CN1201831A - 一种制备重组人促生长激素释放因子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明通过基因重组技术制备人促生长激素释放因子。采用“搭桥”的方法合成基因双链DNA,并且用融合蛋白的方法表达GRF基因,使其适合于在大肠杆菌中表达。使用该方法以简单程序、低成本获得高纯度、高活性的GRF蛋白。

Description

一种制备重组人促生长激素释放因子的方法

本发明涉及一种用遗传工程重组技术制备人促生长激素释放因子的方法。

生长激素释放因子(Growth Releasing Factor，GRF)是下丘脑中最后一个被发现和阐明的神经内分泌因子，1947年Green和Harris推测下丘脑中存在该生长因子，1964年Deuben和Meitas用下丘脑裂解物刺激大鼠垂体分泌生长激素这一实验证实了GRF的存在。1982年Vale和Guillemin两个小组分别从患胰腺肿瘤合并肢端肥大症患者的肿瘤组织中纯化了GRF，但两个小组得到的结果并不相同，Vale小组得到的GRF由40个氨基酸组成，而Guillemin小组得到的GRF则是多态的，分别由37、40、44个氨基酸组成，但它们有相同的N端序列，由此人们推断它们有可能是同一种多肽而降解程度不同，完整的GRF应由44个氨基酸组成，其他均为其降解产物，后来的试验也证实人促生长激素释放刺激因子是由44个氨基酸构成的小肽。1985年Mayo，KE等首次进行了GRF基因的序列测定工作，并将GRF基因定位于人20^#染色体，全长10kb，有五个外显子。免疫染色证明其正常分泌的部位是中枢神经系统下丘脑漏斗部和中部，其它部位也有少量分泌，通常异位大量分泌GRF表明有肿瘤的存在。正常人体内GRF的含量极低，降解比较迅速。生理学和病理学研究表明，GRF能高效、特异地刺激垂体前叶细胞分泌生长激素，并且仅保留其N端29个氨基酸即能保留其全部生物活性。这一特点很快受到人们注意，使之成为治疗生长激素缺乏症的潜在药物。

作为药物，GRF主要用于治疗因生长激素(Growth Hormone，GH)缺乏而引起的各种疾病，比如侏儒症等，特别是针对因下丘脑本身GRF分泌不正常而造成的垂体前叶分泌GH细胞的萎缩。其药理作用在于：(1)患侏儒症及因肾功能失调等原因而导致身高不能达到正常水平的儿童，经过长期、反复给药，刺激垂体细胞恢复功能，使GH分泌量达到正常儿童标准。1987年，英国伦敦St.Bartholomew’s医院R.J.M.Ross等人对18名患GH缺乏症的儿童采用一日二次注射GRF(29个氨基酸)进行治疗，结果12名患儿有明显的身高增长现象，同时，在1983-1985年间，Marie，C.；Stephen，M.及Genevieve，S.等人各自的研究均表明，GRF对正常人的GH含量没有很大影响，从而完全避免了因使用GRF而造成的副作用：特别是肢端肥大症。因此，在目前GH已经限制使用的状况下，GRF显然已经成为治疗GH缺乏症的首选替代药物；(2)中老年人及妇女的骨质疏松症。GRF可以促进骨组织、软骨组织细胞的有丝分裂，促进软骨基质的合成，增加成骨细胞数目，增强骨密度，加强骨骼硬度、韧性，对预防和治疗骨质疏松均有良效；(3)辅助药物。包括治疗骨折、截肢患者；促进烧伤、烫伤病人的恢复。1994年的美国专利5317012还表明，GRF能够增加T₄/T₈淋巴细胞比例，增加机体免疫力，提高抗感染能力，对治疗各种免疫缺乏症，特别是AIDS也是一种比较有效的辅助药物；(4)各种老年性疾病。随着人们年龄的增加，人体GH的分泌量呈下降趋势，从而造成机体各个器官的逐渐衰老，GRF能够不断刺激GH的分泌，保持体内GH的含量维持在一个稳定的浓度，延缓机体的衰老，保持机体旺盛的生命力，对治疗各种老年性疾病有很大帮助；(5)减肥药物。动物试验表明，GRF能够促进脂类代谢，糖类分解，增加蛋白质含量，因此，有人认为GRF也可以作为减肥药物的一种成份。

由于天然GRF在人体内含量极低，GRF的生产主要通过生化提纯---即从胰腺肿瘤中提取，或是化学合成：蛋白质的固定化合成的方法，成本很高，得率相对较低。1983年欧洲专利108387中描述了一种生产GRF的方法，他们应用固定化亚磷酸盐法，根据Guillemin小组由胰腺肿瘤组织中纯化的GRF氨基酸序列，反推出的GRF基因序列，在GRF序列的两端分别加上了EcoRI两个酶识别位点的3′端SalI酶识别位点的5′端，即在GRF两端加上了粘性末端，将这种结构的基因分18个片段，分别全序列合成GRF结构基因的两条链：编码链及其互补链，通过极其复杂的方式将各个片段连接起来，再经过EcoRI，PstI双酶切，切掉多余的片段，形成完整的GRF基因，再将其与原核表达质粒pRC23连接，转化大肠杆菌K12菌株，同时在该菌株中还含有低拷贝的pRK248cIts质粒。pRC23中含由λ噬菌体中的P_L启动子，pRK248cIts质粒中含抑制P_L启动子的cIts857基因，该基因为温度诱导型突变体，可以通过温度控制cI基因的活性，即30℃时，cI基因正常表达，P_L启动子受抑制，42℃时，cI蛋白降解，从而启动GRF基因的表达。该发明没有得到纯化的GRF蛋白。而事实上，由于GRF蛋白本身分子量很小，用这种方法表达的GRF蛋白很容易被大肠杆菌降解而得不到纯品。本发明在参考前人的基础上，又有了很大发展。首先，在设计GRF结构基因时，本发明根据1985年Mayo，KE等测定的人下丘脑GRF的基因序列，在不改变其氨基酸序列的前提下对GRF结构基因进行改造，使其适应于在大肠杆菌中表达，同时，由于小分子多肽的不稳定性，在实验设计上采用融合蛋白方法表达GRF蛋白，即在GRF基因的5′端加上融合蛋白配体基因，在配体与GRF基因之间再加上一个蛋白酶的识别位点，整个基因将在大肠杆菌中表达融合蛋白。纯化后的融合蛋白在蛋白酶的作用下将配体与GRF分开，这样经过一步很简单的分子筛分离即可得到GRF纯品。其次，本发明在GRF基因的合成方法上做了改进，分别从GRF基因的3′端和5′端，合成两段寡核苷酸序列，中间有十个碱基互补，虽然在基因两端也加上了限制酶切点，但合成的两个寡核苷酸片段在Klenow酶作用下，形成的是两端带有完整限制酶切点的GRF基因的平端序列，而不是如欧洲专利上提到的粘端序列，这样大大简化了实验步骤，合成好的寡核苷酸可以在30分钟内得到GRF基因，并且可以很方便地将其连接到大肠杆菌的克隆载体上，也有利于进一步的基因操作，详细的描述见下文。第三，本发明使用的载体是温度诱导型表达载体，比如由中国预防医学科学院病毒所设计的pBV220质粒，与pRC23不同的是，它含有源自λ噬菌体的P_LP_R串联启动子，同时质粒本身即带有cIts857基因，从而不必要求被转化的菌株必须含有cIts857基因，比如在欧洲专利中所描述的含有pRK248cIts质粒的大肠杆菌K12，可以转化任何大肠杆菌菌株，在本发明中使用的是大肠杆菌BL21，从而与欧洲发明有着很大区别。1987年Jamila和Anba等在大肠杆菌中表达了经过修饰的GRF，他们使用融合蛋白的方法，将phoS基因与经修饰的GRF基因融合，即在GRF的N端加上一个甲硫氨酸残基(Met)，并替代GRF中所有甲硫氨酸残基，在大肠杆菌中表达融合蛋白，纯化后用溴化氰(BrCN)切割phoS与GRF融合蛋白，但也未得到基因工程产品。到目前为止，尚未有GRF的基因工程产品问世，各大医院使用的仍为前两种方法得到的GRF，其成本高，纯化步骤复杂，无法大范围使用。

本发明的目的，在于克服以往生产中成本高、工序复杂的缺点，发明一种利用基因工程技术制备GRF的新方法，以降低成本，简化工作程序，得到高纯度、高活性、低消耗的成品。

本发明的技术路线详细描述如下：

根据1985年Mayo，KE等报导的GRF基因序列，将其编码区序列单独取出，如下所示：

        9          18          27          36          455′TAT GCA GAT GCC ATC TTC ACC AAC AGC TAC CGG AAG GTG CTG GGCTyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly

        54          63          72          81          90CAG CTG TCC GCC CGC AAG CTG CTC CAG GAC ATC ATG AGC AGG CAGGln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln

        99         108         117         126     132CAG GGA GAG AGC AAC CAA GAG CGA GGA GCA AGG GCA CGG CTT  3′Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu

在不改变其氨基酸序列的情况下，将部分不适宜在大肠杆菌中使用的密码子替换成使用频率较高的密码子，全序列合成经过修饰的GRF基因，采用“搭桥”的策略合成该基因双链DNA，5′端加限制酶识别位点，并将其克隆到载体pUC19上，如图1所示。

下面现分述部分密码子的修改可以是哪些：在Mayo，KE所测的GRF基因序列中，人体多用TAT作为酪氨酸Tyr的密码子，而根据大肠杆菌某些核糖体蛋白质中密码子使用频率表，在1209个密码子中TAT的使用频率为3，另一Tyr的密码子TAC的使用频率为13，显而易见，以TAC替换TAT，将有利于将酪氨酸残基加入蛋白质多肽链中。同样，以GCT(Ala密码子，使用频率95)替代GCA(45)、GCC(10)、GCG(28)，CTG(Leu，93)→CTT(4)、CTA(0)、CTC(3)等等也都将有利于GRF在大肠杆菌中的表达。现将可能在大肠杆菌中替换的密码子列于下表。

         3           6           9          12          15Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly5′TAT GCA GAT GCC ATC TTC ACC AAC AGC TAC CGG AAG GTG CTG GGC

 C   T   C   T           T   A TC        T   A   T       T

     G   A   G               G TCG           C   A

        18          21          24          27          30Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg GlnCAG CTG TCC GCC CGC AAG CTG CTC CAG GAC ATC ATG AGC AGG CAG

             T   T   A       G                 TC  CGT

             A                                     CGC

             G

        33          36          39          42Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg LeuCAG GGA GAG AGC AAC CAA GAG CGA GGA GCA AGG GCA CGG CTT  3′

     T   A TCC       G   A   T   T   T CGT   T   T   G

     C   C TCG           C   C   C     CGC       C

         T               T

由于GRF的分子量很小(5.3kd)，在大肠杆菌中很容易降解，这也是GRF至今没有得到纯品的原因之一，因此，本发明首先考虑将其连接到一个大蛋白上，联合表达。目前，这种例子很多，形成商品化的也有，比如葡萄球菌的SPA蛋白，人的碳酸酐酶和谷胱甘肽S-转移酶，大肠杆菌的β-半乳糖酐酶等等，1993年世界专利9201707提出了一种新的纯化方式：以融合蛋白形式表达小分子蛋白，特别是以碳酸酐酶为融合蛋白配体，在配体与小分子蛋白之间加入一个蛋白酶特别是肠激酶切点，表达的融合蛋白以亲和层析的方式一步纯化，但由于本发明使用的表达载体内的启动子效率很高，表达的蛋白难以迅速折叠，而以包涵体的形式出现，因此，不需要通过亲和层析，仅通过对包涵体的洗涤即可达到80％以上的纯度，因此，方法上与该专利有着很大的区别。其次，考虑将其连接到一个能够将GRF分泌到大肠杆菌胞质间或胞外的信号肽上，由于细胞胞间质和胞外的蛋白酶的含量大大低于细胞内，因此能够保护GRF不被迅速破坏。这样的信号肽也比较多，比如stII等，有文献报道信号肽stII能将约90％的表达产物分泌到胞外。本发明将这种大分子量蛋白配体或通过反向聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase ChainReaction，RT-PCR)将碳酸酐酶基因从人胎肝中调出来，或通过PCR反应将配体基因从别的质粒上调出来，克隆到pUC19载体上。在分别经序列测定分析验证后，将GRF基因与配体基因通过连接序列(Linker)头尾相连，中间的linker为蛋白酶识别序列，比如肠激酶或凝血酶的识别序列，经序列分析鉴定连接正确，不存在移码突变后，将该融合基因克隆到原核细胞温度诱导型表达载体如pBV220上，组装成原核高效表达系统。

该质粒转化大肠杆菌(E.coli)菌株，获得重组基因工程菌。质粒pBV220上含P_LP_R启动子及温度突变型的cIts857基因，菌株经28-30℃培养后，40-42℃诱导融合蛋白表达。SDS-PAGE电泳表明当配体蛋白为碳酸酐酶II时，融合蛋白分子量为36.96KD，以包涵体形式存在于大肠杆菌内。融合蛋白占菌体总蛋白的30％左右。GRF约占4.3％，配体蛋白为SPA的ZZ功能区时，融合蛋白的分子量为27KD，表达量也约有30％左右，GRF约占6％。

工程菌发酵及重组GRF的纯化。以M9CA为基础培养基，发酵过程中用葡萄糖作为补料。发酵参数如下：温度30-42℃，溶氧80-100％，pH6.8-7.2。发酵后工程菌经超声破碎，离心收集包涵体，去离子水洗涤，8mol/L尿素变性，分子筛分离后，1mol/L尿素复性而获得融合蛋白。融合蛋白经蛋白酶处理后，再通过分子筛分离，得到纯化的GRF。若GRF连接在信号肽上，则GRF不是以包涵体形式存在，GRF分泌在胞周间质或胞外，纯化则需要通过疏水柱、分子筛和离子交换的方法处理。

本产品的优越性在于：首次使用基因工程技术，得到了大量纯化的重组人促生长激素释放因子的基因工程产品，工艺流程简单，与传统的生产技术相比，极大地降低了生产成本，可以解决因价格昂贵而无法大量投入临床使用等问题，为GRF的大规模临床应用创造了条件。

附图说明：

图1为“搭桥”法合成GRF基因序列；

图2为质粒pBCG的构建图谱；

图3为质粒pJZG构建图谱；

图4为质粒pJSG构建图谱；

图5为pBCG质粒在大肠杆菌DH5α中的表达，从左到右泳道依次为蛋白分子量标准，pBCG1，pBCG2，pBCG3，pBCG4，pBV220对照。其中，pBCG4的表达量较高，转化大肠杆菌BL21后，表达量高于30％；

图6为pJZG质粒在大肠杆菌DH5α中的表达，从左到右依次为蛋白分子量标准，pJW2，pJW-CG1，pJW-CG2，pJW-CG3，pJZG1，pJZG2，pJZG3，pJZG4，pJZG5，pJZG6。其中，pJW-CG系列为CG基因连接到pJW2质粒上，因其表达量较低，在后面的工作中放弃了这种表达载体。pJZG6转化大肠杆菌BL21后，表达量也有所提高；

图7为质粒pJSG在大肠杆菌DH5α中的表达，该图表现的是两种浓度的胶，左为双层胶，下层胶浓度为20％，上层胶为10％，右为15％的单层胶，样品相同，但左面的胶分辨率高于右边，上样顺序依次为：EGF样品(分子量为6.7KD)，pJSG1-5号样品，pJW2对照，蛋白分子量标准，分子量标准从小到大依次为：14KD，21KD，31KD，40KD，42KD，55KD，66.2KD，97.4KD，由于没有小分子量的蛋白标准，因此采用表达的EGF为对照。实施例一：1、GRF基因全长序列的设计及合成

依据Mayo，KE的GRF序列，从新修改后合成的新序列如下：本发明使用“搭桥”法，具体方法见图1，即如合成引物一样，从两个方向合成GRF基因的一半，中间十个碱基互补，这两段寡核苷酸序列如下：

序列①

5′-GGTTTAAATACGCAGATGCTATTTTCACTAACAGCTACCGTAAAGTACTGGGTCAGCTGTC

    CGCTCGTAAGCTGCTGCAAGA-3′

序列②

3′-ACGACGTTCTATAGTACTCGGCAGTCGTCCCACTTTCGTTGGTCCTTGCACCACGTGCACG

    TGCAGCATTACTCCTAGGAA-5′两段基因先经过磷酸化反应，条件如下：

      2μl        DNA

      1μl        多聚核苷酸激酶(PNK)

      2μl        10xPNK缓冲液

      1μl        4xdATP(10mmol/L)

     13μl        去离子水37℃反应30分钟，65℃10分钟，之后，在大片段(Klenow)酶的作用下，两条链分别从5′端向3′端延伸，从而得到GRF基因正反两条链的全序列。反应条件如下：

      2μl        5′DNA链

      2μl        3′DNA链

      2μl        4xdNTP(2.5mmol/L)

      1μl        Klenow酶(3U/μl)

      3μl        10x连接缓冲液

     10μl        去离子水37℃反应4小时，即得到GRF基因全序列。将GRF基因克隆到大肠杆菌pUC19载体上，重组质粒命名为pUG₀，经酶切初步鉴定为GRF基因后，进行核酸的序列分析，进一步验证GRF基因的正确性。2、融合蛋白基因的构建及全序列的测定

本发明选择人II型碳酸酐酶作为融合蛋白的配体，根据Gene Bank上Forsman，C等报道的II型碳酸酐酶结构基因序列，合成5′和3′端引物，5′端引物前加EcoRI位点，即：5′-CTATGAATTCATGTCCCATCACTGGGGG-3′(划线处为EcoRI位点)，3′端引物设计时删除CAII基因786处HindIII位点之后的两个密码子及终止密码子，加上肠激酶的酶切位点的前五个氨基酸Val-Asp-Asp-Asp-Asp的密码子GTTGACGACGACGAT及EcoRV位点，形成3′端引物，即：5′-GGGGTAAGATATCGTCGTCGTCAACGAAAGCTTTGATTTGCCTGT-3′(划线处依次为EcoRV、HindIII位点)，使用DNA合成仪合成这两个引物，纯化后准备用于PCR。以人胚肝为材料，提取胚肝总RNA，用RT-PCR的方法扩增CAII基因，CAIImRNA模板的制备材料源于人胚肝，从胚肝组织中提取总RNA，方法按Promega公司提供的产品指南用异硫氰酸胍提取，以此为模板，进行RT-PCR，反应体系如下：

第一条链的合成：使用Boehringer公司cDNA合成试剂盒，反应体系为：

        5μl        RNA(2-5μg)

        4μl        5x反转录酶缓冲液

        1μl        RNasin(50U)

        2μl        4xdNTP(各2.5mmol/L)

        2μl        3′端引物(50pmol)

        2μl        AMV反转录酶

        加无RNase水至20μl。混匀，42℃反应1小时，得到第一条cDNA链。

PCR扩增CAII基因：

        5μl        cDNA

       10μl        10xTaq酶缓冲液(含MgCl₂)

        1μl        5′引物(50pmol)

        2μl        3′引物(50pmol)

        8μl        4xdNTP(各2.5mmol/L)

        1μl        Taq聚合酶(1-2U)

        加去离子水至100μlPCR反应条件为：94℃变性45秒，50℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环后，取10μl反应混合物以0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，观察到一条700bp左右的带，与CAII基因编码区长度近似，将该反应物作加磷反应后，补平，平端连接到pUC19的SmaI位点，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。经酶切鉴定证实，CAII基因343位点为限制酶PstI切割位点，从该点将CAII分成两个亚克隆，分别测序，确定后，定名为pUCA。将pUG₀用DraI和BamHI消化，回收约200bp小片段(GRF片段)，pUCA用EcoRI+EcoRV消化，回收小片段，将两个片段与羟EcorI+BamHI双酶切的pUC19质粒用T₄DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，测序确定EcoRV/DraI平端连接处阅读框架是否正确。该质粒定名为pUCG，CA-GRF全序列如下：

         9          18          27          36          45          545′ATG TCC CAT CAC TGG GGG TAC GGC AAA CAC AAC GGA CCT GAG CAC TGG CAT AAGMet Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp His Lys

        63          72          81          90          99         108GAC TTC CCC ATT GCC AAG GGA GAG CGC CAG TCC CCT GTT GAC ATC GAC ACT CATAsp Phe Pro Ile Ala Lys Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp Ile Asp Thr His

       117         126         135         144         153         162ACA GCC AAG TAT GAC CCT TCC CTG AAG CCC CTG TCT GTT TCC TAT GAT CAA GCAThr Ala Lys Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ser Val Ser Tyr Asp Gln Ala

       171         180         189         198         207         216ACT TCC CTG AGG ATC CTC AAC AAT GGT CAT GCT TTC AAC GTG GAG TTT GAT GACThr Ser Leu Arg Ile Leu Asn Asn Gly His Ala Phe Asn Val Glu Phe Asp Asp

       225         234         243         252         261         270TCT CAG GAC AAA GCA GTG CTC AAG GGA GGA CCC CTG GAT GGC ACT TAC AGA TTGSer Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys Gly Gly Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Arg Leu

       279         288         297         306         315         324ATT CAG TTT CAC TTT CAC TGG GGT TCA CTT GAT GGA CAA GGT TCA GAG CAT ACTIle Gln Phe His Phe His Trp Gly Ser Leu Asp Gly Gln Gly Ser Glu His Thr

       333         342         351         360         369         378GTG GAT AAA AAG AAA TAT GCT GCA GAA CTT CAC TTG GTT CAC TGG AAC ACC AAAVal Asp Lys Lys Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys

       387         396         405         414         423         432TAT GGG GAT TTT GGG AAA GCT GTG CAG CAA CCT GAT GGA CTG GCC GTT CTA GGTTyr Gly Asp Phe Gly Lys Ala Val Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Leu Gly

       441         450         459         468         477         486ATT TTT TTG AAG GTT GGC AGC GCT AAA CCG GGC CTT CAG AAA GTT GTT GAT GTGIle Phe Leu Lys Val Gly Ser Ala Lys Pro Gly Leu Gln Lys Val Val Asp Val

       495         504         513         522         531         540CTG GAT TCC ATT AAA ACA AAG GGC AAG AGT GCT GAC TTC ACT AAC TTC GAT CCTLeu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Ala Asp Phe Thr Asn Phe Asp Pro

    549         558         567         576         585         594CGT GGC CTC CTT CCT GAA TCC TTG GAT TAC TGG ACC TAC CCA GGC TCA CTG ACCArg Gly Leu Leu Pro Glu Ser Leu Asp Tyr Trp Thr Tyr Pro Gly Ser Leu Thr

    603         612         621         630         639         648ACC CCT CCT CTT CTG GAA TGT GTG ACC TGG ATT GTG CTC AAG GAA CCC ATC AGCThr Pro Pro Leu Leu Glu Cys Val Thr Trp Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser

    657         666         675         684         693         702GTC AGC AGC GAG CAG GTG TTG AAA TTC CGT AAA CTT AAC TTC AAT GGG GAG GGTVal Ser Ser Glu Gln Val Leu Lys Phe Arg Lys Leu Asn Phe Asn Gly Glu Gly

    711         720         729         738         747         756GAA CCC GAA GAA CTG ATG GTG GAC AAC TGG CGC CCA GCT CAG CCA CTG AAG AACGlu Pro Glu Glu Leu Met Val Asp Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn

    765         774         783         792         801         810AGG CAA ATC AAA GCT TTC GTT GAC GAC GAC GAT AAA TAC GCA GAT GCT ATT TTCArg Gln Ile Lys Ala Phe Val Asp Asp Asp Asp Lys Tyr Ala Asp Ala Ile Phe

    819         828         837         846         855         864ACT AAC AGC TAC CGT AAA GTA CTG GGT CAG CTG TCC GCT CGT AAG CTG CTG CAGThr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln

    873         882         891         900         909         918GAT ATC ATG AGC CGT CAG CAG GGT GAA AGC AAC CAG GAA CGT GGT GCA CGT GCAAsp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala

    927CGT CTG TAA 3′Arg Leu ***质粒pUCG的构建见图2。3、融合蛋白在大肠杆菌中的表达

将质粒pUCG1用EcoRI+SalI双酶消化，回收CAII-GRF片段，将其连接到pBV220同样位点。pBV220为一种原核表达型质粒，含λ噬菌体P_LP_R启动子、CIts857阻抑蛋白基因和5sRNA转录终止序列t₁t₂等调控元件，重组后质粒转化大肠杆菌(E.coli)DH5α株系，经酶切鉴定CAII-GRF基因插入后，该质粒命名为pBCG，质粒pBCG的构建见图2，并转化E.Coli BL21菌株。

挑含质粒pBCG的单菌落到3ml含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中，30℃振荡培养过夜，按10％接种量转种于20mlLB-Amp培养基中，30℃培养至O.D₆₀₀值达0.4-0.7，升温至42℃，诱导5小时。取1ml培养液离心，收集菌体，溶于100gl1x蛋白上样缓冲液：

         50mmol/L        Tris-cl，pH6.8

        100mmol/L        DTT

           (或5％      β-ME)

              2％      SDS

            0.1％      溴酚蓝

             10％      甘油中，取10μl作10％SDS-PAGE电泳，鉴定表达产物，挑选表达量最大的菌株，做为菌种存于甘油管中，定名为PBCG1。

取PBCG1菌种划单菌落，挑单菌落于6mlLB-Amp培养基中过夜培养，2-5％接种于100ml含100μg/mlAmp的M9CA：

           16.8g/l       Na₂HPO₄·12H₂O

            3.0g/l       KH₂PO₄

            0.5g/l       NaCl

            1.0g/L       NH₄Cl

           246mg/L       MgSO₄·7H₂O

             1.5％       Glucose

             1.5％       Casamino Acids

             4mg/L       Thiamine-HCl培养基中，摇瓶培养至O.D6₀₀达0.4-0.7，升温至42℃诱导表达3-5小时，离心收集菌体，用超声裂解液：

         50mmol/L     Tris-cl

          1mmol/L     EDTA

        100mmol/L     NaCl洗一次，保存于-20℃或立即用于表达产物的鉴定与纯化。4、表达产物鉴定(1)SDS-PAGE凝胶电泳鉴定产物表达量：

样品处理和点样：1ml诱导后菌液离心后沉淀悬浮于100μl1x上样缓冲液，置沸水浴中5分钟，溶解沉淀；纯化的样品，取相当于1ml菌液的样品量，沉淀加100μl 1x上样缓冲液，上清加等体积2x上样缓冲液：

         100mmol/L     Tris-cl，(pH6.8)

         200mmol/L     DTT

           (或10％    β-ME)

               4％      SDS

             0.2％     溴酚蓝

              20％      甘油上样量加倍，对照菌或诱导前细菌采取同样方法处理。

凝胶染色：考马斯亮兰。

表达水平：凝胶中蛋白质的染色条带用双波长扫描仪作黑度扫描，计算机处理，打印蛋白CA-G₀峰所占百分比。

结果：42℃诱导的PBCG1菌体裂解液在SDS-PAGE胶上分子量相当于36.96KD处有一条深染带，对照经同样处理的菌体裂解液在同样部位带型极浅，扫描结果表明CA-G₀占菌体总蛋白30％左右。(2)表达产物的免疫印迹(Western Blot)检测：

表达产物经SDS-PAGE电泳后，将不经过固定的PAGE胶上蛋白条带经电转转印到硝酸纤维素膜上，用GRF抗体做免疫印迹，证实融合蛋白中带有GRF蛋白。详细方法参见《分子克隆》上相应章节。(3)表达产物在菌体内存在状态：

菌体超声裂解后，离心，将含同样蛋白量的上清与沉淀分别点样，SDS-PAGE电泳显示：融合蛋白主要存在于包涵体内，上清中也有，但染色很浅，表明CA-G₀表达产物大部分形成了包涵体。5、工程菌的发酵

LKB-Bromma罐发酵：PBCG1单菌落在6mlLB-Amp培养液中，30℃过夜培养，做为一级种子液，供发酵用。

按1∶50比例，将一级种子液接种于300mlM9CA-Amp培养液中，30℃摇16小时，做为二级种子液，供发酵用。

将发酵灌高压蒸汽灭菌(15P，30分钟)，冷却后安放至操作台上，设定温度为30℃，pH7.0，溶氧83％，搅拌速度450次/分，各项参数稳定后，1∶10接种二级种子液。

在维持上述参数的条件下发酵，5小时后，将温度升至42℃继续诱导8-10小时，自动调节pH6.7-7.2左右，溶氧此时大于100％。6、发酵后的纯化

将发酵菌液收集，离心，回收的菌体加大量超声裂解液，超声破碎，反复4000rpm离心，收集包涵体，加去离子水反复洗涤包涵体，最后一次收集包涵体后，加含8mol/L尿素的变性液：

           8mol/L      尿素

         50mmol/L      Tris-cl(pH8.5)

          1μl/ml      β-ME溶解沉淀。将溶解后的包含体过Sephrose CL600分子筛柱。该柱先用变性液(无β-巯基乙醇)平衡过夜，流速100ml/hr，调整包涵体浓度为10-15mg/ml，上样，用平衡液洗柱，收集每个峰的样品，用12％SDS-PAGE检测，纯度可达95％，合并含CA-G₀的各段溶液，分别用复性液(1)：

          50mmol/L     Tris-HCl(pH9.0)

            1mol/L     尿素复性液(2)、复性液(3)(2、3与1的区别在于50mmol/L的Tris-cl的pH值依次为pH8.5，8.0)透析，最后用无尿素的复性液(3)透析后，回收样品。7、酶切反应

透析后的样品加至终浓度5-7mmol/LCaCl₂，1∶500(W/W)肠激酶，25℃-37℃反应16-20小时，SDS-PAGE电泳检测酶切状况。肠激酶的切割效率可达80％以上。

将上述液体仍过分子筛柱，平衡液为50mmol/LTris-cl(pH8.0)，平衡过夜后上样，洗脱液与平衡液相同，收集各个洗脱峰，用SDS-PAGE检测，此时GRF的纯度可达95％。合并含G₀片段的各段溶液，超滤浓缩，至此，GRF总表达量约占总菌体蛋白量的1％。8、免疫印迹

将经过酶切的GRF片段走SDS-PAGE电泳，用免疫印迹法证明切下的蛋白为GRF。9、活性鉴定

取大鼠垂体细胞做活性检测。具体方法如下：切下大鼠(～250克)头部，取出去除中后叶的垂体，逐次放入三个加有培养液的平皿中漂洗，之后，剪碎成约1mm³的小块，再次将其转入小方瓶中漂洗，组织块沉降后，吸出上层培养液，加入酶消化液(2.5mg/ml胶原酶，1mg/ml透明质酸酶，0.4-0.5mg/mlDNA酶I)，轻轻吹打，放入30℃水浴摇床，隔15分钟轻轻吹打数次，同时监测消化程度，3-5小时后，加入等体积培养基终止消化，1000rpm离心8分钟，所得细胞或细胞团块加入适量培养液(DMEM培养基，含10％小牛血清，1％谷氨酰胺)，尽量吹散细胞团，接种于24孔板中。三天后，细胞完全贴壁，换成无血清培养基，即可测活。测活检测的是GH及cAMP的含量变化，具体方法参照DuPont NEN公司cAMP-RIA-Kit及Boehringer Mannheim公司GH-RIA-Kit说明书。10、N-端氨基酸序列测定

将得到的GRF因子用氨基酸序列测定仪鉴定其N-端15个氨基酸序列。实施例二：

实验二与一的不同主要在于融合蛋白基因的不同，实验二构建的是SPA-G₀融合蛋白基因。1、pNE载体的构建

首先从设计引物，根据Pharmacia产品目录上的载体pEZZ18基因序列，设计SPA蛋白Z功能区两边的引物，5′引物：5′-TATTCATATGAAAAAGAAAAACATTTAT-3′(划线部为NdeI位点)，3′引物：5′-GTGTGAATTCGCATTTGCTGCAGGTGTTAC-3′(划线部为EcoRI位点)，以pEZZ18为模板，PCR反应条件：94℃30秒，54℃30秒，72℃45秒，30个循环后PCR产物分别用EcoRI、NdeI双酶切，低熔点胶回收大片段，并将其连接到载体pET22b(+)的同样位点，构建成pNE质粒。2、ZZ-G₀融合蛋白基因的构建

再将CA-G₀片段用HindIII消化，补平，再用SalI酶切，回收linker-G₀片段，将其连接到经过同样处理的pNE质粒，以保证阅读框正确，序列测定验证两段基因连接正确后，再用NdeI、BamHI双酶切，回收ZZ-G₀片段，将其连接到pJW2质粒的NdeI和BamHI位点，构建成pJZG表达质粒。构建方法见图3。该质粒的表达条件与pBV220质粒相同。

余下的表达与纯化均与实施例一相同。实施例三：

本例主要是构建含有信号肽的GRF基因，信号肽stII来源于本室自建的pJW-stII质粒，合成G₀连接到stII上的5′引物5′-GGACGCGTACGCTTACGCAGATGCTATTTTC-3′(划线处为MluI位点)，3′引物使用pUC19反向测序引物，以pUCG作为模板，PCR反应条件为：95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30个循环，得到的片段用MluI和SalI消化，连接到pJW-stII质粒上同样位点，即得到表达质粒pJSG，构建方法见图4，stII-G₀基因序列如下：

          9          18          27          36          455′ ATG AAA AAG AAT ATC GCA TTT CTT CTT GCA TCT ATG TTC GTT TTT

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe

         54          63          72          81          90

TCT ATT GCT ACA AAC GCG TAC GCT TAC GCA GAT GCT ATT TTC ACT

Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr

         99         108         117         126         135

AAC AGC TAC CTG AAA GTA CTG GGT CAG CTG TCC GCT CGT AAG CTG

Asn Ser Tyr Leu Lys Val Leu Gly Gln Leu Ser Ala Arg Lys Leu

        144         153         162         171         180

CTG CAA GAT ATC ATG AGC CGT CAG CAG GGT GAA AGC AAC CAG GAA

Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly Glu Ser Asn Gln Glu

               189         198

       CGT GGT GCA CGT GCA CGT CTG TAA 3′

       Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu ***

表达质粒转化E.coliDH5α，表达条件与pBV220相同，但表达产物经SDS-PAGE电泳表明在胞间质及胞外即培养液中，胞间质的提取方法如下：

诱导后的培养物离心，上清即为胞外液，可直接用于纯化，取沉淀加1/2体积预冷的高渗液：20％蔗糖；30mMTris-Cl(pH8.0)；1mMEDTA(pH8.0)悬浮，冰浴15分钟，12,000离心10分钟，弃上清，用适量低渗液悬浮，冰浴15分钟，12000离心10分钟，取上清，即为胞间质。表达量约为1％。

胞间质或培养液中GRF的纯化主要是：首先过疏水柱，再过离子交换柱，最后过分子筛柱，纯化后纯度可达90％。鉴定方法与实施例一相同。

Claims (19)

1.一种制备重组人促生长激素释放因子的方法其特征在于用遗传工程的方法合成编码GRF蛋白的结构基因和以融合蛋白的形式在微生物中表达的GRF基因。

2.按照权利要求1所述的方法其特征在于编码GRF蛋白的结构基因如下：

    10         20         30         40         50         60TTTAAATACG CAGATGCTAT TTTCACTAAC AGCTACCTGA AAGTACTGGG TCAGCTGTCCAAATTTATGC GTCTACGATA AAAGTGATTG TCGATGGTCT TTCATGACCC AGTCGACAGG

    70         80         90        100        110        120GCTCGTAAGC TGCTGCAAGA TATCATGAGC CGTCAGCAGG GTGAAAGCAA CCAGGAACGTCGAGCATTCG ACGACGTTCT ATAGTACTCG GCAGTCGTCC CACTTTCGTT GGTCCTTGCA

   130        140        150GGTGCACGTG CACGTCTGTA ATGAGGATCCCCACGTGCAG CTGCAGACAT TACTCCTAGG

3.按照权利要求2所述的编码GRF蛋白的结构基因其特征在于其结构基因两端有限制酶识别位点。

4.按照权利要求2所述的编码GRF蛋白的结构基因其特征在于其基因序列5′一端限制酶位点为DraI识别位上。

5.按照权利要求1所述的方法其特征在于以融合蛋白形式表达的GRF基因为其结构基因和配体基因。

6.按照权利要求5所述的GRF基因其特征在于配体基因为碳酸酐酶。

7.按照权利要求1所述的方法其特征在于以融合蛋白形式表达的GRF基因，其5′端加上一个linker连结配体蛋白基因，其中，linker为一种蛋白酶的识别位点。

8.按照权利要求7所述的蛋白酶其特征在于所用的蛋白酶为肠激酶，其识别位点为-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-。

9.按照权利要求1所述的方法其特征在于以融合蛋白形式表达的GRF基因配体基因与结构基因间的linker 3′端的限制识别位点为EcoRV识别位点。

10.按照权利要求1所述的方法其特征在于以融合蛋白形式表达的GRF基因的5′端加上一段大肠杆菌信号肽基因。

11.按照权利要求9所述的方法其特征在于信号肽基因为stII。

12.按照权利要求10所述的方法其特征在于与信号肽stII连接的GRF基因5′端的限制酶识别位点为MluI识别位点。

13.按照权利要求9所述的方法其特征在于与信号肽stII连接的GRF结构基因如下：

    10         20         30         40         50         60ACGCTGACGC TTACGCAGAT GCCTATTTTC ACTAACAGCT ACCTGAAAGT ACTGGGTCAGTGCGACTGCG AATGCGTCTA CGCATAAAAG TGATTGTCGA TGGACTTTCA TGACCCAGTC

    70         80         90        100        110        120CTGTCCGCTC GTAAGCTGCT GCAAGATATC ATGAGCCGTC AGCAGGGTGA AAGCAACCAGGACAGGCGAG CATTCGACGA CGTTCTATAG TACTCGGCAG TCGTCCCAGT TTCGTTGGTC

   130        140        150GAACGTGGTG CACGTGCACG TCTGTAATGA GGATCCCTTGCACCAC GTGCACGTGC AGACATTACT CCTAGG

14.按照权利要求1所述的方法其特征在于将融合蛋白基因克隆到原核温度诱导表达载体上，组装成表达质粒。

15.按照权利要求1所述的方法其特征在于将融合蛋白基因克隆到表达载体pBV220上。

16.按照权利要求1所述的方法其特征在于将融合蛋白基因克隆到表达载体pJW2上。

17.按照权利要求1所述的方法其特征在于重组质粒在大肠杆菌中表达。

18.按照权利要求1所述的方法其特征在于工程菌的发酵条件为

               温  度    28-42℃

               溶  氧    80-100％

               pH        6.8-7.2

19.按照权利要求1所述的方法其特征在于工程菌的最佳发酵条件为：

               生长温度  30℃

               诱导温度  42℃

               溶    氧  83％

               pH        7.0

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