BRPI9609411B8 - peptídeo, composição, vacina, e, processos para imunocastrar um porco - Google Patents
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Abstract
"peptídeo, composição, vacina, e processos para inocular um animal com a vacina, afetar uma ou mais características reprodutivas ou comportamentais de um animal e imunocastrar um porco". a invenção refere-se a uma preparação de vacina com um peptídeo repetido lhrh modificado em que o aminoácido glicina na posição (6) de um ou ambos os decapeptídeos lhrh que constituem a unidade repetida é substituído por um aminoácido dextrorrotatório que contém uma cadeia lateral à qual um composto carreador pode ser acoplado. além disso, o peptídeo repetido lhrh pode ser posto em uma forma dimérica repetida que é adequada para a produção de uma vacina que é efetiva contra lhrh (luteinizing hormone releasing hormone, fator liberador do hormônio luteinizante), também referido como gnrh (gonadotropin releasing hormone, fator de liberação de gonadotropinas), para castração imunológica, para inibir ou afetar funções reprodutivas ou para afetar o comportamento de vertebrados em geral e de animais domésticos e o homem em particular.
Description
“PEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO, VACINA, E, PROCESSO PARA IMUNOCASTRAR UM PORCO”
Essa invenção refere-se a um peptídeo apropriado para a produção de uma vacina efetiva contra o Fator de Liberação do Hormônio Luteinizante (LHRH, também referido como Fator de Liberação de Gonadotropinas, GnRH), A invenção ainda refere-se a composições imunogênicas e vacinas ou preparações médicas (vacinas e farmacos) baseados em tal peptídeo e o uso de tal vacina ou preparação médica em um processo de imunização de um mamífero contra o LHRH e portanto influenciando características reprodutivas ou de comportamento deste mamífero e em um processo de melhoria da qualidade da carne de porcos,
LHRH é um pequeno peptídeo de 10 aminoácidos (decapeptídeo) proveniente do hipotálamo. A sequência de aminoácidos (com, como usual, o aminoácido amino terminal à esquerda e o aminoácido carboxiterminal à direita) do LHRH é relativa à formula em que os aminoácidos estão representados pelo código de três letras: pGlu-His-TrpSer-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, ou no código de uma letra relativo à fórmula: #EHWSYGLRP G@ , #E é o ácido piroglutâmico e G@ é a glicina amida.
LHRH atua a nível da hipófise para causar um aumento na liberação do FSH (Hormônio de estimulação do folículo) e LH (Hormônio luteinizante) biologicamente ativos no sangue, que por sua vez estimulam o desenvolvimento dos testículos no animal macho em crescimento e a síntese de esteróides testiculares. Na fêmea em crescimento, o desenvolvimento dos ovários é estimulado e portanto o desenvolvimento do folículo, a síntese de esteróides ovarianos e a ovulação.
Sabe-se que o LHRH, se acoplado a uma proteína carreadora, pode ser usada para vacinar animais. Tal vacinação pode ser efetuada por diferentes razões que estão todas conectadas com a função natural do LHRH. Como é sabido, uma drástica redução do LH e FSH no sangue inibe a produção de esteróides testiculares ou androgênios e esperma nos testículos do macho e a formação de esteróides ovarianos ou progestagênios e estrogênios e maturação dos folículos no ovário da fêmea. Tal redução dos níveis de androgênios, progestagênios e estrogênios no sangue a um nível comparável ao nível obtenível por remoção dos testículos ou ovários via castração pode ser alcançada por imunização efetiva do animal contra LHRH. Em animais machos em muitos casos os testículos então aparentam desenvolver-se lentamente ou não se desenvolverem (não há síntese de androgênios (hormônios esteróides masculinos) ou formação de espermatozóides) e em animais fêmeas a atividade dos ovários aparenta diminuir (síntese de estrogênios e prostagênios (hormônios esteróides femininos), amadurecimento dos folículos e ovulação são inibidos).
Em medicina veterinária, imunização 100% efetiva contra LHRH poderia ser utilizada para esterilização de, por exemplo, pequenos animais domésticos tais como gatos e cachorros macho e fêmea, ou para o tratamento da agressividade de cães machos e touros, simplesmente por vacinação ao invés de cirurgias drásticas como castração ou ovariectomia. Outras razões concebíveis para a imunização contra LHRH são prevenir o cio em animais fêmeas, tais como gatas, cadelas ou vacás, e inquietação em animais machos sendo engordados para abate. No tratamento de humanos, imunização contra LHRH pode ser usada no tratamento de câncer de próstata e de mama e, se requerido, no tratamento de algumas formas de carcinoma pituitário.
Outro uso para a vacina contra LHRH está no campo da pecuária, especialmente na engorda de porcos para o abate. A carne de porcos machos sexualmente maduros (varrões) tem um odor típico, o assim chamado odor de varrão.
Nos testículos de porcos sexualmente maduros, são formados muitos esteróides C19-A16 que são estocados no tecido adiposo do animal (Patterson, J. Sei. Food Agric. 19, 31-38 (1968); Brooks en Pearson, J. Anim. Sei. 62, 632-645 (1986); Claus, Zeitschrift. Tierzüchtg. Züchtungsbiol. 93, 38-47 (1976); Claus, Acta Endocrinol. (Copenh.) 91, Suppl. 225, 432-433 (1979)). Estes esteróides são principalmente responsáveis para a formação do odor desagradável de urina quando a carne é esquentada (Fuchs, Swedish J. Agric. Res. 1, 233-237 (1971); Bonneau, Livest. Prod. Sci. 9, 697-705 (1982)). Devido ao seu odor desagradável, a came de porcos machos sexualmente maduros é dificilmente, se tanto, apropriada para o consumo e inadequada para exportação. Uma vez que cerca de 10% dos porcos machos em ponto de abate são sexualmente maduros, resulta-se potencialmente em uma grande perda para a indústria de criação de porcos.
Visando controlar e prevenir estas perdas, quase todos os leitões machos são castrados quando jovens, com um procedimento cirúrgico que é geralmente executado sem qualquer forma de anestesia. Além do aspecto do mal trato do animal de tal castração, o processo também acarreta infecções, inibição do crescimento, e uma qualidade final da carne inferior àquela do animal intacto (contanto que este não tenha desenvolvido ainda o odor de varrão) (Walstra, Livest. Prod.Sci., 1, 187-196 (1974)).
Uma alternativa em que o animal não sofreria e que além disso beneficia a qualidade da carne consiste na redução da concentração de LHRH na pituitária do animal jovem por meio da imunização contra LHRH. Essa redução dos níveis do RHLH leva a uma redução das concentrações de FSH e LH biologicamente ativos, que por sua vez irá inibir o desenvolvimento dos testículos nos animais em crescimento e inibir a síntese de esteróides testiculares, entre os quais os esteróides C19-A16.
A cruel castração toma-se desnecessária: infecções e inibição do crescimento estão sendo prevenidas enquanto a qualidade final da carne certamente não é menor que após a castração. Além disso, esse processo previne a ocorrência do odor de varrão em porcos machos antes do tempo de abate.
Entretanto, um requisito estrito para uma boa vacina contra o odor de varrão é que em todos os porcos o desenvolvimento dos testículos seja inibido a tal extensão que não haja em nenhum caso o desenvolvimento do odor de varrão antes do ponto de abate, nem mesmo quando testado em uma população muito grande de porcos. As preparações vacinais conhecidas não preenchem esse requisito.
Na literatura existente e registros de patentes prévias relacionadas às propriedades anti-fertilizantes de vacinas contra LHRH, os resultados das vacinações frequentemente parecem ser variáveis, de fato, alguns animais vacinados dificilmente respondem à vacinação, ou largas doses em adjuvantes comercialmente inaceitáveis são necessárias para o efeito desejado (Chaffaux et al., Recueil de Médicine Vétérinaire 161 (2), 133-145 (1985); Caraty et al., C.R.Acad.Sc.Paris, t. 303, Série III, n°16, 673676 (1986); Falvo et al., J. Anim. Sc. 63, 986-994 (1986); Goubau et al., Domest. Anim. Endocrinol. 6, 339-347 (1989a); Goubau et al., Theriogenology 32, 557-567 (1989b); Hoskinson et al., Austr. J. Biothech. 4, 166-170 (1990); Bonneau et al, J. Anim. Sei., 72, 14-20 (1994); U.S. Patent 4.608.251; Int. patent appl. WO 88/05308). De acordo com os dados da literatura, não é possível, usando vacinação contra LHRH, bloquear os testículos em cada porco individualmente imunizado a um estágio suficientemente inicial para prevenir totalmente o problema do odor de varrão. O percentual de sucesso parece variar entre 20 e 80%. Isto é insuficiente e toma a atual geração de vacinas contra LHRH inútil para a prática de criações.
A dificuldade na preparação deste tipo de vacinas provavelmente é causada pelo fenômeno de ‘tolerância”. Substâncias “próprias” tais como hormônios não são reconhecidas mas sim toleradas pelo sistema imune. Normalmente, não há anticorpos sendo elicitados contra substâncias próprias. \uma vacina de sucesso precisa portanto usar uma substância suficientemente parecida com o hormônio, mas ao mesmo tempo suficientemente “estranha” para induzir a produção de anticorpos. Uma vez que essa são duas condições mutuamente exclusivas não se sabia ao certo, até recentemente, se tais substâncias poderiam ser preparadas. Uma tentativa de produzir vacinas peptídicas do tipo LHRH consistiu na troca da Gly na posição 6 do decapeptídeo LHRH por um aminoácido dextrorrotatório (DTryp; Chaffaux et al., Recueil de Médicine Vétérinaire 161 (2), 133-145 (1985). Foi, entretanto, demonstrado que a preparação de vacina contendo este LHRH-peptídeo modificado atuava ainda pior do que o decapeptídeo LHRH normal (EP 0 464 124).
Recentemente, entretanto, nós mostramos que é definitivamente possível elicitar uma resposta de anticorpos efetiva em todos os indivíduos vacinados contra LHRH (Meloen et al., Vaccine 12, 741-746 (1994)). Nesses experimentos, porcos foram vacinados duas vezes com uma vacina de LHRH que difere do tipo “clássico” de vacina de LHRH (LHRH acoplado a um carreador, em adjuvante de Freund), especificamente a vacina ΙαλΛ·1·. ' <
de LHRH repetido (European Patent n° 0464124). De acordo com esta invenção da vacina de LHRH repetido, é preferido um peptídeo que é caracterizado por conter pelo menos 2 seqüências LHRH repetidas, correspondendo à fórmula geral (com o aminoácido amino terminal à esquerda e o carboxi terminal à direita) ZhGlx-His-Trp’-Ser-Tyr-Gly-LeuArg-Pro[-Gly-X-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro]2-Gly-Z2, em que os aminoácidos estão designados pelo código de três letras, Trp1 c Trp2 são triptofano (Trp) ou triptofano formilado (N(indol)-formil- triptofano), n é um número com um valor de pelo menos 1, X é ou uma ligação direta ou um grupo espaçador entre os aminoácidos Gly e Gin, Z'-GIx é ou pGlu (ácido piroglutâmico) ou Gin tendo ligada uma cauda composta de um ou mais aminoácidos adicionais, e Gly-Z2 é ou Gly-NH2 ou Gly tendo ligada uma 5 cauda composta de um õu mais aminoácidos adicionais. Nesta fórmula geral, X pode ser uma ligação direta entre os aminoácidos glicina e glutamina, isto é, estes aminoácidos estão interconectados diretamente sem um elo intermediário (via ligação peptídica normal). A invenção da vacina de LHRH (lÂAg.U repetido também compreende peptídeos em que as seqüências LHRH estão 10 interconectadas via espaçadores. A natureza do grupo espaçador pode variar grandemente de um ou mais aminoácidos a uma cadeia hidrocarbônica mais curta ou mais longa e outros grupos compostos ou moléculas. Na fórmula geral acima, Z*-Glx preferencialmente representa pGlu (ácido piroglutâmico), mas pode também representar Gin tendo ligada uma cauda adicional 15 contendo um ou mais aminoácidos, por exemplo, para ser usada para acoplamento do peptídeo a uma proteína carreadora. Na fórmula geral acima, Gly-Z2 representa, por exemplo, Gly-NH2, ou Gly tendo ligada uma cauda adicional contendo um ou mais aminoácidos, por exemplo, para ser usada para acoplamento do peptídeo a uma proteína carreadora. Preferencialmente, 20 Gly-Z2 representa Gly-Cys-NH2, a cisteína C-terminal sendo adicionada em conexão com um possível acoplamento do peptídeo a uma proteína carreadora.
Mais particularmente, a invenção da vacina de LHRH fepçtido fornece um peptídeo que é caracterizado por conter pelo menos 2 25 seqüências em repetição de acordo com a fórmula geral (com o aminoácido amino terminal à esquerda e o carboxi terminal à direita) pGlu-His-Trp’-SerTyr-Gly-Leu-Arg-Pro[-Gly-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly-Lèu-Arg-Pro]n-GlyCys-NH2 , em que os aminoácidos estão designados pelo código de três letras, Trp1 e Trp2 são ou triptofano (Trp) ou N-formil-triptofano, e n é um número com um valor de pelo menos 1.
Esta vacina de LHRH repetido pareceu bloquear completamente o crescimento dos testículos e o desenvolvimento das células produtoras de esteróides (Leydig) no testículo. Entretanto, esta vacina pareceu ter uma série de desvantagens que a tomam menos prática para o uso. Uma desvantagem foi a necessidade de uma alta dose ser aplicada em vacinação para fazer ama imunocastração bem-sucedida, pelo menos 1 mg por porco foi necessário para elicitar a resposta desejada, o que toma caro aplicar a vacina em larga escala na indústria de criação de porcos.
Outra importante desvantagem desta preparação de vacina é que esta vacina só é tão efetiva em uma composição com adjuvante completo de Freund. O uso desse severo adjuvante elicita muitos efeitos colaterais indesejáveis tais como dificuldade na preparação e aplicação devido à sua natureza viscosa, além disso, a aplicação em si pode ser muito dolorosa para o animal, e, finalmente, resquícios do adjuvante e o possível desenvolvimento de reações inflamatórias crônica ao adjuvante tais como abcessos relacionados ao adjuvante no músculo no local da injeção podem diminuir a qualidade da came do animal injetado.
A presente invenção, entretanto, fornece soluções para todos os efeitos colaterais indesejados da vacinação acima descrita contra LHRH com a preparação de peptídeo LHRH repetido, sem perda das vantagens benéficas da vacinação efetiva com um peptídeo LHRH repetido em comparação com outras vacinas existentes direcionadas contra LHRH.
Foi mostrado que a forma monomérica da vacina de peptídeo LHRH repetido com adjuvante completo de Freund mas em total ausência da proteína carreadora KLH foi totalmente efetiva no bloqueio do crescimento do testículo e do odor de varrão em porcos e que formas diméricas da vacina de peptídeo LHRH repetido aplicadas sem o uso do adjuvante completo de Freund mas com o mais brando adjuvante incompleto de Freund no seu lugar resultaram em uma eficácia muito alta. Surpreendentemente, pareceu também que o princípio da repetição aplicado a uma variante da molécula de LHRH, especificamente com a substituição do sexto aminoácido Gly do decapeptídeo por um aminoácido dextrorrotatório (D-), D-Lys, após o que o peptídeo resultante foi acoplado a um composto carreador comum (aqui ovalbumina foi usada), resultou em uma vacina que foi muito efetiva em vários adjuvantes brandos, especificamente Specol e uma emulsão dupla de óleos, e foi além disso efetiva em baixas doses. Então, enquanto a vacina usando a substituição da Gly na posição 6 por ΠΙΟ aminoácidos do único e original decapeptídeo LHRH com um D-aminoácido diminuiu a imunogenicidade se comparada à seqüência LHRH original, tais substituições com um D-aminoácido aplicadas a uma vacina de peptídeo LHRH repetido foi capaz de gerar preparações vacinais de LHRH ainda mais imunogênicas. Pode ser ainda esperado que substituições da Gly na posição 6 15 de um ou de cada um dos decapeptídeos LHRH qúe constituem a unidade repetida com outro aminoácido dextrorrotatório pode também resultar em melhoria da vacina. Além disso, quando usando por exemplo a D-Lys como aminoácido substituinte, isso permite a dimerização ou a multimerização do / peptídeo repetido sem perda da possibilidade de conjugar o peptídeo a um 20 composto carreador. Embora as cisteínas C-terminais possam agora ser utilizadas para dimerização via formação de ponte de dissulfeto e portanto não estejam mais disponíveis para conjugação com um composto carreador, as cadeias laterais das substituições de aminoácidos podem ainda ser usadas para o acoplamento a compostos carreadores. E claro, as substituições com 25 outros aminoácidos que contém cadeias laterais apropriadas (tais como DGlu, mas também outros possíveis aminoácidos substituintes são também conhecidos pelos especialistas) poderiam também permitir possibilidades adicionais de acoplamento a um composto carreador.
[D-Lys6]-LHRH tem sido descrito como um agonista superativo do LHRH (Seprod et al., J. Med. Chem. 21, 276-280 (1978)) e, entre outros, tem sido usado em radioimunoensaios para LHRH (Heber en Odell, Proc. Soe. Exp. Bio. Med. 158, 643-646 (1978)), como ligante fluorescente em pesquisa de receptores de LHRH (Conn et al., J. Bio. Chem. 256, 1098-1100 (1981); Naor et al., J. Bio. Chem. 256, 3049-3052 (1981); Childs et al., Peptides 4, 549-555 (1983)), e acoplado a radicais citotóxicos para combater o crescimento do câncer (Szoke et al., Peptides 15, 359-366 (1994)). [D-Lys6]-LHRH não foi aplicado como vacina de LHRH.
A presente invenção se refere a um peptídeo ou uma composição peptídica consistindo de pelo menos duas seqüências LHRH repetida nas quais o sexto aminoácido Gly da seqüência decapeptídica original do LHRH é substituído por um D-aminoácido. A Gly na posição 6 pode ser substituída por um aminoácido funcional que além disso contém uma cadeia lateral pela qual as unidades repetidas de LHRH podem ser acopladas a um composto carreador. Este peptídeo pode ou não ser amidado na extremidade C-terminal, dependendo das técnicas de síntese de peptídeo utilizada. Além disso, este peptídeo pode ser dimerizado ou multimerizado, e então ao menos um peptídeo da seqüência LHRH repetida no dímero ou multímero irá conter um aminoácido funcional substituído na posição 6 do decapeptídeo LHRH original.
O peptídeo ou a composição peptídica de acordo com a invenção contém uma seqüência consecutiva que pode ser descrita de acordo com a seguinte fórmula geral:
16 21 #EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC em que * indica possível substituição de Gly por um aminoácido dextrorrotatório que além disso contém uma cadeia lateral pela qual as unidades de LHRH repetidas podem ser acopladas a um composto carreador.
O primeiro atributo desta invenção é que neste peptídeo ou composição peptídica um possível aminoácido ou aminoácidos repostos podem estar substituídos em que o sexto aminoácido por decapeptídeo LHRH na unidade repetida, Gly (portanto na posição 6 e ou 16 na fórmula geral acima) está então substituído por um D-aminoácido para gerar um peptídeo que é diferente o suficiente da seqüência normal doz LHRH para ser reconhecido pelo sistema imune sem perda da imunogenicidade apropriada.
Além disso, um segundo atributo dessa invenção é que unidades individuais repetidas são dimerizadas para um aumento adicional de sua imunogenicidade sem perda da possibilidade de acoplar o peptídeo ou composição peptídica a um composto carreador proteíco. Nesse peptídeo ou composição peptídica tal dimerização das unidades repetidas pode por exemplo ser feita via terminal carboxila ou via o terminal amina, duas unidades repetidas podem ainda ser dimerizadas através de uma ponte dissulfeto ou tioéter. Para esse propósito a cys na posição 21 pode ser usada, ou cys pode ser sintetizada antes do ácido glutâmico na posição 1, porém outros processos para dimerizar ou multimerizar as unidades LHRH repetidas podem também ser utilizados. No caso . em que a dimerização ou multimerização resulte na perda de sítios acessíveis onde um composto carreador possa ser conjugado, é suficiente restringir a escolha dos Daminoácidos substituindo Gly na posição 6 e/ou 16 por um aminoácido com uma cadeia lateral apropriada. Tal aminoácido de substituição pode ser por exemplo D-Lis, D-Glu ou outro aminoácido dextroratório contendo uma cadeia lateral que permita acoplamento a um composto carreador.
Mais em particular, um exemplo concreto de tal peptídeo preferido de acordo com a invenção, um dímero de LHRH em seqüência com D-Lys6 de acordo com a seguinte fórmula:
1621 #EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC * = D-'.ys #EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
27 3742
Outro exemplo concreto de tal peptídeo preferido de acordo com a invenção, um dimero de LHRH em seqüência com D-Glu6 de acordo com a seguinte fórmula :
1621 #EHWSY*LRPGQHWSYGLRPGC * = D-Glu #EHWSY*LRPGQHWSYGLRPGC
27 3742
Mas outros peptídeos ou composição peptidica em que unidades LHRH em seqüência monomerizadas, dimerizadas ou multimerizadas que contenham substituições de D-aminoácidos nas posições 6 e/ou 16 e/ou (como nos dois últimos exemplos referindo-se a formas diméricas) nas posições 27 e/ou 37 são também parte da invenção.
A invenção fornece ainda uma composição que é caracterizada por conter um peptídeo apresentado em uma forma imunogênica. Como um profissional gabaritado sabe, existem diferentes processos de levar uma substância que é por si só não imunogênica para uma forma imunogênica. Uma primeira possibilidade é acoplar um peptídeo de acordo com a invenção a uma proteína carreadora. Em um peptídeo repetido, uma cisteína na extremidade N- ou C-terminal pode ser apropriadamente usada para acoplamento químico. No dímero do peptídeo repetido, acoplamento pode também ser efetuado usando a cadeia lateral original ou modificada da Dlisina, D-glutamina, ou qualquer outro aminoácido modificado substituindo a glicina na posição 6 e/ou 16 e/ou 27 e/ou 37. Aqueles gabaritados na área sabem perfeitamente que processos de acoplamento e que proteínas carreadoras são apropriadas. De acordo com a invenção, é preferida uma composição que é caracterizada por conter um imunógeno conjugado de uma proteína, tal como ovalbumina, e um peptídeo ou composição peptídica de acordo com a invenção. E claro, a preparação de vacina de acordo com a invenção pode estar combinada com pelo menos um imunoadjuvante. Imunoadjuvantes apropriados são conhecidos por aqueles com experiência na área. De acordo com a invenção, um adjuvante preferido pode ser Specol ou uma emulsão dupla de óleos, mas outros adjuvantes que elicitam apenas efeitos colaterais brandos, ou nenhum efeito colateral, podem também ser usados. A invenção pode ser usada em processos para imunização de indivíduos selecionados a partir de um largo espectro de vertebrados, mas mais em particular mamíferos, contra LHRH. Imunização contra LHRH pode ainda ser usada para a esterilização de, por exemplo, pequenos animais domésticos tais como gatos e cachorros machos e fêmeas, ou para o tratamento da agressividade em cães machos e touros. Outras razões concebíveis para imunização contra LHRH com a presente invenção são a prevenção do cio em animais fêmeas tais como cadelas, gatas e vacas, e prevenção ou tratamento da hiperatividade em animais machos sendo engordados para abate. No tratamento de humanos, imunização contra LHRH pode ser usada no tratamento de câncer de próstata e de mama e, se requerido, no tratamento de algumas formas de carcinoma pituitário.
A incorporação preferida da invenção é um processo de melhoramento da qualidade da came de porcos sendo os porcos vacinados com tal preparação de vacina. A invenção é ilustrada na seguinte seção experimental.
EXEMPLOS :
Vacinação bem sucedida de varrões é definida pelo peso dos testículos menor do que 150 gramas no abate. O objetivo é obter testículos visivelmente pequenos em todos os animais em um grupo tratado. O peso do testículo parece estar diretamente correlacionado à produção de testosterona e de esteróides. Quando o peso do testículo é menos que 60 gramas os testículos eram completamentes inativos histologicamente (Meloen et al., Vaccine 12, 741-746 (1994)) e nenhuma testosterona pôde ser detectada no soro. Nós descrevemos que uma excelente correlação existe entre tamanho e particularmente peso dos testículos e os níveis de androstenona na gordura traseira. (Oonk et al., Livest. Prod. Sei. 42, 63-71 (1995)). Parece que testículos de animais imunizados pesando menos que 150 gramas são uma clara indicação da ausência do odor de varrão.
Androstenona na gordura traseira era geralmente presente em concentrações indetectavelmente baixas, mas se presente era sempre menor que 0,5 pg/g gordura. Este valor na literatura é referido como um limite seguro para a possível percepção do odor de varrão, embora outros reportem 1 pg/g como suficientemente baixo. Nós tomamos o menor valor como o menor limite, abaixo do qual nós consideramos o porco como imunocastrado com sucesso. Essa relação é baseada em medições de mais de 100 porcos. Os pesos dos testículos dos animais controle em nossos experimentos se mostraram estar entre 200 e 350 gramas. Finalmente, conversão da ração e razão came/gordura pareceram ser aumentados em imunocastrados comparados a porcos castrados cirurgicamente quando jovens. PROCESSOS :
As sínteses de peptídeos foram feitas em um sintetizador de peptídeos ABI 430A usando ciclos FastMoc em uma escala de 0,25 mmoles com tempos de ciclo de cerca de 60 min (Fields CG, Lloyd DH, MacDonald RL, Ottesom KM, Noble RL ativação para síntese de peptídeos em fase sólida Fmoc automatizada. Peptide Research 4, 95-101 (1991); User Bulletin #32, Applied Biosystems (1990)).
Purificações de peptídeos: As purificações foram feitas usando um sistema Waters PrepLC4000 equipado com uma coluna Waters PrepPark (25mmx 100mm)empacotadacomDelta-PakC18 (15pm, 100A) e uma pré-coluna.
Para a cromatografia líquida de alta performance (HPLC) analítica, nós usamos duas bombas Waters modelo 510, em controlador de gradiente modelo 680, um autoinjetor Waters modelo WISP 712, e um detector de fotodiodo modelo 991. Os produtos foram analisados em um gradiente linear de água com TFA 0,1% a acetonitrila 60% em água com TFA a 1% em uma coluna Waters Delta Pak C18-100A (3,9 x 150 mm x 5 pm) a 1 ml/min a 215 nm. Todos os produtos foram 95% puros de acordo com a área do pico.
Análise dos aminoácidos: Foi feita com o sistema Waters PicoTag. Os resultados estavam de acordo com os valores esperados de acordo com a seqüência de aminoácidos.
Procedimento de derivatização: O produto foi dimerizado por dissolução do produto em 20% dimetilsulfóxido em água. O pH deveria ser ajustado para 5-6 com NH4CO3 1% ou 2 %. A solução deveria permanecer límpida. pH muito alto pode ser corrigido com ácido acético 1-10%. Agitação à temperatura ambiente por pelo menos 5 h. O produto foi purificado diretamente usando HPLC.
Conjugação do dímero repetido contendo D-Lys6 à ovalbumina: [Pesos equivalentes a serem usados: 1 mg de ovalbumina e lmg do dímero-repetido-D-Lys6 são ligados usando ÍOmg de ECDI em água MilliQ). Primeiro, tanto o peptídeo como a ovalbumina são dissolvidos em água MilliQ (A = solução do peptídeo; B = solução da ovalbumina). A e B são misturados bem. Então um excesso de 10%, baseado no pesos equivalentes, de carboxidiimida (ECDI) é dissolvido em água MilliQ (C=solução de ECDI).
Subseqüentemente, C é lentamente adicionada à solução A+B sob agitação contínua. Após 6 h, o produto é dialisado (faixa de exclusão de 10.000 u.m.a.) contra água.
Determinação do acoplamento: A ligação é calculada por análise de aminoácido comparativa do conjugado e do peptídeo e proteína carreadora separados. De acordo com a análise de aminoácidos, o conjugado contem aproximadamente 0,5 mg de peptídeo por mg de ovalbumina.
Preparação da vacina: As vacinas foram preparadas misturando-se o peptídeo com o adjuvante (veja detalhes com a Specol).
Os Adjuvantes testados foram o adjuvante completo ,de Freund (CFA), o adjuvante incompleto de Freund (IFA), óleo Specol, e emulsão dupla de óleo (d.o.e.). CFA ou IFA foi misturado 1:1 com uma solução de peptídeo como uma emulsão estável;
- Emulsão dupla de óleo (W/O/W):
partes da primeira fase aquosa: antigeno em PBS (tampão fosfato em salina).
partes da fase óleo: Marcol 52 (Esso) com 10% de “Arlacel”.
partes da segunda fase aquosa: PBS com 2% de Montanox 80 (= Tween 80).
- Specol (Special Oil Phase) é um produto apropriado para a produção de emulsões de água em óleo para propósitos de pesquisa. Composição por 10 ml: 0,453 g Tween 85 (ICI), 0,532 g Span85 (ICI), 9 ml Marcol 52 (Esso Bélgica).
Preparação das emulsões em Specol: Misture 4 partes da fase aquosa contendo o antigeno com 5 partes de Specol (v/v) adicionando a fase aquosa muito lentamente à fase óleo (Specol) enquanto agita-se rapidamente com por exemplo um ultraturrax (vórtex é muito brando). Evite tanto quanto possível a introdução de ar. Use vidraria limpa livre de detergentes. Estocagem: Specol é preferencialmente estocado entre 4 e 8°C (referências: B.A. Bokhout et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 2, 491-500 (1981); W.J.A. Boersma et al., res. Immunol. 143, 503-511 (1992)).
Protocolo de vacinação: Para cada vacina, e por animal, 1 mg do peptídeo (como calculado a partir do acoplamento), ou uma quantidade menor como indicado, preparado como descrito acima, foi dissolvido em 1 ml de tampão fosfato em salina (PBS) e emulsificado no adjuvante indicado.
Porcos machos intactos de aproximadamente 10 semanas de idade no início do experimento, quando então eles receberam a primeira vacinação. O reforço administrado 8 semanas após tinha a mesma composição.
Avaliação: O tamanho do testículo dos porcos foi medido extemamente usando paquímetros. A partir de aproximadamente 12 semanas da primeira vacinação o tamanho dos testículos não aumenta mais (ou até diminui) em porcos com uma concentração abaixada de LHRH. Amostras de soro foram tomadas para determinação de testosterona e dos títulos antiLHRH. Anticorpos para GnRH foram determinados por ligação de diluições seriais do anti-soro do porco a LHRH. Os animais foram abatidos 16 semanas após a primeira vacinação. Após o abate, os testículos foram pesados e uma amostra da gordura traseira foi tomada para determinação do esteróide do odor de varrão androstenona usando ELISA (Ridascreen). Além disso, a qualidade da carne foi testada.
EXPERIÊNCIA 1
Nestes experimentos diferentes peptídeos sintéticos foram testados na sua forma não conjugada. Cada peptídeo foi administrado duas vezes na idade de 10 e 18 semanas em uma quantidade de 1 mg, usando IF A como adjuvante. As formulações testadas foram o monômero de LHRH dimerizado pelo terminal carboxi, o LHRH repetido dimerizado pelo terminal carboxi, o LHRH repetido dimerizado pelo terminal amino, o monômero de LHRH com [D-Nal(2)6]-Nafarelin® dimerizado pelo terminal carboxi, o LHRH repetido com [D-Nal(2)6]-Nafarelin® dimerizado pelo terminal carboxi, o monômero de LHRH com [D-Lys6] dimerizado pelo terminal carboxi e o LHRH repetido com [D-Lys6] dimerizado pelo terminal carboxi.
1) Fórmula do peptídeo com o dímero LHRH monômero C: 1 11 pEHWSYGLRPGC' pEHWSYGLRPGC 1222
2) Fórmula do peptídeo com o LHRH repetido dimerizado pelo terminal carboxi:
pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC 2242
3) Fórmula do peptídeo com o LHRH repetido dimerizado pelo terminal amino: 121
CQHWSYGLRPGQHWSYGLRPG@
CQHWSYGLRPGQHWSYGLRPG @ 22
4) Fórmula do peptídeo com o monômero de LHRH com [DNal(2)6]-Nafarelin® dimerizado pelo terminal carboxi:
611 pEHwsr-LRPGc * = [3-(2-naftalenil)I D-alanina] pEHWSY*LRPGC
1722
5) Fórmula do peptídeo com o LHRH repetido com [DNal(2)6]-Nafarelin® dimerizado pelo terminal carboxi:
1621 pehwsy*lrpgqhwsy*lrpgc * = [3-(2-naftalenil)1 D-alanina] pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
27 3742
6) Fórmula do peptídeo com o monômero de LHRH com [D-Lys6] dimerizado pelo terminal carboxi: 1 6 11 pEHWSY*LRPGC * = [D-lisina] pEHWSY*LRPGC
17 22
7) Fórmula do peptídeo com o LHRH repetido com [D-Lys6] dimerizado
| pelo terminal carboxi: | |||
| 1 6 16 | • 21 | ||
| pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC | * = [D-lisina] | ||
| 5 | 1 pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC 22 27 37 42 Antígeno número de porcos com | peso do testículo | |
| 1) C-dímero-LHRH-monomérico | peso do testículo <150 g/tamanho do grupo 0/7 | (média ±dp.) 294 ±44 | |
| 2) C-dímero-LHRH-repetido | 5/7 | 92 ±105 | |
| 3) N-dímero-LHRH-repetido | 6/7 | 88 ±57 | |
| 3) N-dímero-LHRH-repetido | 6/8 | 72±89 | |
| 4) [D-Nal(2)6]-dímero-LHRH | 2/7 | 177 ±69 | |
| monomérico 5) [D-Nal(2)6]-dímero-LHRH repetido | 0/7 | 248 ±56 | |
| 6) [D-Lys^-dímero-LHRH | 2/7 | 190±44 | |
| monomérico 7) [D-Lys^-dímero-LHRH repetido | 5/7 | 103 ±102 | |
| Nos grupos 2, 3 | e 7, 70-80% dos animais apresentou-se |
imunocastrado com sucesso. Naqueles que responderam ao tratamento 10 o maior peso de testículo medido foi 86 g, onde os que não responderam ao tratamento tiveram o peso do testículo igual ou superior a 193 g. A partir desses resultados aparece que a reposição do adjuvante completo de Freund pelo adjuvante incompleto de Freund na fórmula que contém um peptídeo não conjugado leva a uma perda da eficiência. Além disso, particularmente aparece que, primeiramente o princípio da substituição é essencial para a atividade da vacina, segundamente que a dimerização pode serfeito via terminal carboxila ou via o terminal amina e terceiramente que nem toda a substituição de aminoácido é permitida, tendo em vista a ineficiência do análogo de Nafarelin® como uma vacina.
EXPERIÊNCIA2
A já conhecida eficaz vacina baseada no peptídeo repetido LHRH acoplado a hemocianina de craca (keyhole limpet hemocyanine, KLH) em CFA para a primeira e IFA para a segunda vacinação foi testada sem conjugação para um carreador de proteína, nas formas simples e dimerizada, em CFA/IFA e em 2x, e em uma dose de 1 mg e 100 pg. Porcos foram vacinados 2x em 10 e 18 semanas de idade.
1) Fórmula do peptídeo de repetição LHRH
121 pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
2) Fórmula do peptídeo de repetição dímero LHRH
121 pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
I pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
2242
| Antígeno | adjuvante | dose | n° porcos com testículo | peso do testículo (média ± d.p.) | título de Acs antí- |
| 1) LHRH repetido | CFA/IFA | 1 mg | com peso <150 g/ tamanho do grupo 6/6 | 38 ±23 | LHRH a 8 spv |
| 1) LHRH repetido | CFA/IFA | 1 mg | 6/6 | 24 ±6 | |
| 1) LHRH repetido | CFA/IFA | 1 mg | 6/6 | 41 ±27 | |
| 1) LHRH repetido | CFA/IFA | 1 mg | 11/11 | 39 ± 14 | 17,8 ± 11,5 |
| 2) LHRH repetido | CFA/IFA | 1 mg | 10/11 | 67 ±64 | 16,7 ±5,9 |
| dimérico 1) LHRH repetido | 2xIFA | 1 mg | 5/13 | 159±108 | 10,8 ± 8,4 |
| 2) LHRH repetido | 2xIFA | 1 mg | 6/13 | 154 ±95 | 8,7 ± 6,8 |
| dimérico 1) LHRH repetido | CFA/IFA | 100 pg | 7/12 | 121 ± 92 | 12,6 ±5,9 |
| 2) LHRH repetido | CFA/IFA | 100 pg | 6/12 | 132 ±86 | 9,8 ±5,2 |
| dimérico 1) LHRH repetido | 2xIFA | 100 pg | 5/13 | 172 ± 92 | 3,5 ±4,6 |
| 2) LHRH repetido | 2xIFA | 100 pg | 1/13 | 220 ± 55 | 4,6 ± 5,4 |
| dimérico | A vacina | de LHRH repetido na forma | simples ou |
dimerizada parece de fato completamente efetiva, até mesmo na completa ausência da proteína carreadora KLH no bloqueio do crescimento do testículo e do desenvolvimento do odor de varrão em porcos. Entretanto, uma importante desvantagem dessa vacina é que a sua efetividade muito grande é alcançada apenas em uma composição com adjuvante completo de Freund e em uma alta dose. Ademais, títulos razoáveis de anticorpos anti-LHRH (expressados como % de ligação do soro colhido 8 semanas após a vacinação (spv)), foram alcançados apenas com o LHRH repetido ou o dímero de LHRH repetido em CFA/IFA a uma dose de 1 mg.
EXPERIÊNCIA 3
O efeito da conjugação ao carreador proteico foi testado em combinação com a substituição de IFA pelos adjuvantes brandos Specol e emulsão dupla de óleos (d.o.e.). O peptídeo LHRH repetido dimerizado com uma substituição de glicina pela D-lisina nas posições 6, 16, 27 e 37 foi conjugado a ovalbumina e emulsificados em dois diferentes adjuvantes, Specol e emulsão dupla de óleos. Os porcos foram vacinados 2 x, 10 e 18 semanas de idade, com 1 mg de peptídeo conjugado em adjuvante. A eficácia da junção é 50%, portanto, o equivalente de antígeno administrado é, na realidade, 500 pg.
Fórmula do peptídeo com o LHRH repetido com [D-Lys6]
1621 pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC 22 27 3742
Antígeno n° de porcos com testículo com peso <150g/tamanho do grupo
1) [D-Lys6]-dímero-9/9
LHRH repetido-ova em
Specol
2) [D-Lys6]-dímero-8/8
LHRH repetido-ova em d.o.e.
A coniusacão a um carreador dimerizado: _ _ * = [D-lisina]
Peso do testículo (média ± d.p.)
19± 12 ±46 de proteína comumente usado melhora fortemente a eficiência da vacina, até mesmo quando um 5 adjuvante muito brando é utilizado.
EXPERIÊNCIA 4
Subseqüentemente nós testamos em um número de experimentos em quanto a dose administrada podería ser diminuída. O antígeno peptídico foi o dímero de LHRH repetido contendo [D-Lys6]. Este 10 foi acoplado à ovalbumina e a conjugação foi administrada como uma emulsão no adjuvante Specol. Os porcos foram vacinados 2 x em 10 e 18 semanas de idade.
22 número de porcos
| Dose (pg/conjugado) | com peso de testí- peso do testículo | Título LHRH-Ab a 8 ppv | |||
| culos <150g/grupo tamanho | (média ± s.d.) | ||||
| A. | 1000 | 9/9 | 19 ± | 12 | 46.5± 5.1 |
| B . | 1000 | 8/8 | 43 ± | 46 | 28.7±13.0 |
| C. | 1000 | 7/8 | 60 ± | 62 | 44.1±11.4 |
| D. | 900 | 11/11 | 46 ± | 38 | 24.4± 4.4 |
| C . | 500 | 7/9 ' | 65 ± | 69 | 36.3±14.3 |
| D. | 300 | 11/11 | 29 ± | 18 | 28.0± 3.2 |
| E. | 300 | 15/15 | 24 x | 18 | 35.3± 4.2 |
| C. | 250 | 9/9 | 32 ± | 12 | 45.1± 8.6 |
| C . | 125 | 8/8 | 42 ± | 42 | 44.9±12.0 |
| F. | 125 | 12/12 | 35 ± | 37 | 27.8± 3'. 6 |
| G . | 125 | 10/10 | 21 ± | 12 | 26.5± 3.1 |
| H. | 125 | 6/6 | 12 ± | 2 | n.d. |
| K. | 125 | 7/7 | 31 ± | 22 | 29.5± 5.1 |
| D . | 100 | 9/10 | 62 ± | 58 | 23.2± 6.7 |
| D. | 30 | 10/11 | 53 ± | 65 | 25.6± 7.4 |
| E. | 30 | 13/15 | 61 ± | 75 | 32.5± 5.2 |
| D. | 10 | 9/11 | 78 ± | 86 | 22.9± 7.8 |
| E. | 3 | 6/15 | 207 ± | 117 | 21.3± 9.7 |
Usando o dímero de LHRH repetido contendo [D-Lys6] acoplado à albumina em conjugação em Specol, uma marcante redução da dose de vacina necessária pode ser obtida. Em 43 porcos, vacinados com 125 pg de conjugado (= 62,5 pg de peptídeo) a eficiência foi de 100%. Na 5 gordura traseira de porcos com testículos menores do que 150 g em nenhuma ocasião mais do que 0,5 pg de androstenona/ g de gordura traseira tem sido medido (Oonk et al. , Livest. Prod. Sei. 42, 63-71 (1995) ); na maioria dos casos as concentrações de androstenona são até mesmo mais baixas que o nível de detecção do ELISA (0,111 pg/g de gordura traseira). Com doses de 10 conjugado de 10-100 pg há um risco aumentado para aqueles que não responderam, e doses inferiores a 10 pg não foram efetivas. O títulos de anticorpos anti-LHRH são comparáveis somente no mesmo experimento. Os resultados mostram claramente que baixas doses de vacina são capazes de elicitar títulos semelhantes aos obtidos com altas doses, em contraste aos resultados obtidos utilizando o LHRH repetido ou o dímero de LHRH repetido. Em um mesmo experimento, títulos mais baixos e desvios-padrão 5 maiores resultam da contribuição de porcos que não responderam totalmente ou simplesmente não responderam à vacina.
EXPERIÊNCIA 5
Em grupos controle de varrões intactos, os pesos do testículos e os teores de androstenona foram determinados.
| Número | Peso testículos | Androstenona |
| (média ± s.d.) | (pg/g gordura traseira | |
| 1. 10 | 217 ± 38 | 0,68 ± 0,42 |
| 2. 6 | 233 ±41 | 2,04 ±1,55 |
| 3. 5 | 231 ±58 | 2,05 ± 0,70 |
| 10 | Como reportado anteriormente em Oonk et al. , Livest. Prod. |
Sei. 42, 63-71 (1995), a concentração de androstenona varia fortemente em porcos intactos machos adultos.
Claims (12)
1. Peptídeo caracterizado pelo fato de compreender pelo menos duas seqüências decapeptídicas LHRH contíguas em que o aminoácido glicina na posição 6 de pelo menos um dos decapeptídios LHRH constituintes é substituído por um aminoácido dextrorrotatório com uma cadeia lateral que pode ser acoplada a um composto carreador.
2. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de conter uma seqüência de aminoácidos que compreenda a estrutura:
1 6 16 21 # EHWS Y *L RPGGfflSY * LRPGC na qual o aminoácido * na posição 6 ou 16 é um aminoácido dextrorrotatório que pode ser acoplado a um carreador e o outro aminoácido * é ou glicina ou um aminoácido dextrorrotatório com uma cadeia lateral que pode ser acoplada a um composto carreador.
3. Peptídeos de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de serem dimerizados ou multimerizados.
4. Peptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de compreender a estrutura:
1 6 16 21 # EHWfí Y *LRPGQW Y * LRPGC
22 27 37 42 em que o aminoácido * na posição 6 ou 16 ou 27 ou 37 é D-lisina ou Dglutamina ou outro aminoácido dextrorrotatório com uma cadeia lateral que possa ser acoplada a um composto carreador e o outro aminoácido * é ou glicina ou D-lisina ou D-glutamina ou outro aminoácido dextrorrotatório com uma cadeia lateral que possa ser acoplada a um composto carreador.
5. Peptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de possuir a estrutura:
16 16 21
CQH WS Y * LRPGQHWSY* LRPGC
CQHWS Y* LR PGQ HWS Y * LR PGC 22 28 38 42 em que o aminoácido * na posição 6 ou 16 ou 27 ou 37 é D-lisina ou Dglutamina ou outro aminoácido dextrorrotatório com uma cadeia lateral que possa ser acoplada a um composto carreador e o outro aminoácido * é ou glicina ou D-lisina ou D-glutamina ou outro aminoácido dextrorrotatório com uma cadeia lateral que possa ser acoplada a um composto carreador.
6. Composição caracterizada pelo fato de que um peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 está acoplado a um composto carreador.
7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o composto carreador é uma proteína.
8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o composto carreador é KLH ou ovalbumina.
9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de adicionalmente conter um adjuvante brando.
10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o adjuvante brando é uma fase óleo de uma emulsão água-em-óleo ou uma emulsão dupla de óleo.
11. Vacina caracterizada pelo fato de conter uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10.
12. Processo para imunocastrar um porco, caracterizado pelo fato de dito porco é vacinado com uma vacina como definida na reivindicação 11.
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