HU226293B1 - An improved peptide, immunogenic composition and vaccine or medical preparation, a method to immunise animals against the hormone lhrh , and analogs of the lhrh tandem repeat peptide and their use as vaccine - Google Patents
An improved peptide, immunogenic composition and vaccine or medical preparation, a method to immunise animals against the hormone lhrh , and analogs of the lhrh tandem repeat peptide and their use as vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- HU226293B1 HU226293B1 HU0001431A HUP0001431A HU226293B1 HU 226293 B1 HU226293 B1 HU 226293B1 HU 0001431 A HU0001431 A HU 0001431A HU P0001431 A HUP0001431 A HU P0001431A HU 226293 B1 HU226293 B1 HU 226293B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- lhrh
- peptide
- vaccine
- amino acid
- linked
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 78
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 66
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 38
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 35
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 29
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 18
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 11
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 11
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 8
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 7
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-GSVOUGTGSA-N D-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 5
- 229930195715 D-glutamine Natural products 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 5
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 5
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 101000904173 Homo sapiens Progonadoliberin-1 Proteins 0.000 claims 2
- 102100024028 Progonadoliberin-1 Human genes 0.000 claims 2
- 101000996723 Sus scrofa Gonadotropin-releasing hormone receptor Proteins 0.000 claims 2
- XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N gonadorelin Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 36
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 21
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 14
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 12
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 11
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 9
- HFVMLYAGWXSTQI-QYXZOKGRSA-N 5alpha-androst-16-en-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C=CC4)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 HFVMLYAGWXSTQI-QYXZOKGRSA-N 0.000 description 8
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 6
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 6
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 6
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 6
- 101100508406 Caenorhabditis elegans ifa-1 gene Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- HOWBSMILMYIFKQ-OBCLEYQXSA-N (2s)-n-[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2r)-6-amino-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[(2-amino-2-oxoethyl)carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyph Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 HOWBSMILMYIFKQ-OBCLEYQXSA-N 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- -1 Gly amino acid Chemical class 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 4
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 3
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 3
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108010021717 Nafarelin Proteins 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 2
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 2
- 230000001592 luteinising effect Effects 0.000 description 2
- 230000023508 male gonad development Effects 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- RWHUEXWOYVBUCI-ITQXDASVSA-N nafarelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C=C2C=CC=CC2=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 RWHUEXWOYVBUCI-ITQXDASVSA-N 0.000 description 2
- 229960002333 nafarelin Drugs 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000881711 Acipenser sturio Species 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046686 Gonadorelin-like peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 102000008238 LHRH Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010021290 LHRH Receptors Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 1
- 206010058901 Testicular mass Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000282485 Vulpes vulpes Species 0.000 description 1
- NWGKJDSIEKMTRX-BFWOXRRGSA-N [(2r)-2-[(3r,4s)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-2-hydroxyethyl] (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)C1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-BFWOXRRGSA-N 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 201000005179 adrenal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 229940090047 auto-injector Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical group 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000006408 female gonad development Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N glycinamide Chemical compound NCC(N)=O BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical group 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002130 immunocastration Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 235000004213 low-fat Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000009806 oophorectomy Methods 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
A találmány tárgyát olyan módosított peptid képezi, amely alkalmas vakcina előállítására és hatásos a luteinizáló hormont kibocsátó hormon (LHRH) ellen, amit gonadotropinkibocsátó hormonnak is (GnRH) neveznek. A találmány tárgyához tartoznak továbbá olyan immunogén készítmények és vakcinák vagy gyógyászati készítmények (vakcinák és gyógyászati készítmények), amelyek a fenti peptidet tartalmazzák; a találmány tárgyához tartozik továbbá ezen vakcina vagy gyógyászati készítmény alkalmazása emlősök immunizálására LHRH ellen, aminek révén az emlősök szaporodási, valamint viselkedési jellemzői befolyásolhatók, továbbá a találmány tárgyát képezi a sertéshús minőségének javítása.
Az LHRH a hipotalamuszból származó kisméretű, 10 aminosav hosszúságú peptid (dekapeptid). Az LHRH aminosavszekvenciája (ahol, mint általában, a terminális aminosav aminocsoportja balra és a terminális aminosav karboxilcsoportja jobbra helyezkedik el), az aminosavak szokásos hárombetűs kódjával a következőképpen néz ki: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-GlyLeu-Arg-Pro-Gly-NH2, vagy pedig az aminosavak egybetűs kódjával a következő: #EHWSYGLRPG@, ahol #E piroglutaminsavat, és a G@ glicinamidot jelöl.
Az LHRH hatását a hipofízisen fejti ki, és fokozza a biológiailag aktív FSH kibocsátást (tüszőstimuláló hormon), valamint az LH-nak (luteinizálóhormon) a vérben való képződését, ami viszont a növekedésben lévő hím állat heréjének fejlődését és a tesztikulárís szteroidok szintézisét segíti elő. A növekedésben lévő nőstény állatoknál az ováríum fejlődése, és ezen belül a tüsző fejlődése, valamint a petefészek-szteroidok szintézise és a peteérés van stimulálva.
Ismeretes, hogyha az LHRH egy hordozófehérjéhez van kapcsolva, ez az állatok vakcinálására használható. Ilyen típusú vakcinálást különböző okok miatt lehet végezni, amelyek mind az LHRH természetes funkcióival állnak kapcsolatban. Ismeretes, hogy drasztikusan csökkentve a vérben lévő LH és FSH mennyiségét, ez gátolja a tesztikulárís szteroidok és androgének, valamint a sperma képződését a hím állatok heréjében, valamint az ovariáriumszteroidok vagy progesztagének és ösztrogének képződését, továbbá a nőstény állatok petefészkében a tüsző érését. Az androgének, progesztagének és ösztrogének vérben lévő mennyiségét lecsökkenthetjük arra a szintre, amelyet akkor kapunk, ha kasztrációval a heréket vagy ováriumot eltávolítjuk, amennyiben az állatokat LHRH ellen eredményesen immunizáljuk. Ilyen esetben a hím állatoknál a herék lassan vagy egyáltalán nem fejlődnek ki (nem szintetizálódnak androgének, azaz hím szteroidhormonok, nem képződik ondószál), hasonlóképpen a nőstény állatoknál a petefészek tevékenysége lecsökken (a női szteroidhormonok, ösztrogének és progesztagének szintézise lecsökken), gátolva van a tüsző érése és az ovuláció).
Az állatgyógyászatban az LHRH elleni 100%-ban eredményes immunizálás alkalmazható volna például a kisméretű háziállatok, mint például hím és nőstény macskák és kutyák sterilezésére, vagy pedig az agresszív hím kutyák és bikák kezelésére, ahol a vakcinával való beoltás egyszerű megoldást képezhet a drasztikus sebészeti beavatkozás, mint a kasztrálás vagy a petefészek eltávolítása helyett. Az LHRH elleni immunizálás egy másik lehetséges indoka volna a nőstény állatoknál, így például kutyáknál, macskáknál és teheneknél a párzásra törekvés gátlása, továbbá a levágásra szánt, hizlalás alatt álló nyugtalan hím állatok kezelése. A humán egészségügyben az LHRH elleni immunizálást alkalmazni lehet a prosztatarák és mellrák, és kívánt esetben az agyfüggelék-karcinóma némely alakjának kezelésére.
Az LHRH elleni vakcina alkalmazásának másik lehetséges területe az állattenyésztés, elsősorban a levágásra szánt sertések hizlalása. A nemileg érett hím sertések (kanok) húsán egy tipikus szag, az úgynevezett kanszag érezhető. A nemileg érett sertések heréjében számos C19—Δ16 szteroid képződik, amelyek az állat zsírszöveteiben tárolódnak [Patterson, J. Sci. Food Agric., 19, 31-38 (1968); Brooks en Pearson, J. Anim. Sci., 62, 632-645 (1986); Claus, Zeitschrift. Tierzüchtg. Züchtungsbiol. 93, 38-47 (1976); Claus, Acta Endocrinol. (Copenh.), 91, Suppl. 225, 432-433 (1979)]. Ezen szteroidok felelősek főleg a kellemetlen, vizeletszerű szag képződéséért, ami a hús hőkezelésekor észlelhető [Fuchs, Swedish J. Agric. Rés., 1, 233-237 (1971); Bonneau, Livest. Prod. Sci., 9, 687-705 (1982)]. Ezen kellemetlen szag miatt a nemileg érett hím sertések húsa nem alkalmas, vagy csak igen kis mértékben alkalmas fogyasztásra és nem exportálható. Minthogy a levágásra szánt hím sertéseknek mintegy 10%-a a levágás idejét megelőzően már nemileg érett, ez a körülmény a sertéstenyésztők számára nagy veszteséget jelent.
Ezen veszteségek csökkentésére vagy megelőzésére csaknem mindegyik hím malacot fiatal korban kasztrálják sebészeti beavatkozás segítségével, ahol általában semmilyen érzéstelenítést nem alkalmaznak. Eltekintve ezen kasztrálás! mód nem állatbarát aspektusától, ez a művelet általában fertőzést, a növekedésben való elmaradást is okoz, és rosszabb minőségű húsminőséget eredményez az intakt állat húsához viszonyítva (legalábbis mindaddig, amíg az intakt állatnál nem fejlődik ki a kan sertés mellékíz) [Walstra, Livest. Prod. Sci., 1, 187-196 (1974)].
Az LHRH elleni immunizáció állatbarát megoldást nyújt, ezenkívül javítja a hús minőségét, amennyiben a fiatal állat agyfüggelékében csökkenti az LHRH koncentrációt. Az LHRH szintnek ezen csökkentése a biológiailag aktív FSH és LH koncentráció csökkenését eredményezi, ami viszont gátolja az állatok heréinek fejlődését és a tesztikulárís szteroidok, ezek között a Ο19-Δ16 szteroidok szintézisét. Feleslegessé válik a nem állatbarát kasztráció: nem lép fel fertőzés, a növekedés nincs gátolva, és a végső húsminőség sem gyengébb, mint kasztrálást követően. Ezen túlmenően ezen módszer alkalmazásával elkerülhető, hogy a hím állatok húsában a levágás időpontját megelőzően kansertés mellékíz jelentkezzen.
Azonban a kansertés mellékíz ellen alkalmazandó vakcinával szemben azt a szigorú követelményt tá2
HU 226 293 Β1 masztjuk, hogy mindegyik beoltott sertésnél a herék fejlődését késleltesse annak érdekében, hogy a levágás időpontja előtt egy esetben se lépjen fel kan-melléklz, akkor sem, ha az ellenőrzést igen nagy számú sertéstenyészetben végzik. Az ismert vakcinakészítmények nem felelnek meg ennek a követelménynek.
Az LHRH elleni vakcinák termékenység elleni tulajdonságaival foglalkozó szakirodalomból és a közrebocsátott szabadalmi bejelentésekből az tűnik ki, hogy a vakcinálás eredménye gyakran változó, így például némely esetben az állatok kismértékben, vagy egyáltalán nem reagálnak a beoltásra, vagy pedig nagy mennyiségű, a kereskedelmi forgalom által nem elfogadott adjuvánsokat kell alkalmazni a kívánt hatás biztosítására [Chaffaux és munkatársai, Recueil de Médícine Vétérinaire, 161 (2), 133-145 (1985); Caraty és munkatársai, C. R. Acad. Se. Paris, 303 kötet, III széria, 16. szám, 673-676 (1986); Falvo és munkatársai, J. Anim. Sci., 63, 986-994 (1986); Goubau és munkatársai: Domest. Anim. Endocrinol. 6, 339-347 (1989a); Goubau és munkatársai, Theriogenology, 32, 557-567 (1989b); Hoskinson és munkatársai, Austr. J. Biotech. 4, 166-170 (1990); Bonneau és munkatársai, J. Anim. Sci., 72, 14-20 (1994); 4 608 251 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, WO 88/05308 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés]. Az irodalomban megjelent adatok szerint LHRH vakcinálást alkalmazva nem lehet mindegyik immunizált sertésnél már egy megfelelő korai korszakban gátolni a herék fejlődését oly mértékben, hogy a kanszag problémája teljes mértékben kiküszöbölhető legyen. Az eredmény százalékos értéke 20 és 80% között van. Ez az eredmény nem kielégítő, és a jelenlegi LHRH vakcinagenerációt alkalmatlanná teszi az állattenyésztésben való alkalmazásra.
Ezen típusú vakcinák készítésénél a nehézséget talán a „tolerancia” jelensége okozza. A saját anyagokat, mint a hormonokat, az immunrendszer nem ismeri fel, hanem tolerálja. Általában a saját anyagok ellen nem képződnek antitestek. Egy eredményesen alkalmazható vakcinánál így arra van szükség, hogy olyan anyagot adjunk be, amely kellő mértékben hasonlít a hormonhoz, de ugyanakkor kellően idegen is ahhoz, hogy antitestek képződését váltsa ki. Minthogy ezen feltételek egymást kölcsönösen kizárják, nem volt bizonyos egészen a legutóbbi időkig, hogy egyáltalán előállíthatók-e ilyen anyagok. Az egyik kísérletnél, ahol LHRH-szerű peptidvakcinát próbáltak előállítani, az LHRH dekapeptid 6-os helyzetében a Gly csoportot egy jobbra forgató aminosawal, D-Tryp csoporttal helyettesítették [Chaffaux és munkatársai, Recueil de Médícine Vétérinaire, 161 (2), 133-145 (1985)]. Azonban kitűnt, hogy ezen módosított LHRH pepiidet tartalmazó vakcina még kevésbé eredményes, mint a normál LHRH dekapeptidet tartalmazó oltóanyag (EP 0 464 124).
Újabban azonban azt találtuk, hogy az LHRH ellen beoltott mindegyik állatban lehetséges antitestválaszt kiváltani [Meloen és munkatársai: Vaccine 12, 741-746 (1994)]. Ezen kísérletek során a sertéseket kétszer oltják be olyan LHRH vakcinával, amely eltér a klasszikus típusú LHRH oltóanyagtól (amely LHRH-t tartalmaz egy hordozófehérjéhez kapcsolva Freund-féle adjuvánsban), amelyet tandem-LHRH vakcinának neveznek (0 464 124 számú európai szabadalmi leírás). A tandem-LHRH vakcina találmánya szerint előnyösen olyan peptidet alkalmaznak, amelyre jellemző, hogy legalább két LHRH szekvenciát tartalmaz egymás után kapcsolva, amelynek általános képlete (a terminális aminosav aminocsoportja balra és az aminosav terminális karboxilcsoportja jobbra helyezkedik el): Z1-Glx-HisTrp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-[Gly-X-Gln-His-Trp2-SerTyr-Gly-Leu-Arg-Pro]n-Gly-Z2, ahol az aminosavak a hárombetűs kóddal vannak jelölve és ahol Trp1 és Trp2 jelentése triptofán (Trp) vagy formilezett triptofán [N(indoi)-f°rmil-triptofán], n értéke egy egész szám, legalább 1, X jelentése egy vegyértékkötés vagy egy spacercsoport a Gly és Gin aminosavak között, Z1-Glx jelentése pGlu (piroglutaminsav) vagy Gin, amelyhez egy elágazás kapcsolódik, amely egy vagy több további aminosavat tartalmaz, és Gly-Z2 jelentése Gly-NH2 vagy olyan Gly, amelyhez egy vagy több további aminosavat tartalmazó elágazás kapcsolódik. Ezen általános képletben X jelentése például a glicin és glutamin aminosavak közötti közvetlen kötés, vagyis ezen aminosavak közvetlenül kapcsolódnak egymáshoz egy közvetítő kapcsolat nélkül (vagyis a normális peptidkötés nélkül). így például a tandem-LHRH vakcina olyan peptideket is tartalmaz, amelyekben az LHRH szekvenciák spacereken keresztül vannak egymáshoz kapcsolva. A spacercsoportok természete igen különböző lehet, így például spacerként szerepelhet egy vagy több aminosav, rövidebb vagy hosszabb szénhidrogénlánc vagy spacerként jelen lehetnek egyéb vegyületcsoportok vagy molekulák. A fenti általános képletben Z1-Glx jelentése előnyösen pGlu (piroglutaminsav), de jelenthet egy Gin csoportot is, amelyhez egy vagy több további aminosavat tartalmazó lánc kapcsolódik, így például amely alkalmazható a peptidnek egy hordozófehérjéhez való kapcsolására. A fenti általános képletben Gly-Z2 jelentése például Gly-NH2 csoport, vagy olyan Gly, amelyhez egy vagy több további aminosavat tartalmazó elágazó lánc kapcsolódik, így például egy olyan, amely használható a peptidnek egy hordozófehérjéhez történő kapcsolására. Előnyösen Gly-Z2 jelentése GlyCys-NH2, ahol a C terminális ciszteint azért adják a molekulához, hogy ez lehetőséget nyújtson a peptidnek egy hordozófehérjéhez történő kapcsolására.
Közelebbről, a tandem-LHRH vakcina olyan peptidet tartalmaz, amelyben legalább két LHRH szekvencia van egymás után (tandemben) kötve, amelynek általános képlete: pGlu-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-ArgPro-[Gly-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro]n-GlyCys-NH2 (ahol a terminális aminosavon az aminocsoport balra, és a terminális aminosavon lévő karboxilcsoport jobbra helyezkedik el), ahol az aminosavak a hárombetűs kóddal vannak jelölve és Trp1 és Trp2 jelentése Trp vagy N-formil-Trp, n értéke egy egész szám, amely legalább 1.
Ez a tandem-LHRH vakcina úgy tűnt, hogy teljes mértékben gátolja a herék növekedését, és a herékben
HU 226 293 Β1 a szteroidot termelő sejtek (Leydig) fejlődését. Azonban ezen oltóanyag számos kedvezőtlen tulajdonságot mutat, ami miatt alkalmazása kevésbé előnyös. Az egyik hátrány az, hogy nagy dózisokat kell alkalmazni a vakcinálásnál ahhoz, hogy az immunkasztráció eredményes legyen; a kívánt válasz kiváltásához legalább 1 mg hatóanyagra van szükség sertésenként, ami az oltóanyag alkalmazását túlságosan költségessé teszi ahhoz, hogy a sertéstenyészetben széles körű alkalmazást nyerjen.
Ezen vakcinakészítmények egy másik lényeges hátránya az, hogy az oltóanyag csak a teljes Freund-féle adjuváns jelenlétében kellően hatásos. Ezen erélyes adjuváns azonban számos nemkívánatos mellékhatást vált ki, így például nehézséget okoz az előállítás és az alkalmazás során a vakcina viszkózus jellege, továbbá az oltóanyag beadása fájdalmas lehet az állat számára, ezenkívül az adjuvánsból visszamaradó anyagok, valamint az esetleges krónikus gyulladások által kiváltott reakciók, így például az injekció helyén az izomban fellépő tályogok a beoltott állat húsminőségét ronthatják.
Jelen találmány szerinti megoldással azonban kiküszöbölhetők a tandem-LHRH peptidekkel végzett vakcinálás fentiekben ismertetett, nemkívánatos mellékhatásai anélkül, hogy elveszítenénk a tandem-LHRH peptidekkel végzett vakcinálás előnyeit, amelyek fennállnak az LHRH-val szemben egyéb ismert vakcinákhoz viszonyítva.
Azt találtuk, hogy a tandem-LHRH vakcinának monomer alakját teljes Freund-féle adjuvánssal, de a KLH hordozófehérje nélkül alkalmazva ez teljesen hatásosnak mutatkozik a here fejlődésének és a sertéshús kan-mellékízének gátlására; ezenkívül azt találtuk, hogy a tandem LHRH vakcina dimer formáját a teljes Freund-féle adjuváns nélkül, de ehelyett egy enyhébb, nem teljes Freund-féle adjuvánst használva meglehetősen magas hatásosság érhető el. Meglepő módon azt találtuk, hogy a tandem elvet alkalmazva különböző LHRH molekuláknál, vagyis olyan vegyületeknél, amelyekben a dekapeptidben lévő hatodik aminosavat (Gly-t) egy jobbra forgató (D-) aminosawal, a D-Lysvel helyettesítve egy olyan peptidszármazékot kapunk, amelyet egy általában alkalmazott hordozóvegyülettel összekapcsolva (jelen esetben ovalbumint használtunk) olyan vakcinához jutunk, amely igen hatásos különféle enyhe adjuvánsban is, így például Specolban vagy dupla olajemulzióban, ezenkívül, ezen vakcina már alacsony dózisok beadása mellett is igen hatásosnak mutatkozott. Ámbár az esetben, ha az eredeti egyszálú LHRH dekapeptid 6-os helyzetében lévő Gly aminosavat egy D-aminosawal helyettesítjük, csökken a vakcina által előidézett immunogenitás az eredeti LHRH szekvencia hatásához hasonlítva, amennyiben azonban ezen D-aminosav szubsztitúciót egy tandemLHRH vakcinán végezzük el, úgy olyan vakcinakészítményeket kapunk, amelyek lényegesen nagyobb immunogenitást biztosítanak. Feltételezésünk szerint várható, hogy az LHRH dekapeptid egyik láncában, vagy mindkét láncában a 6-os helyzetben lévő Gly-t valamely egyéb jobbra forgató aminosawal helyettesítve szintén olyan vakcinát kaphatunk, amely kedvező tulajdonságokkal rendelkezik. Ezen túlmenően, amennyiben például D-Lys-t használunk helyettesítő aminosavként, ez lehetővé teszi a tandempeptid dimerizációját vagy multimerizációját anélkül, hogy elveszítenénk azt a lehetőséget, hogy a peptidkészítményt egy hordozóvegyülethez kapcsoljuk. Annak ellenére, hogy a C-terminális ciszteineket a diszulfidkötések révén felhasználhatjuk a dimerizációra, amikor is a cisztein már nem áll rendelkezésre egy hordozóvegyülethez való kötés céljára, azonban a helyettesítőként bevitt aminosav-oldalláncok felhasználhatók arra a célra is, hogy kötést létesítsenek egy hordozóvegyülettel. Magától értetődik, hogy ha a helyettesítést olyan egyéb aminosavakkal végezzük el, amelyek megfelelő oldalláncokat hordoznak (mint a D-Glu, de ezenkívül ismeretesek a szakember számára egyéb lehetséges aminosavhelyettesítők is, amelyek megfelelő oldalláncot hordoznak), ez további lehetőséget biztosít arra, hogy egy hordozóvegyülettel kapcsolást létesítsünk.
A [D-Lys6]-LHRH-ról leírták, hogy az egy szuperaktív LHRH agonista [Seprodi és munkatársai, J. Med. Chem., 21, 276-280 (1978)], és többek között e vegyületet alkalmazták LHRH-radioimmunológiai vizsgálatokhoz [Heber és Odell, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 158, 643-646 (1978)], továbbá fluoreszkáló ligandumként LHRH-receptor kísérletekhez [Conn és munkatársai, J. Bioi. Chem., 256, 1098-1100 (1981); Naor és munkatársai, J. Bioi. Chem., 256, 3049-3052 (1981); Childs és munkatársai, Peptides 4, 549-555 (1983)]; továbbá ezen anyagot citotoxikus csoportokhoz kapcsolták annak érdekében, hogy gátolják a rákos növekedést [Szőke és munkatársai, Peptides, 15, 359-366 (1994)]. A [D-Lys6]-LHRH-t azonban az eddigiekben nem használták LHRH-vakcina formájában.
Jelen találmány olyan peptidre vagy peptidkompozícióra vonatkozik, amelyikben legalább két LHRH szekvencia kapcsolódik össze egymást követően (tandem), amelyben az eredeti LHRH dekapeptid szekvenciában lévő hatodik Gly aminosavat egy D-aminosavval helyettesítünk. A 6-os helyzetben lévő Gly-t egy funkciós csoportot hordozó aminosav segítségével helyettesíthetjük, amely ezenkívül egy oldalláncot is hordoz, amelynek segítségével az LHRH tandemegység egy hordozóvegyülethez kapcsolható. Ez a peptid a C-terminális ponton adott esetben amidálva lehet, attól függően, milyen peptidszintézis technológiát alkalmazunk. Ezen túlmenően ezt a peptidet dimerizálhatjuk vagy multimerizálhatjuk, és ezesetben a dimerben vagy a multimerben a tandem-LHRH peptidszekvenciák közül legalább az egyik egy funkciós aminosavhelyettesítőt tartalmaz az eredeti LHRH dekapeptid 6-os helyzetében.
A találmány szerinti peptid vagy peptidkompozíció egy egymást követő szekvenciát tartalmaz, amit az alábbi általános képlettel írhatunk le:
16 21 #EHWSY*LRPQHWSY *LRPGC ahol a * jelzi a Gly lehetséges helyettesítését, ahol helyettesítőként egy jobbra forgató aminosav szerepel,
HU 226 293 Β1 amely ezenkívül egy oldalláncot tartalmaz, amelynek révén az LHRH tandemegység egy hordozóvegyülethez kapcsolható.
A találmány első jellemző vonása szerint ezen pepiidben vagy peptidkompozícióban egy helyettesítő aminosavat vagy aminosavakat vihetünk be, ahol a tandemegység LHRH dekapeptidjében lévő hatodik aminosavat, a Gly-t (vagyis a fenti általános képletben a 6-os és/vagy 16-os helyzetben) például egy D-aminosawal helyettesítjük, és ily módon olyan peptidet állítunk elő, amely kellően eltér szerkezetileg a normális LHRH szekvenciától ahhoz, hogy az immunrendszer felismerje anélkül, hogy a peptid immunogenitását elveszítené.
A találmány második jellemző vonását képezi az, hogy az egyedi tandemegységeket dimerizálva ezek immunogenitását tovább fokozhatjuk anélkül, hogy elveszítenénk azt a lehetőséget, hogy a peptidet vagy peptidkompozíciót egy hordozó fehérjevegyülethez kapcsoljuk. Ezen peptidben vagy peptidkompozícióban a tandemegységek dimerizációja történhet például a karboxilvégződés vagy az aminovégződés révén, két tandemegységet dimerizálhatunk például egy diszulfidvagy tioéterhíd segítségével. Erre a célra használható a 21-es helyzetben lévő Cys vagy pedig egy Cys-t vihetünk be az 1-es helyzetbe a glutaminsav elé, de az LHRH tandemegységek dimerizálására vagy multimerizálására használhatunk az irodalomból ismert egyéb módszereket is. Abban az esetben, ha a dimerizáció vagy multimerizáció következtében elvész az a hely, amelyen keresztül a peptidet egy hordozóvegyülethez lehetne konjugálni, elegendő a 6-os és/vagy 16-os helyzetben a Gly-t helyettesítő D-aminosavakat úgy megválasztani, hogy az megfelelő oldalláncot hordozzon. Ilyen helyettesítési célra megfelelő aminosav például a D-Lys, D-Glu vagy egyéb jobbra forgató aminosav, amely olyan oldalláncot tartalmaz, ami lehetővé teszi a hordozóvegyülettel való kapcsolódást.
Közelebbről, egy találmány szerinti előnyös peptidekre példaként szolgál egy D-Lys6-tandem-LHRH dimer, amely az alábbi képlettel írható le:
16 21 #EHWSY*LRPQHWSY *LRPGC ahol *=D-Lys #EHWSY*LRPQHWSY *LRPGC
27 37 42
A találmány szerinti előnyös peptidekre példaként említjük meg azon D-Glu6-tandem-LHRH dimert, amelyet a következő képlettel írhatunk le:
16 21 #EHWSY*LRPQHWSYGLRPGC ahol *=D-Glu
I #EHWSY*LRPQHWSYGLRPGC
27 37 42
A találmány tárgyát képezik egyéb peptidek vagy peptidkompozíciók is, amelyekben monomer, dimer vagy multímer LHRH tandemegységek vannak jelen, és amelyek D-aminosavszubsztitúciót tartalmaznak a
6-os és/vagy 16-os (mint ahogy a két utolsó példában a dimer alakban bemutattuk), és/vagy a 27 és/vagy 37-es helyzetben.
A találmány tárgyához tartozik továbbá egy olyan kompozíció, amelyre jellemző, hogy az immunogén formájú peptidet tartalmaz. A szakember számára ismeretesek olyan módszerek, amelyek segítségével egy önmagában nem immunogén anyagot hogyan lehet immunogén formává alakítani. Az egyik lehetőség szerint a találmány szerinti peptidet egy megfelelő hordozófehérjéhez kapcsoljuk. Egy tandem peptid esetében a kémiai kapcsoláshoz előnyösen használhatjuk az N- vagy C-terminális helyen lévő ciszteint. Egy tandem-dimer peptid esetében a kapcsolást oly módon is elvégezhetjük, hogy D-lysint, D-glutamint vagy ezek módosított oldalláncot hordozó származékát használjuk fel a kapcsoláshoz, de erre a célra használhatunk bármely egyéb módosított aminosavat, amely a 6-os és/vagy 16-os és/vagy 27-es és/vagy 37-es helyzetben lévő glicint helyettesíti. A szakember számára teljesen világos, hogy milyen kapcsolási módszert és milyen hordozófehérjét válasszon. A találmány egy előnyös megoldásához tartozik olyan készítmény, amelyre jellemző, hogy az egy fehérjéből, mint ovalbuminból, valamint egy találmány szerinti peptidből vagy peptidkompozícióból álló immunogén konjugátumot tartalmaz. Magától értetődő, hogy a találmány szerinti vakcinakészítményt kombinálhatjuk legalább egy immunoadjuvánssal is. A megfelelő immuno-adjuvánsok ismertek a szakember számára. A találmány szerinti megoldáshoz előnyösen alkalmazható adjuváns lehet a Specol vagy egy dupla olajos emulzió, vagy egyéb adjuváns, amely nem vált ki mellékreakciókat, vagy csak igen enyhe mellékreakciókat vált ki. A találmány szerinti vakcina alkalmazható különféle gerincesek, elsősorban emlősök LHRH elleni immunizálására. Az LHRH elleni immunizálás szolgálhat például a kisebb háziállatok, mint hím és nőstény macskák és kutyák sterilezésére, vagy pedig hím kutyák vagy bikák agresszivitásának kezelésére. Más ok, ami miatt a találmány szerinti vakcinával az LHRH elleni immunizálás szükségessé válhat, az az, hogy nőstény állatoknál, mint kutyáknál, macskáknál és teheneknél gátoljuk a párzás iránti készséget, vagy pedig a levágás céljából hizlalt hím állatoknál jelentkező nyugtalanságot kezeljük. A humán egészségvédelemben az LHRH elleni immunizálást alkalmazhatjuk prosztatarák, mellrák vagy szükség esetén az agyfüggelék karcinóma némely alakjának kezelésére.
A találmány egy előnyös megoldását képezi a sertéshús minőségének javítása, ahol is a sertéseket egy találmány szerinti vakcinakészítménnyel oltunk be. A találmány szerinti megoldást az alábbi példákkal szemléltetjük.
Példák
Hím sertések eredményes vakcinálásának tekintjük azt az esetet, amikor az állatok levágásánál a herék súlya kevesebb 150 g-nál. A beoltás célja, hogy a kezelt csoporton belül mindegyik állatnál észlelhetően kisméretű herék fejlődjenek ki. A here nagysága közvetlen összefüggésben áll a tesztoszteronképződéssel és a kan-mellékízt adó szteroidok képződésével. Amennyi5
HU 226 293 Β1 ben a herék tömege 60 g-nál kevesebb, úgy a herék hisztológiai szempontból teljesen inaktívak [Meloen és munkatársai, Vaccina, 12, 741-746 (1994)], és az állat szérumában nem mutatható ki tesztoszteron jelenléte. Már ismertetve lett az, hogy szoros összefüggés található a herék mérete és különösen tömege, valamint a hátulsó zsírréteg androsztenon tartalma között [Oonk és munkatársai, Livest. Prod. Sci., 42, 63-71 (1995)]. Úgy tűnik, amennyiben az immunizált állatok heréje 150 g-nál kevesebb tömegű, nem lép fel kan-mellékíz. A közölt kísérleteknél a hátulsó zsírrétegben általában igen alacsony, nem észlelhető koncentrációban androsztenon volt jelen, de amennyiben jelen volt, ennek koncentrációja mindig alacsonyabb volt 0,5 pg/g-nál, a hátsó zsírréteg tömegére számítva. Az irodalomban ezt az értéket jelölték meg, mint biztonságos alsó határértéket, amelynél a kan-mellékíz még nem jelentkezik, noha egyéb közleményekben megfelelő alacsony értéknek tekintik az 1 pg/g zsírkoncentrációt Is. Megoldásunknál a fenti alacsonyabb értéket tekintjük alsó határértéknek, amely alatt - úgy véljük - a sertés eredményesen lett immunokasztrálva. Ezen összefüggést több mint 100 sertés esetében állapítottuk meg. A kontroll állatok here tömege kísérleteink során 200 és 350 g között volt. Azt találtuk továbbá, hogy az immunokasztrált állatok esetében a tápanyag konverziója, valamint a hús/zsír arány kedvezőbb volt, mint a fiatal korban sebészetileg kasztrált állatoknál (ártány).
Vizsgálati módszerek
Peptidszintézist végeztünk ABI 430 A típusú peptidszintetizáló berendezéssel FastMoc ciklust alkalmazva 0,25 mmol szinten, ahol a ciklusidő mintegy 60 perc [Fields CG, Llyod DH, MacDonald RL, Otteson KM, Noble RL HBTU aktiválás automatikus Fmoc szilárd fázisú peptidszintézis; Peptide Research 4, 95-101 (1991); User Bulletin #32, Applied Biosystems (1990)].
Peptidtisztltás: A tisztítást Waters PrepLC4000 típusú rendszerrel végezzük, amely fel van szerelve Waters PrepPak Cartridge (25 mm* 100 mm) oszloppal (ahol töltésként Delta-Pak C18 15 pm, 100 A szolgál) és egy tartalék oszloppal.
Az analitikai HPLC vizsgálatokhoz két 510 típusú Waters-szivattyút, 680 típusú Waters-féle gradiensszabályozót, WISP 712 típusú Waters-féle autoinjektort, valamint 991-es típusú Waters-féle fotodioda-elrendezésű detektort használtunk. A termékeket lineáris gradienssel analizáljuk, erre a célra 0,1% TFA-60% acetonitriltartalmú vizet és 0,1% TFA-tartalmú vizet engedünk át 60 percig Waters Delta Pák C18-100A (3,9*150 mm, 5 pmol) oszlopon 1 ml/perces átfolyási sebességgel, 215 nm-nél végezzük a méréseket. Mindegyik termék több mint 95%-os tisztaságot mutatott a csúcs alatti felszínt alapul véve.
Aminosavanalízist végzünk Waters-féle PicoTag rendszerrel. Az eredmények összhangban voltak az aminosavszekvenciák alapján várt értékekkel.
Dimerizálási művelet: A terméket oly módon dimerizáljuk, hogy a terméket 20%-os dimetil-szulfoxidtartalmú vízben feloldjuk. A pH-t 5-6-os értékre állítjuk 1%-os vagy 2%-os NH4HCO3 segítségével. Az oldat a művelet alatt tiszta kell maradjon. A túlságosan magas pH-t 1-10% ecetsavoldat hozzáadásával korrigáljuk. Az elegyet szobahőmérsékleten legalább 5 óra hosszat keverjük. A kapott terméket HPLC közvetlen alkalmazásával tisztítjuk.
Konjugálás: D-Lys6-tandem-dimert ovalbuminnal konjugálunk: (az alkalmazandó tömegekvivalensek·. 1 mg ovalbumint és 1 mg D-Lys6-tandem-dimert kapcsolunk 10 mg ECDI-vel milliQ-vízben). Először a peptidet és az ovalbumint külön-külön milliQ-vízben feloldjuk (A=peptidoldat; B=ovalbuminoldat). Az A és B oldatokat alaposan elkeverjük. A következő lépésben 10-szeres feleslegben (a tömegekvivalensre számítva) karbodiimidet (ECDI) oldunk fel milliQ vízben (C=ECDIoldat). Ezt követően a C oldatot lassan az A+B oldathoz adjuk állandó keverés közben. 6 óra eltelte után a terméket dializáljuk (móltömeg levágás 10 000-nél) vízzel szemben.
A töltés meghatározása: A konjugátum töltését összehasonlító aminosavanalízis alapján állapítjuk meg, külön-külön mérve a peptid és a hordozófehérje töltését. Az aminosavanalízis szerint a konjugátum mintegy 0,5 mg peptidet tartalmaz 1 mg ovalbuminra számítva.
Vakcina előállítása: Vakcinát állítunk elő a peptidet adjuvánssal elegyítve (a részleteket lásd a Specollal kapcsolatos résznél).
Adjuvánsok: A vizsgálatokhoz teljes Freund-féle adjuvánst (CFA), nem teljes Freund-féle adjuvánst (IFA), Specol olajat, valamint dupla emulziós olajat (d.o.e.) használunk.
- CFA-t vagy IFA-t elegyítünk peptid oldattal 1:1 arányban, így stabil emulziót kapunk.
- Dupla emulziós olaj (víz/olaj/víz):
rész első vízfázis: antigén PBS-ben (foszfátpuffer-tartalmú sóoldatban) rész olajfázis: Marcol 52 (Esso) 10% mannidmonooleáttal („Arlacel”).
rész második vízfázis: PBS 2% Montanox 80-nal (=Tween 80).
- Specol (speciális olajfázis): olyan termék, amely alkalmas a kutatási célokra szánt víz-az-olajban emulziók előállítására.
összetétel: 10 ml-re számítva: 0,453 g Tween 85 (ICI), 0,532 g Span 85 (ICI), 9 ml Marcol 52 (Esso Belgium).
Emulzió előállítása Specollal: 4 rész antigéntartalmú vízfázist 5 rész Specollal elegyítünk (térfogat/térfogat), a vizes fázist igen lassan az olajfázishoz (Specol) adjuk, miközben az elegyet erélyesen keverjük, így például ultraturraxszal (az örvényléssel végzett keverés túl enyhe). Amennyire lehetséges, a levegő beáramlását el kell kerülni. Felületaktív anyagoktól mentes tiszta üvegedényeket kell alkalmazni.
Tárolás: A Specolt előnyösen 4-8 °C hőmérsékleten tartjuk [referenciák: Bokhout B. A. és munkatársai: Vet. Immunoi. Immunopathol., 2, 491-500 (1981); Hall W. és munkatársai: Vet. Immunoi. Immunopathol., 22,
HU 226 293 Β1
175-186 (1989); Boersma W. J. A. és munkatársai: Rés. Immunoi., 143, 503-511 (1992)].
Vakcinálási eljárás: Minden egyes vakcina számára állatonként 1 mg peptidet (a töltés alapján számítva) vagy szükség esetén ennél kisebb mennyiséget (ahol a peptidet a fentiek szerint állítottuk elő) 1 ml foszfátpuffer-tartalmú sóoldatban (PBS) feloldunk, és a jelzett adjuvánssal emulgeáljuk. A kísérlet kezdetén az intakt hím sertések mintegy 10 hetesek, ekkor kapják az első oltást; az első vakcina beadása után 8 hét elteltével az állatok ugyanolyan összetételű emlékeztető vakcinát kapnak.
Értékelés: A sertések heréinek méretét mérő körző segítségével kívülről állapítjuk meg. Az első vakcina beadása után mintegy 12 hét elteltével a herék mérete nem nő tovább (vagy éppen csökken) azoknál a sertéseknél, amelyeknél az LHRH koncentráció alacsony. Szérummintákat veszünk az anti-LHRH titer és a tesztoszteronszint meghatározására. A GnRH-val szembeni antitesteket oly módon határozzuk meg, hogy a sertés antiszérum széria hígításait 125LHRH-hoz kötjük. Az első vakcina beadását követő 16 hét eltelte után az állatokat leöljük. A leölés után a herék tömegét megmérjük, a hátulsó zsírból mintát veszünk a kanízt okozó androsztenonszteroid meghatározására; e művelethez ELISA (Ridascreen) módszert használjuk. Ezenkívül értékeljük a hús minőségét.
1. kísérlet
Ezen kísérletekben különféle peptidszerkezeteket vizsgálunk nem konjugált alakban. Minden egyes peptidet kétszer adjuk 10 és 18 hetes korban lévő állatoknak, a peptid mennyisége 1 mg, IFA adjuvánst használunk. A vizsgált peptidszerkezetek: a karboxl-végcsoporton dimerizált LHRH monomer, karboxi-végcsoporton dimerizált LHRH tandem, amino-végcsoporton dimerizált LHRH-tandem, karboxi-végcsoporton dimerizált [D-Nal(2)6]-LHRH (Nafarelin®)-monomer, karboxivégcsoporton dimerizált [D-Nal (2)6]-LHRH (Nafarelin®)-tandem karboxi-végcsoporton dimerizált [D-Lys6]LHRH-monomer és karboxi-végcsoporton dimerizált [D-Lys6]-LHRH-tandem.
1) A C-monomer-LHRH-dimer peptid képlete:
11 pEHWSYGLRPGC
I pEHWSYGLRPGC
22
2) A C-tandem-LHRH-dimer peptid képlete:
21 pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
I pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
42
3) Az N-tandem-LHRH-dimer peptid képlete:
21
CQHWSYGLRPGQHWSYGLRPG@
I
CQHWSYGLRPGQHWSYGLRPG@
42
4) A [D-Nal(2)6]-monomer-LHRH-dimer peptid képlete:
11 pEHWSQ*LRPGC ahol *=[3-(2-naftalenil)-D-alanin] I pEHWSQ*LRPGC
17 22
5) A [D-Nal(2)6]-tandem-LHRH-dimer peptid képlete:
16 21 pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC ahol *=[3-(2-naf| talenil)-D-alanin] pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC
27 37 42
6) A [D-Lys®]-monomer-LHRH-dimer peptid képlete:
11 pEHWSQ*LRPGC ahol *=[D-lizin]
I pEHWSQ*LRPGC
17 22
7) A [D-Lys6]-tandem-LHRH-dimer peptid képlete:
16 21 pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC ahol *=[D-lizin] pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC 22 27 37 42
| Antigén | Sertések száma, amelyeknél a here tömege <150 g/csoport nagysága | Heretömeg (átlag ±s.d.) |
| 1) C-monomer-LHRHdimer | 0/7 | 294±44 |
| 2) C-tandem-LHRH-dimer | 5/7 | 92±105 |
| 3) N-tandem-LHRH-dimer | 6/7 | 88±57 |
| 3) N-tandem-LHRH-dimer | 6/8 | 72±89 |
| 4) [D-Nal(2)6]-monomer-LHRH-dimer | 2/7 | 177±69 |
| 5) [D-Nal(2)6]-tandemLHRH-dimer | 0/7 | 248±56 |
| 6) [D-Lys6]-monomerLHRH-dimer | 2/7 | 190±44 |
| 7) [D-Lys6]-tandemLHRH-dimer | 5/7 | 103±102 |
A 2., 3. és a 7. csoportban az állatok 70-80%-ánál eredményesnek mutatkozott az immunokasztrálás. Ezeknél a kezelésre jól reagáló állatoknál 86 g volt a legnagyobb heresúly, ezzel szemben azoknál az állatoknál, amelyek nem reagáltak, a here tömege 193 g vagy ennél több volt. Ezekből az eredményekből arra lehet következtetni, hogy a teljes Freund-féle adjuvánst nem teljes Freund-féle adjuvánssal helyettesítve olyan
HU 226 293 Β1 készítményben, ahol nem konjugált peptid van jelen, az a hatás csökkenéséhez vezet. Ezen túlmenően az eredményekből kitűnik először, hogy a vakcina hatásossága szempontjából a tandem kialakítása elengedhetetlen, másodsorban, hogy a dimerizácló egyaránt elvégezhető a karboxi-végcsoporton vagy az aminovégcsoporton, harmadszor, nem minden aminosavszubsztitúció lehetséges, tekintetbe véve a Nafarelin®analógnak a vakcina formájában mutatott hatástalanságát.
2. kísérlet
Már ismert, hatásos vakcinát vizsgálunk, amelyben egy tandem-LHRH peptid van hemocianinhoz kapcsolva (KLH), és ahol adjuvánsként CFA van jelen az első, majd IFA adjuváns a második vakcinálásnál; a vizsgálatot elvégeztük hordozófehérjéhez való konjugálás nélkül is, monomer és dimerizált alakban, CFA/IFA adjuvánssal és 2*IFA adjuvánssal, 1 mg és 100 pg dózis5 bán. A sertéseket kétszer oltottuk be 10 és 18 hetes korukban.
1) A tandem-LHRH peptid képlete:
21 pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
2) A tandem-LHRH-dimer-peptid képlete:
21 pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
I pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC
22 42
| Antigén | Sertések száma, amelyeknél a here tömege <150 g/csoport nagysága | Here tömege (átlag ±s.d.) | LHRH-Ab titer 8 wpv-nél | ||
| adjuváns | dózis | ||||
| 1) Tandem-LHRH | CFA/IFA | 1 mg | 6/6 | 38±23 | |
| 1) Tandem-LHRH | CFA/IFA | 1 mg | 6/6 | 24±6 | |
| 1) Tandem-LHRH | CFA/IFA | 1 mg | 6/6 | 41 ±27 | |
| 1) Tandem-LHRH | CFA/IFA | 1 mg | 11/11 | 39±14 | 17,8±11,5 |
| 2) Tandem-LHRH-dimer | CFA/IFA | 1 mg | 10/11 | 67±64 | 16,7±5,9 |
| 1) Tandem-LHRH | CFA/IFA | 100 pg | 7/12 | 121±92 | 12,6±5,9 |
| 2) Tandem-LHRH-dimer | CFA/IFA | 100 pg | 6/12 | 132±86 | 9,8±5,2 |
| 1) Tandem-LHRH | 2xlFA | 100 pg | 5/13 | 172±92 | 3,5±4,6 |
| 2) Tandem-LHRH-dimer | 2xlFA | 100 pg | 1/13 | 220±55 | 4,6±5,4 |
A Tandem-LHRH vakcina monomer vagy dimerizált 35 alakban egyaránt lényegében teljes mértékben hatásos akkor is, ha a KLH hordozófehérje nincs jelen, e vakcina eredményesen gátolja a herék növekedését és a kaníz kifejlődését sertéseknél. Azonban ezen vakcinának számottevő hátránya az, hogy az igen magas 40 hatásosság csak akkor biztosítható, ha olyan készítményt használunk, amely teljes Freund-féle adjuvánssal készült, és a vakcinát magas dózisban adjuk be. Ezen túlmenően megfelelő anti-LHRH Ab titereket (amit az oltás utáni 8 héten levett szérum-kötődés szá- 45 zalékában fejezünk ki) csak a tandem-LHRH vagy tandem-LHRH dimernek CFA/IFA adjuvánssal készült 1 mg-os dózisával lehetett elérni.
3. kísérlet 50
Egy hordozófehérjével végzett konjugálás hatását vizsgáltuk az IFA adjuváns helyettesítésével is kombinálva, ahol az IFA adjuvánst az enyhébb Specol adjuvánssal és dupla olajemulzióval (d. o. e.) helyettesítettük. Olyan dimerizált tandem-LHRH peptidet, amelynél 55 a 6-, 16-, 27- és 37-es helyzetben glicint D-llzinnel helyettesítettük, ovalbuminhoz konjugáltuk, és két különböző adjuvánssal, Specollal és dupla olajemulzióval emulgeáltuk. Sertéseket 10 és 18 hetes korukban kétszer vakcináitok, esetenként 1 mg peptidkonjugátumot 60 adjuvánssal adva. A kapcsolódás hatásossága 50%-os, ezért a beadott antigónmennyiség a valóságban 500 pg.
A [D-Lys3 * * 6]-tandem-LHRH-dimer peptid képlete: 16 16 21 pEHWSY*LRPQHWSY *LRPGC ahol *=[D-lizin] pEHWSY*LRPQHWSY *LRPGC
27 37 42
| Antigén | Sertések száma, amelyeknél a here tömege <150 g/csoport nagysága | Heretömeg (átlag ±s.d.) |
| 1) [D-Lys6]-tandemLHRH-dimer-ova Specolban | 9/9 | 19±12 |
| 2) [D-Lyse]-tandemLHRH-dimer-ova d. o. e.-ben | 8/8 | 43±46 |
Egy általában alkalmazott hordozófehérjéhez történő konjugálás nagymértékben fokozza a vakcina hatásosságát még az esetben is, ha igen enyhe adjuvánst használunk.
HU 226 293 Β1
4. kísérlet
Ezt követően nagyszámú kísérlettel ellenőrizzük, milyen mértékben lehetne a beadott dózist csökkenteni. Peptid antigénként [D-Lys6]-tandem-LHRH-dimer szolgál. Ezt ovalbuminhoz kapcsoljuk, és a konjugátumot Specol adjuvánssal készült emulzió formájában adjuk be. A vizsgálati sertéseket kétszer vakcináljuk, 10 és 18 hetes korukban.
| Dózis (pg konjugátum) | Sertések száma, amelyeknél a herék tömege <150 g/cso port nagysága | Herék tömege (átlag ±s.d.) | LHRH titer 12 wpv-nél | |
| A. | 1000 | 9/9 | 19±12 | 46,5±5,1 |
| B. | 1000 | 8/8 | 43±46 | 28,7±3,0 |
| C. | 1000 | 7/8 | 60±62 | 44,1±11,4 |
| D. | 900 | 11/11 | 46±38 | 24,4±4,4 |
| D. | 500 | 7/9 | 65±69 | 36,3±14,3 |
| D. | 300 | 11/11 | 29±18 | 28,0±3,2 |
| E. | 300 | 15/15 | 24±18 | 35,3±4,2 |
| C. | 250 | 9/9 | 32±12 | 45,1 ±8,6 |
| C. | 125 | 8/8 | 42±42 | 44,9±12,0 |
| F. | 125 | 12/12 | 35±37 | 27,8±3,6 |
| G. | 125 | 10/10 | 21±12 | 26,5±3,1 |
| H. | 125 | 6/6 | 12±2 | n.d. |
| K. | 125 | 7/7 | 31 ±22 | 29,5±5,1 |
| D. | 100 | 9/10 | 62±58 | 23,2±6,7 |
| D. | 30 | 10/11 | 53±65 | 25,6±7,4 |
| E. | 30 | 13/15 | 61 ±75 | 32,5±5,2 |
| D. | 10 | 9/11 | 78±86 | 22,9±7,8 |
| E. | 3 | 6/15 | 207±117 | 21,3±9,7 |
[D-Lys6]-tandem-LHRH-dimer-ovalbumin konjugátumot Specol adjuvánsban alkalmazva a szükséges vakcinadózis nagysága lényegesen csökkenthető volt. 43 sertést oltottunk be 125 pg konjugátummal (=62,5 pg peptid), e hatásosság 100%-osnak bizonyult. Azon sertéseknél, amelyeknél a herék tömege 150 g-nál kisebb volt, a hátsó zsírrész androsztenontartalma egy esetben sem volt több, mint 0,5 pg androsztenon/g zsír [Oonk és munkatársai, Livest. Prod. Sci., 42, 63-71 (1995)]; a legtöbb esetben az androsztenonkoncentráció értékek az észlelhető határ alatt vannak ELISA módszerrel ellenőrizve (0,111 pg/g zsír). Amennyiben 10-100 pg konjugátumdózisokat adunk be, fennáll annak a veszélye, hogy nem reagáló állatok lesznek a vizsgált csoportokban, a 10 pg-nál alacsonyabb dózisok pedig hatástalanok. Az anti-LHRH antitesttiterek csak egy kísérleten belül hasonlíthatók össze. Az eredmények azt mutatják, hogy alacsony dózisú vakcina esetében ugyanolyan titereket lehet előhívni, mint magas dózisokkal, ellentétben azokkal az eredményekkel, amelyeket a tandem-LHRH-val vagy tandem-LHRH-dimerrel kaptunk. A vakcinára nem teljes mértékben reagáló, vagy nem reagáló sertések esetében egy kísérleten belül alacsonyabb átlag titereket és magasabb standard eltéréseket kaptunk.
5. kísérlet
Az intakt sertések kontrollcsoportjában meghatároztuk a herék tömegét és az androsztenonkoncentrációt. Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaljuk össze:
| Szám | Herék tömege (átlag ±s.d.) | Androsztenon (pg/g zsír) | |
| 1. | 10 | 217±38 | 0,68±0,42 |
| 2. | 6 | 233±41 | 2,04±1,55 |
| 3. | 5 | 231±58 | 2,05±0,70 |
Mint már korábbról ismert [Oonk és munkatársai, Livest. Prod. Sci., 42, 63-71 (1995)] az androsztenonkoncentráció erősen változik az intakt kifejlődött hím sertés egyedeknél.
Claims (15)
1. Legalább két, egymással összefüggő LHRH dekapeptidszekvenciát tartalmazó peptid, amelyben az egymással összefüggő LHRH dekapeptidek legalább egyik láncában a 6-helyzetben lévő glicin aminosav egy oldalláncot tartalmazó jobbra forgató aminosawal van helyettesítve, ahol az oldallánc egy hordozóvegyülethez kapcsolható.
2. Az 1. igénypont szerinti peptid, amely a következő szerkezetű aminosavszekvenciát tartalmazza: 16 16 21 #EHWSY*LRPQHWSY *LRPGC ahol a 6-os vagy 16-os helyzetben lévő *-gal jelölt aminosav jobbra forgató, és egy hordozóvegyülethez kapcsolható oldalláncot tartalmaz, és a másik *-gal jelölt aminosav glicin vagy egy jobbra forgató aminosav, amely egy hordozóvegyülethez kapcsolható oldalláncot tartalmaz és #E jelentése piroglutaminsav.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti peptidek, amelyek dimerizálva vagy multimerizálva vannak.
4. A 3. igénypont szerinti peptid, amelynek szerkezete
16 16 21 #EHWSY*LRPQHWSY *LRPGC I #EHWSY*LRPQHWSY *LRPGC
22 27 37 42 ahol a 6-os vagy 16-os vagy 27-es vagy 37-es helyzetben lévő *-gal jelölt aminosav D-lizin vagy D-glutamin vagy egy egyéb jobbra forgató aminosav, amely egy hordozóvegyülethez kapcsolható oldalláncot tartalmaz, és ahol a másik *-gal jelölt aminosav glicin vagy D-lizin vagy D-glutamin vagy egyéb jobbra forgató aminosav,
HU 226 293 Β1 amely egy hordozóvegyülethez kapcsolható oldalláncot tartalmaz és #E jelentése piroglutaminsav.
5. A 3. igénypont szerinti peptid, amelynek szerkezete:
17 17 21
CQHWSY*LRPGQHWSY*LRPG
I
CQHWSY*LRPGQHWSY* LRPG
22 28 38 42 ahol a 7-es vagy 17-es vagy 28-as vagy 38-as helyzetben lévő *-gal jelölt aminosav D-lizin vagy D-glutamin vagy egyéb, jobbra forgató aminosav, amely egy hordozóvegyülethez kapcsolható oldalláncot tartalmaz, és ahol a másik *-gal jelölt aminosav glicin vagy D-lizin vagy D-glutamin vagy egyéb, jobbra forgató aminosav, amely egy hordozóvegyülethez kapcsolható oldalláncot tartalmaz.
6. Kompozíció, amely egy az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti peptidet tartalmaz egy hordozóvegyülethez kapcsolva.
7. A 6. igénypont szerinti kompozíció, amely hordozóvegyülétként fehérjét tartalmaz.
8. A 7. igénypont szerinti kompozíció, amely hordozóvegyületként KLH-t vagy ovalbumint tartalmaz.
9. A 6-8. igénypontok bármelyike szerinti kompozíció, amely enyhe adjuvánst is tartalmaz.
10. A 9. igénypont szerinti kompozíció, amely enyhe adjuvánsként egy „víz az olajban” típusú emulzió vagy kettős olaj típusú emulzió olaj fázisát tartalmazza.
11. Vakcina, amely a 6-10. igénypontok bármelyike szerinti kompozíciót tartalmaz.
12. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti kompozíció alkalmazása vakcina előállítására.
13. A 12. igénypont szerinti alkalmazás, amelynél hatásos mennyiségként mintegy 1 mg-nál kisebb dózist használunk.
14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti alkalmazás, amelynél állatok egy vagy több szaporodási vagy viselkedési jellemzőjére ható vakcinát állítunk elő.
15. A 12. vagy 13. igénypont szerinti alkalmazás, amelynél sertések immunokasztrálására szolgáló vakcinát állítunk elő.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47729895A | 1995-06-07 | 1995-06-07 | |
| US47601395A | 1995-06-07 | 1995-06-07 | |
| PCT/NL1996/000223 WO1996040755A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-06-06 | An improved peptide, immunogenic composition and vaccine or medical preparation, a method to immunise animals against the hormone lhrh, and analogs of the lhrh tandem repeat peptide and their use as vaccine |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0001431A2 HUP0001431A2 (hu) | 2001-02-28 |
| HUP0001431A3 HUP0001431A3 (en) | 2001-09-28 |
| HU226293B1 true HU226293B1 (en) | 2008-08-28 |
Family
ID=27045028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0001431A HU226293B1 (en) | 1995-06-07 | 1996-06-06 | An improved peptide, immunogenic composition and vaccine or medical preparation, a method to immunise animals against the hormone lhrh , and analogs of the lhrh tandem repeat peptide and their use as vaccine |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0832107B1 (hu) |
| JP (1) | JP3959746B2 (hu) |
| KR (1) | KR100335320B1 (hu) |
| CN (1) | CN1159338C (hu) |
| AT (1) | ATE205219T1 (hu) |
| AU (1) | AU710778B2 (hu) |
| BR (2) | BRPI9609411B8 (hu) |
| CA (1) | CA2221129C (hu) |
| DE (1) | DE69615026T2 (hu) |
| DK (1) | DK0832107T3 (hu) |
| ES (1) | ES2163631T3 (hu) |
| HK (1) | HK1014963A1 (hu) |
| HU (1) | HU226293B1 (hu) |
| MX (1) | MX9709669A (hu) |
| RU (1) | RU2147307C1 (hu) |
| WO (1) | WO1996040755A1 (hu) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6761890B1 (en) | 1995-06-07 | 2004-07-13 | Pepscan Systems B.V. | Peptide, immunogenic composition and vaccine or medical preparation, a method to immunize animals against the hormone LHRH, and analogs of the LHRH tandem repeat peptide and their use as vaccine |
| AUPO776897A0 (en) | 1997-07-09 | 1997-07-31 | Csl Limited | A method of achieving production gains in livestock and agents useful for same |
| US6013770A (en) * | 1997-07-21 | 2000-01-11 | Washington State University | Chimeric contraceptive vaccines |
| US8709998B2 (en) | 2003-04-22 | 2014-04-29 | Ipsen Pharma S.A.S. | Peptide vectors |
| GB0329146D0 (en) * | 2003-12-16 | 2004-01-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| WO2007093373A2 (en) * | 2006-02-14 | 2007-08-23 | Università Degli Studi Di Siena | Branched multimeric peptides for tumor diagnosis and therapy |
| AT508569A1 (de) * | 2009-07-23 | 2011-02-15 | Affiris Ag | Pharmaceutical compound |
| TWI418362B (zh) * | 2010-11-19 | 2013-12-11 | Univ Nat Pingtung Sci & Tech | 溶血性巴斯德桿菌重組外膜脂蛋白e及含此之疫苗組成物 |
| EP2703483A1 (en) | 2012-08-29 | 2014-03-05 | Affiris AG | PCSK9 peptide vaccine |
| ITBO20130129A1 (it) * | 2013-03-27 | 2014-09-28 | Gd Spa | Articolo da fumo |
| CN103554228B (zh) * | 2013-11-11 | 2016-05-04 | 宁波市三生药业有限公司 | 一种GnRH去势疫苗及并列体 |
| RU2745720C2 (ru) * | 2014-07-25 | 2021-03-31 | Юнайтед Байомедикал, Инк. | Иммуногенная композиция lhrh и ее применение у свиней |
| CN107449924B (zh) * | 2017-10-12 | 2019-03-19 | 华派生物工程集团有限公司 | 一种鸡免疫去势效果的判定方法 |
| BR102018068504A2 (pt) * | 2018-09-12 | 2021-11-16 | Ouro Fino Saúde Animal Ltda | Polipeptídeo quimérico antigênico, construção gênica e composição antigênica para imunocastração de mamíferos não humanos |
| KR102477054B1 (ko) * | 2020-03-24 | 2022-12-14 | 주식회사 바이오앱 | 웅취 제거용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8713240D0 (en) * | 1987-06-05 | 1987-07-08 | Proteus Biotech Ltd | Hormones |
| NL8900726A (nl) * | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Stichting Centr Diergeneeskund | Peptide, immunogene samenstelling en vaccin- of geneesmiddelpreparaat; werkwijze voor het immuniseren van een zoogdier tegen lhrh, en werkwijze voor het verbeteren van de vleeskwaliteit van varkens. |
| GB2282813A (en) * | 1993-10-15 | 1995-04-19 | Merck & Co Inc | Annular antigen scaffolds comprising thioether linkages |
-
1996
- 1996-06-06 KR KR1019970709019A patent/KR100335320B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-06-06 WO PCT/NL1996/000223 patent/WO1996040755A1/en active IP Right Grant
- 1996-06-06 EP EP96916372A patent/EP0832107B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-06 BR BRPI9609411A patent/BRPI9609411B8/pt unknown
- 1996-06-06 RU RU98100226A patent/RU2147307C1/ru active
- 1996-06-06 CA CA002221129A patent/CA2221129C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-06 CN CNB961946091A patent/CN1159338C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-06 JP JP50032397A patent/JP3959746B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-06 HU HU0001431A patent/HU226293B1/hu unknown
- 1996-06-06 AU AU59130/96A patent/AU710778B2/en not_active Expired
- 1996-06-06 DK DK96916372T patent/DK0832107T3/da active
- 1996-06-06 BR BR9609411-7A patent/BR9609411A/pt active IP Right Grant
- 1996-06-06 DE DE69615026T patent/DE69615026T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-06 ES ES96916372T patent/ES2163631T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-06 AT AT96916372T patent/ATE205219T1/de active
-
1997
- 1997-12-05 MX MX9709669A patent/MX9709669A/es unknown
-
1999
- 1999-01-07 HK HK99100064A patent/HK1014963A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0832107B1 (en) | 2001-09-05 |
| KR19990022538A (ko) | 1999-03-25 |
| JP3959746B2 (ja) | 2007-08-15 |
| HK1014963A1 (en) | 1999-10-08 |
| AU5913096A (en) | 1996-12-30 |
| BRPI9609411B8 (pt) | 2020-05-12 |
| BR9609411A (pt) | 1999-12-14 |
| ES2163631T3 (es) | 2002-02-01 |
| JP2002504886A (ja) | 2002-02-12 |
| ATE205219T1 (de) | 2001-09-15 |
| CA2221129C (en) | 2002-09-17 |
| CA2221129A1 (en) | 1996-12-19 |
| HUP0001431A2 (hu) | 2001-02-28 |
| EP0832107A1 (en) | 1998-04-01 |
| DE69615026T2 (de) | 2002-02-14 |
| CN1159338C (zh) | 2004-07-28 |
| MX9709669A (es) | 1998-10-31 |
| CN1187200A (zh) | 1998-07-08 |
| WO1996040755A1 (en) | 1996-12-19 |
| DK0832107T3 (da) | 2001-11-19 |
| HUP0001431A3 (en) | 2001-09-28 |
| DE69615026D1 (de) | 2001-10-11 |
| KR100335320B1 (ko) | 2002-09-13 |
| AU710778B2 (en) | 1999-09-30 |
| RU2147307C1 (ru) | 2000-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0181236B1 (en) | Lhrh analogues useful in stimulating anti-lhrh antibodies and vaccines containing such analogues | |
| EP0464124B1 (en) | A peptide, immunogenic composition and vaccine or medicinal preparation; a method of immunising a mammal against lhrh, and a method of improving the meat quality of pigs | |
| RU2147307C1 (ru) | Улучшенный пептид, иммуногенная композиция и вакцина с его использованием, способ иммунизации животных против гормона лгвг | |
| USRE39048E1 (en) | Peptide, immunogenic composition and vaccine or medical preparation, a method to immunise animals against the hormone LHRH, and analogs of the LHRH tandem repeat peptide and their use as vaccine | |
| US5484592A (en) | Peptide, immunogenic composition and vaccine or medicinal preparation: a method of immunising a mammal against LHRH, and a method of improving the meat quality of pigs | |
| US7361349B2 (en) | Peptide, immunogenic composition and vaccine or medical preparation, a method to immunize animals against the hormone LHRH, and analogs of the LHRH tandem repeat peptide and their use as vaccine | |
| JPH11515013A (ja) | 合成複合ワクチンの免疫原性担体としてのシュードモナスエクソトキシン | |
| AU2001294395B2 (en) | Discrimination between GnRH-I and GnRH-II | |
| Ayalew | A review on the effect of immunocastration against gonadal physiology and boar taint. | |
| WO1997015316A1 (en) | Conjugates of gonadotropin releasing hormone | |
| AU2001294395A1 (en) | Discrimination between GnRH-I and GnRH-II | |
| JPH11514380A (ja) | ＧｎＲＨ／シュードモナス還元型菌体外毒素結合体 | |
| NZ215999A (en) | Vaccine for inducing antibodies to lhrh |