CN102119033B - 用于增强促生长素抑制素免疫原性的组合物和方法 - Google Patents

用于增强促生长素抑制素免疫原性的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供在需要的患者中治疗生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷的组合物和方法。组合物和方法包括新的疫苗，其提供促生长素抑制素的免疫原性并引起内源性产生的生长激素和/或胰岛素样生长因子1的释放增加。

Description

用于增强促生长素抑制素免疫原性的组合物和方法
相关申请
本申请与PCT专利申请系列号PCT/US08/68195有关，其标题为“Chloramphenicol Acetyl Transferase(CAT)-Defective Somatostatin FusionProtein and Uses Thereof”，2008年6月25日提交，为了全部目的援引加入本文。
技术领域
本发明涉及患有生长激素(GH)和/或胰岛素样生长因子1(IGF-1)缺陷的患者的治疗。更具体地，本发明涉及通过使用基于促生长素抑制素的抗原/佐剂疫苗对患有GH和/或IGF-1缺陷的患者的治疗以及涉及所述治疗的组合物和方法。
背景
自从18世纪晚期(1798年的天花疫苗)实施利用疫苗预防传染病，包括使用疫苗预防脊髓灰质炎、乙肝和流感。近来，疫苗还被确定用于治疗癌症，其中疫苗诱导患者的免疫系统识别并破坏靶肿瘤细胞，即治疗乳腺癌、结肠癌、皮肤癌等。由于使用患者自身免疫系统击败侵入或致癌物质的益处，正在开发用于疫苗治疗的其他新的和有用的靶。大部分情况下，疫苗包括所需免疫针对的抗原和佐剂以增强疫苗受体针对该抗原的应答。
生长激素是由前叶垂体合成和释放的191个氨基酸的多肽激素。生长激素通常被认为是合成代谢激素，是儿童的生长/身高，钙保留(骨强度)的增加，脂解作用的促进，蛋白合成的增加，肝脏中糖异生的促进及其他类似功能所需要的。患有内源性生长激素缺陷的患者通常具有较低的骨密度，减弱的瘦体质，减少的能量以及其他类似的全身症状。
当前，患有生长激素缺陷的患者用生长激素替代法进行治疗，通常使用在遗传工程化的细菌中表达的重组生长激素。这些治疗方案通常是非常昂贵的(估计范围从$10,000到$30,000每年)且依赖于激素的外源替代(每天注射是典型的，经常跨越18个月到患者一生)。结果，对于患有生长激素缺陷的患者来说需要新的、非外源的、长效的和花费较少的疗法。
此外，对于治疗需要额外的、高于基准水平的生长激素的患者(例如这些患者经常需要额外的生长激素用于治疗肥胖症、创伤愈合、烧伤愈合等)也需要这种疗法。
本发明目的在于克服上文讨论的一或多个问题。
实施方案概述
本发明的实施方案提供用于治疗生长激素缺陷的组合物和方法。对于本发明来说，生长激素缺陷是与疾病状态或生长障碍(由于缺乏足够的内源性生长激素分泌和/或水平)有关的生长激素水平的任何降低。生长激素缺陷还包括以下情况：其中存在正常内源性水平(对于该患者来说)的生长激素，但据信额外的生长激素有益于疾病或病症的治疗例如肥胖症的治疗，创口的治疗和烧伤的治疗。
本发明的实施方案还提供用于治疗胰岛素样生长因子1缺陷的组合物和方法。对本发明来说，胰岛素样生长因子1缺陷是与疾病状态或病症(由于缺乏足够的内源胰岛素样生长因子1分泌和/或水平)有关的胰岛素样生长因子1水平的任何降低。胰岛素样生长因子1缺陷还包括以下情况：存在正常内源性水平的胰岛素样生长因子1，但是据信额外的胰岛素样生长因子1有益于疾病或病症例如生长障碍，1型和2型糖尿病以及软骨修复和/或替代的治疗。
在一个实施方案中，为需要其的患者提供治疗生长激素缺陷的方法。该方法包括给患者施用免疫原性量的本发明基于促生长素抑制素的抗原疫苗并监测患者的进展。可以施用额外的接种以促进患者生长激素缺陷的治疗。需要这类治疗的患者包括：缺乏内源性生长激素(导致不充分的生长，先天性心脏疾病或其他类似心脏疾病，肥胖症)的成人和儿童，需要增强的烧伤修复的患者，和需要增强的创伤愈合的患者。
在另一个实施方案中，为需要其的患者提供治疗胰岛素样生长因子1缺陷的方法。该方法包括给患者施用免疫原性量的本发明基于促生长素抑制素的抗原疫苗并监测患者的进展。可以施用额外的接种以促进患者胰岛素样生长因子1缺陷的治疗。需要这类治疗的患者包括：患有早产儿视网膜病(ROP)的婴儿，肥胖的成人和/或儿童，患有1型或2型糖尿病的成人和/或儿童，患有Rett′s综合征的成人和/或儿童，肥胖的狗和/或猫，需要软骨替代和/或修复的马，以及其他类似治疗。
本发明还提供具有增强的促生长素抑制素免疫原性的新的多肽以及编码它们的多核苷酸用于治疗患有生长激素或胰岛素样生长因子1缺陷的患者。本发明的多肽包括通过功能优化的接头与灭活的氯霉素乙酰转移酶蛋白融合的促生长素抑制素-14。本发明的多肽因为促生长素抑制素-14的高度保守的性质而可用于全部脊椎动物物种，长期保存是稳定的，高度免疫原性的以及在患者中对降解是抗性的。因此，本发明的嵌合多肽提供高效和低成本的材料用于治疗所有脊椎动物的生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷。
本发明还提供用于治疗需要免疫原性应答的患者的新的佐剂，特别是涉及需要生长激素或胰岛素样生长因子缺陷的治疗的患者。本文新的佐剂用于脊椎动物是高度有效和安全的，包括人，狗，马，猫等。
本发明还提供用于治疗患有生长激素或胰岛素样生长因子缺陷的患者的新的疫苗。疫苗用于脊椎动物是高度有效和安全的，包括人，狗，马，猫等。
在阅读下列详细说明并浏览所附权利要求后，本发明的这些以及各种其他特征和优点将是明显的。
附图简述
图1是根据本发明实施方案的pET30b CatSom质粒的说明性示意图。质粒包括卡那霉素抗性标记，Lac操纵基因，T7启动子，根据本发明实施方案的CAT编码序列，根据本发明的接头区并且还包括根据本发明的促生长素抑制素编码区。
图2是说明性的染色SDS-PAGE，显示对应于本发明密码子优化的、CAT缺陷型促生长素抑制素多肽的预测大小的28KD条带。泳道1是LB+IPTG，还原的，泳道2是LB，还原的，泳道3是LB+IPTG和泳道4是LB。
图3是远交小鼠中百分比基准重量对包含促生长素抑制素的接种的散射图。
图4是显示7天期间每组小鼠的食品摄入的示意图。
图5是显示39天期间治疗组小鼠的平均体重的图示，用误差线显示检测的每组。
图6是显示39天期间治疗组小鼠的基准体重的百分比的图示，用误差线显示检测的每组。
序列的鉴定和序列标识符
SEQ ID NO：1AGCKNFFWKTFTSC
SEQ ID NO：15GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCAC
ATCCTGT
SEQ ID NO：2(His 192-＞Gly，His 193-＞Gly)：
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cctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttg
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gtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcag
gttggtggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcag
SEQ ID NO：3：(His192-＞Gly，His193-＞Gly)：
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vhpcytvfheqtetlsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmg
kyytqgdkvlmplaiqvggavcdgfhvgrmlnelqq
SEQ ID NO：4(His193-＞Gly)
Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgta
cctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttg
cccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgtttt
ccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgtt
acggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaac
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gttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcag
SEQ ID NO：5(1His193-＞Ala)
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ccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgtt
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gtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcag
gttcatgctgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcag
SEQ ID NO：6(1His+CAT wt)
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gttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaactgcagcag
SEQ ID NO：7(一个H-＞G)：
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vhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvsanpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmg
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SEQ ID NO：8：(H-＞A)
Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmnahpefrmamkdgelviwds
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SEQ ID NO：9
tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatg
SEQ ID NO：10
welhrsgprprprprpefm
SEQ ID NO：11
welhrsgp(rp)nefm其中n＞1
SEQ ID NO：12
Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgta
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gtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcag
gttggtggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccgtatgcttaatgaactgcagcagtgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgc
cctcgcccacgtccggaattcatggccggctgcaagaacttcttttggaaaacctttacgagctgc
SEQ ID NO：13
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yytqgdkvlmplaiqvhhavcdgfhvgrmlnelqqwelhrsgprprprprpefmagcknffwktftsc
详细说明
本发明提供用于在需要这类治疗的患者中治疗生长激素缺陷的组合物和方法。对于本文的目的以及先前的描述，生长激素缺陷是与疾病状态或病症(由于患者缺乏足够的内源性生长激素分泌和/或水平)有关的生长激素水平的任何降低。生长激素缺陷还包括以下情况：其中存在正常内源性水平(即对患者来说是正常的)的生长激素，但据信额外的生长激素有益于对患者的目标疾病或病症的治疗，例如肥胖症的治疗，创口的治疗和烧伤的治疗。
本发明还提供用于治疗需要这类治疗的患者的胰岛素样生长因子1缺陷的组合物和方法。对于本文来说，胰岛素样生长因子1缺陷是与疾病状态(由于缺乏足够的内源性胰岛素样生长因子1分泌)有关的胰岛素样生长因子水平的任何缺陷。胰岛素样生长因子1缺陷还包括以下情况：其中存在正常水平(即对患者来说是正常的)的胰岛素样生长因子，但据信额外的因子1有益于对患者的疾病或病症例如肥胖症，1型和2型糖尿病和Rett′s综合征的治疗。
在一个实施方案中，提供新的多肽和编码它们的多核苷酸，包括通过功能优化的接头与灭活的氯霉素乙酰转移酶蛋白融合的促生长素抑制素-14的多肽。本发明的嵌合多肽提供高效和低成本的材料用于治疗生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷。
在另一个实施方案中，提供新的佐剂组合物用于治疗患有生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷的患者。在一个具体实施方案中，基于促生长素抑制素的抗原可以与新的佐剂组合并用于治疗生长激素或胰岛素样生长因子1缺陷相关疾病状态或病症，例如儿童的生长缺陷，成人的生长缺陷，缺乏足够的内源性生长激素分泌，烧伤、肥胖症、心脏病的治愈等。本文的佐剂被设计成最适用于脊椎动物，尤其是人。本文的佐剂提供高于常规佐剂的增强免疫原性，从而允许疫苗包括更小量的抗原。除了用于生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷的治疗以外，本文的佐剂实施方案还可与其他抗原组合联用。新的单独的佐剂实施方案因此属于本发明的范围，但本文的佐剂主要根据基于促生长素抑制素的抗原进行描述。
在另一个实施方案中，提供引起抗促生长素抑制素的免疫原性的疫苗，这导致促生长素抑制素的减少从而去除一定比例的促生长素抑制素对生长激素释放进而胰岛素样生长因子1释放的抑制。本文的疫苗实施方案在安全性和功能方面都进行了优化，在安全和高效的佐剂组合物中具有高免疫原性的促生长素抑制素构建体。本发明的疫苗需要相对更小量的抗原(与常规疫苗相比)，具有增强的保存期限，成本更低。
尽管本发明目标在于人类中生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷的治疗，但可以预期其他脊椎动物中这些缺陷的治疗也属于本发明的范围。例如，可以利用本文描述的组合物和方法治疗显示肥胖症症状的狗和猫以及需要软骨修复或替代的马。
提供下列定义以有利于本文经常使用的一些术语的理解，其不是为了限制当前公开内容的范围。
定义：
“氨基酸”是指20种天然存在的氨基酸以及任何修饰的氨基酸序列中的任一种。修饰可以包括自然过程诸如翻译后加工，或可以包括但不限于磷酸化，泛素化，乙酰化，糖基化，黄素的共价粘附，ADP-核糖基化，交联，碘化，甲基化等等。
“抗体”是指具有一对抗原结合位点，铰链区和恒定区的Y形分子。抗体的片段例如抗原结合片段(Fab)、嵌合抗体、具有与鼠抗原结合区偶联的人恒定区的抗体及其片段以及其他公知的重组抗体包括在本发明抗体的定义内。
“分离”是指从其自然环境的至少一种污染物分离或回收的多核苷酸或多肽。一些情况下，多核苷酸或多肽已经从其自然环境的10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的污染物分离或回收。通常，利用至少一个纯化步骤制备分离的多核苷酸或多肽。在这方面，纯化是指不含至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％95％，96％，97％98％或99％污染多肽的靶多肽。从污染多肽纯化多肽可以通过许多公知的技术实现，包括硫酸铵或乙醇沉淀，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水性相互作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析和凝集素层析。
“肥胖症”是指超过理想体重至少20％的对象。例如对于人类，理想体重由对象的身高、年龄、性别和体格(build)确定。本文肥胖症包括术语：温和地肥胖(超过理想重量20-40％)，适度地肥胖(超过理想重量40-100％)和严重地肥胖(超过理想重量100％)。
“患者”是指需要本发明的组合物和/或方法的脊椎动物，通常是哺乳动物，例如需要体重减轻的人(肥胖，例如)或需要软骨修复的马。
“百分比”核酸或氨基酸序列相同性描述与参照多核苷酸或多肽相同的核酸序列或氨基酸残基的百分比。在一些情况下，序列被比对并引入缺口以实现最大序列相同性。在一些情况下，使用计算机程序计算百分比相同性，例如Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，Madison Wisconsin)，其使用Smith and Waterman，1981，Adv.Appl.Math.，2：482-489)的算法(每篇均以其全文援引加入本文)或ALIGN-2序列比较计算机程序(参见WO00/15796)。
“多核苷酸”是指核苷酸的线性序列。核苷酸是多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸的线性序列，或这两者的混合物。本发明上下文中多核苷酸的实例包括单链和双链DNA，单链和双链RNA，以及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂种分子。多核苷酸还包括一或多种修饰的核苷酸和肽核酸(PNA)。
“蛋白”，“肽”和“多肽”可以互换使用，表示氨基酸聚合物或一组两或多个相互作用或结合的氨基酸聚合物。
“治疗”是指在相对同等情况下对象相对于未经治疗对象的改善。治疗通常表明通过使用本发明的组合物和方法已经实现所需的药理和/或生理作用。治疗可以包括预防性治疗。
“疫苗”是指为了本文描述的目的可以刺激接种对象的免疫系统产生抗体的任意组合物。
生长激素
生长激素是由垂体前叶中的促生长激素细胞产生和释放的191个氨基酸的肽。体内的生长激素水平由生长激素释放激素(GHRH)和促生长素抑制素调节。GHRH引起生长激素的合成和释放(已知应激，锻炼等也是生长激素释放的刺激剂)，而促生长素抑制素抑制生长激素的释放。
生长激素(GH)通常参与体内的各种生理功能，包括：在整个儿童期增加身高，通过肌原纤维节增生增加肌肉质量，促进脂解，促进肝脏的糖异生，和参与燃料稳态。生长激素缺陷通常自身显示为许多已知的疾病或生理状态，包括：矮小的身材/生长障碍(如果缺陷发生在儿童期)，力量不足(strength deficits)，骨量损失，心血管风险的增加，例如慢性心力衰竭(Tien etal.，Growth Hormone：A Promising Treatment for the Failing Heart，2000，Pharmacotherapy 20(9)：1096-1106，以其全文援引加入本文)，和其他类似状态。此外，给对象补充生长激素可能有利于治疗创口，烧伤，肥胖等。Vickerset al.，2002，Adult growth hormone treatment reduces hypertension and obesityinduced by an adverse prenatal environment，J.Endocrinol，175(3)：615-623；Ramirez et al.，1998，Is there a role for growth hormone in the clinicalmanagement or burn injuries，Growth Hormone IGF Res.Suppl.B：99-105；和Lal et al.，2000，Growth hormone，burns and tissue healing，Growth HormoneIGF Res.10 Suppl.B：539-543，为了所有目的每篇均援引加入本文。
抗击生长激素缺陷的常规疗法包括给患病个体补充重组人生长激素(参见例如美国专利号4,446,235和4,601,980)。生长激素补充疗法通常需要连续基础上的重组生长激素皮下注射，即每天注射至少18个月是典型的，尽管很多个体需要终生治疗。最近，生长激素补充疗法已经用于多发性硬化(MS)的治疗，纤维肌痛的治疗，克罗恩氏病和/或溃疡性结肠炎的治疗，老化逆转作用的治疗，烧伤的治疗，和原发性矮小身材的治疗。但是，利用重组生长激素疗法的治疗已经显示可能增加糖尿病，结肠癌等的风险。此外，利用重组蛋白治疗患者通常缺乏内反馈对照(提供恒定监测和病人监护的环境)，当患者具有活跃的恶性肿瘤时相关风险增加。另外，重组生长激素的获得是极其昂贵的，按照通过注射的每天施用方式，一或多年的使用成本会阻止其应用。因此，本发明的实施方案为治疗这些生长激素缺陷相关疾病或病症提供出乎意料的和实质上的益处。
胰岛素样生长因子1(IGF-1)
IGF-1是在结构上与胰岛素类似的多肽蛋白激素。IGF-1是响应生长激素在肝脏和其他靶组织中产生，通常对释放具有合成作用。通常，IGF-1通过AKT信号途径(AKT代表丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶家族)起作用。通常，IGF-1合成作用包括细胞生长和增殖以及靶位点凋亡的抑制。
许多因素涉及影响患者循环中的IGF-1水平，包括：生长激素的水平，遗传构成，时刻(time of day)，年龄，性别，锻炼情况，应激，体重指数，和疾病状态。IGF-1缺陷的特征在于生长迟滞或障碍，与数种病症有关，包括：肥胖症，1型和2型糖尿病，心血管疾病，各种应激障碍等等。
重组IGF-1已经用于治疗这类疾病中的数种，获得混合的结果。最近，Increlex(由Tercica生产的重组IGF-1)已在美国上市用于治疗目标病症，尽管临床结果还有差别。
促生长素抑制素
促生长素抑制素是抑制例如垂体前叶释放生长激素的肽激素。促生长素抑制素通过与靶内分泌细胞上G蛋白偶联促生长素抑制素受体的相互作用调节各种内分泌功能。促生长素抑制素从下丘脑、胃、肠和胰的部位分泌。目标动物中促生长素抑制素水平的控制最近被确定为提高农畜产量的关注点，即促生长素抑制素水平的控制增强奶牛产奶量或农畜的大小等等(参见共同未决申请S/N 12/198,579，标题为“Chloramphenicol AcetylTransferase(CAT)-Defective Somatostatin Fusion Protein And Uses Thereof”，为了所有目的其援引加入本文)。
在这些研究中，通过使用促生长素抑制素抗原的接种方案优化农畜的生产力。通常，用促生长素抑制素免疫的农畜平均每天体重增加10-20％，食欲降低9％，食物利用率增加11％。用促生长素抑制素免疫的动物以及它们的后代具有正确的比例，动物重量在肌肉、骨和脂肪之间的分布与对照动物相同(参见Reichlin，1987)。但是，替代性的促生长素抑制素治疗例如利用抗促生长素抑制素抗体对目标动物的直接治疗已被证明是过度昂贵和功能不那么显著的，从而因为不实际而放弃了直接抗体治疗。Muromtsev G.S.，et al.，1990，Basics of agricultural biotechnology，Agropromizdat，Moscow，pp102-106。因此，这些研究表明在目标动物中诱导促生长素抑制素免疫原性可以实现安全和有效的结果。
本发明人在此获得了惊奇和出乎意料的结果，这些接种方案的改变(包括其中的方法和组合物)可用于治疗人类疾病或生理状态，尤其是治疗人生长激素和/或IGF-1缺陷。
本发明的实施方案提供针对脊椎动物(更具体地，哺乳动物)生长激素缺陷的基于促生长素抑制素的治疗。典型实施方案是针对人，狗，猫和马的治疗。用促生长素抑制素免疫的人和其他哺乳动物接受本发明疫苗的治疗(参见下文)以限制或抑制天然促生长素抑制素对生长激素释放的作用。例如，当给缺乏生长激素或需要过量生长激素来治疗烧伤、心脏疗法、糖尿病等的患者施用重组生长激素时，提供本发明的疫苗以产生额外的内源性生长激素释放。疫苗抗原和佐剂被优化用于脊椎动物使用，尤其是人类使用和疾病治疗。因为促生长素抑制素在脊椎动物中是高度保守的，本发明的实施方案可以使用本文的方法和组合物在所有接种的目标脊椎动物中引发免疫应答。本发明的重大利益是接种患者在加强事件之间可持续数周到数月，允许患者的免疫系统限制或消除来自系统的促生长素抑制素。
本发明的实施方案还提供针对脊椎动物(更具体地，哺乳动物，例如人，狗，猫，马等)IGF-1缺陷的基于促生长素抑制素的治疗。用本发明疫苗免疫的脊椎动物限制或抑制促生长素抑制素对该动物中IGF-1水平的作用。治疗实施方案可用于治疗许多与IGF-1缺陷有关的疾病和/或病症或用于需要额外的IGF-1以改善接受治疗的动物的健康状况或疾病。
因此，本发明的一些方面有利于基于促生长素抑制素的免疫疫苗，通过提供高度免疫原性材料用于预防和治疗疾病和/或其他病症。这些基于促生长素抑制素的免疫化合物已经为了表达和抗原性而进行了优化。
在一些实施方案中，促生长素抑制素-14被表达为密码子优化的、CAT缺陷型促生长素抑制素嵌合多肽。这些材料为用于治疗基于生长激素和IGF-1缺陷的疾病以及生长激素或IGF-1的额外水平有益于治疗方案时提供出乎意料的治疗效果。如下文更全面的描述，本发明还为最大化密码子优化的CAT缺陷型促生长素抑制素嵌合多肽的作用而提供优化佐剂。本发明基于促生长素抑制素的抗原被设计为提供大的分子(27,000+道尔顿对比天然促生长素抑制素的1,600)，免疫原性以及对降解的抗性。采用这样的方式，本发明基于促生长素抑制素的抗原在接受治疗的患者中存在更长(患者中半衰期更长)，更大的效果(更大的免疫原性)。这些用于脊椎动物的新抗原提供了为患者免疫系统产生应答的最佳暴露。
用于治疗生长激素缺陷的新的疫苗实施方案
促生长素抑制素具有两种活性形式，通过多肽的选择性切割产生。Costoff A.Section 5，Chapter 4：Structure，Synthesis，and Secretion ofSomatostatin.Endocrinology：The Endocrine Pancreas.Medical College ofGeorgia，第16页，为了所有目的以其全文援引加入。尽管预期任一种促生长素抑制素形式均可用于本文基于促生长素抑制素的抗原实施方案，但促生长素抑制素-14将被详细描述。促生长素抑制素-14是在下丘脑和胃肠道(胃，肠和胰)产生的生物活性十四肽。十四肽的氨基酸序列是AGCKNFFWKTFTSC(SEQ ID NO：1)。促生长素抑制素-14的序列在脊椎动物中是高度保守的(Lin XW et al.Evolution of neuroendocrine peptidesystems：gonadotropin-releasing hormone and somatostatin.Comp.Biochem.Physiol.C.Pharmacol.Toxicol.Endocrinol.1998 119(3)：375-88.)。该十四肽由以下核酸序列编码：GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT(SEQ ID NO：15)(应注意其他核酸序列可用于编码SEQ IDNO：1，但是提供SEQ ID NO：15用于说明目的)。
已知促生长素抑制素-14对参与动物的生长和食物利用的大量激素具有强抑制作用。如先前在美国专利号6,316,004和美国专利申请号12/198,579(为了所有用途每篇均援引加入本文)中所述，促生长素抑制素和促生长素抑制素的嵌合形式可用于动物的免疫以增加每天重量，以及合适情况下增加产奶量。这些免疫方法利用常规佐剂进行。促生长素抑制素-14免疫还没有被用于治疗任意特定的生长激素缺陷状态。
本发明的一个方面提供分离的核酸分子，其编码具有优化的促生长素抑制素免疫原性活性的嵌合蛋白。特别地，本发明的实施方案包括新的核酸构建体，其编码具有促生长素抑制素的免疫原性活性的CAT融合蛋白。已经针对在免疫方法和治疗生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷(尤其是治疗哺乳动物生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷)的用途中的最佳功能活性鉴定了这些多肽。
在一个实施方案中，提供具有如图1所示的简图的构建体以编码本发明的嵌合多肽。本发明的核酸构建体通常编码没有10个C端氨基酸的无活性CAT酶并且包括一或两个组氨酸置换氨基酸。通过去除His193的咪唑基(典型的CATIII变体中的His 195)灭活CAT酶。在另一个实施方案中，通过去除His193和邻近的His192(对于CATIII来说分别是His195和His194)的咪唑基灭活CAT酶。从CAT的活性位点去除重要的His 193(CATIII中是His 195)咪唑基以及用丙氨酸、甘氨酸或其他类似氨基酸的置换引起CAT酶的基本上失活(参见例如Lewendon A et al.(1994)Replacement of catalytichistidine-195 of chloramphenicol acetyl transferase：evidence for a general baserole for glutamate.Biochemistry.33(7)：1944-50；White et al.，(2000)Characterization of Chloramphenicol and Florfenicol Resistance in Escherichiacoli associated with Bovine Diarrhea.J.Clin.Micro 38(12)p4593-4598，为了所有目的每篇均援引加入本文)。最后，本文实施方案还可以包括通过单独去除His192(对于CATIII来说是His194)的咪唑基的CAT酶失活。至于His193，置换可以用丙氨酸、甘氨酸或其他类似氨基酸。
在一些方面，一或多个置换的组氨酸氨基酸由位于SEQ ID NO：2的位置号574-576和577-579(对应于SEQ ID NO：3中氨基酸编号192和193)的核酸编码。在一些实施方案中，本发明的核酸序列包括SEQ ID NO：4，SEQID NO：5和SEQ ID NO：6。本文包括组氨酸置换构建体的本发明嵌合蛋白提供很少或没有CAT活性的高免疫原性蛋白，是对现有领域的显著改进。灭活的CAT酶实施方案与本发明的促生长素抑制素多肽结合。这种结合直接完成或利用接头完成(下文将更全面的描述)。
His192和His193位点的CAT失活可以通过本领域技术人员已知的大量方法实现，包括定点诱变和合成基因组装。在一个实施方案中，编码组氨酸193或组氨酸192的核酸序列被修饰以编码丙氨酸、甘氨酸或其他类似氨基酸。在另一个实施方案中，编码组氨酸192和193二者的核酸序列被修饰为编码丙氨酸、甘氨酸或其他类似氨基酸。对于192和193嵌合多肽的典型置换包括：丙氨酸，丙氨酸，丙氨酸，甘氨酸，甘氨酸，丙氨酸，甘氨酸，甘氨酸。
本发明的实施方案还包括本发明CAT缺陷型多肽的氨基酸序列，包括具有SEQ ID NO：7、8和3的氨基酸序列(对应于193位的his-＞gly，193位的his-＞ala以及192和193位的his-＞gly)。
本发明人出乎意料的发现以下事实：CAT酶可以被灭活并用做治疗本文的疾病和/或病症(特别是哺乳动物)中呈递促生长素抑制素-14的载体蛋白。未灭活的CAT已经被描述成在多个世界范围的革兰氏阴性菌分离物中引起对氯霉素和氟苯尼考(Florfenicol)(氟化类似物)的质粒介导的细菌抗性的酶。未灭活的CAT的用途(如US 6316004B1所述)在这些科学发现之前。因此，根据现在理解和建立的标准，由于安全性的关注(即产生更多抗生素抗性宿主)而使用未灭活的CAT是禁忌的。氯霉素在约60年前发现，主要用做抗生素。数种健康关注由这类使用引起，包括药物受体患上再生障碍性贫血。此外，当持续使用抗生素氟化类似物时(例如在牛产业中)，由于质粒编码的基因，增加数种细菌菌株变为是抗生素抗性的。尽管氯霉素被持续用于滴眼剂以治疗细菌性结膜炎，但在美国它不被用于治疗带有其他细菌的疾病。因此，在哺乳动物尤其是人中在任意物质中使用灭活CAT酶的实现和发展是令人惊奇的，其中本说明书自始至终描述的基于载体蛋白使用的效益同时避免活性CAT的显著健康关注提供对本文描述的疫苗的显著改进。
应注意与小分子一起使用的这些CAT的“载体”相关改进描述于共同未决和相关的美国专利申请系列号PCT/US08/68195以及美国专利号6,316,004，为了所有目的这两篇均援引加入本文。尤其是，本发明人在此处出乎意料地发现灭活的CAT酶作为促生长素抑制素-14的载体蛋白可以避免与酶有关的显著健康风险，其利用嵌合蛋白增强的免疫原性能力，对酶降解的抗性，增加的半衰期和患者巨噬细胞增强的摄取。
如图1所示，可以通过不同长度的接头或间隔物将无活性的CAT酶与促生长素抑制素-14连接。要求间隔物确保编码的促生长素抑制素在球形表面呈现。本文的间隔物实施方案提供最佳蛋白酶抗性和最佳表位暴露，并且显示相对于没有本发明接头序列的构建体的出乎意料的改进。
因此，间隔物实施方案已经在长度和组成上被优化以确保CAT缺陷型促生长素抑制素在各种微生物尤其是大肠杆菌(E.coli)中表达。美国专利号6,316,004描述的原始构建体包括具有稀有大肠杆菌密码子的间隔物和需要来自第二或辅助质粒的稀有tRNA的共表达。本文的间隔物实施方案去除这些罕见的大肠杆菌密码子，从而去除对第二辅助质粒的需要，是对先前技术的改进。
在典型实施方案中，间隔物具有tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatg(SEQ ID NO：9)的核酸序列。本发明间隔物的一个实例具有welhrsgprprprprpefm(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。本发明间隔物的典型氨基酸序列是welhrsgp(rp)nefm，其中n＞1(SEQ ID NO：11)。如上所述，这些新的间隔物序列提供增强的蛋白酶抗性(从而允许与美国专利号6,316,004公开的构建体相比增加的产量)和最佳促生长素抑制素-14暴露。当为了疾病治疗而用于免疫目标患者时，通过最佳配置的接头将促生长素抑制素与灭活CAT酶连接的这种组合显示出乎意料的改进。这些构建体被用作抗原治疗基于生长激素和胰岛素样生长因子1缺陷的疾病。
此外，与单独的促生长素抑制素-14相比，这些嵌合构建体显示增强的保存稳定性。此外，本发明基于促生长素抑制素的抗原提供患者中更长的半衰期，给予这些材料对降解增强的抗性。注意到其他载体多肽可以取代灭活的CAT来连接促生长素抑制素。例如，促生长素抑制素-14可以与替代灭活CAT酶的KLH、破伤风类毒素或CRM组合。
本发明的实施方案还提供用于增强目标患者中体液免疫的诱导的新的佐剂组合物。这些佐剂组合物提供在诱导体液应答方面相对常规材料的显著改进并且对于用于人类目标是安全的。本文的佐剂组合物被用于基于促生长素抑制素的抗原以产生本发明的疫苗。本发明的疫苗然后被用于治疗基于GH和/或IGF-1缺陷的疾病或病症。
在本文的实施方案中，佐剂组合物的所有成分具有非人来源，从而消除了接种人被可能污染的佐剂成分的可能的交叉污染。例如，本文的实施方案可以利用不含动物来源的Tween 80。令人惊讶的是，与动物来源的Tween 80相比，不含动物来源的Tween 80在本文的疫苗使用中显示显著更好的结果，并且消除了基于动物的对疫苗污染的可能性，例如牛海绵状脑病(BSE)。此外，与动物来源的Tween 80相比，不含动物来源的Tween 80显示更好的乳化能力，为其按照本文实施方案的用途提供额外的出乎意料的益处。
此外，本文的佐剂实施方案也不含苯和其他类似致癌化合物。这些实施方案提供大部分常规佐剂复合物中没有的安全效益。例如，本文实施方案利用Carbopol 974P或不含苯的多环酸。
在一个实施方案中，免疫佐剂包括Carbopol基质，角鲨烯基质和阿拉伯半乳聚糖溶液。更详细地，Carbopol基质使用于水或盐水的Carbopol 974P制备。角鲨烯基质是从角鲨烯、非动物来源的Tween 80和Span 85的组合制备的。在一些实施方案中，角鲨烯基质是MF59(Chiron Corp.，Emeryville，CA)。阿拉伯半乳聚糖溶于PBS或盐水。佐剂组合物与本发明的嵌合多肽组合产生本发明疫苗。
在另一个实施方案中，免疫佐剂包括Carbopol基质，角鲨烯基质和西黄蓍胶素溶液。更详细地，Carbopol基质使用于水或盐水的Carbopol 974P制备。角鲨烯基质是从角鲨烯、非动物来源的Tween 80和Span 85的组合制备的。纯化的西黄蓍胶素溶于PBS或盐水。佐剂组合物与本发明嵌合多肽组合产生本发明疫苗。
具体的佐剂组合和浓度显示于实施例3。根据本发明的佐剂对于人类使用是安全和有效的，避免了动物产品，避免了基于石油的烃类，并且避免了致癌化合物。
载体和宿主细胞
本发明还涉及包括本发明多核苷酸分子的载体，以及利用这类载体转化的宿主细胞。可以将本发明的任意多核苷酸分子与载体(其通常包括选择性标记和感兴趣增殖宿主的复制起点)相连。宿主细胞被遗传工程化以包括这些载体，从而表达本发明的多肽。通常，本文的载体包括与合适的转录或翻译调节序列(诸如用于微生物或病毒宿主细胞的那些)可操作的连接的本发明多核苷酸分子。调节序列的实例包括转录启动子，操纵基因，或增强子，mRNA核糖体结合位点，以及控制转录和翻译的适当序列。当本文的调节序列功能上涉及本发明的嵌合多肽编码多核苷酸时，核苷酸序列是可操作连接的。
典型的载体包括质粒，酵母穿梭载体，杆状病毒，灭活的腺病毒等。在一个实施方案中，载体是被修饰的pET30b CatSom质粒(参见图1)。用于本文的靶宿主细胞包括细菌宿主，例如大肠杆菌，酵母，SF-9昆虫细胞，哺乳动物细胞，绿色植物等。
在一个实施方案中，调节序列包括用于在大肠杆菌或其他类似微生物中表达本发明嵌合多肽的T71ac，CAT，Trp或T5启动子。这些调节序列是本领域已知的，在合适的和已知的条件下使用。
已经构建出本发明的各种质粒以通过使用靶调节序列表达本发明的嵌合多肽。示例性的质粒可包括T71ac启动子(参见图1)。
用于表达靶嵌合多肽的宿主细胞包括原核生物，酵母和更高级的真核细胞。示例性的原核宿主包括埃希氏菌属(Escherichia)，芽孢杆菌属(Bacillus)和沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。在典型实施方案中，宿主细胞属于埃希氏菌属，可以是大肠杆菌。宿主细胞(酵母或细菌)还可以用于产生作为病毒样粒子(VLP)的本发明靶多肽。
如下文实施例所示，本发明的构建体提供各种条件下最佳的CAT缺陷型促生长素抑制素表达。这些构建体对于在原核宿主(尤其是埃希氏菌属的细菌)中表达特别有效。
用于本发明疫苗的不含内毒素的融合蛋白
本发明的方面包括使用不含内毒素的、密码子优化的CAT缺陷型促生长素抑制素。在一个实施方案中，通过用合适的含促生长素抑制素的载体转化靶细胞来制备本发明的包括嵌合免疫原性促生长素抑制素的蛋白。如上所述，用于本文的载体包括适于在选定的靶细胞中表达的已知质粒和载体系统。
在本发明的一个方面，在靶宿主细胞中表达包括嵌合免疫原性促生长素抑制素的蛋白。利用靶调节序列进行嵌合蛋白表达。在一些方面，为了在大肠杆菌中表达已经将嵌合多肽优化(特别是关于本文公开的间隔物序列)。
然后根据已知的蛋白纯化技术(包括例如溶菌酶裂解，包涵体的差速离心，筛网层析等)纯化嵌合蛋白。重折叠方法可以在碱性pH的氯化胍和尿素中进行，然后进行透析和冻干。
在一个实施方案中，利用含密码子优化的CAT缺陷型促生长素抑制素质粒-pET30b CatSom转化大肠杆菌细胞；pET30b CatSom具有用于表达的合适大肠杆菌基础调节序列。一些情况下，大约十升这些细胞的发酵提供至少500克总生物量，一些情况下提供600克总生物量，产生约4-6克的总蛋白。从银和考马斯蓝染色估算约一半的蛋白是靶嵌合蛋白(参见实施例2和图2)。
在本文一些实施方案中，从转化的宿主细胞纯化处于基本上不含内毒素状态的本发明嵌合蛋白。额外的纯化将内毒素去除或降低到根据食品和药物管理局(Food and Drug Administration)标准对人来说可接受的水平。
因此，本文的一些实施方案涉及用于疫苗的基本上不含内毒素的嵌合蛋白的产生。在一些实施方案中，内毒素水平是1EU/ml或低于1EU/ml，在其他实施方案中，内毒素水平被基本上消除，即本发明的嵌合多肽基本上不含内毒素。
在一个实施方案中，从裂解宿主细胞回收的IB用不含内毒素的清洗液清洗多次。任选地，清洗回收的IP沉淀直至内毒素水平低于大约1EU/ml(内毒素检测可以使用一或多种已知的测定法进行，包括商品化供应的检测试剂盒，来自MP Biochemicals，Charles River等)。在一些实施方案中，清洗缓冲液是不含内毒素的，包括一或多种蛋白水解蛋白抑制剂，例如苯甲基磺酰氟(PMSF)。在一些实施方案中，清洗缓冲液是含有抑制有效量的PMSF和/或氨乙基-苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)的磷酸缓冲盐水(PBS)。
在一些方面，基本上不含内毒素的沉淀可以用pH 12.5的含尿素的蛋白解折叠溶液处理并在含降低摩尔浓度的尿素以及精氨酸、甘油和/或蔗糖的蛋白重折叠溶液中进行重折叠。将纯化的嵌合蛋白浓度调整为1到3mg/ml之间，通常是大约1.4到1.8mg/ml。一些情况下，按照约1.5到5mg/2ml剂量和更常见的2.0到3.5mg/2ml剂量给疫苗制剂提供基本上不含内毒素的嵌合蛋白。还可以使用其他内毒素去除方法，例如商品化供应的离子交换内毒素去除柱，疏水柱等。
疫苗
本发明的疫苗是本文描述的免疫佐剂与用于预防或治疗人疾病状态的靶抗原的组合。
用于本文疫苗实施方案的药物剂量包括1-5mg嵌合多肽。在本文所有实施方案中，疫苗应当是无菌的、液体的并且在制备和保存条件下是稳定的。可以通过添加各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯类，氯丁醇，山梨酸，硫柳汞等)实现对微生物作用的预防。
本文的疫苗通常包括总蛋白量从约1mg/2ml到3mg/2ml剂量的抗原，其中大约5％到25％的剂量是佐剂，更常见的约10％到20％的剂量是佐剂。在一些实施方案中，佐剂占剂量的约18％。
为了说明目的，本发明的佐剂与基于促生长素抑制素的多肽组合以提供用于治疗基于人生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷的疾病和/或病症的疫苗。应注意本文描述的佐剂可以与其他抗原组合以产生用于治疗其他目标人类疾病的新的疫苗。
治疗人类疾病的方法
本发明提供包含本发明嵌合多肽和佐剂的药物等级疫苗。可以给患有生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷的患者施用这类疫苗以促进来自患者内源的适当释放。
给患有生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷的患者提供本发明的疫苗。在一个实施方案中，在治疗期间提供本发明的疫苗1到2次，以及3到5次加强。典型的疫苗抗原量是1到5mg/ml嵌合多肽。可以通过已知的技术施用疫苗。在一个实施方案中，通过皮下注射施用疫苗。在另一个实施方案中，通过皮内注射，肌肉注射或输注施用疫苗。
本发明的疫苗实施方案还可以包括分散剂或湿润剂，悬浮剂，或其他类似材料。例如，实施方案可以包括无菌油类，合成的甘油单酯或甘油二酯，脂肪酸或油酸。
疫苗通常被制备为无菌水溶液。这些溶液在制备和保存条件下是稳定的。一些方面，疫苗可以包括其他物质以预防微生物作用，例如抗细菌剂或抗真菌剂。
本发明的疫苗溶液通过加入需要量的材料(抗原，佐剂，其他成分)来制备，之后是最终消毒，例如通过紫外线或臭氧处理。可选的，在最后配制之前使用分别灭菌的成分制备本发明的疫苗溶液(这种情况下不需要最终消毒)。
可以监测接受本发明疫苗实施方案的患者的治疗进展并提供额外的施用。生长激素水平的增加，胰岛素样生长因子1水平的增加以及功能上的利益(例如肥胖患者可接受的体重减轻)都是监测治疗有效性的靶。此外，当1型或2型糖尿病或肥胖症正在接受治疗时，可以监测血糖，IGF-1水平，脂谱，胰岛素水平和血红蛋白结合的A1c(HbA1c)水平以确定对患者治疗的有效性。根据个体患者的进展，可以使用更多或更少的本发明抗原进行额外的疫苗注射。此外，由卫生保健专业人员确定，可以使用可选择的佐剂组合来改变特定患者对接种的应答。
本文的实施方案可以与用于目标生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷疾病状态或病症的其他常规疗法组合。例如，本发明的接种可以与1型糖尿病治疗的胰岛素替代法组合，或接种可以与严重肥胖症患者的体重减轻手术或低热量饮食组合。
已经大概描述了本发明，通过参考下列实施例(提供其是为了解释而不是作为限制)相同内容将更容易理解。
实施例
提供下列实施例只是为了说明目的，而不是用于限制本发明的范围。
实施例1：构建CAT-缺陷型促生长素抑制素融合蛋白
当前实施例举例说明根据本发明实施方案的CAT缺陷型促生长素抑制素融合蛋白的产生。在质粒pET30b-Cat-Som上进行定点诱变以用甘氨酸残基置换His192和His193(修饰后：Gly192和Gly193)。His193(和His192)残基的失活消除了CAT酶接受质子的能力，从而提供CAT的完全失活。
相同pET30b-Cat-Som(具有His置换)中的间隔物为了在没有共表达的tRNA分子的情况下由大肠杆菌表达而进行密码子优化。
修饰的CAT缺陷型促生长素抑制素核酸构建体如SEQ ID NO：12所示。CAT缺陷型促生长素抑制素融合蛋白序列如SEQ ID NO：13所示，与未修饰的CAT促生长素抑制素融合蛋白(SEQ ID NO：14)进行比较。
实施例2：CAT缺陷型促生长素抑制素融合蛋白可以高水平表达
如实施例1描述的密码子优化的CAT缺陷型促生长素抑制素构建体用于在BL21(DE3)细胞中表达融合蛋白。转化的细胞在LB中生长并用0.4mMIPTG诱导大约3小时。将1毫升来自密度为OD 0.7的培养物的细胞沉淀，在100μl SDS样品缓冲液中在70℃加热十分钟。每条泳道上样40μl细胞提取物样品进行SDS-PAGE。
如图2所示，用IPTG诱导后在泳道1(LB+IPTG，还原的)和3(LB+IPTG)观察到一条28KD条带，其对应于密码子优化的CAT缺陷型促生长素抑制素融合蛋白的预测大小。在对照泳道2(LB，还原的)和4(LB)没有看到表达。与预期一致，当在标准或还原条件下电泳时融合蛋白的大小不存在差异。
实施例3：包含无内毒素的密码子优化的CAT缺陷型促生长素抑制素的疫苗
根据本发明的示例性疫苗：
试剂溶液：
1.Carbopol基质
a.将0.5克Carbopol 974P溶于水或盐水；
b.混合并煮沸以溶解，然后高压灭菌；
c.4℃保存。
2.角鲨烯基质
a.混合58.1ml角鲨烯，4.6ml非动物来源的Tween 80和5.2mlSpan 85；
b.通过0.2μ滤器将混合物过滤；
c.4℃保存。
3.西黄蓍胶素溶液
a.利用甲醇提取西黄蓍胶；
b.收集不溶于甲醇的组分；
c.在室温干燥；
d.室温下干燥状态保存；
e.将1克干的西黄蓍胶素添加到水或盐水中；
f.混合并煮沸以溶解，然后高压灭菌；
g.4℃保存。
疫苗制备
1.按照5mg/ml或更低在盐水或PBS中制备疫苗抗原；
2.向混合瓶中添加6.79ml角鲨烯基质；
3.向角鲨烯基质中添加10ml Carbopol基质(CS)；
4.充分混合；
5.向CS溶液中添加10ml西黄蓍胶素溶液；
6.充分混合；
7.添加未稀释的或稀释的用于盐水或PBS的疫苗抗原到终体积82ml；
8.添加1ml的1％硫柳汞溶液，充分混合；
9.4℃保存疫苗直至使用。
根据本发明的另外可选的示例性疫苗：
试剂溶液：
1.Carbopol基质：
a.将0.5克Carbopol 974P溶于水或盐水中；
a.混合并煮沸以溶解，和高压灭菌；
b.4℃保存。
2.角鲨烯基质：
a.混合58.1ml角鲨烯，4.6ml非动物来源的Tween 80和5.2mlSpan 85，并通过0.2μ滤器过滤；
b.4℃保存。
3.阿拉伯半乳聚糖溶液：
a.将1-10克阿拉伯半乳聚糖加入PBS或盐水中；
b.混合并煮沸以溶解，和高压灭菌；
c.4℃保存。
疫苗制备
1.按照5mg/ml或更低在盐水或PBS中制备疫苗抗原；
2.向混合瓶中添加6.79ml角鲨烯基质；
3.向角鲨烯基质中添加10ml Carbopol基质；
4.彻底混合并添加10ml阿拉伯半乳聚糖溶液；
5.添加未稀释或稀释的用于盐水或PBS的本发明抗原到终体积82ml；
6.添加1ml的1％硫柳汞溶液，混合疫苗；和
7.4℃保存疫苗直至使用。
实施例4：使用实施例3的疫苗治疗心血管病
本实施例使用患有左心室功能障碍的大鼠，按照Genentech，1995刊登的方案制备。将大鼠分为两组(每组中每个成员具有结扎的左冠状动脉)，第一治疗组接受本发明的接种，第二对照组(没有接种，但其他方面的治疗相同)。治疗组的每个成员接受接种，21天后然后接受第二次接种，肌内施用(1ml/剂量)。在第0天、第21天和第42天测量血清IGF-1水平和抗促生长素抑制素抗体。在第42天还测量两组的血液动力学参数并且测定梗塞面积和心脏指数。
预期接受两次接种(如实施例3所述)的大鼠组与对照组相比具有实质上改善的心脏功能(减少的梗塞面积和改善的心脏指数)。
实施例5：使用实施例3的疫苗治疗肥胖症
使用Vickers等(2001)描述的大鼠肥胖症模型来确定本发明疫苗对肥胖症的作用。给大鼠喂食高热量饮食30到60天。称重高热量大鼠，将其分成三组—盐水对照组，继续高热量饮食的接种组，和正常热量饮食组。接受接种的大鼠在第0天和第21天接受2×1ml的肌内剂量。在整个研究期间每周称重所有大鼠。第42天，称重所有大鼠，收集血清进行IGF-1分析、尿素分析和抗促生长素抑制素抗体水平。
预期接受实施例3所述接种的大鼠将相对盐水对照组具有实质上改善的重量控制并显示相应的血清结果(与生长激素改变引起的重量控制有关)。接种组将显示与正常热量摄入组基本上相同的重量控制。
实施例6：使用实施例3的疫苗治疗生长缺陷
使用1ml剂量每月接种3周龄Cox(CD)大鼠，共3个月。每次接种在肌内或皮下进行。对照大鼠将接受盐水注射，使用相同的施用方式和相同体积的施用材料。称重所有大鼠以确定每周基础上的生长并在第0，4，8，12和16周采血。按照类似的日程表收集血清，分析IGF-1、尿素和抗促生长素抑制素抗体水平。
预期接受实施例3所述接种的CD大鼠与对照CD大鼠相比将具有实质上改善的生长。治疗大鼠应当显示证实接种对治疗大鼠作用的血清结果。
实施例7：增加的促生长素抑制素导致小鼠体重增加
进行小鼠肥胖症研究以观察外源施用的促生长素抑制素是否将造成小鼠体重增加。在远交小鼠上进行七天研究，其中将3种不同的本发明佐剂与重组促生长素抑制素组合(佐剂被称为JH 14，JH 17和JH 18)。每份佐剂添加1mg/ml重组产生的促生长素抑制素(2009年生产)，一种佐剂(JH14)还添加2007年产生的浓度为2.57mg/ml的促生长素抑制素。对照组的小鼠接受无菌盐水注射。
在研究开始时称重每只小鼠以确定基准重量。在第0天通过IP注射0.5ml疫苗进行每只小鼠的接种。给雌性小鼠施用在JH17和18佐剂中的促生长素抑制素，给雄性小鼠施用在JH14中的促生长素抑制素。在7天期间给小鼠喂食正常饮食，第7天再称重每只小鼠。
如图3所示，接受促生长素抑制素的远交小鼠维持健康状态，在一周研究期间几乎不显示不利作用。JH17组的雌性小鼠具有重量增加，而雌性JH18小鼠的重量增加与对照小鼠相似。两个JH14组(2007和2009)的雄性小鼠均显示超过对照组雄性小鼠的体重增加。图3的全部发现说明JH14、JH17和JH18佐剂可安全用于小鼠，高度一致并且能够保存，外源施用的促生长素抑制素通常引起靶小鼠的重量增加，提供证据证明促生长素抑制素参与体重增加。所有效果发生在IP免疫数天内。这归因于直接的巨噬细胞加工和加速的抗原和呈递B淋巴细胞，取决于施用途径、嵌合多肽的性质和佐剂作用。
JH14，17和18预混合物(Preblends)描述于下文和美国申请系列号PCT/US08/68195题为“Chloramphenicol Acetyl Transferase(CAT)-DefectiveSomatostatin Fusion Protein and Uses Thereof”。最终制剂具有1mg蛋白抗原每1ml剂量。为此制剂如下所示：
JH17
重折叠的蛋白12ml(5.86mg/ml)
Dulbecco′s PBS 24.5ml
JH17预混合物13.4ml
1％硫柳汞0.5ml
37％甲醛0.1ml
JH18
重折叠的蛋白12ml(5.86mg/ml)
Dulbecco′s PBS 24.5ml
JH18预混合物13.4ml
1％硫柳汞0.5ml
37％甲醛0.1ml
JH14
重折叠的蛋白12ml(5.86mg/ml)
Dulbecco′s PBS 27.8ml
JH14预混合物10ml
1％硫柳汞0.5ml
37％甲醛0.1ml
应注意上面的制剂包括硫柳汞和甲醛以限制疫苗的污染。在使用多剂量重复使用瓶子分配疫苗时才使用这些材料，通常人和动物治疗方案将包装在一次性使用小瓶中，从而消除对这些防腐剂的需要。还应注意更高水平的抗原用于2007JH14批次以弥补蛋白降解。
实施例8：小鼠肥胖症的治疗
使用来自Jackson Laboratories(Bar Harbor，Maine)的小鼠进行小鼠肥胖症研究。许多来自C57BL/6J品系的近交小鼠获自Jackson Laboratories，所述小鼠是：雄性，显示诱导的严重肥胖症，具有多基因遗传，并显示成熟发作的肥胖症。在先前的检测中，Jackson Laboratories已经确定这一特异小鼠品系当喂食高脂饮食时患有实质上非常类似于在人群中报道的代谢综合征表型。例如，喂食高脂饮食的C57BL/6J小鼠显示内脏肥胖，胰岛素抗性，高胰岛素血症，高瘦素血症，瘦素抗性和高血压。
进行研究以检测本文疫苗实施方案治疗肥胖症的有效性，即包括限制一些小鼠的体重增加到引起C57BL/6J小鼠的体重减轻。给6周龄小鼠喂食60％kcal％脂肪饮食共6周。然后将12周龄小鼠分到四组之一：组1包括用包含JH14的疫苗治疗的小鼠；组2包括用包含JH17的疫苗治疗的小鼠；组3包括用包含JH18的疫苗治疗的小鼠，和组4包括用PBS而不是任意类型的抗促生长素抑制素型抗原治疗的对照小鼠。通过IP途径使用0.5ml指定疫苗或PBS接种每组中的小鼠。22天后，使用0.1ml疫苗通过第二次IP剂量再次治疗小鼠。
在整个研究期间(6周)，每只小鼠每周称重两次并监测食物摄入，即确保重量变化不是因为食物摄入的减少或增加引起(参见图4，显示4组中每组的累积食物摄入)。当研究结束时对每只小鼠进行最终放血，确定IGF-1水平(利用Diagnostic Systems Laboratories Inc.Active Mouse/Rat IGF-1ELISA(DSL-10-29200)测定IGF-1血浆水平)。
如图5和6以及表1所示，用JH14，17和18治疗的小鼠在最终体重对基准重量百分比中都显示非常显著的差异(p＜0.0001)(通过参数或非参数统计分析)。前7天内在每个接种组中观察到显著的体重减轻，而对照组在相同时段内显示轻微体重增加。第22天给JH14、JH17和JH18组施用第二剂量的疫苗(第1天提供剂量的1/5th)后也观察到轻微的体重减轻。
来自小鼠肥胖症研究的数据提供以下结论：(1)尽管就IGF-1ng/ml而言，JH18和对照之间不存在统计上显著的差异，但通过参数或非参数统计分析在最终体重对基准重量百分比中这些组之间存在非常显著的差异(P＜0.0001)；(2)在最终体重对基准重量百分比中，通过两种统计检验JH17相对对照产生统计上显著的差异；(3)JH18(其具有135.8ng/ml的平均IGF-1水平，高于JH17)，在基准重量百分比(仅通过无参数检验)中显示对JH17的统计上显著的差异；(4)在JH17和JH18佐剂中的本发明嵌合-促生长素抑制素抗原诱导最终体重对基准重量百分比的统计上显著的差异；(5)就最终体重对基准重量百分比而言，当通过非参数分析与JH17相比时，JH18是统计上显著的；(6)IGF-1水平与研究结束时相对对照和JH17接种的更大的体重减轻有关(参见表2)；(7)因为所有接种具有相同剂量的本发明嵌合-促生长素抑制素抗原，在研究期间观察到佐剂作用；(8)喂食60％kcal脂肪饮食的近交C57BL/6J雄性小鼠显示IP接种后第一周内显著的体重减轻；和(9)甚至当小鼠在整个研究期间进食60kcal％脂肪饮食时，本文显示的体重减轻也保持不变。
表1：最终体重对基准重量
表2：IGF-1统计分析
  组   # 平均IGF-1(ng/ml)   标准差  Mann Whitney(1尾)
  对照   10 365.6   88.7  未做
  JH17   10 304.2   99.2  P＝0.0827
  JH18   10 440.4   103.7  P＝0.105
对于本文来说应理解可以在本发明的范围内对本发明做出各种变化和改变。可以做出对本领域技术人员来说显而易见的大量其他变化，这包括在本文公开的本发明精神内，如所附权利要求所限定。说明书包含对专利和出版物的大量引用。为了全部目的将每篇均援引加入。

Claims (20)

1.基于促生长素抑制素的抗原在制备用于治疗患者生长激素缺陷的疫苗中的应用，所述疫苗包括：
(1)基于促生长素抑制素的抗原，其由灭活的CAT酶、间隔物和促生长素抑制素14组成，其中灭活的CAT酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、7和8，促生长素抑制素14的氨基酸序列是SEQ ID NO：1，间隔物的氨基酸序列选自SEQ ID NO：10和11，其中所述间隔物连接所述灭活的CAT酶和促生长素抑制素14，和
(2)佐剂，
其中施用的疫苗在患有生长激素缺陷的患者中引起生长激素水平的增加。
2.权利要求1的应用，其中所述基于促生长素抑制素的抗原是SEQ IDNO：13所示的嵌合多肽。
3.权利要求2的应用，其中所述佐剂包括有效量的Carbopol 974P。
4.权利要求3的应用，其中所述佐剂还包括角鲨烯和非动物来源的Tween 80。
5.权利要求1的应用，其中所述患者是患有生长缺陷的成人。
6.权利要求1的应用，其中所述患者是患有生长缺陷的儿童。
7.权利要求1的应用，其中正在进行生长激素缺陷治疗的患者患有粘膜病。
8.权利要求1的应用，其中正在进行生长激素缺陷治疗的患者患有心脏病。
9.权利要求1的应用，其中正在进行生长激素缺陷治疗的患者是肥胖的。
10.权利要求1的应用，其中所述患者是肥胖的狗。
11.权利要求1的应用，其中所述患者是肥胖的猫。
12.权利要求1的应用，其中所述患者是需要软骨修复的马。
13.基于促生长素抑制素的抗原在制备用于治疗患者胰岛素样生长因子1缺陷的疫苗中的应用，所述疫苗包括：
(1)基于促生长素抑制素的抗原，其由灭活的CAT酶、间隔物和促生长素抑制素14组成，其中灭活的CAT酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、7和8，促生长素抑制素14的氨基酸序列是SEQ ID NO：1，间隔物的氨基酸序列选自SEQ ID NO：10和11，其中所述间隔物连接所述灭活的CAT酶和促生长素抑制素14，和
(2)佐剂，
其中施用的疫苗在患有胰岛素样生长因子1缺陷的患者中引起胰岛素样生长因子1水平的增加。
14.权利要求13的应用，其中正在进行胰岛素样生长因子1缺陷治疗的患者患有1型或2型糖尿病。
15.权利要求13的应用，其中正在进行胰岛素样生长因子1缺陷治疗的患者患有应激障碍。
16.权利要求13的应用，其中正在进行胰岛素样生长因子1缺陷治疗的患者患有心脏病。
17.一种用于治疗患有生长激素和/或胰岛素样生长因子1缺陷的患者的疫苗，所述疫苗包括：
免疫原性量的基于促生长素抑制素的抗原，其由灭活的CAT酶、间隔物和促生长素抑制素14组成，其中灭活的CAT酶的氨基酸序列选自SEQ IDNO：3、7和8，促生长素抑制素14的氨基酸序列是SEQ ID NO：1，间隔物的氨基酸序列选自SEQ ID NO：10和11，其中所述间隔物连接所述灭活的CAT酶和促生长素抑制素14；和
包括至少Carbopol 974P、角鲨烯和阿拉伯半乳聚糖的佐剂。
18.权利要求17的疫苗，其中基于促生长素抑制素的抗原由SEQ IDNO：13所示。
19.基于促生长素抑制素的抗原在制备用于治疗患者肥胖症的疫苗中的应用，其中所述疫苗包括：
(1)基于促生长素抑制素的抗原，其由灭活的CAT酶、间隔物和促生长素抑制素14组成，其中灭活的CAT酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、7和8，促生长素抑制素14的氨基酸序列是SEQ ID NO：1，间隔物的氨基酸序列选自SEQ ID NO：10和11，其中所述间隔物连接所述灭活的CAT酶和促生长素抑制素14，和
(2)佐剂。
20.权利要求19的应用，其中所述患者是人，狗，猫或马。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101525754B1 (ko) 2007-03-28 2015-06-09 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 스티칭된 폴리펩티드
NZ590011A (en) 2008-06-25 2012-09-28 Braasch Biotech Llc Chloramphenicol acetyl transferase (cat)-defective somatostatin fusion protein and uses thereof
BRPI0914300B8 (pt) 2008-06-25 2021-05-25 Braasch Biotech Llc vacina para tratamento de obesidade
JP6181121B2 (ja) * 2009-09-30 2017-08-16 ロンザ リミテッドＬｏｎｚａ Ｌｉｍｉｔｅｄ 適応性免疫応答を向上させるためのアラビノガラクタン
EP2327411A1 (en) * 2009-11-27 2011-06-01 Lonza Ltd. Arabinogalactan as immune enhancer
US8784844B2 (en) 2009-09-30 2014-07-22 Lonza Ltd. Arabinogalactan for enhancing the adaptive immune response
SI2603600T1 (sl) 2010-08-13 2019-04-30 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetični makrocikli
KR20140100937A (ko) 2011-10-18 2014-08-18 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티도미메틱 거대고리
WO2013123267A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Aileron Therapeutics, Inc. Triazole-crosslinked and thioether-crosslinked peptidomimetic macrocycles
CN104159595A (zh) 2012-02-15 2014-11-19 爱勒让治疗公司 拟肽大环化合物
BR112015009470A2 (pt) 2012-11-01 2019-12-17 Aileron Therapeutics Inc aminoácidos dissubstituídos e seus métodos de preparação e uso
US9393259B2 (en) 2013-03-21 2016-07-19 Lonza Ltd. Composition comprising arabinogalactan and polyphenols from larch trees
WO2016029013A2 (en) 2014-08-21 2016-02-25 Braasch Biotech Llc Methods for improving immunological response in vaccinated animals
KR20170058424A (ko) 2014-09-24 2017-05-26 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티드모방 거대고리 및 이의 용도
WO2018038803A1 (en) * 2016-08-26 2018-03-01 Nal Pharmaceutical Group Limited Compositions containing fusion protein of albumin and analogs thereof, methods for making and using the same
AU2016235424A1 (en) 2015-03-20 2017-10-05 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
RU2722849C1 (ru) 2019-12-25 2020-06-04 Владимир Глебович Лунин Рекомбинантный белок GBD-SSTad-SSTad, способ его получения и применения
RU2766292C1 (ru) * 2021-08-05 2022-03-14 Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) Состав вакцины против covid-19

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6316004B1 (en) * 1993-06-22 2001-11-13 T. Tikhonenko Chimeric somatostatin containing protein and encoding DNA, plasmids of expression, method for preparing chimeric protein, strain-producers, immunogenic composition, method for increasing the productivity of farm animals
US7186411B2 (en) * 2001-03-19 2007-03-06 Grisotech S.A. Vaccines absorbable by the transmucosal way

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3919411A (en) * 1972-01-31 1975-11-11 Bayvet Corp Injectable adjuvant and compositions including such adjuvant
US4342832A (en) 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
US4446235A (en) 1982-03-22 1984-05-01 Genentech, Inc. Method for cloning human growth hormone varient genes
JP2602968B2 (ja) 1987-11-04 1997-04-23 カリフォルニア バイオテクノロジー インコーポレイテッド 肺胞の界面活性タンパク類
AUPN999096A0 (en) * 1996-05-22 1996-06-13 Northstar Biologicals Pty Ltd Peptides, antibodies, vaccines & uses thereof
US6303584B1 (en) * 1996-11-20 2001-10-16 The University Of Montana Water soluble lipidated arabinogalactan
US6025368A (en) * 1997-02-25 2000-02-15 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Method for treating the symptoms of chronic stress-related disorders using IGF
US20070048860A1 (en) 1997-10-10 2007-03-01 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Carcinoembryonic antigen (CEA) peptides
CA2329755A1 (en) * 1998-06-20 1999-12-29 United Biomedical, Inc. Synthetic somatostatin immunogen for growth promotion in farm animals
US7018638B2 (en) * 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
MY129765A (en) * 2000-12-19 2007-04-30 Wyeth Corp Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
US6861410B1 (en) * 2002-03-21 2005-03-01 Chiron Corporation Immunological adjuvant compositions
PL213561B1 (pl) 2004-01-09 2013-03-29 Inst Biotechnologii I Antybiotykow Sposób otrzymywania plazmidu, plazmid oraz zastosowania
US7998930B2 (en) * 2004-11-04 2011-08-16 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified growth hormones
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US7884136B2 (en) 2005-06-27 2011-02-08 Biovail Laboratories International S.R.L. Modified-release formulations of a bupropion salt
GB0622282D0 (en) * 2006-11-08 2006-12-20 Novartis Ag Quality control methods
BRPI0914300B8 (pt) 2008-06-25 2021-05-25 Braasch Biotech Llc vacina para tratamento de obesidade
NZ590011A (en) 2008-06-25 2012-09-28 Braasch Biotech Llc Chloramphenicol acetyl transferase (cat)-defective somatostatin fusion protein and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6316004B1 (en) * 1993-06-22 2001-11-13 T. Tikhonenko Chimeric somatostatin containing protein and encoding DNA, plasmids of expression, method for preparing chimeric protein, strain-producers, immunogenic composition, method for increasing the productivity of farm animals
US7186411B2 (en) * 2001-03-19 2007-03-06 Grisotech S.A. Vaccines absorbable by the transmucosal way

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Endogenous growth hormone (GH)- releasing hormone is required for GH responses to pharmacological stimuli;craig A. Jaffe et al.;《the journal of clinical investigation》;19960228;第97卷(第4期);全文 *
余？.中国医学百科全书 微生物学.《中国医学百科全书 微生物学》.1984, *
叶维法等.肝病免疫学.《肝病免疫学》.1997, *

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Publication number Publication date
AU2009262243A1 (en) 2009-12-30
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