CN107449924A - 一种鸡免疫去势效果的判定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸡免疫去势效果的判定方法，包括以下步骤：将鸡促黄体素释放激素抗原稀释后加佐剂乳化，然后免疫肉鸡，测定其鸡促黄体素释放激素抗体效价，然后观察外观特征并测定性激素以及性腺重量，以免疫15天后抗体效价不低于10×IC50，免疫4个月后睾丸重量有效抑制为95％置信区间作为10×IC50判定标准，判定去势有效率。本发明通过研究cLHRH抗体效价与免疫鸡外观特征、激素含量及性腺重量的相关性，制定出一种鸡免疫去势效果的判定方法，该方法稳定性好，准确性高，可充分保证去势疫苗在免疫有效期内的免疫效力。

Description

一种鸡免疫去势效果的判定方法
技术领域
本发明属于去势效果的判定技术领域，具体涉及一种鸡免疫去势效果的判定方法。
背景技术
“去势术”是我国古代重大发明之一，俗称“阉割”，是一项改善肉质的传统畜牧业生产技术，沿用数千年，在我国牧业经济和传统美食文明中具有决定性地位。除改善畜禽肉质、口感和风味以外，去势可以使动物温顺、便于管理、使役、增重快，能降低热量消耗，提高饲料的利用率。然而，手术“阉割”除了“残忍”外，主要还存在不足之处有：会引起出血，容易造成伤口感染，甚至可能导致动物死亡；对动物应激很强，会引起减食和体重下降，饲养周期延长；技术原始，劳动强度大，不适合现代集约化、规模化生产；对施术者的技术经验要求相当高，适用动物范围也很受限；为了防止破伤风，手术后常要打“破抗”，加重畜主负担。
随着科技的进步，现在的去势方法是接种去势疫苗来替代传统的手术去势，用于克服传统“阉割”手术的缺陷。但经过免疫后的动物，其免疫去势效果该怎样判定是现在研究的重点，现有技术中有报道其他动物免疫去势效果的判定方法，但未见鸡去势效果的判定方法。因此，亟需寻求一种准确、稳定的鸡免疫去势效果的判定方法。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种鸡免疫去势效果的判定方法，该方法以疫苗免疫肉鸡的抗体效价测定为主，再结合外观特征与性行为的观察，血清中睾酮及雌二醇含量的测定，再测定睾丸等性腺重量，经过统计分析，最终获得鸡免疫去势效果的判定方法。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种鸡免疫去势效果的判定方法，包括：将鸡促黄体素释放激素抗原(cLHRH)稀释后加佐剂乳化，然后免疫肉鸡，测定其鸡促黄体素释放激素抗体效价，然后观察外观特征并测定性激素以及性腺重量，以免疫15天后抗体效价不低于10×IC50，免疫4个月后睾丸重量有效抑制为95％置信区间作为可量化的判定标准，判定去势有效率，去势有效率达80％以上。
进一步地，鸡促黄体素释放激素抗体效价的测定方法为ELISA法，具体包括：制备包被抗原、包被、洗涤、封闭、加样、添加酶标抗体、显色、终止反应和效价测定；其中，包被抗原为cLHRH-Lys10-cLHRH，
分子量为3353.82，纯度大于90％(HPLC)，包被抗原中的氨基酸序列为：
Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly；
效价测定是通过标准曲线法进行测定。
本发明还对各个过程的条件进行了优化，优化结果如下：
进一步地，包被具体过程为：用包被缓冲液将包被抗原稀释至0.5-1μg/ml，然后加入酶标板的酶标孔内，每孔加入量为80-100μl，2-8℃包被12h；其中，包被缓冲液为0.1mol/L，pH＝9.0的磷酸缓冲液；优选用包被缓冲液将包被抗原稀释至1μg/ml，每孔加入量为80-100μl，2-8℃包被12h。
进一步地，洗涤具体过程为：每孔加300μl洗涤液洗涤包被的酶标板，洗涤4-5次，每次4-5min，拍干；其中，洗涤液为含0.05％吐温-20，浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸缓冲液。
进一步地，封闭具体过程为：向洗涤后的酶标板中加入封闭液封闭，每孔加300μl，置于37℃孵育2h，然后重复洗涤过程；其中，封闭液为含2％明胶和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝9.0。
进一步地，加样具体过程为：将待检样品和标准血清样品分别用样品稀释液稀释，然后按照100μl/孔加入封闭后的酶标板中，置于37℃孵育1h，然后重复洗涤过程；其中，样品稀释液为含1％BSA、0.5％复方肽酶抑制剂Cocktail和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝8.0。
进一步地，添加酶标抗体具体过程为：将酶标抗体用酶标抗体稀释液稀释5000倍，然后按照100μl/孔加入封闭后的酶标板中，置于37℃孵育1h，重复洗涤过程；其中，所用酶标抗体为兔抗鸡酶标二抗；其中，酶标抗体稀释液为含1％BSA的PBST溶液。
进一步地，显色具体过程为：向酶标板中加入TMB显色液，加入量为100μl/孔，置于37℃显示15min；其中，TMB显色液通过以下方法制备得到：
A液：将0.2mol/L Na2HPO4和0.1mol/L柠檬酸混合，使溶液pH＝4.5，接着加蒸馏水至100ml，制得pH＝4.5的磷酸-柠檬酸缓冲液，最后加入2％H2O2，磷酸-柠檬酸缓冲液和2％H2O2的体积比为1000:1.5；
B液：将TMB溶于无水乙醇中，使其浓度为2mg/ml；
将A液和B液按体积比为20:1混合。
进一步地，终止反应具体过程为：向酶标板中加入终止液终止反应，加入量为50μl/孔，然后在450nm下测定OD450值；其中，终止液为浓度为2mol/L的硫酸溶液。
进一步地，标准曲线法为：免疫血清OD450值/免疫前血清OD450值≥2.1，OD450值>0.2，判断为阳性；以标定效价的SPF鸡标准抗血清建立标准曲线，根据测定的OD450值获得被检样品阳性抗体的ELISA效价测定值，ELISA效价测定值×稀释倍数，即为被检样品cLHRH抗体效价。
本发明提供的一种鸡免疫去势效果的判定方法，具有以下有益效果：本发明通过研究cLHRH抗体效价与免疫鸡外观特征、激素含量及性腺重量的相关性，制定出一种鸡免疫去势效果的判定方法，该方法稳定性好，准确性高，可充分保证去势疫苗在免疫有效期内的免疫效力。
附图说明
图1为cLHRH抗体效价和血清睾酮含量的对应关系。
图2为cLHRH抗体效价和血清雌二醇含量的对应关系。
图3为cLHRH抗体效价和性腺(睾丸)重量的对应关系。
图4为免疫后15天cLHRH抗体效价和120天睾丸重量相关性(九斤黄公鸡的重复试验)。
图5为免疫后15天cLHRH抗体效价和120天睾丸重量相关性(青脚麻公鸡的重复试验)。
图6为3批试验免疫后15天cLHRH抗体效价和120天睾丸重量数据汇总相关性分析。
图7为3批试验免疫后15天cLHRH抗体效价和去势效果相关性。
具体实施方式
本发明将鸡促黄体素释放激素重组抗原(cLHRH)梯度稀释后加佐剂乳化，以不同剂量免疫15-20日龄九斤黄等商品肉鸡，以期获得不同水平的抗体反应。免疫后不同时间测定血清中的cLHRH抗体ELISA效价，观察外观性征和性行为，测定血清睾酮及雌二醇含量，最终扑杀检查睾丸等性腺重量，通过统计分析，比较各项免疫去势效果判定指标的可靠性及其与cLHRH抗体水平的对应关系。探索试验研究结果表明，血清中cLHRH抗体效价与公鸡睾丸重量呈现典型的抑制效应关系(负相关)，相关关系符合log(inhibitor)vs.Response模式；尽管抗体效价与免疫后期鸡血清中的性激素含量亦呈现抑制效应关系，但相关性程度偏低，稳定性不够。
因此，我们选择公鸡睾丸重量作为鸡免疫去势效果的最佳量化技术参数，并对免疫后15天血清cLHRH抗体水平与免疫后120天(四个月)睾丸重量的对应关系在九斤黄及青脚麻公鸡进行了重复和扩充验证。重复和扩充验证结果证实了血清中15天cLHRH抗体ELISA效价与120天公鸡睾丸重量呈现典型的负相关关系的稳定性和可靠性。统计分析结果表明，当免疫后15天血清cLHRH抗体ELISA效价在10×IC50(5126)以上时，按睾丸重量有效抑制95％置信区间判定，免疫后四个月去势有效率在81.43％到98.57％之间，为保证疫苗效果，故以“免疫后15天ELISA抗体效价几何平均值均不低于5126”作为疫苗效力检验的标准，充分保证鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗(cLHRH-RA-RS1株)免疫有效期(三个月)内的群体免疫效力(免疫去势效果)，其具体过程和结果见实施例。
以下实施例中的研究对象为：15-20日龄，雌雄各半，健康九斤黄及青脚麻鸡商品肉鸡。
研究方案为：
(1)探索性预备试验方案：对免疫后不同时间、不同个体血清抗体效价与相应各个体的血清性激素(睾酮、雌二醇)含量或性腺(睾丸)重量进行相关性分析，比较性激素含量或性腺重量等可量化去势有效性判定指标的可靠性与稳定性，选择确定最佳的免疫去势效果判定量化指标。探求建立抗体效价与性激素含量或性腺重量相关性模型的可行性。
(2)重复和扩大试验验证：根据探索试验所获得的抗体效价与去势效果量化指标的相关性模型，选择最佳模型进行重复和扩大试验验证，考察抗体的半抑制效价(IC50)以及去势有效性判定的上限和下限等技术参数的可重复性。
(3)疫苗效力检验标准：根据去势有效性的上限和下限判定去势有效率，获取去势有效率(80％以上)相应的抗体效价参数，为制定鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗(cLHRH-RA-RS1株)的效力检验标准提供科学依据。
实施例1制备抗原
用鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗生产菌种按疫苗生产检验规程制备cLHRH蛋白(蛋白含量为6.75mg/ml、蛋白纯度为92％)，然后用生理盐水稀释，使其蛋白含量分别为0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml及4.0mg/ml，按疫苗乳化工艺配方制成“水包油包水”剂型的小样(抗原终浓度分别为0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.075mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml及0.4mg/ml)，经物理性状及无菌检验合格后，于2-8℃冷藏，用于本试验。
实施例2探索性预备试验
1、向15-20日龄九斤黄商品肉鸡分别注射抗原终浓度分别为0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.075mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml及0.4mg/ml的抗原，对照组注射生理盐水，每组8只，共128只。肌肉注射，0.5ml/羽。
2、观察记录：观察记录鸡各试验阶段的性征和性行为等外观去势指标，特别是性成熟过程中特有的鸡冠、髯垂和羽毛变化。
3、血清抗体及性激素含量测定：免疫后15天、30天、60天、90天、120天采血，分离血清，测定cLHRH抗体效价及睾酮和雌二醇含量。
其中，睾酮和雌二醇含量采用化学发光法检测试剂盒(Siemens)测定。
cLHRH抗体效价的测定过程(ELISA方法)：
①制备包被抗原
包被抗原为含有双抗原表位和多聚赖氨酸的合成肽，分子量为3353.82，纯度大于90％，包被抗原中的氨基酸序列为：
Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly；
②包被：用包被缓冲液将包被抗原稀释至1μg/ml，然后加入酶标板的酶标孔内，每孔加入量为100μl，4℃包被12h；其中，包被缓冲液为0.1mol/L，pH＝9.0的磷酸缓冲液；
③洗涤：每孔加300μl洗涤液洗涤包被的酶标板，洗涤4-5次，每次4-5min，拍干；其中，洗涤液为含0.05％吐温-20，浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸缓冲液；
④封闭：向洗涤后的酶标板中加入封闭液封闭，每孔加300μl，置于37℃孵育2h，然后重复洗涤过程；其中，封闭液为含2％明胶和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝9.0；
⑤加样：将待检样品、阴性样品、阳性样品和标准血清样品分别用样品稀释液稀释，然后按照100μl/孔加入封闭后的酶标板中，置于37℃孵育1h，然后重复洗涤过程；其中，样品稀释液为含1％BSA、0.5％复方肽酶抑制剂Cocktail和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝8.0；待检样品、阴性样品和阳性样品分别用样品稀释液稀释1000倍、1000倍和2000倍；
⑥添加酶标抗体：将酶标抗体用酶标抗体稀释液稀释5000倍，然后按照100μl/孔加入封闭后的酶标板中，置于37℃孵育1h，重复洗涤过程；其中，所用酶标抗体为兔抗鸡酶标二抗；其中，酶标抗体稀释液为含1％BSA的PBST溶液；
⑦显色：向酶标板中加入TMB显色液，加入量为100μl/孔，置于37℃显示15min；其中，TMB显色液通过以下方法制备得到：
A液：将0.2mol/L Na2HPO4(28.4g/L)25.7ml，0.1mol/L柠檬酸(19.2g/L)适量，混匀，使溶液pH＝4.5，加蒸馏水至100ml，再加2％H2O2 150μl；
B液：将TMB溶于无水乙醇中，使其浓度为2mg/ml；
临用时将A液和B液按体积比为20:1混合。
⑧终止反应：向酶标板中加入终止液终止反应，加入量为50μl/孔，然后在450nm下测定OD450值；其中，终止液为浓度为2mol/L的硫酸溶液；
⑨效价测定
1)SPF鸡免疫血清cLHRH抗体效价的标定
采用终点稀释法对批量混合的SPF鸡疫苗免疫血清cLHRH抗体效价进行标定，用非免疫SPF鸡血清作阴性对照，以P/N≥2.1(P/N为免疫血清OD450值/免疫前血清OD450值)，且OD450>0.2的最高稀释度判定抗体效价。如此进行5次独立试验的重复测定，每次独立测定又包含3个重复，计算所有15个抗体效价测定结果的平均值为19200，即获得该血清的标定ELISA效价，然后用无菌生理盐水稀释抗体效价至16000，混匀，按50μl及100μl批量分装，作为标准阳性血清。
2)标准曲线的建立
将cLHRH抗体效价为16000的标准血清作125、250、500、1000、2000、4000、8000及16000倍梯度稀释，获得抗体效价为128、64、32、16、8、4、2、1的标准血清稀释液，通过ELISA测定各稀释度抗体效价所对应的OD450值，用ELISA数据处理软件(Skanlt software 4.1，Thermo)中的自定义法生成标准曲线，获取相关系数R2。反复进行6个独立试验的重复测定，所得标准曲线中R2分别为0.999、0.999、0.995、1.000、0.995及0.996，均在0.995以上，表明各稀释度的OD450值与相应抗体效价有极显著(≥0.99)的相关关系。
3)测定待测样品的效价
免疫血清OD450值/免疫前血清OD450值≥2.1，OD450值>0.2，判断为阳性；根据标准曲线测定待测样品的OD450值，根据测定的OD450值获得被检样品阳性抗体的ELISA效价测定值，ELISA效价测定值×稀释倍数，即为被检样品cLHRH抗体效价。
4、剖检：免疫后120天扑杀、剖解，记录睾丸等性腺发育情况，并称重。
5、数据处理、统计分析采用Statistica Enterprise V8、Sigma Plot和GraphPadPrism等软件进行数据处理、统计分析。
相关显著性判定标准：|r|≥0.8为高度相关(或极显著相关)；0.5≤|r|≤0.8为中度相关(或显著相关)；0.3≤|r|≤0.5为低度相关(或弱相关)；|r|≤0.3为不确定性相关(或极弱相关)。
6、实验结果
(1)性征、性行为等观察
①对比公鸡在2.5-3月龄后出现典型的外观特征和性行为，公鸡外观去势效果包括鸡冠和髯垂小而淡、羽毛鲜亮度低、性情温和、叫声比较嘶哑等等。总体看，免疫后外观去势效果的明显程度、有效率和持续时间，均随着免疫剂量的递减而降低，参见表1。
表1不同免疫剂量公鸡在免疫后不同时间的外观去势效果
注：+，表示去势效果明显；+/-，表示去势效果可疑(个体差异大或不明显)；-，表示无去势效果(或已经恢复相关性征)。
②因去势母鸡与对照母鸡的外观性征和性行为区别不大，故，不需对母鸡的外观去势效进行判定。
用外观性征和性行为来评判去势效果，相关指标难以量化，且人为因素影响太大。故，不能作为建立抗体效价和去势效果相关关系的依据。
(2)抗体效价与性激素含量的相关性
根据免疫后激素水平消长研究中有关激素动力学变化规律，肉鸡在2月龄前(性发育早期)，血清睾酮及雌二醇含量均处于基础水平，只有在3月龄后，性激素水平明显上升，方可见免疫去势对睾酮及雌二醇的显著抑制效应，故本试验选择在疫苗免疫后90天、120天(相当于3.5和4.5月龄)测定免疫血清中睾酮及雌二醇含量。
①公鸡血清cLHRH抗体效价与睾酮含量的相关性结果
免疫后不同时间血清抗体效价和睾酮含量相关检测数据参见表2。相关性统计分析结果表明，免疫后15天、30天、60天、90天血清抗体效价与免疫后90天、120天血清中睾酮含量均呈现一定程度的负相关，相关关系符合log(inhibitor)vs.Response模式，即对数抑制效应关系。就相关系数平均绝对值来看，0.3≤|r|≤0.5，属低度相关；免疫后120天血清睾酮含量与公鸡血清cLHRH抗体效价的相关性程度，略高于免疫后90天。结果见图1，图1中公鸡免疫后15、30、60、90天血清cLHRH抗体效价与免疫后90天(左)、120天(右)血清睾酮含量呈现负相关(相关系数r<0)，相关关系符合log(inhibitor)vs.Response模式，即对数抑制效应关系；0.3≤|r|≤0.5为低度相关，|r|≤0.3为不确定性相关。
免疫后90天血清睾酮含量与15天、30天、60天及90天抗体效价相关系数r分别为-0.3252、-0.2979、-0.3128和-0.3347，|r|平均值为0.3177。
免疫后120天血清中睾酮含量与15天、30天、60天及90天抗体效价相关系数r分别为-0.4325、-0.3578、-0.3360和-0.3166，|r|平均值为0.3607。
表2九斤黄预备试验的cLHRH抗体效价、睾酮含量和睾丸重量
注：“-”表示抗体效价低于ELISA最低检测限度1000；“/”样本量不足未检测
②母鸡血清cLHRH抗体效价与雌二醇含量的相关性结果
免疫后15、30、60、90天血清抗体效价和免疫后90、120天血清雌二醇含量相关检测数据参见表3。与公鸡的血清抗体效价和睾酮含量相关性分析结果相似，母鸡血清cLHRH抗体效价与雌二醇含量亦呈现一定程度的负相关，相关关系符合log(inhibitor)vs.Response模式，即对数抑制效应关系。就相关系数绝对值|r|来看，免疫后120天血清雌二醇含量与血清cLHRH抗体效价的相关性程度，明显高于免疫后90天。结果见图2，图2中母鸡免疫后15、30、60、90天血清cLHRH抗体效价与免疫后90天(左)、120天(右)血清雌二醇含量呈现不同程度的负相关(相关系数r<0)，相关关系符合log(inhibitor)vs.Response模式，即对数抑制效应关系；0.3≤|r|≤0.5为低度相关，|r|≤0.3为微弱相关。
表3九斤黄预备试验的cLHRH抗体效价和雌二醇含量数据
注：“-”表示抗体效价低于ELISA最低检测限度1000；“/”样本量不足未检测
③免疫后90天血清雌二醇含量与抗体效价相关系数
免疫后90天血清雌二醇含量与15天、30天、60天及90天抗体效价相关系数r分别为-0.1114、-0.0623、-0.1712和-0.3645。除免疫后90天血清雌二醇含量与90天抗体效价的相关系数绝对值|r|为0.3645，在0.3-0.5之间，属“低度相关”外，其余|r|均小于0.3，微弱相关(相关关系不确定)。|r|平均值为0.17735。
④免疫后120天血清雌二醇含量与抗体效价相关系数
免疫后120天血清中雌二醇含量与15天、30天、60天及90天抗体效价相关系数r分别为-0.2375、-0.3428、-0.3428和-0.3014。|r|多在0.3-0.5之间，属低度相关。|r|平均值为0.3039。
综合上述抗体效价与性激素含量相关性分析结果，虽然血清抗体效价与性激素含量呈现一定程度的负相关，即抑制效应关系，但是，两者之间相关关系不够稳定，相关性程度也较弱，|r|均介于“低度相关”或“微弱相关”(相关关系不确定)的判定范围，因此不能作为判断鸡免疫去势效果中的量化指标。相对与现有技术中去势效果判定的标准，这是本发明首次明确的结论即首次明确抗体效价与免疫后期鸡血清中的性激素含量呈现抑制效应关系，但相关性程度偏低，稳定性不够。
(3)血清抗体效价与性腺重量的相关性分析结果
①血清抗体效价与公鸡睾丸重量的相关性分析结果
经Statistica Enterprise V8、Sigma Plot和GraphPad Prism等软件分析，鸡促黄体素释放素重组抗原去势疫苗免疫后15天、30天、60天、90天cLHRH抗体效价与免疫后120天睾丸重量的呈现较高程度的负相关，相关关系符合log(inhibitor)vs.Response模式，亦即对数抑制效应关系，0.5≤|r|≤0.8为中度相关，0.3≤|r|≤0.5为低度相关，结果见图3。
15天、30天、60天、90天血清抗体ELISA效价的半抑制浓度(LogIC50)分别为571.7、2390.0、1534.8、584.4。
②血清抗体ELISA效价与性腺(睾丸)重量的相关性程度
免疫后120天睾丸重量与15天、30天、60天及90天抗体效价|r|(相关系数绝对值)分别为0.5618、0.4760、0.4598及0.3898。抗体效价和睾丸重量抑制的相关性程度均达到低度相关乃至中度相关的程度，其中，免疫后15天血清抗体效价和免疫后120天睾丸重量的相关性最强，相关系数为-0.5618，0.5≤|r|≤0.8，符合“中度相关”的判定标准(中度相关，亦即显著相关)。
③抗体效价与母鸡卵巢重量的相关性
一方面由于母鸡的卵巢不易剥离，因为卵巢剥离缺失或连带输卵管等因素造成误差太大，另一方面因性成熟母鸡的卵巢含有不同数量、不同大小的卵子，成为卵巢重量的决定因素，无法根据卵巢重量对去势效果进行量化。故，只对剖解后疫苗组与对照组的差异进行观察，未进一步对抗体效价与母鸡卵巢重量的相关性进行研究。
综上所述，血清抗体效价和各项去势效果评价指标相关性的探索性预备试验结果得到以下结论：
外观性征和性行为难以量化，卵巢重量亦受不同数量不同大小的卵子等非特异性因素影响太大，不作为建立抗体效价和去势效果相关关系的依据。
虽然血清抗体效价与性激素含量呈现一定程度的负相关，即抑制效应关系，但是，由于动物血清睾酮和雌二醇含量的时间波动性以及显著的个体差异性，血清抗体效价与性激素含量相关关系不够稳定，相关性程度也较弱，|r|均介于“低度相关”或“微弱相关”(相关关系不确定)的判定范围。
免疫后15天、30天、60天、90天抗体效价，与免疫后120天睾丸重量之间，呈现稳定的抑制效应关系，相关关系符合log(inhibitor)vs.Response模式，相关性程度均达到“低度相关”以上；其中，以免疫后15天血清抗体效价和免疫后120天睾丸重量的相关性程度最高，相关系数为-0.5618，0.5≤|r|≤0.8，符合“中度相关(亦即显著相关)”的判定标准。
实施例3重复和扩大试验
根据探索性试验结果，鉴于睾丸重量抑制效应作为去势效果判定指标的可靠性，以及15天血清抗体效价与120天睾丸重量抑制效应之间相关关系的稳定性和显著性，我们在九斤黄和青脚麻肉鸡进行了重复和扩大验证试验，以期进一步验证相关技术参数的稳定性和可靠性，并探求免疫后15天抗体效价和去势有效率等效果指标之间的对应关系，从而，为建立疫苗的抗体效力检验方法和判定标准提供更为可靠的技术参数和支撑依据。
1、向15-20日龄九斤黄商品肉鸡注射抗原，注射抗原剂量同实施例2，每组12只，共96只；向15-20日龄青脚麻公鸡商品肉鸡，注射抗原剂量同实施例2，每组10只，共80只。均肌肉注射，0.5ml/羽。
2、观察记录试验：观察记录鸡各试验阶段的性征和性行为等外观去势指标，特别是性成熟过程中特有的鸡冠、髯垂和羽毛变化。
3、血清抗体及激素含量测定：免疫后15天、30天、60天、90天、120天采血，分离血清，测定cLHRH抗体效价及睾酮和雌二醇含量；其中cLHRH抗体效价及睾酮和雌二醇含量的测定同实施例2。
4、剖检：免疫后120天扑杀、剖解，记录睾丸等性腺发育情况，并称重。
5、数据处理、统计分析采用Statistica Enterprise V8、Sigma Plot和GraphPadPrism等软件进行数据处理、统计分析。
相关显著性判定标准：|r|≥0.8为高度相关(或极显著相关)；0.5≤|r|≤0.8为中度相关(或显著相关)；0.3≤|r|≤0.5为低度相关(或弱相关)；|r|≤0.3为不确定性相关(或极弱相关)。
6、实验结果
①九斤黄：免疫后15天九斤黄的血清抗体效价，与120天剖杀测定睾丸重量，相关检测数据见表4。
表4九斤黄重复试验的cLHRH抗体效价和睾丸重量
注：“-”表示抗体效价低于ELISA最低检测限度1000
统计分析结果显示，免疫后15天血清抗体效价和免疫后120天睾丸重量相关关系符合log(inhibitor)vs.Response模式，呈现典型的对数抑制效应关系；免疫后15天血清抗体效价对120天睾丸重量的半抑制浓度(LogIC50)为394.4；去势有效性睾丸重量上限和下限分别为30.53克和21.51克；相关系数r＝-0.5479，|r|>0.5，抗体效价和睾丸重量抑制效应的相关关系显著。结果见图4。
②青脚麻：免疫后15天青脚麻公鸡的血清抗体效价，与120天剖杀测定睾丸重量，相关检测数据参见表5。
表5青脚麻鸡验证试验的cLHRH抗体效价和睾丸重量试验数据
注：“-”表示抗体效价低于ELISA最低检测限度1000
统计分析结果显示，免疫后15天血清抗体效价和免疫后120天睾丸重量相关关系符合log(inhibitor)vs.Response模式，呈现典型的抑制效应关系；免疫后15天血清抗体效价与120天睾丸重量半抑制浓度(LogIC50)为503.2；去势有效性睾丸重量上限和下限分别为28.83克和21.47克；相关系数r＝-0.5629，|r|>0.5，抗体效价和睾丸重量抑制效应的相关关系显著。结果见图5。
③抗体效价和睾丸重量相关性参数汇总分析
1)睾丸重量上限和下限作为去势有效性判定依据的可靠性及其与抗体效价相关关系稳定性
为了进一步考察睾丸重量作为去势有效性判定的可靠性及其与抗体效价相关关系稳定性，我们对九斤黄预备试验、重复试验以及青脚麻验证试验所得各项参数进行了汇总，包括睾丸重量抑制效应有效性判定上限(top)和下限(bottom)、抗体的半抑制效价(LogIC50)、以及抗体效价对应睾丸重量的抑制效应相关系数(R)，并对其离散度和可信度进行了分析，结果见表6。3次试验各项指标的统计分析结果表明，睾丸重量抑制效应有效性判定上限(top)和下限(bottom)的平均值分别为29.70克和21.70克，变异系数(CV％)分别为2.86％和1.68％，可信度分别为98.32％和97.14％；半抑制抗体效价(LogIC50)平均值为489.77，变异系数(CV％)18.26％，可信度为81.84％；抗体效价对应睾丸重量的相关系数|r|的平均值为0.5575，变异系数(CV％)为1.50％，可信度为98.5％。除半抑制抗体效价(LogIC50)的可信度较低(81.84％)以外，睾丸重量抑制效应有效性判定上限(top)和下限(bottom)以及抗体效价对应睾丸重量的相关系数(R)的可信度均在95％以上，不仅证实了相关参数在同一肉鸡品种的可重复性以及不同肉鸡品种的一致性，亦表明了所有相关技术参数作为标准依据的可靠性。
上述分析证实了睾丸重量上限和下限作为去势有效性判定依据的可靠性及其与抗体效价相关关系稳定性。
表6睾丸重量、半抑制抗体效价以及抗体效价对应睾丸重量的相关系数
2)免疫后15天抗体效价和120天睾丸重量汇总数据的相关性分析
为了保证疫苗效力检验标准依据的数据量和代表性，我们对九斤黄预备试验、重复试验以及青脚麻验证试验15天抗体效价对应120天睾丸重量进行了汇总数据的相关性分析。分析结果表明，抗体效价和睾丸重量呈现典型的抑制效应关系，符合log(inhibitor)vs.Response模式(图6)，相关系数为-0.5551，|r|>0.5，相关系显著。按睾丸发育抑制作为免疫去势有效性判定的依据，睾丸重量上限(Top)和下限(Bottom)分别为29.76克和21.76克，半抑制抗体效价为(LogIC50)为512.6，结果见图6。
实施例4疫苗效力检验标准的制定
1、免疫后15天抗体效价和去势有效率的对应关系
鉴于免疫去势抑制效应有效性睾丸重量上限(top)和下限(bottom)及抗体效价对应睾丸重量的相关系数(r)在同品种肉鸡的可重复性和不同品种肉鸡的稳定性，且相关参数的可信度均在95％以上，我们以免疫后120天睾丸重量低于有效抑制上限(29.76克)和下限(21.76克)判定去势有效率，并参照半抑制浓度LogIC50(抗体ELISA效价512.6)，寻求免疫后4个月(120天)去势有效率与15天抗体效价的对应关系。结果表明，当免疫后15天血清cLHRH抗体效价在10×IC50(5126)以上时，所对应120天睾丸重量低于有效抑制上限29.76g(粗虚线)和下限21.76g(细虚线)的个体分布，去势有效率分别为98.57％和81.43％，参见图7。
2、为了进一步考察免疫后15天抗体效价和去势有效率对应关系的可靠性，我们对3次独立试验的相应数据分别进行了同样的处理分析，计算各自试验免疫后15天抗体效价高于10×LogIC50所对应120天睾丸重量低于各自试验睾丸重量有效抑制上限和下限的去势有效率，并获取平均值和变异系数，相关分析结果表7所示。
表7去势有效率独立分析结果及离散度分析
九斤黄 九斤黄 青脚麻鸡
预备试验 重复试验 验证试验 平均值 SD CV(％)
睾丸重量上限(Top)有效率 100％ 97.14％ 100％ 99.05％ 0.0165 1.67
睾丸重量下限(Bottom)有效率 87.50％ 71.42％ 88％ 82.31％ 0.0943 11.46
结果表明，九斤黄公鸡预备试验中免疫后15天抗体效价5717(10×LogIC50)以上所对应120天睾丸重量低于有效抑制上限29.74g和下限22.12g的个体分布，去势有效率分别为100％和87.50％。
九斤黄公鸡重复试验中免疫后15天抗体效价3944(10×LogIC50)以上所对应120天睾丸重量低于有效抑制上限30.53g和下限21.51g的个体分布，去势有效率分别为97.14％和71.42％。
青脚麻公鸡预备试验中免疫后15天抗体效价3944(10×LogIC50)以上所对应120天睾丸重量低于有效抑制上限28.83g和下限21.47g的个体分布，去势有效率分别为100％和88％。
总之，睾丸重量低于有效抑制上限和下限的去势有效率平均值分别为99.05％和82.31％，与汇总数据分析所得结果98.57％和81.43％相近，符合率分别为99.51％和98.93％；3次独立试验分析结果之间的变异系数分别为1.67％和11.46％(试验重复可信度分别为98.33％和88.54％)。
在本发明中，我们将鸡促黄体素释放激素重组抗原(cLHRH)梯度稀释后加佐剂乳化，以不同剂量免疫15-20日龄九斤黄等商品肉鸡，免疫后不同时间测定血清中的cLHRH抗体ELISA效价，观察外观性征和性行为，测定免疫血清中睾酮及雌二醇含量，最终扑杀检查睾丸等性腺重量，综合评价去势效果。探索试验研究结果表明，血清中15天cLHRH抗体效价与120天公鸡睾丸重量呈现典型的抑制效应关系(负相关)，相关关系符合log(inhibitor)vs.Response模式；抗体效价与免疫后期鸡血清中90、120天性激素(睾酮)含量亦呈现抑制效应关系，但相关关系稳定性不够、相关性程度亦偏低，与性激素含量的时间波动性和显著的个体差异有关。
我们选择公鸡睾丸重量作为鸡免疫去势效果的最佳量化技术参数，并对免疫后15天血清cLHRH抗体水平与免疫后120天(四个月)睾丸重量的对应关系在九斤黄及青脚麻公鸡进行了重复和扩充验证。重复和扩充验证结果证实了血清中15天cLHRH抗体ELISA效价与120天公鸡睾丸重量相关关系的稳定性和可靠性。
统计分析结果表明，当免疫后15天血清cLHRH抗体效价在10×IC50(5126)以上时，按睾丸重量有效抑制95％置信区间判定，免疫后四个月去势有效率在81.43％到98.57％之间，为保证疫苗效果，故以“免疫后15天ELISA抗体效价，几何平均值不低于5126”作为疫苗效力检验的标准，充分保证鸡促黄体素释放激素重组抗原去势疫苗(cLHRH-RA-RS1株)免疫有效期(三个月)内的群体免疫去势效果。

Claims (10)

1.一种鸡免疫去势效果的判定方法，其特征在于，包括以下步骤：将鸡促黄体素释放激素抗原稀释后加佐剂乳化，然后免疫肉鸡，测定其鸡促黄体素释放激素抗体效价，然后观察外观特征并测定性激素以及性腺重量，以免疫15天后抗体效价不低于10×IC50，免疫4个月后睾丸重量有效抑制为95％置信区间作为可量化的判定标准，判定去势有效率。
2.根据权利要求1所述的鸡免疫去势效果的判定方法，其特征在于，鸡促黄体素释放激素抗体效价的测定方法包括以下步骤：制备包被抗原、包被、洗涤、封闭、加样、添加酶标抗体、显色、终止反应和效价测定；其中，包被抗原为cLHRH-Lys10-cLHRH，分子量为3353.82，纯度大于90％，包被抗原中的氨基酸序列为：
Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Gln-Pro-Gly；
效价测定通过标准曲线法进行测定。
3.根据权利要求2所述的鸡免疫去势效果的判定方法，其特征在于，包被过程为：用包被缓冲液将包被抗原稀释至0.5-1μg/ml，然后加入酶标板的酶标孔内，每孔加入量为80-100μl，2-8℃包被12h；其中，包被缓冲液为0.1mol/L，pH＝9.0的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求2所述的鸡免疫去势效果的判定方法，其特征在于，洗涤过程为：每孔加300μl洗涤液洗涤包被的酶标板，洗涤4-5次，每次4-5min，拍干；其中，洗涤液为含0.05％吐温-20，浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的磷酸缓冲液。
5.根据权利要求2所述的鸡免疫去势效果的判定方法，其特征在于，封闭过程为：向洗涤后的酶标板中加入封闭液封闭，每孔加300μl，置于37℃孵育2h，然后重复洗涤过程；其中，封闭液为含2％明胶和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝9.0。
6.根据权利要求2所述的鸡免疫去势效果的判定方法，其特征在于，加样过程为：将待检样品和标准血清样品分别用样品稀释液稀释，然后按照100μl/孔加入封闭后的酶标板中，置于37℃孵育1h，然后重复洗涤过程；其中，样品稀释液为含1％BSA、0.5％复方肽酶抑制剂Cocktail和0.05％吐温-20的磷酸缓冲液，磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝8.0。
7.根据权利要求2所述的鸡免疫去势效果的判定方法，其特征在于，添加酶标抗体的过程为：将酶标抗体用酶标抗体稀释液稀释5000倍，然后按照100μl/孔加入封闭后的酶标板中，置于37℃孵育1h，重复洗涤过程；其中，所用酶标抗体为兔抗鸡酶标二抗；其中，酶标抗体稀释液为含1％BSA的PBST溶液。
8.根据权利要求2所述的鸡免疫去势效果的判定方法，其特征在于，显色过程为：向酶标板中加入TMB显色液，加入量为100μl/孔，置于37℃显示15min；其中，TMB显色液通过以下方法制备得到：
A液：将0.2mol/L Na2HPO4和0.1mol/L柠檬酸混合，使溶液pH＝4.5，接着加蒸馏水至100ml，制得pH＝4.5的磷酸-柠檬酸缓冲液，最后加入2％H2O2，磷酸-柠檬酸缓冲液和2％H2O2的体积比为1000:1.5；
B液：将TMB溶于无水乙醇中，使其浓度为2mg/ml；
将A液和B液按体积比为20:1混合。
9.根据权利要求2所述的鸡免疫去势效果的判定方法，其特征在于，终止反应过程为：向酶标板中加入终止液终止反应，加入量为50μl/孔，然后在450nm下测定OD450值；其中，终止液为浓度为2mol/L的硫酸溶液。
10.根据权利要求2所述的鸡免疫去势效果的判定方法，其特征在于，标准曲线法为：免疫血清OD450值/免疫前血清OD450值≥2.1，OD450值>0.2，判断为阳性；以标定效价的SPF鸡标准抗血清建立标准曲线，根据测定的OD450值获得被检样品阳性抗体的ELISA效价测定值，ELISA效价测定值×稀释倍数，即为被检样品cLHRH抗体效价。
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