CN1692121A

CN1692121A - 一种编码鸡ⅱ型胶原蛋白的全长多核苷酸序列及其用途

Info

Publication number: CN1692121A
Application number: CNA2003801004387A
Authority: CN
Inventors: 奚永志; 习彩霞
Original assignee: Affiliated Hospital of Academy of AMMS
Current assignee: Affiliated Hospital of Academy of AMMS
Priority date: 2002-11-14
Filing date: 2003-11-14
Publication date: 2005-11-02
Also published as: JP2006512063A; EP1584624A1; WO2004052910A1; US20060276383A1; CN101899444A; AU2003284807A1; EP1584624B1; US7973010B2; CN1500876A; EP1584624A4

Abstract

本发明涉及一种包含如SEQ ID NO：1所示编码全长鸡II型胶原蛋白的多核苷酸序列之核酸分子，或其具有相同生物学功能的片段；及其所编码的鸡II型胶原蛋白。本发明还涉及一种制备所述鸡II型胶原蛋白的方法，以及由本发明所述方法制备的鸡II型胶原蛋白用于制备治疗和/或预防类风湿性关节炎的药物的用途。本发明特别涉及一种用于预防和/或治疗骨关节炎、类风湿性关节炎的药物组合物，以及食品或饮料组合物或食品添加剂组合物，其中含有本发明方法制备的所述鸡II型胶原蛋白。本发明还涉及所述核酸分子用于基因治疗的用途。

Description

一种编码鸡 II型胶原蛋白的

全长多核苷酸序列及其用途发明领域

本发明涉及一种包含如 SEQ ID NO: 1所示编码全长鸡 II 型胶原蛋白的多核苷酸序列之核酸分子，或其具有相同生物学功能的片段；及其所编码的鸡 II型胶原蛋白。本发明还涉及一种制备所述鸡 II型胶原蛋白的方法，以及由本发明所述方法制备的鸡 II型胶原蛋白用于制备治疗和 /或预防类风湿性关节炎的药物的用途。本发明特别涉及一种用于预防和 /或治疗骨关节炎、类风湿性关节炎 (RA)的药物组合物，以及食品或饮料组合物或食品添加剂組合物，其中含有本发明方法制备的所述鸡 II型胶原蛋白。本发明还涉及所述核酸分子用于基因治疗的用途。发明背景

类风湿性关节炎是严重影响人类健康的常见病、多发病，由于迄今为止对其病因及其发病机制不甚了解，因此控制炎症、緩解症状、维持关节功能仍是目前 RA治疗的主要手段，远未达到控制关节损伤的目标。近年来，随着分子生物学技术的发展，对 RA 研究取得了巨大进展，尤其是随着对其发病机制认识的不断深入，新的治疗方法和策略也相应产生。

1993 年，美国科学家首次在《科学》（ Trentham DE， Dynesius-Trentham RA, Orav EJ, et al. Science, 1993,261: 1727-1730 )报道了他们用天然鸡 II型胶原蛋白（鸡 CCII ) 治疗 RA 患者获得巨大成功的研究结果，立刻引起全世界对这一疗法的高度重视。目前美国、英国、法国等发达国家正在进行鸡 II型胶原蛋白治疗 RA的 ΙΙ-ΙΠ期临床实验研究。从已发表的研究结果综合分析可以得出如下基本结论：口服耐受的确为 RA的治疗开辟了一条能标本兼治极具前景的新途径、新策略和新疗法

(Trentham DE, Dynesius-Trentham RA, Orav EJ, et al.， Science, 1993,261: 1727-1730，)。

目前，在鸡 II型胶原蛋白还未完成 ΙΙ-ΠΙ期临床实验之前，欧美发达国家制药公司纷纷将鸡 II型胶原蛋白制成食品添加剂，以避开冗长烦瑣的药物审批。然而，纵观目前国际上探索口服免疫耐受治疗 RA所用的均是天然鸡 II型胶原蛋白，其最大的缺陷就在于： 1 )不同公司生产制备的天然鸡 II型胶原蛋白质量不同，即便是同一公司所生产的不同批号的鸡 II型胶原蛋白产品质量也会不同。从而也就难以确保疗效的一致性、连续性。 2 )天然鸡 II 型胶原蛋白提取和制备所需人力物力甚大。

本发明人提出了解决上述问题的新思路：即采用基因工程方法重組生产鸡 II 型胶原蛋白。为此，提出克隆其编码基因，即 CCOL2A1基因，并实现高效表达，重组生产鸡 II型胶原蛋白的设想。本发明就是基于发明人首次克隆成功编码鸡 II型胶原蛋白的全长多核苷酸序列 -CCOL2A1 cDNA而完成的。发明概述

本发明一个方面涉及一种如 SEQ ID NO: 1所示包含编码全长鸡 II型胶原蛋白的多核苷酸序列之核酸分子，或其具有相同生物学功能的片段。

本发明又一方面涉及由本发明所述核酸分子编码的鸡 II 型胶原蛋白，或其具有相同生物学活性的片段。

本发明另外涉及一种含有本发明所述编码鸡 II 型胶原蛋白的核酸分子或其具有相同生物学功能的片段的重组表达载体。

本发明又一方面涉及一种由上述重组表达载体转化的宿主细胞，其能够表达鸡 II型胶原蛋白，或其具有相同生物学活性的片段。

本发明再一方面涉及一种制备所述鸡 II型胶原蛋白的方法，其中包括

1) .用本发明所述重组表达载体转化合适的宿主细胞；

2) .在合适的培养基中及适当的培养条件下培养宿主细胞；

3) .从培养基或细胞中分离、纯化目的蛋白质。

本发明还涉及了本发明所述鸡 II 型胶原蛋白用于制备治疗和 /或预防类风湿性关节炎的药物的用途。

本发明特别涉及了一种用于预防和 /或治疗骨关节炎、类风湿性关节炎的药物组合物，其中包含治疗有效量的由本发明所述方法制备的鸡 II型胶原蛋白，和任选的，药学可接受的载体。

本发明还包括食品或饮料组合物，其特征在于包含一定量的由本发明所述方法制备的鸡 II型胶原蛋白。

本发明也包括一种食品添加剂组合物，其中包含一定量的由本发明所迷方法制备的鸡 II型胶原蛋白。

本发明还包括了本发明所述核酸分子或其片段用于基因治疗的用途。发明详述

口服耐受是自九十年代国际上兴起治疗自身免疫病的特异性免疫疗法之一，也是近年来免疫学研究领域中最活跃、最富有成效的领域之一。它是指口服某种蛋白质抗原，随后再用该抗原进行胃肠外免疫，引起机体对该抗原产生全身性低免疫应答状态。现已知介导口服耐受的主要机制包括自身细胞抑制、克隆无能、克隆清除以及旁观者抑制，这还远不是其机制的全部。其中决定因素是抗原的用量、种类来源、性质、抗原递呈处理的过程以及宿主的遗传背景和发育程度。

从已发表的研究结果综合分析可以得出如下基本结论： 1 ) . 口服耐受的确为 RA的治疗开辟了一条能标本兼治极具前景的新途径、新策略和新疗法； 2 ) . 口服耐受鸡 II型胶原蛋白的确对相当一部分 RA患者疗效十分显箸； 3). 鸡 II型胶原蛋白的疗效要远好与其它物种来源的 II型胶原蛋白，因其富含大量的硫酸软骨素 A和粘蛋白（proteoglycans), 而粘蛋白中破酸葡糖胺含量最高，它们有着强有力的抗炎作用和软骨修复作用；尤其是来源于 6-8 周龄雏鸡胸骨的鸡 II型胶原蛋白其含量最高； 4). 此外，鸡 II型胶原蛋白中还含有抗氧化作用的粘蛋白，又称之为软骨基质糖蛋白（CMGP), 它能有效地減少氧化作用对软骨细胞的损伤； 5 ) . 鸡 II型胶原蛋白能有效防止蛋白酶对关节软骨的消化破坏，重新编程已被破坏的软骨细胞和细胞因子，从而明显减少炎症的发生； 6 ). 鸡 II型胶原蛋白能促进软骨细胞及粘蛋白的合成，增加关节滑液及透明质酸的分泌； 7 ) . 鸡 II型胶原蛋白是强有力的抗炎剂和疼痛緩解剂； 8 ) . 鸡 II型胶原蛋白治疗十分安全无任何毒副作用，这是目前任何其它治疗 RA药物所不能比拟的。

目前，口服 II型胶原蛋白诱导机体产生免疫耐受已成为有效治疗类风湿关节炎极为重要的新策略。为了提供大量、优质鸡 II 型胶原蛋白用于上述治疗，本发明人摒弃传统的从天然来源中提取、纯化的方法，采用基因工程方法重组生产鸡 II型胶原蛋白。

为此，本发明人提出克隆 CCOL2A1基因并高效表达重組生产 CCII的设想，同时还可深化对 CCOL2A1基因的全面认识与了解。因为迄今为止，国际上虽已成功地克隆了人、犬、鼠 COL2A1基因及并进行了染色体上的定位，但对于具有如此重大药用价值、治疗价值和经济价值的 CCOL2A1基因尚未有克隆成功的报道。亦即，有关 CCOL2A1全长 cDNA与基因组 DNA的克隆、 CCOL2A1在染色体上的定位、 CCOL2A1 在各组织中的构成性表达、 CCOL2A1 相关生物信息学以及重組 CCOL2A1的表达研究在国际上还是一个空白。

由于编码鸡 II型胶原蛋白的 cDNA基因序列较长，而目前对其功能区的 cDNA序列所知甚微，因此获得编码鸡 II型胶原蛋白三螺旋区的 cDNA无疑是非常重要。由于 II型胶原具有复杂的二级结构，高重复序列，高 GC含量（平均 GC含量大于 70%, 个别区域 GC 含量高达 80% ) (Nah DH, Upholt WB., J Biol Chem，1991, 266 34:23446-23452),因此，直接进行 PCR非常困难。

为此，我们首先采用 Goldkey软件对已知的编码鸡 II型胶原蛋白 3，原肽区 cDNA序列进行酶切位点分析，尝试采用限制性内切酶不完全消化 cDNA, 再用消化后的 cDNA进行 C端原肽区的 PCR 扩增的策略获得成功。鉴于编码鸡 II 型胶原蛋白的 cDNA基因序列较长，我们将 cDNA分成五部分分别进行 PCR扩增，并使各扩增片断彼此之间重叠至少 50bp，便于最后采用 SOE-PCR策略将各 cDNA片段进行首尾连接。针对编码鸡 II型胶原蛋白胶原基因中的高 GC含量，在 PCR扩增中应选用适宜扩增高 GC含量且保证性强的 Tag酶。

最终本发明人获得了长度为 4837bp的 CCOL2A1全长 cDNA, 它包括 4260bp 开放阅读框和 520bp 的 3 '非翻译区。将其插入 pGEM-T载体进行序列测定证实，该 cDNA序列为 CCOL2A1所特有的迄今未曾报道过的基因序列。序列测定结果登录于 GenBank (AY046949)。

已有的研究表明，鸡 II型胶原蛋白基因组 DNA具有复杂的结构。鉴于国际上迄今为止对于 CCOL2A1基因組 DNA尚无任何详细研究资料加以阐述这一事实，我们在成功地克隆了编码 CCOL2A1全长 cDNA的基础上，随后又对 CCOL2A1基因組 DNA 进行了克隆分析。由于 CCOL2A1基因组 DNA具有含高量 GC、重复序列多、引物非特异结合部位太多等复杂的结构，最初我们通过 PCR对鸡外周血细胞（ EDTA抗凝）中提取的 DNA进行扩增，仅能获得 CCOL2A13，端 5494bp的片段，而对 3，端以外的基因組序列，无论如何调整模板、引物及 PCR扩增条件，均未能获得该目的基因。随后，又对从鸡基因组 DNA文库中筛选到的阳性克隆进行测序，但也因高 GC含量及 PolyT结构限制了测序反应的进行，使测序信号中断。

为此，我们采取了利用已知的外显子序列，设计多个测序引物，才使 CCOL2A1基因组 DNA的测序得以完成。最终我们获得长度为 12003bp的 CCOL2A1基因组 DNA序列，其中包含 45个外显子和 44个内含子。经查新检索证实，该基因組 DNA序列为 CCOL2A1 基因组所特有的国际上未曾报道过的。相关基因序列亦已递交 GenBank, Accession No为 AF452711。

通过对 CCOL2A1基因组 DNA序列的分析不难看出，与鸡 I 型胶原和 III型胶原相比， CCOL2A1基因的内含子与外屋子明显的较小，这与 Upholt 等曾报道的相同（Ausar SF, Beltramo DM, Castagna LF， et al., Rhematol Int., 2001， 20 :138-144 ); II型胶原 (CII)在进化上高度保守，不同种属的 II型胶原蛋白其氨基酸同源性均高于 92%，甚至达 99%。因此，我们认为造成 CCOL2A1基因紧凑的原因并非内含子数量上的减少，而是由于内含子平均长度较小所致。

为了更好地认识和掌握 CCOL2A1 基因生物信息学的相关内容，深入了解 CCOL2A1基因的进化特征，本研究利用 Dnastar软件包中的 MegAlign,将我们所克隆的 CCOL2A1全长 cDNA及其相应蛋白质序列与从 GenBank数据库中检索到的犬（ AF023169, AF242201 ), 人 ( L10347 X 斑点鱼 ( U23822 )和小鼠 ( M65161 ) 等不同种属的 II型胶原三螺旋区 cDNA序列及蛋白质序列进行了同源性比较与分析，通过 Genedoc程序编辑，绘制出进化树。结果显示，鸡 CII与犬 CII在种族进化上同源性最高， cDNA与氨基酸同源性分别为 79.03 %和 94.77 %；其次为鸡与人的 CII, 同源性分别为 78.96%和 93.89%; 鸡与小鼠 CII的同源性最低分别为 77.38%和 92.90%。人与犬 CII在所比较的五种种属中同源性最高，核苷酸与氨基酸同源性分别为 91.89%和 98.52%; 其次为人与鼠 CII, 同源性分别为 88.63%和 96.15%。

在成功地揭示了有关 CCOL2A1 cDNA、基因組 DNA及其进化特征后，及时准确地将 CCOL2A1在染色体上进行定位则显得十分重要。虽然 RH 杂交作图是目前基因在染色体定位最精确的方法，但限于鸡 RH杂交板目前尚无厂家出售。为此我们采用染色体 FISH技术，利用地高辛标记的 CCOL2A13，UTR基因片段为探针，与从鸡外周血细胞中制备的中期分裂相染色体进行杂交。经统计分析确证，编码 CCOL2A1的基因定位于 4号染色体短臂 2区，而小鼠、人相应的 COL2A1则分别定位于 8号及 12号染色体（ Barnett ML, Combitchi D, Trentham DE. ， Arthritis & Rheumatism, 1996， 39 4:623-628 )。

我们知道，胶原在机体内广泛存在，不同的胶原型可公用其中的一条链， XI型胶原与 II型胶原之间则属于此情况。 XI型胶原是由三个不同的多肽亚单位 α1、 α2、 α3组成的，其中 α3是 αΐ ( II )基因的表达产物，即 α3与 II型胶原 o l链仅羟化赖氨酸含量不同（Rousseau JC， Farjanel J, Boutillon MM, et al.， J Biol Chem, 1996,271(39): 23743-8)； XIII型胶原为 II型胶原的跨膜形式，即 XIII 型胶原与 II 型胶原链的组成完全相同（Snellman A,Keranen MR, Hagg PO, et al. J Biol Chem, 2000, 275(12):8936-44)。为了深入认识 CCOL2A1 在鸡整个胚胎发育进化中的重要作用，本发明采用 RT-PCR与双抗体夹心 ELISA法分别对 CCOL2A1 在鸡胚与成鸡各组织中的构成性表达进行了全面系统的分析。结果表明， CCOL2A1 mRNA在发育鸡胚的心、肝、玻璃体、角膜、皮肤、胸肌、胸骨、小肠、关节软骨、半月板及颅骨中存在着相应表达，而在脾脏、胸腺与睾丸中未检测到 CCOL2Al mRNA的表达；对成鸡 ccn蛋白质水平的检测显示， CCII蛋白除了在胸骨与关节软骨中有表达外，在胰脏与小肠中亦有表达，其中以关节软骨中的表达水平为最高，其次为胸骨。应说明的是，在成年鸡 II型胶原蛋白表达傅的检测中，由于 ELISA实验中鸡 II型胶原蛋白经胃蛋白酶、弹性蛋白酶消化后， II型胶原形成 α链小短肽，因此含有 αΐ ( II )链的胶原均可与鸡 II型胶原蛋白单克隆抗体结合，因此实验中不能排出同时检测到 XI, XIII型胶原蛋白的可能。

应强调的是， CCOL2A1外显子的剪切方式十分复杂，尤其是 II型胶原外显子 2在不同的組织采取不同的剪接方式。为此，我们对鸡胚发育时的软骨組织如胸骨、关节软骨和非软骨组织如心脏、肝脏、胸肌、小肠、眼球玻璃体、角膜中 Ν端外显子 2剪切方式进行了分析。在实验中我们发现 17日龄鸡胚胸骨、生长板、关节软骨中获取的编码鸡 Π型胶原蛋白的 cDNA不含外显子 2;而心脏、肝脏、眼球玻璃体、角膜、小肠、肌肉、皮肤、胸肌等非软骨组织中以含有外显子 2的表达存在；其中眼球玻璃体、角膜中提取的总 RNA, 经 RT-PCR发现存在含与不含有外显子 1两种情形；但眼球玻璃体 RT-PCR显示，在较小日龄的鸡胚（小于 14天）仅以含外显子 2的形式存在（数据未给出）；而当鸡胚发育至 17天， RT-PCR结果却出现另外一种情形，以不含外显子 2为主要表达形式。这是迄今国际上首次对 CCOL2A1外显子 2在不同组织中进行剪切方式的研究报道。对于上述现象只能以下面的解释作为答案：鸡 II型胶原蛋白在软骨組织中已不含外显子 2的形式存在，而在非软骨组织中如心脏、肝脏、角膜、小肠、肌肉、皮肤等中主要以含有外显子 2 的形式存在； II型胶原基因组存在调控序列，其调控 II型胶原在胚胎发育的不同时期及不同组织中的表达；鸡 II型胶原蛋白在各脏器广泛存在的现象随着鸡的成长发育而消失，而代之于鸡 II型胶原蛋白仅在软骨组织中表达；发育的鸡胚胸骨中鸡 II型胶原蛋白含量丰富（ Young MF, Vogeli G， Nunez AM, et al. , Nucleic Acids Res, 1984,12 (10): 4207-4228； Marshall GE, Konstas AGP, Lee WR. ， BrJ Ophthalmol, 1993,77:515-524 ), 但随鸡的生长发育，胸软骨逐渐钙化，鸡 II型胶原蛋白含量逐渐下降。关于鸡 II 型胶原在机体内的表达，目前认为鸡 II型胶原在成熟的个体存在于眼球玻璃体与软骨（ Seery CM, Davision PF. , Invest Ophthalmol Vis Sci，1991，32:1540-1550 ; Huerre-Jeanpierre C, Mattei MG, Weil D， et al., Am J Hum Genet, 1986, 38(1): 26-37 ), 而我们对天然鸡 II型胶原的表达检测中却发现眼球玻璃体中不存在 Π型胶原的表达。

为实现本发明的目的，本发明人对编码鸡 π型胶原蛋白的 cDNA成功进行了克隆、染色体定位、表达谱分析、基因组 DNA 克隆以及 CCOL2A1相关生物信息学分析。尤其是编码鸡 II型胶原蛋白全长 cDNA 的克隆成为本发明完成的坚实基础，意义重大。鸡 II型胶原蛋白作为口服耐受治疗 RA的新策略，其 cDNA 的克隆无疑将使基因工程方法生产重组鸡 II 型胶原蛋白成为可能。

具体的，本发明一个方面涉及一种如 SEQ ID NO: 1所示包含编码全长鸡 II型胶原蛋白的多核苷酸序列之分离的核酸分子，或其具有相同生物学功能的片段。本发明又一方面涉及由本发明所述分离的核酸分子编码序列所编码的鸡 II型胶原蛋白，或其具有相同生物学活性的片段或其保守性变体。

本发明中，蛋白质或多核苷酸 "变体 "是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有守性"改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

"缺失 "是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。

"插入 "或加"是指在氨基酸序列或核苦酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。

换"是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。

"生物活性"是指具有天然分子的结构、控或生物化学功能的蛋白质。

湘似性 " 是指氨基酸序列之间排列对比时相应位置氨基酸残基的相同或保守性取代的程度。用于保守性取代的氨基酸例如，带负电荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的头部基团有相似亲水性的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。

"分离的 "一词指将物质从它原来的环境（例如，若是自然产生的就指其天然环境）之中移出。比如说，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来，但同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分。既然载体或组合物不是它天然环境的成分，它们仍然是分离的。

本发明的多核苷酸可以 RNA或 DNA的形式存在，其中 DNA 包括 cDNA、基因組 DNA和合成的 DNA。 DNA可以是双链或者单链的，单链也可以是有义链或者反义链。编码多肽的多核苷酸序列可以与 SEQ ID No.l所示的多核苷酸序列相同，或者可以是一个由于遗传密码的冗余或简并性而不同的多核苷酸序列，但它编码与 SEQ ID No.2相同的成熟多肽。

本发明进一步涉及利用本发明所述的多核苷酸的各种变体，它们编码含有 SEQ ID No.2所示的推定的氨基酸序列多肽的片段、类似物和衍生物。这些多核苷酸变体可以是天然存在的等位基因变体或非天然存在的多核苷酸变体。

编码本发明多肽的多核苷酸也可能与特定的标记序列在同一读框中相融合，标记序列可帮助本发明多肽的纯化。标记序列在使用细菌宿主时可以是 pQE载体的六聚組氨酸标记，以利于融合有标记的成熟多肽的纯化，或者当使用哺乳类宿主（如猴肾成纤维细胞的 COS-7细胞系）时，标记序列可以是一种血细胞凝集素（HA )标记。此外，包含编码本发明多肽的多核苷酸序列还可包含同源或异源的特定信号肽序列，以帮助目的蛋白质分泌到原核细胞或真核细胞膜外。本领域普通技术人员知晓，上述标记序列和信号肽序列也可通过重组方法或化学法添加在用于表达本发明多肽的载体上。

本发明进一步涉及具有 SEQ ID No.2所示推定氨基酸序列的多肽及其活性片段、类似物和衍生物。 SEQ ID No.2所示多肽的 "具有相同生物学活性的片段"指能基本保留该多肽的生物学功能或活性的多肽。

由本发明所述方法制备的鸡 II型胶原蛋白为重组蛋白、多肽或其片段、衍生物和类似物。具体的， SEQ ID No.2所示多肽的片段、衍生物和类似物可以是：（i)一个或多个氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸残基所取代（优选是保守性氨基酸残基）的多肽，取代的氨基酸残基是或不是由遗传密码所编码的氨基酸。例如，可以通过氨基酸残基的插入、取代和 /或删除，得到鸡 II型胶原蛋白的沉默突变体或功能等同物。可基于氨基酸残基之间在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和 /或两亲性等方面的相似性进行保守性氨基酸取代，只要保留磚 II型胶原蛋白的活性；或 (ii) 一个或多个氨基酸残基带有取代基团的多肽；或（iii ) 成熟多肽与其它功能性化合物，如提高多肽半寿期的化合物（例如聚乙二醇）融合在一起的多肽；或（iv ) 成熟多肽与其它氨基酸序列相融合的多肽，其中所述其它氨基酸序列包括诸如帮助纯化成熟蛋白的氨基酸序列或蛋白原序列等。这些帮助纯化的结构域包括但不限于：金属鳌合肽，如用于在固定化金属上纯化的组氨酸 -色氨酸模块；用于在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白 A结构域以及用于 FLAGS延伸 /亲和纯化系统的结构域（ IMMUNEX公司， Seattle, Wash. )。特异于因子 XA或肠激酶的断裂接头序列也可用于帮助目的蛋白质的纯化（ Porath , J. 等人（1992) , Prot.Exp.Purif. 3:263-281 X 从这些公开内容看，这样的片段、衍生物和类似物的应处于本领域技术人员的知识范围内。

本发明的鸡 II型胶原蛋白包括 SEQ ID No.2所示的鸡 II型胶原蛋白，即成熟多肽，也包括与 SEQ ID No.2多肽至少有至少有 90%相似性（优选是 90%的相同性）的多肽，更优选至少有 95% 相似性（优选是 95%相同性）的多肽，也包括这些多肽的一些部分，通常这些多肽部分至少含有 30个氨基酸、优选至少 50个氨基酸。

本发明的多肽、其保守性变体和生物活性片段及衍生物可以用常规的肽合成的方法制备，例如固相肽合成（Merrifidd J. (1963), 美国化学学会杂志 ( J. Am. Chem. Soc. ) 85:2149 - 2154; Roberge, J. Y. 等人， (1995) 科学， 269:202-204 )„ 蛋白质合成可以手工完成，也可利用肽自动合成仪如 Applied Biosystems 431A 肽合成仪进行（Perkin Elmer )。本发明鸡 II型胶原蛋白也可以从天然生物材料中经分离纯化得到，但优选利用本发明提供的多核苷酸用重組 DNA技术制备。

根据常规的重组 DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可表达或制备重组的鸡 II型胶原蛋白。本发明因而涉及制备本发明鸡 II型胶原蛋白的方法，一般包括以下步骤：

(1) .用本发明编码鸡 II型胶原蛋白的多核苷酸（或变体）或含有该多核苷酸的重組表达载体转化合适的宿主细胞；

(2) .在合适的培养基中及适当的培养条件下培养宿主细胞；

(3) .从培养基或细胞中分离、纯化目的蛋白质。

本发明也涉及包含本发明多核苷酸的重组载体、带有本发明重組载体的遗传工程化宿主细胞和通过重組技术制备本发明多肽的方法。

本发明的多核苷酸可以用来经重组技术产生多肽。例如，该多核苷酸可以存在于选自多种用于表达多肽的表达载体中的任一载体上，这些载体包括染色体的、非染色体的及合成的 DNA序列，例如， SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体 DNA、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体 DNA结合的载体、病毒 DNA、杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及伪狂犬病毒，包括但不限于 pQE系列（Qiagen)、 pBS、 pD10、 phagescript, psiX174、 pBluescript SK, pBSKS、 pNH系列（Stratagene)、 pTRC99a、 pKK223-3, pDR540、 pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT、 pOG44、 pXTl、 pSG (Stratagene), pSVK3、 pBPV, pMSG、 pSVL (Pharmacia) » 不过，只要是能在宿主中复制和存活，其它质粒或载体也可应用。

本发明也包括含有本发明多核苷酸的重组构建体。该构建体包括载体，如上述质粒或病毒载体，其中可正向或反向插入本发明的多核苷酸序列。构建体中还包含调节序列，例如，有效地连接到本发明多核苷酸序列上的启动子（包括组成型和诱导型启动子），介导下游结构序列的转录。合适的启动子包括但不限于， λ 噬菌体的 PL启动子、杆状病毒多角体蛋白启动子；细菌启动子如； Lacl、 LacZ、 T3、 T7、 gpt、 λ PR, PL和 trp; 真核启动子如： CMV立即早期启动子、 HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期 SV40 启动子、逆转录病毒的 LTR和小鼠金属硫蛋白 I启动子；还包括衍生自植物细胞基因组中的启动子，如热休克蛋白、 RUBISCO启动子。

表达载体也包含翻译起始所需要的核糖体结合位点和转录终止子，其还可以具有增强表达的合适序列，如增强子。增强子是 DNA的顺式作用因子，通常有大约 10-300bp, 作用于启动子，提高它的转录。例如， SV40中位于复制起点后侧 100-270bp处的增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点后侧的多形瘤增强子及腺病毒增强子。此外，表达载体优选还包含能提供表型特征的一种或多种选择性基因、抗性基因和 /或标记基因，以便于转化宿主细胞的筛选。选择性基因如帮助细胞利用吲哚或组氨醇的 trpB、 hisD ( Hartman, S. C, 和 R.C.Mumgan(1988) 美国国家科学院院报 85:8047-51 ), 用于 tk-或 apr f细胞的肝疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（Wigler， M. 等人 (1977) 细胞 11:223-32 ) 和腺嘌呤磷酸核糖转移酶（ Lowy , I. 等人（1980) 细胞 22:817-23 )；抗性基因如赋予氨甲蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶 DHFR ( Wigler , M. 等人（1989)，美国国家科学院院报， 77:3567-70 )或赋予新霉素和 G-418抗性的 npt( Colbere-Garapin, F.等人 (1981) 生物化学杂志（ J.Mol.Biol. ), 150:1-14 ), 以及四环素或氨苄青霉素抗性基因。哺乳类表达载体一般包括复制起点、适当的启动子、增强子及任何必需的核糖体结合位点、多腺苷化位点、拼接供体和受体位点、转录终止序列和 5，侧翼非转录序列。衍生于 S V40拼接序列的 DNA序列和多腺苷化位点可用于提供所需要的非转录遗传元件。此外，包含编码本发明多肽的核苷酸序列的载体还可包含同源或异源的特定信号肽序列，以帮助目的蛋白质分泌到原核细胞或真核细胞膜外。本领域普通技术人员知晓，上述表达载体及构建体中含有的标记序列和信号肽序列也可通过重组方法或化学法添加在编码本发明多肽的多核苷酸上。

合适载体和启动子的选择为本领域普通技术人员周知。细菌适用的有效表达载体可以这样来构建：将编码目的蛋白的结构 DNA序列随同适当的翻译起始和终止信号被插入到带有一个功能启动子的可操纵的阅读框中。本领域普通技术人员周知用于构建含有本发明核苷酸序列以及合适的转录及翻译调控元件的方法。这些方法包括体外重组 DNA技术、合成技术以及体内遗传重組技术（Sambrook, J. (1989), 分子克隆实验室手册， Cold Spring Harbor Press; Plainview, N.Y.;Ausubel, F.M. (1989) 当代分子生物学方法 ( Current Protocols in Molecular Biology )， John Wiley & Sons, N.Y. )。

包含上述合适的 DNA序列、合适的启动子或控制序列的载体可以用于转化合适的宿主，让宿主表达该蛋白。

本领域技术人员知晓，根据本发明 DNA序列所插入的表达载体或构建体的种类和特性选择合适的宿主以表达目的蛋白质。适于表达本发明的多肽的宿主包括但不限于：原核宿主，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等；真核宿主，诸如：酵母属、曲霉属、昆虫细胞，诸如果蝇 S2和草地夜蛾 Sf9; 动物细胞，如 CHO、 COS (猴肾成纤维细胞系， Gluzman (细胞 23:175， 1981)及其它的能表达相容载体的细胞系，例如 C127、 3T3、 CHO、 HeLa、 BHK、 Bowes黑素瘤细胞；植物细胞以及腺病毒等等。各种哺乳动物细胞的培养系统也能用于表达重组蛋白。从这些讲授看，合适宿主的选择应该在本领域技术人员的知识范围内。

带有如上所述的含有本发明核苷酸序列之载体或构建体能够通过传统的方法导入合适的宿主细胞中以产生重组产物。将构建体导入上述宿主细胞的方法为本领域技术人员周知，包括但不限于：氯化钙介导的转化、磷酸钙转染、 DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、显微注射、粒子轰击法或基因枪方法（ Sambrook, J.(1989) , 分子克隆实验室手册， Cold Spring Harbor Press; Plainview, N.Y.;Ausubel, F.M. (1989) 当代分子生物学方法， John Wiley & Sons, N.Y.; Hobbs, S. 等人， McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992), McGraw Hill, N.Y.191-196; Engelhard， E.K.等人，美国国家科学院院报， 91 :3224-3227; Logan, J.等人，美国国家科学院院报， 81:3655-3659 )。

在适当的培养条件与培养基中培养经转化的宿主菌株或细胞，使其生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法（例如温度转变或化学药品诱导）诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。针对不同的宿主菌株或细胞选择以及所表达的目的蛋白质的性质相应的培养条件和培养基在本领域技术人员知识范围之内。

在合适的启动子控制下可以在哺乳类细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白。利用由本发明的 DNA构建体衍生的 RNA, 也可以用无细胞翻译体系产生这种蛋白质（ Sambrook, J. (1989), 分子克隆实验室手册，第 18章第 4节， Cold Spring Harbor Press; Plainview, N.Y. )。

通常用离心的方法收获细胞或培养液。对于目的蛋白质保留在胞内的情况，一般可用任何便捷的物理、化学方法或酶法，包括冻融循环、超声波、机械破碎，或使用细胞溶解剂或特定的酶破碎细胞，将所得粗提物保留以进一步纯化。对于目的蛋白质分泌到胞外的情况，可直接从培养上清液中利用常规方法回收目的蛋白质。这些方法都是本领域的技术人员熟知的。

将多肽从重组细胞培.养物中回收和纯化的方法有硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、体积排阻层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。形成成熟蛋白的完整构象还需要蛋白质的重折叠步骤。通常高效液相层析（HPLC)或毛细管电泳可应用于最后的纯化步骤。

本发明还涉及了根据本发明所迷多核苷酸序列制备的鸡 II 型胶原蛋白在制备治疗和 /或预防类风湿性关节炎等病的药物的用途。具体的，本发明所述核酸分子的编码区或其部分，如全长序列、部分序列或其突变体均能用于有效表达本发明所述鸡 II型胶原蛋白或其功能性片段。

本发明特别涉及了一种用于预防和 /或治疗骨^节炎、类风湿性关节炎的药物組合物，其中包含治疗有效量的由本发明所述方法制备的鸡 II型胶原蛋白，和任选的，药学可接受的载体。

本发明还包括食品或饮料組合物，其特征在于包含一定量的由本发明所述方法制备的鸡 II型胶原蛋白。在发明的一个实施方案中，所述鸡 II型胶原蛋白用于制备保健食品或食品添加剂等产品以对尤其是对骨关节病中的类风湿性关节炎、骨关节炎等病起到保健作用。本发明也包括一种食品添加剂组合物，其中包含一定量的由本发明所述方法制备的鸡 II型胶原蛋白。

本发明还包括了本发明所述核酸分子或其片段用于基因治疗的用途。附图说明

图 1 。显示本发明所述鸡 II型胶原蛋白编码基因的 PCR克隆策略。

图 2。显示本发明所述全长鸡 II型胶原蛋白的结构。

图 3。显示鸡胚中 II型胶原蛋白编码基因 3非翻译区（ UTR ) 的 PCR结果。

图 4。显示成鸡中 II型胶原蛋白编码基因的組织特异性表达。图 5。 II型胶原蛋白浓度与吸光度标准曲线

图 6。鸡 II型胶原蛋白编码基因外显子的剪切分析

图 7。鸡 II型胶原蛋白编码基因的染色体分带。

图 8。鸡染色体中期分裂相

图 9。 ISH杂交结果。

图 10„ 人、犬、鼠、鸡、斑点鱼之 II型胶原蛋白与基因同源性比较进化树。

图 11。 pPIC9K/CCOL2Al ( A ) 与及 pPICZotB/CCOL2Al ( B ) 诱导表达上清及胞浆中表达产物的 WB分析，其中， M为蛋白分子量标准， 1-5为 WB阳性带， 6为空载体对照。

图 12 pPICZaB/CCOL2Al/GS115 与 pPIC9K/P4Ha. pPIC9/P4Hp共表达的 WB分析，其中， M为蛋白分子量标准， 1-5为 WB阳性带， 6为空载体对照。本发明将在下面的实施例中进一步描述。但是本发明并不局限于这些实施例。

其中，分子生物学、生物化学、免疫学等常规操作均按照 "分子克隆：实验指南 "第 2版中的描述进行。所迷酶切条件和緩冲液均按照生产厂家的说明书操作。通常所用的温育时间大约是 37 —个小时，但根据厂家的指示可以有所改变。实施例

实施例 1 鸡胚胸骨总 RNA提取

17日龄 SPF鸡胚（中国农业科学院畜牧研究所，北京）经消毒后破壳，取鸡胚，置水冷生理盐水中冲洗，无菌取胸骨，迅速置 Trizol ( Imitrogen ) 中快速研磨，转移至 1.5ml eppendorf 管，室温放置 lOmin, 10000g离心 lOmin, 将上清转移至一

DEPC处理的 eppendorf 管，每管加 200μ1氯仿，混匀，室温放置 lOmins, 离心同上。将水相转移至一新 eppendorf管，加等量异丙醇，室温再放置 lOmin, 离心， 75%乙醇洗涤沉淀，无 RNase 水溶解， -80 °C保存待反转录。 cDNA合成

提取的总 RNA, 以 3，RACE 试剂盒（ TAKARA ) 中的 oligodT-3sites adaptor primer 作为下游引物进行反转录。反转录完毕 95°C处理 5分钟灭活反转录酶并将 cDNA置 -20°C保存备用。鸡 COL2A1 cDNA C-端原肽 cDNA的 PCR扩增

根据已知鸡 COL2A1 C端 UTR的序列（ Sanddl LJ， Prentice HL, Kravis D, Upholt WB. , J Biol Chem ， 1984,259 (12) 7826-7834 ), 利用引物 col2al-2F， col2al-2R (如表 1所示) , 扩增鸡 COL2A1 C-端原肽部分。 C-端原肽 (COL2A1-2) cDNA进行以下 PCR扩增程序：引物 col2al-2F， col2al-2R， 10 x PCR 緩冲液； 5 L， MgCl₂ ( 25Mm ) 5 μ L, dNTP Mix ( lOMm ) 1 μ ί, 引物各自为 Ι μ ( 20pmol/ μ L ) 1 μ L, 100%甘油 2·5 μ Ι (终浓度 5% ), cDNA 2 μ L, Taq 0.8 μ L, 总体积 50 L。 PCR 所用程序 96°C lOmin, 96° lmin, 62 C I min, 72 °C 3min, 72 " 7min。 PCR反应体系内含终浓度 5%甘油， 1%琼脂糖电泳检查扩增结果，并采用凝胶回收试剂盒（ Invitrogen )回收目的基因，连接 pGEM-T载体（Promega ), 转化 DH5 a , 酶切鉴定后测序。鸡 COL2A1 3'UTR cDNA的克隆

根据已知鸡 COL2A1基因序列设计扩增鸡 COL2A1 3'UTR 的上游引物 col2al-lF (参见表 1 ) , 采用 3 ' RACE策略，以反转录相对应的 3 sites adaptor primer ( col2al-lR ) 扩增 3，UTR，其中，采用 PCR緩冲液，引物 col2al-lR为 3sites adaptor primers, 采用 96。C 5min, 96^ lmin, 63 °C 1 min, 72 °C 30 sec ( 4个循环）， 96 30sec, 61 °C 30sec, 72 °C 20sec ( 26 个循环）， ΊΙ 7min。回收及转化均同前述步骤。鸡 COL2A1 N-原肽 cDNA的克隆

col2al-5F , co!2al-5R为上下游引物扩增 5，N原肽。采用 PCR 緩冲液，退火与延伸在同一温度点上。 96" 5min, 96^ lmin, 72 °C 50 sec ( 30个循环）， 12°C 7min。重組质粒载体的构建及序列测定

质粒提取、酶切、回收、连接、转化、构建重组质粒的鉴定等均按《分子克隆实验指南》（ Sambook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2 ed Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989. ) 进行，将上述构建好的鸡 COL2A1 cDNA系列片段基因以及 SOE连接的鸡 COL2A1 cDNA 系列片段及全长鸡 COL2A1分别插入 pGEM-T载体（ Promega )，酶切鉴定后测序。

其中所述质粒的构建和制备如下进行：

凝胶快速提取试剂盒回收过程： PCR扩增产物经 1%琼脂糖电泳，切胶回收目的基因，再经凝胶快速提取试剂盒回收。过程如下：

1 )含目的基因的凝胶置于 eppendorf 管中，加入 1ml溶液 L1, 50 水浴 15分钟，使凝胶彻底溶解；

2 )将溶解好的凝胶加入离心柱中， 12000rpm 离心，柱内再加入 500μ1 1, 室温放置 1分钟，离心同上；

3 ) 加 Ι^ 700μ1，室温放置 5分钟，离心同上；

4 ) 12000rpm再离心 2分钟，使酒精挥发；

5 ) 将柱转移至 1新 eppendorf 管中，加入热（约 70 ) 的 TE 30μΙ, 室温放置 2分钟， 12000rpm离心，柱下的液体即为回收的目的 DNA。回收 DNA经 1%琼脂糖电泳，确定浓度为 40μ^μ1。目的 DNA与 pGEMT载体的连接：连接体系如下： 2x连接緩冲液 5μ1 ，目的 ϋΝΑ 3μ1, Τ 载体 Ιμΐ, T4DNA连接酶 Ιμΐ, 共计 ΙΟμΙ, 混匀， 4 放置过夜。

大肠杆菌 DH5a感受态的制备参照 Sambook J， Fritsch EF，

Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2^nd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.中所述方法。

PCR 连接产物转化 DH5a 感受态：取如上述连接好的 pGEMT-col2al-l ( 2, 3， 4, 5等） 4μ1, 加入 ΙΟΟμΙ新鲜制备的感受态，冰浴 30分钟， 42 热休克 90秒，再迅速置冰水中 2-3 分钟，加入 900μ1无氨苄 LB, 37 、 160rpm轻摇 45分钟，加入 1ΜΙΡΤΘ4μ1， 16μ1 ( 50mg/ml ) X-gal, 涂布氨苄 LB 平板， 37 下培养 16小时至菌落大小合适为止。阳性转化子的筛选：挑取 IPTGX-gal氨苄青霉素 LB平板上的白色克隆接种含有 200 g/ml氨苄青霉素的 LB中， 37 , 200rpm 摇床培养 12小时，提取质粒。

由上述方法制备得到本发明所述 pGEMT-col2al-2, pGEMT- col2al-l, pGEMT- col2al-3, pGEMT- coI2al-( 1+2 )和 col2al - 5、 col2al-4质粒

质粒采用 Not 与 Nco 双酶切鉴定阳性克隆。 Not 与 Nco 双酶切体系： Ιθχ ΐμΐ, 0.1%BSA Ιμΐ, 采用 Promega Α7500试剂盒提取质粒 8μ1, Not 1μ1， Nco ΙμΙ, 水 8μ1, 共计 20μ1， 37 酶切 2小时。酶切完毕， 1%琼脂糖电泳鉴定阳性克隆，将酶切阳性的克隆送样测序。核酸测序仪为 ΡΕ公司的 ΑΒΙ377。鸡 COL2A1 全长 cDNA的 SOE-PCR

为获得鸡 COL2A1 全长 cDNA, 本研究采用重叠延伸 -PCR ( SOE-PCR )策略来进行构建（ Horton RM， Hunt HD, Ho SN, et al. ， Gene, 1989， 77:61-68 ), 这需进行四次 PCR反应。

第一次 PCR 反应是以质粒 pGEMT-col2al-2, pGEMT- col2al-l PCR产物为模板, 以 col2a - 2F 、 col2al-lR 为上、下游引物，使 col2al-2、 col2al-l连接起来形成产物 coI2al- ( 2+1 ); 采用 Pfu DNA 聚合酶， PCR扩增条件： 5min, 96 C lmin, 60 °C l min, 72€ 150sec ( 4个循环）， 96 ^ 30sec, 58。C 30sec, 72 130sec ( 26个循环）， 72 °C 7min„；第二次 PCR 反应是以质粒 pGEMT- coI2al-3, pGEMT- col2al- ( 1+2 ) PCR产物为模板，以 col2a-3F 、 col2al-lR为上、下游引物。 PCR扩增条件： 5min, 96 C lmin, 64€ 1 min, Ί7 120 sec ( 4个循环）， 96 °C 30sec, 62 °C lmin, 72 90sec ( 26个循环）， 72 °C 7min。

第三次 PCR反应中，以 col2a-5F、 col2al-4R为上、下游引物，将 col2al - 5、 col2al-4质粒 PCR产物为模板。 PCR扩增条件： 96。C 5min, 96€ lmin, 62 °C 2 min, 72。C 120 sec ( 4个循环）， 96 °C lmin, 60 lmin, 12°C 90sec ( 26 个循环）， 72 7miii。

第四次 PCR反应则以 col2a-5F、 col2al-lR为上、下游引物，以前三次连接好的 PCR产物（coI2al-5+4, col2al 1+2+3 ) 为模板，可获得全长 col2al cDNA。 PCR扩增条件： 96°C 5min, 96 °C lmin, 64 °C 2 min, 72 "C 210 sec ( 4cycles ), 96 °C lmin, 62 lmin, 72 X： 180sec ( 26 cycles ), 12°C 7min。

鸡 COL2A1 全长 cDNA克隆所用引物序列如表 1示：表 1. 鸡 COL2A1 全长 cDNA 扩增引物序列

col2al-lF 5，- TCT ATC GCG CAC CCG TTG TGC -3，

col2al-lR 5，- GTC TTG TAG TGC TAC GGC TTG C -3，

col2a-12F 5，- TTG CAG ATG TCT CCA ATA CCA G -3'

col2al-2R 5'- GCA CAA CGG CTC GGG CAA TGT GCT AAC G -3' col2al-3F 5，- GCT CGG AAG CAA CGG CCT CG -3'

col2al-3R 5'- CTC GTC CCG GAC GCG ACG G -3'

col2al-4F 5，- CGC TGC GAT CGT CAT GCG G -3，

col2al-4R 5'- GTA GTG ACC CTA CGC CCG AG -3'

col2al-5F 5'- ACG CCG GCT CTC GTG CTC CTC GTG GTG C -3' coI2al-5R 5'- CCG CCC GGG TCC GAA TGC CCG CAT -3，本研究采用重叠延伸 -PCR ( SOE-PCR ) 策略来获得全长 4837b 鸡 COL2A1 cDNA (图 1 )。由于鸡 COL2A1基因 GC含量较高，基因扩增过程中反应体系采用适宜扩增高 GC含量的緩冲液，扩增产物特异性极高，将其插入 pGEM-T载体。利用大肠杆菌 DH5 a ; 以及 Promega出品的工具酶进行酶切、转化和序列测定。其中上述引物由上海博亚生物技术有限公司合成，测序由曰本 TAKARA公司完成。所得结果见后附序列表中 SEQ ID NO:

实施例 2 鸡 COL2A1基因组 DNA的提取

鸡 COL2A1基因组 DNA的提取采用 Wizard genomic DNA purification kit ( Promega ) 进行。具体操作见试剂盒说明书。提取 DNA纯度测定 260/280为 1.6-1.8 ( BECKMAN, DU®640 )。鸡 COL2 A1基因组 DNA的 PCR克隆及文库选

以 PgF与 PgR为上、下游引物，引物序列为： PgF 5，CCA GGC AAG GAT GGC GCA CG 3 I PgR 5'CCT GAT CGG CTC CGC CAA TGT CCA TAG G 3；进行 CCOL2A1C端基因組的克隆。选用 LA Taq酶（ GC buffer )对 CCOL2A1基因组 DNA进行 PCR扩增。采用 0.8%琼脂糖电泳检查 PCR扩增结果，以凝胶回收试剂盒回收目的基因并连至 pGEM-T载体，酶切鉴定、测序鉴定阳性克隆。由于 CCOL2A1基因组序列中的高 GC含量及 polyT结构，亦通过 SOE-PCR方法以全血总 DNA为模板分段克隆 CCOL2A1基因组 N-端序列，以拼接成接近于全长的 CCOL2A1基因組 DNA序列。

最初我们通过 PCR对鸡外周血中提取的 DNA进行扩增，能获得 CCOL2A1 3，端 5494bp的片段，扩增产物特异性极高（图 1-9)，将其插入 pGEM-T载体，得到 pGEM-T/CCOL2Al, 进行测序。测序结果可以看出鸡 CCOL2A1 3，端基因组 DNA包含部分三螺旋区、 3，端肽及 3，原肽，此克隆基因组部分含有 19个内含子及 20个外显子。

然而对 3，端以外的基因组序列，无论如何调整模板、引物及 PCR扩增条件，均未能获得该目的基因。随后，又对从鸡基因組 DNA 文库中筛选到的阳性克隆进行测序，但也因高 GC含量及 PolyT结构限制了测序反应的进行，使测序信号中断。

为此，我们采取了利用已知的外显子序列，设计多个测序引物，才使 CCOL2A1基因組 DNA的测序得以完成。最终我们获得长度为 12003b 的 CCOL2A1基因组 DNA序列，其中包含 45个外显子和 44个内含子，内含子、外显子结构如表 2示。所得鸡 COL2A1 3 ' 端基因的结构如图 2所示。经查新检索证实，该基因组 DNA序列为 CCOL2A1 基因组所特有，国际上未曾报道过。相关基因序列亦已递交 GenBank, Accession No为 AF452711。

鸡 COL2A1基因組 DNA 3'端的外显子、内含子结构外显子编码区氨基酸外显子 sizes (bp) 内含子 sizes (bp)

1 1-30 > 135 ND

2 31-100 210 ND

3 101-117 50 ND

4 118-146 87 ND

5 147-180 102 ND

寸

6 181-206 78 ND

7 207-221 45 ND

8 222-239 54 ND

9 240-258 54 124

10 259-274 54 107

11 275-292 54 100

12 293-310 54 98

13 311-325 45 86

14 326-343 54 110

15 344-358 45 86

16 359-376 54 113

17 377-409 99 89

18 410-424 45 198

19 425-457 99 367

20 458-475 54 885

21 476-511 108 408

22 512-529 54 88

23 530-562 99 91

24 563-580 54 682

25 581-613 99 82

26 614-631 54 82

27 54 124

28 650-667 54 277 29 668-685 54 79

30 686-700 45 114

31 701-733 99 262

32 734-769 108 92

33 770-787 54 80

34 789-805 54 81

35 806-823 54 82

36 824-841 54 94

37 842-877 108 89

38 878-895 54 108

39 896-913 54 113

40 914-967 162 268

41 968-1003 108 92

42 1004-1039 108 309

43 1040-1057 54 160

44 1058-1093 108 97

45 1094-1111 54 268

46 1112-1147 108 109

47 1148-1165 54 134

48 1156-1201 108 79

49 1202-1297 289 78

50 1298-1360 188 407

51 1361-1441 243 594

52 1442-1489+ 667 112

520bp 3'UTR

注：外显子、内含子的命名采用 Upholt等 J Biol Chem, 1984 59 ( 12 )： 7826-7834的方法。实施例 3 鸡 COI^Al o^ ( Π ) 組织特异性表达鸡胚 COL2A1表达谱

COL2A1 3 ' UTR 经 Blast 的核甘酸序列数据库检索为 COL2A1所特有。因此以 COL2A1 cDNA 3， UTR为扩增对象，研究 α ΐ ( II )在发育的鸡胚中的表达。应用 RT-PCR对 17 曰龄鸡胚心、肝、玻璃体、角膜、皮肤、胸肌、胸骨等脏器进分析，所用引物为表 1 中的 col2al— IF , col2al— lR，产物连 pGEMT-easy载体，酶切后测序。同时以 GAPDH作为内参，利用引物 PF_GAPDH 5， G C AGA GGT GCT GCC CAG AAC 3 I PRGAPDH 5 TCA CTC CTT GGA TGC CAT GTG 3 '扩增 412bp 片段的 GAPDH。

从 17曰龄鸡胚 COL2A1 3 UTR R T - PCR结果可以看出，鸡 COL2A1 mRNA在鸡胚的心、肝、玻璃体、角膜、皮肤、胸肌、胸骨、小肠、关节软骨、半月板、颅骨中有表达，而脾脏、胸腺、睾丸却检测不到 COL2A1 mRNA。（参见图 3 )。成鸡 II型胶原蛋白表达谱

采用天然 II型胶原检测试剂盒（ Chondrex )对四周龄鸡心、肝、脾、肾、玻璃体、角膜、皮肤、胸肌、半月板、胰脏、胸腺、小肠、胃、睾丸、骨骼肌、大脑、小脑、关节软骨、胸骨、肺脏共 20个脏器进行 ELISA检测 II型胶原蛋白的存在。（冻干组织各 5mg, 充分匀浆， 0.8ml 50mM醋酸 -0.2M NaCI ( pH2.9-3.0 ) 溶解， ΙΟΟμΙ 20mg/ml的胃蛋白酶（ Sigma ) 4°C消化 48h; 加入 250μ1 10 xTSB，并用 1 M NaOH调 pH至 8.0，加入 ΙΟΟμΙ 2mg/ml 的弹性蛋白酶（Sigma ) 混匀， 4°C消化过夜。 10000g, 4°C离心 5 分钟，弃沉淀，上清定容至 lml， 4°C保存备用。

采用双抗体夹心 ELISA法检测提取的 II型胶原蛋白。选用两种针对鸡 II型胶原蛋白分子不同表位的单克隆抗体，其中，一种作为包被抗体，另一种作为酶标检测抗体。首先捕获抗体包被

ELISA板， 4" 过夜，洗涤三次，处理好的样品 1: 200稀释并与标准品一同点样于包被好的 ELISA板， yj。C 2h洗涤同上；生物素标记的鸡 II型胶原蛋白单克隆抗体加入各孔， 37°C孵育 2h, 洗涤同上，最后加入酶标链亲和素， 37°C lh; 充分洗涤，最后加显色液 OPD, 37"C显色半小时， 1.25M硫酸终止反应。测 OD490 光密度值。具体操作见试剂盒说明书。

成鸡 20种脏器天然 II型胶原蛋白检测实验发现，鸡 II型胶原蛋白在胸骨、关节软骨、胰脏、小肠有表达，而在其它脏器却不见表达。（参见图 4 )

同时以鸡天然 II型胶原蛋白作为标准品，制作浓度、吸光度标准曲线，依据标准曲线计算相应各阳性组织中鸡 II型胶原蛋白的表达量（参见图 5 )。

据标准曲线得出胸骨中鸡 II型胶原蛋白的表达量为 0.4%, 关节软骨表达量在四周鸡所检测组织中表达量最高达 1.5%，胰脏、小肠中的表达量分别为 0.84%与 0.2%。实施例 4 鸡 COL2A1 5，原肽外显子 2剪接分析

采用 RT-PCR分析鸡 COL2A1外显子 2在鸡胚各脏器中的剪接情况，以表 1中 col2al—5F, col2al— 5R为上、下游引物对鸡皮肤、肝脏、眼球玻璃体、角膜、胸肌、小肠、胸骨、关节软骨等进行 PCR扩增分析， 1%琼脂糖电泳检测 PCR扩增产物的特异性。 RT-PCR结果表明，鸡 COL2A1 5 ' N原肽外显子 1存在于鸡心脏、肝脏、眼球玻璃体、角膜、胸肌、小肠，而软骨組织如胸骨、关节软骨中以不含外显子 2的表达形式存在。（参见图 6 ) 实施例 5 鸡 COL2A1基因染色体的定位

为了将鸡 COL2A1基因精细定位于染色体，采用染色体 ISH 技术，应用地高辛高效标记检测试剂盒（ Roche )标记的鸡 COL2A1 3，UTR基因片段为探针，与中期分裂相的鸡染色体进行杂交，研究其在染色体上的定位。

采用 ISH原位杂交，以地高辛标记的鸡 COL2A1 3 ' UTR 基因片段为探针，与鸡中期分裂相的染色体精细杂交，杂交信号经统计分析，将鸡 COL2A1基因定位于 4号染色体短臂 2区（参见图 7, 8, 和 9 )。实施例 6 鸡 COL2A1同源性比较

利用 Dnastar软件包中的 MegAlign 对已获得的鸡 COL2A1与从 GenBank数据库中检索到的犬（ AF023169, AF242201 )、人

( MM001844 )、斑点鱼 ( U23822 )、小鼠 ( M65161 )等不同种属的 II型胶原三螺旋区 cDN A序列及蛋白质序列进行同源性的比较和分析， Genedoc程序编辑，绘制进化树（参见图 10 )。

鸡 COL2A1 cDNA序列与已知的人、犬、小鼠、斑点鱼进行了同源性比较，结果显示鸡 COL2A1与犬 CII在种族进化上同源性最高，其氨基酸与 cDNA同源性分别为 79.03 %, 94.77 %; 其次为鸡与人，同源性分别为 78.96%, 93.89%；鸡与鼠同源性分别为 77.38%, 92.90%。人与犬在所比较的五种种属中同源性最高，氨基酸与蛋白质分别为 91.89%、 98.52%。其次为人与鼠，分别为 88.63%, 96.15%, 比较结果建立进化树。参考文献

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实施例 7 重组 CCOL2A1全长 cDNA的表达

实施例中所采用的材料、试剂和仪器如下所述：

pPIC9K、 pPIC9、 pPICZaA, B、 C表达载体系统及 GS115、 X33酵母菌株均购自 Invitrogen公司；绿豆核酸酶购自 NEB公司； Spheroplast kit for yeast 与 Pichia EasyComp™ kit 购自 Invitrogen 公司； Mini II 型蛋白电泳仪及蛋白半干电转仪 ( Bio-Rad公司）； GeL-Pro3.1凝胶成像系统（ Media Cybernetic 公司）； DU640型核酸 -蛋白分析仪（ Beckman公司）。

1 ) pPICZ B/CCOL2Al真核表达载体的构建

用于构建 pPICZaB/ CCOL2A1真核表达载体。引物序列 25: 5'GGT ACC TTG GTG GAA ACT TTG CGG 3 l 引物 26序列： 5'GGT ACC GTT ACA AGA AGC AGA CTG 3 以质粒 pGEM-T/CCOL2Al为模板进行 PCR扩增， PCR反应体系为： 2 xGC Buffer I 25μ1, dNTP( 2·5ιηΜ ) 4μ1, 引物 25( 20μΜ ) 0.5μ1, 引物 26 ( 20μΜ ) 0.5μ1， PCR扩增程序如下 96 ^ 5 min 4 x ( 96 C lmin, 67 ^ 1ιηίη, 72 C 3 min ) 26 ^x ( 96°C lmin， 65^ 30sec, 72 °C 2.5min ) 72 5min。

回收 PCR产物克隆入 pPICZaB表达载体中，采用限制性内切酶 Bam 婆定正确插入方向的表达载体 pPICZaB/ CCOL2Al。

2 ) 酵母表达载体 pPIC9K/CCOL2Al的构建

为提高 pPICZaB/CCOL2Al载体在毕赤酵母中的表达稳定性和表达量，进一步将 CCOL2A1构建在多拷贝载体 pPIC9K中，构建 pPIC9K/CCOL2Al。 pPIC9K/CCOL2Al的构建流程详见下图，简述如下：首先 pPICZaB/CCOL2Al经 Kpn I线形化后再用绿豆核酸酶进行削平，同时 pPIC9K经平端酶 S/mBI削平，两者由 T4 DNA连接酶连接，构建成 pPIC9K /CCOL2A1表达载体，经测序确定阅读框正确否。

3) Rpastoris GS115原生质体的制备

采用原生质体法转化酵母，流程如下：

a )、将 Ϊ pastoris GS115划线接种于 YPD平板， 30°C培养 2d, 挑取单克隆接种于 5ml YPD培养基中， 30°C 300rpm培养过夜； b )、 1： 1000稀释接种菌悬液至 lOOml YPD, 30 ^ 300rpm 培养至 OD600 为 0.2-0.3时， l，500g离心 5min, 弃上清；

c )、分别以 20ml无菌水、 20 ml SED及 20ml 1M 山梨醇各洗涤细胞一次，每次洗完后 l，500g 离心 5min，弃上清，最后加 20ml SCE重悬细胞，分成 10ml的、 B两管；

d )、取 1.5ml eppendorf , 每管加 800μ1 15%SDS, 并分别标上 0、 2、 4、 5、 6、 8、 9、 10、 15、 18、 20、 25、 30、 35、 40 分别代表 Zymolyase消化细胞壁的时间（ min ); 从 A管中取 200μ1 菌悬液加入后，放入冷冻中作为 Zymolyase消化分钟的对照管。加 7.5μ1 Zymolyase ( 2.25 units ) 到 A管，轻轻混匀，保温；根据管上标记的时间，每次从 A管取 200μ1消化的细胞悬液并加 800 l 5%SDS至 eppendorf管中，并立即放置水上以终止酶反应； e )、依据下列公式计算每个时间点形成原生质体的百分比：原生质体％=100- [ ( OD800 ( min ) /OD800 ( Omin ) <100 ), 以计算形成 70%原生质体的时间（t min); 加 7.5μ1 Zymolyase到 B 管， 30 °C保温 t min;

f )、室温 750g离心 10min，弃上清，分别用 lOml lM的山梨醇 10ml CaS洗涤原生质体，弃上清，最后用 0.6ml CaS重悬原生质体，用于转化。 4 ) pPIC9K/CCOL2Al, pPICZaB/CCOL2Al转化 GS115原生质体

a ) 、约 lO g 线形化的 pPICZaB/CCOL2Al 、 pPIC9K/CCOL2Al分别与 ΙΟΟμΙ刚制备好的原生质体轻轻混合，室温放置 lOmin; 同时以 pPIC9K/GS115及 pPICZaB/GS115空质粒载体作为阴性对照；

b )、加 lml新鲜配制的 PEG/CaT ( 1: 1 ) 溶液，轻轻混合，室温再放置 lOmin;

c )、 750g离心 10min，尽可能吸去上清，用 150 l SOS重悬细胞并静置 20min, 加 850μ1 1M的山梨醇；

d )、每 150μ1已转化的原生质体与 10ml RD琼脂糖培养基混合，并铺在 RDB平板上层， 28-30°C培养 4-6d并观察结果。

5 ) pPICZaB/CCOL2Al/GS115及 pPIC9K/CCOL2Al/GS115阳性转化子的抗性筛选

培养后的 pPIC9K/CCOL2Al/GS115 与 pPICZaB/CCOL2Al/GS115在 RDB平板长出约 100个的转化子，为了获得多拷贝，将各转化子分别转移至在含不同浓度的 G418 或 Zeocin 的抗性平板（ G418 浓度： 0.25mg/ml、 0.5 mg/mK 1 mg/mK 2.0mg/ml、 3.0 mg/mL 4.0mg/ml; Zeocin浓度 100 g/ml, 200 g/ml ) 上筛选多拷贝。

6 ) 酵母基因组 DNA 的提取及目的基因在酵母基因组中整合的 PCR鉴定

分别将抗性转化子及空载体对照，接种到 2ml的 YPD 中， 30 300rpm培养 2d，离心后提取基因组 DNA，采用 PCR检测 CCOL2A1基因在酵母基因组中的整合，其中以 CCOL2A1 cDNA 的特异性引物： F:5，GGTACC TTG GTG GAA ACT TTG CGG 3； R: 5'GGTACC GTT ACA AGA AGC AGA CTG 3，。 PCR 循环参数为： 96 ! 5min →5 x(96°C lmin, 60^ 2min, 72°C 3min) → 25 x(96°C lmin ,58^ 1ιηίη ,72^ 2min) → 72^ 5min„

7 ) pPICZaB/CCOL2Al/GS115, pPIC9K/CCOL2Al/GS115 的甲醇诱导表达及免疫印迹分析

将经过鉴定为阳性的克隆，接种至 30ml BMGY的培养基中 28°C 300rpm培养 2d后离心弃上清，以 1/10 体积的 BMMY 重悬，于 28°C 300rpm继续培养；期间每隔 24hr补充甲醇至 1%体积。分别收集诱导 4d培养物的上清及菌体；上清经透析、脱盐后冻干；菌体中加入破菌 buffer与约 1/4体积的玻璃珠破菌， 10，000rpm 离心，上清即为胞浆液；诱导上清及胞浆液经 10%SDS-PAGE电泳并转膜分析， 20%胎牛血清封闭，过夜；以 1: 1000 稀释的 95D1A单克隆抗体与 NC膜作用，室温孵育 2h, TTBS洗膜三次，每次 5min; 然后再用 1: 500稀释的羊抗小鼠二抗 -AP与 NC 膜室温孵育 2h, 洗膜同上；最后用 NBT/BCIP显色试剂盒显色。结果：

别取上述各表达载体诱导表达后的上清进行脱盐、浓缩及 10% SDS-PAGE 的电泳分析与 WB 鉴定。结果表明， pPICZ B/CCOL2Al 转化子中仅在胞浆内可见位于 80KD 左右 CCOL2A1CC链的表达带（图 11A ); 而在 pPIC9K/CCOL2Al转化子胞浆中 WB检测到表达完整的 CCOL2A1C链（图 11B )，上清中却无 WB条带出现。实施例 8脯氨酸 4羟化酶 a亚单位和 /或 β亚单位表达载体的构建 1 ) 脯氨酸 4羟化酶 a亚单位（P4Ha ) cDNA的克隆

根据鸡脯氨酸 4羟化酶 a亚单位（P4Ha )基因的序列，设计引物 a: 5 ' AGA TAC TGC TAC GAA AGA CCC CGA G 3 ' ；引物 b: 5 ' CTC TCT TGG TTG TAG CCC TCA TCT G 3 \ PCR反应体系为： 10 xPCR Buffer 5μ1, MgCI₂ ( 25mM) 5μ1, dNTP Mix ( 2.5mM ) 4μ1, 引物 a ( 20μΜ ) 0·5μ1，引物 b ( 20μΜ ) 0.5μ1, cDNA Ιμΐ , Taq 0.5μ1, Η₂0补至 50μ1; PCR扩增产物用 1%琼脂糖电泳检测； PCR 扩增程序为： 96*C5mhi →4

lmin, 72°C3min) →26 x(96 imin, 69 ^lmin, 72 2min) →72 。C3miii。

2) pPIC9K/P4Ha真核表达载体的构建

将如上述所得 Ρ4Ηα的 PCR产物与 pGEM-T载体连接，构建 pGEM-T/P4Hoc质粒。通过 PCR引入 Not I酶切位点，所用引物 a: 5 GCG GCC GCA GAT ACT GCT ACG AAA G 3 \ 引物 b: 5 GCG GCC GCC TCT CTT GGT TGT AGG 3 \ 采用 Pfu DNA 聚合酶进行 PCR扩增，产物回收后加 A尾，连至 pGEM-T 载体内并测序； pGEM-T/P4Hoc经 VWl酶切、回收目的片段，通过 T4 DNA连接酶将 Ρ4Ηα基因与经 Notl线形化的酵母 pPIC9K 载体相连接，构建成 pPIC9K/P4Ha表达载体。鉴定插入方向正确。

3 ) P4HPcDNA的克隆及重组表达载体的构建

根据已知鸡 Ρ4Ηβ亚基基因序列设计引物 F: 5'GCG GCC GCA CAG CCC CTG GAG GAG 3；引物 R: 5'GCG GCC GCG GTG ATG TAG ATC AGT C 3', 并引入 VWl酶切位点；对 17曰龄鸡胚胸骨细胞中提取的 RNA进行 PCR扩增，反应体系中采用 1.5mM 浓度的 [ Mg^2t ] ， PCR扩增程序为： 96°C5min →4 χ(96 。C lmin, 53 °C lmin,

30sec, 51°C30sec, 72 2min) →72 5min。 PCR产物连入 pGEM-T载体内进行测序；测序正确的克隆再导入毕赤酵母 pPIC9 表达载体中，构建成 pPIC9/P4H β表达载体。实施例 9 pPIC9K/P4Ha 、 ρΡΙ 9/Ρ4Ηβ与 pPICZaB/CCOL2Al 在酵母 GS115中的共表达

将如实施例 7 和 8 中所述重组表达载体 pPIC9K/P4Ha、 pPIC9/P4HP及 pPICZaB/CCOL2Al分别采用 Bg l、 SaH. PmeK 线形化。各取 10 g线性化的盾粒转化 GS115,在含 G418及 Zeocin 的 MM平板筛选阳性转化子， 30°C培养 4-6d。实施例 10 pPICZaA/ P4Ha-P双表达载体的构建

pPIC9K/P4Ha, ρΡΙ 9/Ρ4Ηβ及 pPICZaB/CCOL2Al在共表达时，阳性克隆不稳定，为了克服上述构建的不足之处，将 Ρ4Ηα、 β构建在同一表达载体 pPICZaA,形成 pPICZaA/P4H(x-P4HP双表达载体。

分别以实施例 8和 9中所得质粒 pGEM-T/P4Ha及 pGEM-T/P4Hp 为模板进行 PCR， P4Ha引物 F: 5'GCGGCCGC GAT ACT GCT ACG AAA G3 \ 引物 R: 5'GCGGCCGC CTC CAA CTC TGA TAA C 3 ', Ρ4Ηβ引物 F: 5 GCGGCCGC CAG CCC CTG GAG GAG -3 I R 5， GCGGCCGC TTA ATC ATC ATC AGC 3 I PCR循环参数： 96 °C 5min→ 4 x( 96。C 1 min, 66 80sec, 72 90sec ) →26 x ( 96 ^ 1ιηίη, 64€40sec, 72。C 50sec ) →72 °C 5min。 PCR 扩增产物用 1%琼脂糖电泳检查, 回收特异性扩增目的条带并连接 pGEM-Teasy载体并测序。

测序正确的 pGEM-T/P4Ha及 pGEM-T/P4Hp分别采用 Noil 酶切，连接 pPICZaA, 得到 pPICZaA/P4Hoc重组表达载体，和 pPICZocA/P4HP表达载体。将 pPICZaA/P4HP 完整表达单元切下，插入 pPICZaA/P4Ha₀ 再根据 /11、 J?« wHI为同裂酶，可连接 II 线性化的 pPICZaA/P4Hcc, 构建成 pPICZaA/P4H(x-P双表达载体。

根据 Ρ4Ηβ表达单元位于 Ρ4Ηβ表达单元的上游，应用 PCR鉴定 pPICZaA/P4Ha-P双表达载体中 Ρ4Ηα、 β表达单元的方向是否一致。上游引物 5， GCGGCCGC CAG CCC CTG GAG GAG 3；与扩增 P4Ha特异性的下游引物 5， GCGGCCGC CTC CAA CTC TGA TAA C 3，进行 PCR扩增；如插入为正向，则 PCR扩增可获得 4644bp的产物，反之，则 PCR扩增无目的条带出现。实施例 11 pPIC9K/CCOL2Al与 pPICZaA/P4Ha-P共表达

将 pPIC9K/CCOL2Al与 ρΡΙ€ΖαΑ/Ρ4Ηα-β共转化 GS115进行三基因的共表达研究。原生质体的制作、阳性转化子的筛选、

PCR鉴定以及甲醇诱导均按前述方法进行。

采用 SDS-PAGE及 WB法对 pPICZaB/CCOL2Al/GS115与 pPIC9K/P4Ha. ρΡΙ09/Ρ4Ηβ 共表达的诱导上清及胞浆表达物进行鉴定， WB结果如图 12示，从图中可看到，共表达时可在其胞浆内得到全长表达的的 CCOL2A10C链，而在上清中则未检测到表达产物。

Claims

1. 一种如 SEQ ID NO: 1所示的包含编码全长鸡 II型胶原蛋白的多核苷酸序列之分离的核酸分子，或其具有相同生物学功能的片段。
2. 权利要求 1 所述的分离的核酸分子，其为具有如 SEQ ID NO: 2所示编码全长鸡 II型胶原蛋白的多核苷酸序列片段。
3. 权利要求 1 所述分离的核酸分子或其具有相同生物学功能的片段编码的鸡 II型胶原蛋白，或其具有相同生物学活性的片段。
4. 一种含有权利要求 1或 2所述核酸分子或其具有相同生物学功能的片段的重组表达载体。
5. 一种由权利要求 4所述重组表达载体转化的宿主细胞，其能够表达鸡 II型胶原蛋白，或其具有相同生物学活性的片段。
6. 一种制备权利要求 3所述鸡 II型胶原蛋白的方法，其中包括

1) .用权利要求 4所述重組表达载体转化合适的宿主细胞；

2) .在合适的培养基中及适当的培养条件下培养宿主细胞；

3) .从培养基或细胞中分离、純化目的蛋白质。
7. 权利要求 6所述方法制备的鸡 II型胶原蛋白用于制备治疗和 /或预防类风湿性关节炎药物的用途。
8. —种用于预防和 /或治疗骨关节炎、类风湿性关节炎的药物組合物，其中包含治疗有效量的根据权利要求 6所述方法制备的鸡 II型胶原蛋白，和任选的，药学可接受的载体。
9. 一种食品或饮料组合物，其特征在于包含一定量的权利要求 6所述方法制备的鸡 II型胶原蛋白。
10. 一种食品添加剂组合物，其中包含一定量的权利要求 6所述方法制备的鸡 II型胶原蛋白。
11. 一种治疗和 /或预防类风湿性关节炎的方法，包括向需要的患者施用权利要求 1所述核酸分子或其具有相同生物学功能的片段。