物精巢发育迟缓或停止(无雄激素生成、无精子形成)，雌性动物卵巢变小(无雌激素、孕激素等雌性类固醇激素合成，卵泡成熟及排卵受阻)。
兽医药中，针对LHRH的100％有效的免疫法可替代阉割、卵巢切除等彻底手术对雌、雄性小型家养动物诸如猫、狗等作绝育，或者控制雄性狗、牛等的功击行为。针对LHRH的免疫法的其它用途还包括抑制雌性动物热量消耗，减少雄性动物焦燥不安，以利于育肥屠宰。人类健康理疗方面，针对LHRH的免疫可用于前列腺癌和乳腺癌治疗，甚至可治疗一些类型的垂体癌。
针对LHRH的疫苗的另一用途在于家畜育种方面，尤其是用于屠宰的猪的育肥。雄性、性成熟的猪肉(公猪)有典型的所谓公猪膻味。这种猪在其精巢中形成C19-Δ16类固醇并贮于脂肪组织中(帕特森，《科学食品农业杂志)》19，31-38(1968)；布鲁克斯·安·柏森，《动物科学杂志》62，632-645(1986)；克劳兹，Zeitschrift.Tierzuchtg.Zuchtungsbiol.93，38-47(1976)；克劳兹，《内分泌年鉴》(哥本哈根)91，增补本，225，432-433，(1979))。当猪肉加热时，这些类固醇会散发出难闻的尿样气味(福齐斯，《瑞典农业研究杂志)》1，233-237(1971)；勃尼，《生畜生产科学》9，687-705(1982))。由于气味难闻，性成熟的公猪肉不适于消费及出口。约有10％的雄猪在屠宰时已经性成熟，给养猪业带来巨大损失。
为了控制和消除这种损失，几乎所有雄猪在幼龄阶段均阉割处理，一般在无任何麻醉剂情况下进行。阉割既对动物不友善，又会导致感染、生长抑制，最终肉质劣于完整的未阉割雄猪(只要完整的雄猪还未出现公猪膻味)(沃斯特拉，《生畜生产科学》1，187-96(1974))。
一种较为友善又增加猪肉质量的替代办法是，通过针对LHRH的免疫减少幼猪垂体中LHRH的浓度。LHRH水平的减少导致生物活性FSH及LH浓度的减少，从而抑制精巢发育及精巢类固醇包括C19-Δ16类固醇的合成。阉割变得没有必要，感染和生长抑制得到消除，最终的肉质不比阉割后的差。这种方法消除了屠宰前公猪膻味的发生。
然而，作为消除公猪膻味的好疫苗有其严格要求，即延迟精巢发育，使得在屠宰前不会发生公猪膻味。已知的疫苗制剂不符合这一要求。
有关针对LHRH的疫苗的抗生育性质，现有技术文献及以往专利申请中疫苗接种的结果经常不一；如一些动物几乎没有反应。或者需要较大剂量的疫苗佐剂(这在商业上不能接受)才有期望的效果(Chaffaux等，Recueil de Medicine Veterinaire，16卷(2)，133-145页(1985)；加拉蒂等，C.R.Acad.Sc.Paris，303，集III，16期，673-676(1986)；法尔沃等，《动物科学杂志》，63卷，986-994页(1986年)；戈宝等，家养动物内分泌科学》，6卷，339-347页(1989年a)；戈宝等，《兽医学》，32卷，557-567页(1989年b)；霍斯金森等，《动物科学》，72卷，14-20页(1994年)；美国专利4,608,251；国际专利申请WO 88/05308)。根据文献资料，使用针对LHRH的免疫接种阻断免疫过的猪早期阶段精巢发育而完全解决公猪膻味问题是不可能的。成功率仅在20-80％间。这是不够的，使得现有LHRH疫苗不能用于农业实践中。
制备这种疫苗的难点可能在于“耐受性”现象的存在。免疫系统不能识别而是耐受象激素这样的“自身”物质，通常没有抗体产生，一个好的疫苗要求既与激素相似又有充分的“外源性”以诱发抗体的产生。这两个要求互相抵触，直到现在也没有确定是否能够制备出这种物质。一种生产类似LHRH肽疫苗的尝试是将LHRH十肽的第6位的Gly替换成右旋氨基酸(D-Tryp；Chaffaux等，Recueil deMedicine Veterinaire 161卷，(2)，133-145，1985)。然而，含有此种修饰的LHRH肽的疫苗制备物效果比LHRH正常十肽更差(EPO 464 124)。
然而是最近我们发现，在针对LHRH免疫的动物中引发有效抗体反应是可能的(梅隆等，《疫苗》，12卷，741-746页，(1994年))。实验中用一种LHRH疫苗给猪接种两次，该疫苗不同于典型的LHRH疫苗(LHRH偶连载体蛋白，使用弗氏佐剂)，它是串联LHRH疫苗(欧洲专利号046124)。根据此串联LHRH疫苗的发明，优选的肽是至少包括2个串联LHRH序列，通式为(N端氨基酸在左，C端氨基酸在右)Z1-Glx-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro[-Gly-X-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-ProJn-Gly-Z2，其中氨基酸以三字母代码表示，Trp1和Trp2为色氨酸(Trp)或甲基化色氨酸(N(吲哚)-甲基-色氨酸)，n至少为1，X为氨基酸Gly和Gln之间的一个直接键合或一个间隔基，Z1-Glx要么是pGlu(焦谷氨酸)要么是连有包括一个或多个额外氨基酸的尾部的Gln，Gly-Z2要么是Gly-NH2要么是连有包括一个或多个氨基酸的尾部的Gly。通式中，X可能是甘氨酸与谷氨酸胺间的一个直接键合，即这些氨基酸不经中间连键而直接相连(通过一般肽键)。此串联LHRH疫苗发明还包括这样的肽，其中LHRH序列通过间隔基相互连接。间隔基的性质可以是一个或多个氨基酸，或者一个较短或较长的碳氢链以及其它化合物基团或分子。在上述通式中，Z1-Glx优选代表pGlu(焦谷氨酸)，但也可代表连接有包括一个或多个额外氨基酸的尾部的Gln，例如用于将肽偶联到载体蛋白。上述通式中，Gly-Z2代表例如Gly-NH2或代表连接有包括一个或多个额外氨基酸的尾部的Gly，例如用于将肽偶联到载体蛋白。Gly-Z2优选代表Gly-Cys-NH2，加入C末端的半胱氨酸可将肽偶联到载体蛋白。
更具体地说，此串联LHRH疫苗发明提供了一种肽，其特征在于包括至少2个LHRH序列串联，通式为(N端氨基酸在左，C端氨基酸在右)pGlu-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro[-Gly-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro]n-Gly-Cys-NH2，其中氨基酸以三字母代码表示，Trp1和Trp2是色氨酸或N-甲基-色氨酸，n是至少为1的数字。
这个串联LHRH疫苗似乎完全阻断精巢发育及精巢中产类固醇细胞(间质细胞)的发育。但此疫苗有许多不利的方面不适于实际应用。一个不利的方面是，要使免疫阉割成功，需用高剂量接种以引发所需反应，每头猪至少1mg，在养猪业中大规模使用这种疫苗无疑十分昂贵。
该疫苗另一重要的不利是该疫苗只有在与完全弗氏佐剂合用时才会高效，而且使用这种强刺激的佐剂会引发许多不希望的副作用，如由其粘稠的性质引起的疫苗制备和使用中的困难，而且其本身应用也会使动物很痛苦，佐剂残余物及佐剂引发的接种部位慢性炎症反应如化脓等可能降低猪肉品质。
然而，本发明解决了以上所述由使用针对LHRH的串联LHRH肽疫苗引起的不利副反应，而且又不会丧失其有利的方面。
已表明，串联LHRH疫苗的单体形式结合弗氏完全佐剂但无载体蛋白KLH，对阻断精巢生长和公猪膻味充分有效，并且串联LHRH疫苗的二聚体形式与较温和的弗氏不完全佐剂结合，可以产生相当高的效果。令人惊奇的是，将串联原则应用到LHRH分子的变体，即该十肽的第6位甘氨酸被右旋氨基酸D-Lys取代，然后将得到的肽偶联到普通载体化合物(这里用卵清蛋白)，并与几种温和佐剂如Specol、双油乳化剂等配合使用，可以得到非常有效疫苗，即使低剂量也有效。因此尽管单一LHRH十肽中第6位甘氨酸被取代为D-氨基酸会降低原来的LHRH序列的免疫原性，然而此种取代应用于串联LHRH疫苗却能产生更高的免疫原性LHRH疫苗制备物。用其它右旋氨基酸取代串联单位中一个或每个LHRH十肽第6位甘氨酸预期也会增加疫苗效果。另外，例如使用右旋赖氨酸作为取代氨基酸时，可以使串联肽既可以二聚或多聚，又不失去将肽组合物结合到载体化合物的可能性。尽管C端半胱氨酸可通过二硫键的形成而用于二聚化，因而不能再用来偶联载体化合物，但取代氨基酸的侧链仍可用来偶联载体化合物。当然，用含有合适侧链的其它氨基酸作为取代物(如右旋谷氨酸，其它带合适侧链的可能的取代氨基酸是普通技术人员公知的)也能将肽偶联到载体化合物。
[D-Lys6]-LHRH已被描述为一种超活性LHRH兴奋剂(西柏罗迪等，《药物化学杂志》，21卷，276-280页(1978年)并用于LHRH放射免疫分析(赫伯·安·欧德尔，《实验生物药学进展》，158卷，643-646页(1978年))中，作为LHRH受体研究的荧光配体使用(科恩等，《生物化学杂志》，256卷，1098-1100页(1981)；劳尔等，《生物化学杂志》，256卷，3049-3052页(1981年)；齐尔兹等，《肽》，4卷，549-555页(1983年))，并偶联到细胞毒性基团以阻止癌生长(斯诺克，《肽》，15卷，359-366页(1994)。[D-Lys6]-LHRH以前未作LHRH疫苗使用过。
本发明涉及由至少两个串联形式的LHRH序列组成的肽或肽组合物，其中最初的LHRH十肽序列的第6位甘氨酸已被右旋氨基酸所取代。第6位Gly可被一功能氨基酸取代，这个右旋氨基酸还含有一侧链，通过该侧链可将LHRH串联单位偶联到载体化合物。根据所用的肽合成技术，此肽有或没有C端酰胺化。另外此肽可以二聚化或多聚化，其中至少一个原始LHRH十肽在第6位含有功能性的氨基酸取代。
本发明的肽或肽组合物含有可以如下列通式所示的连续序列：
 1    6         16   21
#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
其中*号表示Gly可能被一个右旋氨基酸所取代，该右旋氨基酸还含有可将LHRH串联单位偶联到载体化合物的侧链。
本发明的第一个特征是，此肽或肽组合物中的一个或多个氨基酸可以被取代，例如串联重复单位中每个LHRH十肽的第6位氨基酸即甘氨酸(上述通式中的第6位和/或第16位)被右旋氨基酸取代，从而产生与正常LHRH序列有足够的差异而被免疫系统识别的肽，而不失去免疫原性。
本发明的第二个特征是，各个串联单位二聚化以加强其免疫原性，并且不失去将肽或肽组合物偶联到载体化合物的可能性，在这种肽或肽组合物中，串联单位的二聚化可发生于羧基末端或氨基末端，如通过二硫桥或硫醚键而将两个串联单位二聚化。为达到这个目的可使用第21位半胱氨酸，或半胱氨酸可在第1位谷氨酸之前合成。现有技术中的其它将LHRH串联单位二聚化或多聚化的方法也可使用。为了防止二聚化或多聚化导致可缀合载体化合物的结合位点的丢失，需将替换第6位和/或第16位甘氨酸的右旋氨基酸的选择限制为有合适的侧链的氨基酸，这种替换氨基酸可以例如是右旋赖氨酸、右旋谷氨酸或其它含有可偶联载体化合物的侧链的右旋氨基酸。
更具体地，本发明的一个优选肽D-Lys6-串联LHRH二聚体通式如下：
 1    6         16   21
#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC    *＝D-Lys
                     |
#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
22    27        37   42
本发明另一个优选肽D-Glu6-串联LHRH二聚体通式如下：
1     6         16   21
#EHWSY*LRPGQHWSYGLRPGC    *＝D-Glu
                     |
#EHWSY*LRPGQHWSYGLRPGC
22    27        37   42
但其它在第6位和/或第16位和/或(如在上两个二聚体形式例子中)在第27位和/或第37位有右旋氨基酸取代的单聚、二聚或多聚LHRH串联单位的肽和肽组合物也是本发明的一部分。
本发明还提供一种组合物，其特征在于含有已被变为免疫原性形式的肽。如熟练技术人员熟知的，有许多不同方法将本身无免疫原性的物质转变为免疫原性形式。本发明中首先的可能做法是将本发明的肽偶联到合适的载体蛋白。串联肽中的N端或C端半胱氨酸可用于化学偶联。串联二聚体肽中，用在第6位和/或16位和/或27位和/或37位取代甘氨酸的D-赖氨酸，D-谷氨酰胺或其它修饰氨基酸的普通或修饰侧链作偶联。本领域熟练人员十分清楚何种偶联方法，何种载体蛋白比较合适。本发明的一个优选组合物的特征在于包括一种蛋白如卵清蛋白和本发明的肽或肽组合物的免疫缀合物。当然本发明的疫苗制备物可以与至少一种免疫佐剂联合应用。本领域熟练人员熟知合适的免疫佐剂。根据本发明，优选的佐剂可以是Specol或双油乳液，但其它没有或有较小副作用的佐剂也能使用。本发明可用于针对LHRH免疫不同脊椎动物但尤其是哺乳动物的方法中，针对LHRH免疫可以例如用于给小型家养动物如雄性、雌性猫、狗等绝育，或治疗雄性狗、牛的攻击行为。其它用本发明针对LHRH免疫的可想象的原因还包括阻止狗、猫、牛等雌性动物的热量散失，治疗雄性动物的焦燥不安，以利育肥屠宰。对人类健康理疗，针对LHRH的免疫可用于前列腺癌、乳房癌、垂体癌的治疗。
一个优选的实施方案是增加猪肉质量的方法，其中用本发明的疫苗制剂给猪接种。本发明在下述实验部分中说明。
实施例：
成功的公猪接种的定义是屠宰时精巢重量应小于150克，接受疫苗的治疗组所有动物精巢均应明显可见减小。精巢重量与睾丸甾酮及公猪膻味的产生直接相关。精巢重量小于60克时精巢在组织学上完全没有活性(梅隆等，《疫苗)》，12卷，741-746页(1994))，血清中检测不到睾丸甾酮。我们已描述了精巢大小、特别是重量与背部脂肪雄激素水平的精确相关关系(翁克等，《家畜生产科学》，42卷，63-71(1995)。免疫动物精巢小于150克是无公猪膻味的清楚指标。背部脂肪中雄激素通常浓度很低，不易检测，如存在也总低于0.5μg/g脂肪。文献中将这个值称为可检测公猪膻味的安全低限，而也有报道说每克背部脂肪中1μg睾丸甾酮足够低。我们将最低值作为低限，低于此值我们就认为猪已成功地免疫阉割。这个关系建立在对100多头猪的测定之上。本实验对照动物精巢重量介于200至350克之间。免疫阉割的猪饲料转化率和瘦肉/脂肪比率相对于幼年手术阉割的公猪均有提高。
方法：
肽合成在ABI 430A肽合成仪上进行，以0.25mM规模、约60分钟的循环时间作FastMoc循环(菲尔兹CG，罗伊德DH，麦克唐纳RL，奥迪森KM，自动化Fmoc固相肽合成中惰性RL HBTU活化”，《肽研究》，4卷，95-101页，(1991年)；用户手册#32，应用生物系统公司(1990))。
肽的纯化：纯化用Waters PrepLC4000系统进行，装备有WatersPrepPak柱(25毫米×100毫米)，填充Delta-Pak C18(15nm，100A)材料和保护柱。
我们使用两个Waters型号510泵，一个Waters型号680梯度控制仪，一个Waters型号WISP 712自动进样机和一个Waters型号991光二极管阵检测仪进行分析高效液相层析。以从含0.1％TFA的水到60％乙腈在含0.1％TFA的水中的线性梯度，在Waters Delta PakC18-100A(3.9×150mm，5μm)柱上，在250nm以1毫升/分对产物作分析。所有产物由峰表面显示为纯度95％。
氨基酸分析采用Waters PicoTag系统进行，结果与根据氨基酸序列所作的估计值一致。
二聚化程序：将产物溶于20％二甲基亚砜水溶液中。pH值应用1％或2％NH4HCO3调到5-6，溶液应澄清。pH过高则用1-10％乙酸矫正。在室温至少搅拌5小时。产物直接用高效液相色谱纯化。
D-Lys6-串联二聚体与卵清蛋白的缀合：(使用的重量当量：在milliQ-水中使用10mgECDI偶联1mg卵清蛋白和1mg D-Lys6-串联二聚体)。首先将肽与卵清蛋白溶于milliQ-水中(A＝肽溶液；B＝卵清蛋白溶液)，将A、B充分混合，接着将基于重量当量10倍过量的碳二亚胺(ECDI)溶于milliQ-水中(C＝ECDI溶液)。然后连续搅拌下将C缓慢加入A+B溶液中，6小时后，对水透析(截流分子量：10,000)产物。
荷载测定：荷载量通过计算缀合物以及单独的肽与载体蛋白的比较氨基酸分析得到。从氨基酸分析得知缀合物中每毫克卵清蛋白约含0.5mg肽。
疫苗制备物：疫苗由肽与佐剂混合制得(细节见Specol)
受试佐剂为弗氏完全佐剂(CFA)，弗氏不完全佐剂(IFA)，Specol油和双油乳液(d.o.e)。
-CFA或IFA按1∶1与肽溶液混合，得到稳定的乳液。
-双油乳液(W/O/W)：
10份第一水相：溶于PBS(磷酸盐缓冲液)的抗原
11份油相：含10％一油酸二缩甘露酯(“Arlacel”)的Marcol52(Esso)。
10份第二水相：含2％Montanox 80(＝Tween80)的PBS
-Specol(特殊油相)是适于产生用于研究的油包水乳液的产品。组成：每10ml含0.453g Tween 85(ICI)，0.532g Span 85(ICI)，9ml Marcol52(Esso Belgium)。
在Specol中的乳液的制备：将4份含抗原的水相与5份Specol(体积比)混合，将水相慢慢加入油相(Specol)，同时用ultraturrax剧烈(振荡器混合太温和)。尽可能防止空气进入。使用干净的无清洁剂的玻璃器皿。贮存：Specol优选贮于4-8℃。(参考：B.A.博克豪特等，《兽医免疫学与免疫病理学)》，2卷，491-500(1981)；W.霍尔等，《兽医免疫学与免疫病理学》22卷，175-186(1989)；W.J.A.博尔斯玛等，《免疫学研究》，143卷，503-511(1992))。
接种程序：将上述制备的1mg肽(由负荷量计算)或较低量溶于1ml磷酸盐缓冲液(PBS)并用指示的佐剂乳化，用于一只动物的一次接种。实验开始时，雄猪一般在10周龄左右接受第一次接种，8周后用同样组合物加强免疫。
评价：猪的精巢大小在外部用卡尺测量。从首次接种约12周后猪的精巢不再增大(甚至变小)，LHRH浓度降低。取血清作抗LHRH效价及睾丸甾酮测定。通过系列稀释度的猪抗血清与125LHRH的结合测定抗GnRH的抗体。动物在首次接种后16周宰杀，精巢取出称重，取背部脂肪样品用ELISA法(Ridascreen)测定类固醇雄激素。进一步鉴定肉质。
实验1
在这些实验中检测了非缀合形式的不同肽构建物。每种肽在10周龄和18周龄两次接种，每次接种量为1mg，使用IFA作为佐剂，受检的构建物是羧基端二聚化LHRH单体，羧基端二聚化的LHRH串联体，氨基端二聚化的LHRH串联体，羧基端二聚化的[D-Nal(2)6]-LHRH(NafarelinR)单体，羧基端二聚化的[D-Nal(2)6]-LHRH(Nafarelin)单体，羧基端二聚化的[D-Nal(2)6]-LHRH(Nafarelin)串联体，羧基端二聚化的[D-Lys6]-LHRH单体和羧基端二聚化的[D-Lys6]-LHRH串联体。
1)C-单体LHRH二聚体的肽分子式：
 1         11
pEHWSYGLRPGC
           |
pEHWSYGLRPGC
12         22
2)C-串联LHRH二聚体的肽分子式：
 1                   21
pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
                     |
pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
22                   42
3)N-串联LHRH二聚体的肽分子式：
1                   21
CQHWSYGLRPGQHWSYGLRPG@
|
CQHWSYGLRPGQHWSYGLRPG@
22                   42
4)[D-Nal(2)6]-单体LHRH二聚体的肽分子式：
 1    6    11
pEHWSY*LRPGC            *＝[3-(2-萘)-D-丙氨酸]
           |
pEHWSY*LRPGC
12    17   22
5)[D-Nal(2)6]-串联LHRH二聚体的肽分子式：
 1    6         16   21
pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC  *＝[3-(2-萘)-D-丙氨酸]
                     |
pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
22    27        37   42
6)[D-Lys6]-单体LHRH二聚体的肽分子式：
 1    6    11
pEHWSY*LRPGC            *＝[D-赖氨酸]
           |
pEHWSY*LRPGC
12    17   22
5)[D-Lys6]-串联LHRH二聚体的肽分子式：
 1    6         16   21
pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC  *＝[D-赖氨酸]
                     |
pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
22    27        37   42
抗原                精巢重量＜150克       精巢重量
                    的猪数/组猪数      (平均值±s.d.)1)C-单体LHRH二聚体            0/7              294±442)C-串联LHRH二聚体            5/7              92±1053)N-串联LHRH二聚体            6/7              88±573)N-串联LHRH二聚体            6/8              72±894)[D-Nal(2)6]-单体LHRH二聚体 2/7              177±695)[D-Nal(2)6]-串联LHRH二聚体 0/7              248±566)[D-Lys6]-单体LHRH二聚体    2/7              190±447)[D-Lys6]-串联LHRH二聚体    5/7              103±102
第2、3、7组中70-80％的动物免疫阉割成功，在这些应答者中精巢重量最高为86克，而没有应答的动物精巢重为193克或更高。从这些结果看起来在配方中用弗氏不完全佐剂代替完全弗氏佐剂与未缀合的肽一起使用会降低效果。另外，第一，其特别示出串联原则对疫苗活性是必要的，第二，在羧基端或氨基端均可二聚化，第三，并非每一种氨基酸取代都是允许的，如用Nafarelin-类似物作为疫苗即没有效果。
实验2
对于第一次在CFA中接种，第二次在IFA中接种已知成功的基于与匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)偶联的串联-LHRH肽的疫苗，使肽不结合载体蛋白，以单体或二聚体形式，在CFA/IFA中，及在2×IFA中，剂量为1mg和100μg进行测试。分别在10周龄和18周龄接种两次免疫猪。
1)串联LHRH的肽分子式：
1                    21
pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
2)串联LHRH二聚体的肽分子式：
1                    21
pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
                     |
pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
22                   42
抗原                      精巢重量     精巢重量    8wpv时的
                        ＜150克的数 (平均值±s.d.) LHRH-Ab
                          猪数/组猪                 效价
              佐剂    剂量1)串联LHRH       CFA/IFA  1mg    6/6      38±231)串联LHRH       CFA/IFA  1mg    6/6      24±61)串联LHRH       CFA/IFA  1mg    6/6      41±271)串联LHRH       CFA/IFA  1mg    11/11    39±14    17.8±11.52)串联LHRH二聚体 CFA/IFA  1mg    10/11    67±64    16.7±5.91)串联LHRH       2×IFA   1mg    5/13     159±108  10.8±8.42)串联LHRH二聚体 2×IFA   1mg    6/13     154±95   8.7±6.81)串联LHRH       CFA/IFA  100μg 7/12     121±92   12.6±5.92)串联LHRH二聚体 CFA/IFA 100μg    6/12    132±86  9.8±5.21)串联LHRH       2×IFA  100μg    5/13    172±92  3.5±4.62)串联LHRH二聚体 2×IFA  100μg    1/13    220±55  4.6±5.4
单体或二聚体形式的串联LHRH疫苗即便在完全缺失载体蛋白KLH时也能有效阻止精巢生长及公猪膻味形成。这个疫苗不利的一面是只有高剂量使用弗氏完全佐剂才能取得高效。此外，只有使用1mg剂量CFA/IFA的串联LHRH或串联LHRH二聚体才能得到合理的抗LHRH抗体效价(表示为免疫后8周(8wpv)所取血清的结合百分率)。
实验3
用更温和的佐剂SpeCol和双油乳液(d.o.e)代替IFA，检测缀合载体蛋白的效果。将在第6、16、27、37位甘氨酸被D-赖氨酸取代的二聚化串联LHRH肽与卵清蛋白缀合，用Specol及双油乳液分别乳化。在10周龄及18周龄分别给猪接种2次，剂量为1mg肽缀合物。偶联效果为50％，因此实际使用的抗原量为500μg。
[D-Lys6]-串联LHRH二聚体的肽分子式：
 1    6         16   21
pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC    *＝[D-赖氨酸]
                     |
pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
22    27        37   42
抗原                 精巢重量＜150克    精巢重量
                     的猪数/组猪数    (平均值±s.d.)1)在Specol中的[D-Lys6]-串联 9/9              19±12LHRH二聚体-卵清蛋白2)在d.o.e中的[D-Lys6]-串联  8/8              43±46LHRH二聚体-卵清蛋白
即使使用非常温和的佐剂，与通用载体蛋白缀合也会极大改善疫苗效率。
实验4
在后续实验中，我们检测了使用剂量可降低到何种程度。肽抗原为[D-Lys6]-串联LHRH二聚体，其偶联到卵清蛋白，使用Specol作为佐剂，分别在10周龄和18周龄两次给猪接种缀合物。
   剂量       精巢重量＜150克    精巢重量  12wpv时的
(μg缀合物)    的猪数/组猪数 (平均值±s.d.)LHRH效价A.    1000              9/9          19±12    46.5±5.1B.    1000              8/8          43±46    28.7±13.0C.    1000              7/8          60±62    44.1±11.4D.    900               11/11        46±38    24.4±4.4C.    500               7/9          65±69    36.3±14.3D.    300               11/11        29±18    28.0±3.2E.    300               15/15        24±18    35.3±4.2C.    250               9/9          32±12    45.1±8.6C.    125               8/8          42±42    44.9±12.0F.    125               12/12        35±37    27.8±3.6G.    125               10/10        21±12    26.5±3.1H.    125               6/6          12±2     n.d.K.    125               7/7          31±22    29.5±5.1D.    100               9/10         62±58    23.2±6.7D.    30                10/11        53±65    25.6±7.4E.    30                13/15        61±75    32.5±5.2D.    10                9/11         78±86    22.9±7.8E     3                 6/15        207±117   21.3±9.7
使用在Specol中的[D-Lys6]-串联LHRH二聚体-卵清蛋白缀合物，可以显著降低疫苗剂量。在43头接种125μg缀合物(＝62.5μg肽)的猪中，有效率100％。精巢小于150g的猪中测得每克背部脂肪中雄激素含量低于0.5μg(翁克等，《生畜生产科学》，42卷，63-71(1995))，大多数情况下甚至低于ELISA可检水平(0.111μg/g背部脂肪)。用10-100μg缀合物剂量时，非反应者有增加趋势，剂量低于10μg则无效。抗LHRH抗体效价仅在一个实验内部可比。结果清楚表明，低剂量疫苗能引发与高剂量相似的效价，这与使用串联LHRH或串联LHRH二聚体获得的结果相反。在一个实验中低平均效价、高标准偏差产生于猪的方面而非全出自对疫苗的响应或不响应。
实验5
对照组为完整雄猪，测定其精巢重量和雄激素水平。
 数目        精巢重量             雄激素
         (平均值±s.d.)       (μg/g背部脂肪)1   10        217±38             0.68±0.422   6         233±41             2.04±1.553   5         231±58             2.05±0.70
正如翁克等《生畜生产科学》，42卷，63-71(1995)报道，雄激素浓度在各个完整成年雄猪中差别较大。

Claims (15)

1、一种含至少两个连续LHRH十肽序列的肽，其中至少有一个LHRH十肽的第6位甘氨酸被具有可偶联载体化合物的侧链的右旋氨基酸取代。
2、根据权利要求1的肽，其特征在于其包括具下列结构的氨基酸序列：
1     6         16  21
#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
其中第6位或第16位氨基酸*是具有可偶联载体化合物的侧链的右旋氨基酸，另一个氨基酸*是甘氨酸或具有可偶联载体化合物的侧链的右旋氨基酸。
3、根据权利要求1或2的肽，其是二聚化或多聚化的。
4、根据权利要求3的肽，其包括下列结构：
1     6          16  21
#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
                     |
#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
22    27         37  42
其中第6位或16位或27位或37位氨基酸*为右旋赖氨酸或右旋谷氨酰胺或另一种具有可偶联载体化合物的侧链的右旋氨基酸，另一氨基酸*是甘氨酸或右旋赖氨酸或右旋谷氨酰胺或另一种具有可偶联载体化合物的侧链的右旋氨基酸。
5、根据权利要求3的肽，其具有下列结构：
  1    6         16   21
#CQHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
 |
#CQHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
 22    27        37   42
其中第6位或16位或27位或37位氨基酸*为右旋赖氨酸或右旋谷氨酰胺或另一种具有可偶联载体化合物的侧链的右旋氨基酸，另一氨基酸*是甘氨酸或右旋赖氨酸或右旋谷氨酰胺或另一种具有可偶联载体化合物的侧链的右旋氨基酸。
6、一种组合物，其中根据权利要求1-5任一项所述的肽与一种载体化合物偶联。
7、根据权利要求6的组合物，其中载体化合物是一种蛋白质。
8、根据权利要求7的组合物，其中载体化合物是KLH或卵清蛋白。
9、根据权利要求1-8任一项所述的组合物，其还含有一种温和佐剂。
10、根据权利要求9的组合物，其中温和佐剂是一种油包水乳液的油相或一种双油乳液。
11、一种疫苗，包括权利要求1-10任一项所述的组合物。
12、一种用权利要求13的疫苗接种动物的方法。
13、根据权利要求12的用疫苗接种动物的方法，其中有效剂量低于约1mg。
14、一种影响动物的一种或多种生殖特征或行为特征的方法，所其特征在于所述动物已根据权利12或13的方法接种。
15、一种免疫阉割猪的方法，其特征在于所述猪已根据权利要求12或13的方法接种。
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