CN118302186A - 用胶原多肽治疗结缔组织病况的药物组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于治疗伤口和皮肤增殖性病症的包含非天然存在的胶原多肽(优选衍生自史氏鲟的胶原多肽)的治疗组合物。

Description

用胶原多肽治疗结缔组织病况的药物组合物和方法

交叉引用

本申请要求于2021年7月28日提交的美国临时专利号63/226,591的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

胶原是在体内各种结缔组织(包括肌腱、韧带、皮肤和头发)中发现的最丰富的蛋白质之一。胶原或胶原补充剂在医疗、美容和/或健康目的中受欢迎(例如，刺激皮肤生长、促进伤口愈合、强化指/趾甲或关节等)。大多数胶原补充剂的胶原衍生自动物，作为动物加工业的副产品。然而，这种衍生自动物的胶原可能会增加疾病传播和过敏的风险。此外，某些消费者通常出于各种其他原因对无动物的产品感兴趣。因此，仍然需要改进衍生自非动物来源的胶原的组合物和方法。

发明内容

在一个方面，提供了一种治疗对象的伤口的方法，所述方法包括：向所述对象施用治疗有效量的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，从而治疗所述伤口。在一些实施方案中，所述伤口表现出不良的伤口愈合。在一些实施方案中，所述施用包括向所述伤口或邻近所述伤口的皮肤施用所述多肽。

在另一个方面，提供了一种治疗皮肤增殖性病症的方法，所述方法包括：向对象施用治疗有效量的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，从而治疗所述皮肤增殖性病症，其中所述皮肤增殖性病症的特征在于皮肤细胞(例如，成纤维细胞、角质形成细胞)的异常增殖、迁移和/或黏附。在一些实施方案中，所述异常增殖、迁移和/或黏附为降低或减少的增殖、迁移和/或黏附。在一些实施方案中，所述皮肤病况为表皮变薄、表皮萎缩、真皮萎缩、表皮变性、棘层松解、落叶性天疱疮、寻常型天疱疮、棘层松解性角化不良、Darier病、Hailey-Hailey病、Grover病、硬化性苔藓、胶原透明化或其组合。

在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，SEQ ID NO：32的所述截短物相对于SEQ ID NO：32包含N末端截短、C末端截短或两者。在任何前述实施方案中，所述N末端截短是相对于SEQ ID NO：32的50个氨基酸至750个氨基酸的N末端截短。在任何前述实施方案中，所述C末端截短是相对于SEQ ID NO：32的50个氨基酸至600个氨基酸的C末端截短。在任何前述实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽具有50个氨基酸至1250个氨基酸的总截短。在任何前述实施方案中，所述多肽的长度为至少50个氨基酸。在任何前述实施方案中，所述多肽的长度为50个氨基酸至250个氨基酸。在任何前述实施方案中，所述多肽不包含以下中的一者或多者：层粘连蛋白G结构域、Von Willebrand因子A型(vWA)结构域和纤维胶原C末端结构域。在任何前述实施方案中，所述多肽包含一个或多个胶原三螺旋重复。在任何前述实施方案中，所述多肽为单体的。在任何前述实施方案中，所述多肽不形成天然存在的胶原的稳定的三螺旋结构。在任何前述实施方案中，所述多肽基本上不含其他胶原链。在任何前述实施方案中，所述多肽相对于天然存在的胶原具有非天然存在的羟基化水平。在任何前述实施方案中，所述多肽中存在的少于10％的脯氨酸被羟基化。在任何前述实施方案中，所述多肽为非羟基化的。在任何前述实施方案中，所述多肽相对于天然存在的胶原具有非天然存在的糖基化水平。在任何前述实施方案中，所述多肽包含小于5wt.％的糖基化。在任何前述实施方案中，所述多肽作为药物组合物施用。在任何前述实施方案中，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在任何前述实施方案中，所述药学上可接受的赋形剂选自：抗黏剂、黏合剂、涂层剂、着色剂、崩解剂、调味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、媒介物及其任何组合。在任何前述实施方案中，所述药物组合物被配制用于表面施用。在任何前述实施方案中，所述药物组合物被配制为凝胶、霜剂、洗剂、油、泡沫、软膏、精华液及其任何组合。在任何前述实施方案中，在所述施用之后，所述皮肤中的角质形成细胞生长和/或再生增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在任何前述实施方案中，在所述施用之后，所述皮肤中的胶原产生增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在任何前述实施方案中，在所述施用之后，所述皮肤中的成纤维细胞迁移、增殖和/或黏附增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在任何前述实施方案中，在所述施用之后，暴露于城市灰尘后的角质形成细胞活力增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在任何前述实施方案中，在所述施用之后，涉及选自以下信号传导通路的一个或多个基因的表达(例如，由角质形成细胞、成纤维细胞)增加：VEGFA/VEGFR2信号传导通路、黏着斑信号传导通路、内皮素信号传导通路、EGF/EGFR信号传导通路、TGF-β信号传导通路及其任何组合。在任何前述实施方案中，涉及VEGFA/VEGFR2信号传导通路的所述一个或多个基因选自：MYOC1、FLII、ROCK1、ROCK2、CLTC、LIMK1、EGR1及其任何组合。在任何前述实施方案中，涉及黏着斑信号传导通路的所述一个或多个基因选自：ITGA3、TNC、LAMC1、FLNA、TLN1、ZYX、DIAPH1及其任何组合。在任何前述实施方案中，涉及内皮素信号传导通路的所述一个或多个基因选自：TRIOBP、WNK1、MMP2、VCAN、ACTA2、GNA12、EGR1及其任何组合。在任何前述实施方案中，涉及EGF/EGFR信号传导通路的所述一个或多个基因选自：ATXN2、JAK1、RPS6KA2、ROCK1、SHC1、IQGAP1、PLCG1及其任何组合。在任何前述实施方案中，涉及TGF-β信号传导通路的所述一个或多个基因选自：SMURF1、SPTBN1、PAK2、ROCK1、SHC1、TGFBR3、TGFBR1及其任何组合。

在另一个方面，提供了药物组合物，所述药物组合物包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；以及药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，SEQ ID NO：32的所述截短物相对于SEQ IDNO：32包含N末端截短、C末端截短或两者。在一些实施方案中，所述N末端截短是相对于SEQID NO：32的50个氨基酸至750个氨基酸的N末端截短。在一些实施方案中，所述C末端截短是相对于SEQ ID NO：32的50个氨基酸至600个氨基酸的C末端截短。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述多肽具有50个氨基酸至1250个氨基酸的总截短。在一些实施方案中，所述多肽的长度为至少50个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽的长度为50个氨基酸至250个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽不包含以下中的一者或多者：层粘连蛋白G结构域、Von Willebrand因子A型(vWA)结构域和纤维胶原C末端结构域。在一些实施方案中，所述多肽包含一个或多个胶原三螺旋重复。在一些实施方案中，所述多肽为单体的。在一些实施方案中，所述多肽不形成天然存在的胶原的稳定的三螺旋结构。在一些实施方案中，所述多肽基本上不含其他胶原链。在一些实施方案中，所述多肽相对于天然存在的胶原具有非天然存在的羟基化水平。在一些实施方案中，所述多肽中存在的少于10％的脯氨酸被羟基化。在一些实施方案中，所述多肽为非羟基化的。在一些实施方案中，所述多肽相对于天然存在的胶原具有非天然存在的糖基化水平。在一些实施方案中，所述多肽包含小于5wt.％的糖基化。在一些实施方案中，所述药学上可接受的赋形剂选自：抗黏剂、黏合剂、涂层剂、着色剂、崩解剂、调味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、媒介物及其任何组合。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于表面施用。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制为凝胶、霜剂、洗剂、油、泡沫、软膏、精华液及其任何组合。

通过下面的详细描述，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中，仅示出和描述本公开内容的说明性实施方案。将会认识到，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和描述本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。

附图说明

本文公开的主题的新颖特征在所附权利要求书中特别阐述。通过参考以下对其中利用了本文公开的主题的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将获得对本文公开的主题的特征和优点的更好理解，在附图中：

图1描绘了本公开内容的非天然存在的多肽与相应的天然存在的胶原的比对。图1公开了SEQ ID NO：33(SEQ ID NO：31的小节)。

图2描绘了本公开内容的非天然存在的多肽与相应的天然存在的胶原的比对。图2公开了SEQ ID NO：34(SEQ ID NO：32的小节)。

图3描绘了两种SDS-PAGE凝胶的图像，其显示来自微生物细胞培养物的上清液样品中的胶原蛋白条带。每个蛋白质的身份均标在每个条带上方。

图4A-图4C描绘了显示本公开内容的非天然存在的多肽在pH3.0处理之前和之后的条带的SDS-PAGE凝胶图像。

图5A-图5C描绘了在暴露于本公开内容的示例性非天然存在的多肽之后永生化人角质形成细胞细胞系、人原代成纤维细胞和人原代角质形成细胞的活力。

图6描绘了在暴露于本公开内容的示例性非天然存在的多肽之后人原代角质形成细胞的增殖的剂量依赖性增加。

图7描绘了在暴露于本公开内容的示例性非天然存在的多肽之后原代人成纤维细胞产生的I型胶原的剂量依赖性增加。

图8描绘了在暴露于本公开内容的示例性非天然存在的多肽之后人真皮成纤维细胞的伤口愈合活性。

具体实施方式

本文所使用的术语仅用于描述特定情况的目的并且不旨在进行限制。如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该/所述”也旨在包括复数形式，除非上下文清楚地另有说明。此外，就详细描述和/或权利要求中使用的术语“包括”、“包含”、“具有”或其变体而言，这些术语旨在以类似于术语“包含”的方式是包含性的。

术语“约”或“大约”意指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受的误差范围内，这将部分取决于该值是如何测量或确定的，例如，测量系统的限制。例如，“约”可以意指根据给定值的实践，在1个或超过1个标准差之内。当本申请和权利要求书中描述了特定值时，除非另有说明，否则术语“约”应当被假定为意指特定值的可接受的误差范围。

术语“个体”、“患者”或“对象”在本文中可互换使用。这些术语均不需要或限于以卫生保健工作者(例如医生、注册护士、执业护士、医师助理、勤务人员或临终关怀工作者)的监督(例如持续或间歇)为特征的情况。

如本文所使用的，术语“包括/包含”或其变体应被理解为指示包括任何所列举的特征，但不排除任何其他特征。因此，如本文所使用的，术语“包括/包含”是包含性的并且不排除附加的、未列举的特征。在本文提供的任何组合物和方法的一些实施方案中，“包括/包含”可以替换为“基本上由...组成”或“由...组成”。短语“基本上由......组成”在本文中用于要求指定的特征以及那些不会实质上影响所要求保护的公开内容的特征或功能的特征。如本文所使用的，术语“由......组成”用于指示仅存在所列举的特征。

贯穿本公开内容，各种实施方案以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对任何实施方案的范围的不灵活限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内直至下限单位的十分之一的任何单独数值，除非上下文另外明确指出。例如，诸如1至6的范围的描述应当被认为具有具体公开的子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的任何单独值，例如1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围有多大，此均适用。这些中间范围的上限和下限可以独立地包括在更小的范围内，并且也涵盖在本公开内容内，但受到所述范围中任何具体排除的限制的影响。当所述范围包括一个或两个限制时，排除这些所包括的限制中的一个或两个的范围也包括在本公开内容中，除非上下文另外明确指出。

术语“处理”或“治疗”在本文中可互换使用。这些术语指的是用于获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。所谓“治疗益处”意指根除或改善正在治疗的潜在病症。此外，用根除或改善与潜在病症相关的一个或多个生理症状，使得在对象中观察到改善来实现治疗益处，尽管对象仍然患有潜在病症。关于预防益处，在一些实施方案中，将组合物施用于处于发展特定疾病或病况风险的对象，或组合物施用于报告疾病的一个或多个生理症状的对象，即使尚未做出该疾病的诊断。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

术语“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”在本文中可互换使用，且指的是药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。每种载体必须是“可接受的”，即与制剂中的其他成分相容并且不会对患者造成伤害。可用作药学上可接受的载体的材料的一些示例包括：(1)糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状西黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；(21)药物制剂中使用的其他无毒相容物质。

本文所用的术语“截短的胶原”通常是指小于全长(例如，天然的)胶原的多肽，其中不存在全长(例如，天然的)胶原的一个或多个部分。本文提供的非天然存在的多肽可以在C末端截短，在N末端截短，通过去除全长胶原序列的内部部分而截短(例如，内部截短)，在C末端和N末端两者截短，或者可以具有C末端截短和N末端截短之一或两者以及内部截短。在非限制性实施方案中，截短的胶原可以包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其同系物。在另一个非限制性实施方案中，截短的胶原可以包含根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列或其同系物。

当用于提及氨基酸位置时，“截短”包括所述氨基酸位置。例如，相对于全长多肽在氨基酸位置100处的N末端截短意指从全长多肽的N末端截短100个氨基酸(即，截短的多肽缺少全长多肽的氨基酸位置1至100)。类似地，在全长多肽(假设全长多肽有1000个氨基酸)的氨基酸位置901处的C末端截短是指从C末端截短100个氨基酸(即，截短的多肽缺少全长多肽的氨基酸位置901至1000)。类似地，在氨基酸位置101和200处的内部截短是指全长多肽的100个氨基酸的内部截短(即，截短的多肽缺少全长多肽的氨基酸位置101至200)。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。

在某些实施方案中，本文提供了用于治疗各种皮肤病症、疾病和/或病况的组合物(例如，药物组合物)和方法。在一些情况下，皮肤病症、疾病和/或病况的特征可以是伤口愈合异常或不良。在一些情况下，皮肤病症、疾病和/或病况的特征可以是角质形成细胞和/或成纤维细胞增殖、迁移和/或黏附不良。本文提供的组合物(例如，药物组合物)和方法通常涉及本文提供的任何多肽的使用。在非限制性示例中，多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成(例如，如本文所述)。

作为非限制性示例，在本文的某些实施方案中进一步提供了用于制造非天然存在的多肽(例如，无动物的胶原多肽或胶原样多肽，以及胶原片段和/或截短的胶原，诸如在基因工程微生物中表达和/或由基因工程微生物表达)的组合物、方法和系统。因此，在本公开内容的各个方面，本文提供的非天然存在的多肽包括胶原或胶原样多肽、重组胶原、胶原片段或截短的胶原。在某些实施方案中，本文所述的非天然存在的多肽(例如，重组胶原、胶原片段或截短的胶原)衍生自任何合适的来源，诸如衍生自哺乳动物或非哺乳动物来源。例如，在一些实施方案中，本文所述的非天然存在的多肽(例如，重组胶原、胶原片段或截短的胶原)或其至少一部分衍生自(例如，修饰的、截短的、片段的，等等)鸟或禽类动物的胶原(例如原鸡(Gallus gallus)胶原)、淡水鱼或咸水鱼的胶原(例如，史氏鲟(Acipenserschrenckii)胶原)或其任何组合。

本文提供的非天然存在的多肽通常不存在于自然界中。一般而言，本文所述的非天然存在的多肽表现出与天然存在的胶原的一个或多个差异。在某些方面，本文提供的非天然存在的多肽可以具有与天然存在的多肽(例如，截短的胶原)不同的氨基酸序列。在一些情况下，非天然存在的多肽可具有与天然存在的胶原不同的结构。天然胶原的四级结构是三螺旋，通常由三个多肽组成。在一些方面，本文所述的非天然存在的多肽可以不具有或可以不形成天然胶原的四级结构。例如，在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽可以不形成天然存在的胶原的稳定的三螺旋结构。在某些情况下，在形成天然胶原的三条多肽中，两条通常是相同的并且被称为α链。第三条多肽被称为β链。在某些情况下，典型的天然胶原可被称为AAB，其中胶原由两条α(“A”)链和一条β(“B”)链组成。在一些方面，本文所述的非天然存在的多肽不具有天然胶原的AAB结构。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽不含或基本上不含不同的胶原链(例如，本文所述的非天然存在的多肽可以包含α链胶原并且可以不含或基本上不含β链胶原)。在一些方面，本文所述的非天然存在的多肽是单体的和/或不形成多聚体结构。在其他方面，本文所述的非天然存在的多肽在一些情况下可以与相同单体形成多聚体结构(例如，同二聚体、同三聚体等)。

在一些方面，非天然存在的多肽是重组多肽(例如，在宿主细胞中重组制备)。在一个实施方案中，非天然存在的多肽是截短的胶原。其他非天然存在的胶原多肽包括嵌合胶原。嵌合胶原是一种多肽，其中胶原多肽的一部分与第二胶原多肽的一部分邻接。例如，包含来自一个物种的胶原的一部分与来自另一物种的胶原的一部分邻接的胶原分子是嵌合胶原。在另一个实施方案中，非天然存在的多肽包含融合多肽，该融合多肽包含另外的氨基酸，诸如分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白、蛋白酶切割位点、GEK重复、GDK重复和/或β-内酰胺酶。

在一些实施方案中，本文提供的非天然存在的多肽(例如，重组多肽)例如相对于相应的天然胶原或天然存在的胶原具有非天然存在的糖基化水平。例如，在一些实施方案中，非天然存在的多肽(例如，重组多肽)包含小于约10wt.％、小于约9wt.％、小于约8wt.％、小于约7wt.％、小于约6wt.％、小于约5wt.％、小于约4wt.％、小于约3wt.％、小于约2wt.％、小于约1wt.％、小于约0.9wt.％、小于约0.8wt.％、小于约0.7wt.％、小于约0.6wt.％、小于约0.5wt.％、小于约0.4wt.％、小于约0.3wt.％、小于约0.2wt.％、或小于约0.1wt.％的糖基化。替代地和/或另外地，非天然存在的多肽(例如，重组多肽)包含小于约95％、小于约90％、小于约85％、小于约80％、小于约75％、小于约70％、小于约65％、小于约60％、小于约55％、小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％的相应的天然胶原或天然存在的胶原的总糖基化。例如，当来自物种XYZ的天然存在的胶原ABC具有20个糖基化(胶原ABC的全长或其一部分)时，预期非天然存在的多肽(例如，重组多肽)包含小于19、小于18、小于17、小于16、小于15、小于14、小于13、小于12、小于11、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6个、小于5个、小于4个、小于3个、小于2个或小于1个糖基化。在一些实施方案中，那些较低水平的糖基化可以对一个或多个类型的糖基化(例如，O-糖基化或N-糖基化等)和/或糖基化残基(例如，半乳糖基羟赖氨酸(Gal-Hyl)、葡糖基半乳糖基羟胺酸(GlcGal–Hyl)等)具有特异性。在一些情况下，重组(例如，在重组宿主细胞中)产生的非天然存在的多肽可以具有与天然存在的胶原不同的糖基化水平和/或糖基化模式。

在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽具有非天然存在量的羟脯氨酸。在一些情况下，本文提供的非天然存在的多肽缺乏羟脯氨酸。在一些情况下，本文提供的非天然存在的多肽包含比天然存在的胶原更少的羟脯氨酸。羟脯氨酸包括但不限于3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸和5-羟脯氨酸。在一些情况下，本文提供的非天然存在的多肽的氨基酸序列中存在的小于约50％(例如，小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或更少)的脯氨酸为羟脯氨酸。在一些方面，重组(例如，在重组宿主细胞中)产生的非天然存在的多肽可以具有比天然存在的胶原更少的羟脯氨酸。在一些情况下，本文提供的重组多肽在缺乏使重组多肽的一个或多个氨基酸(例如，脯氨酸)羟基化的酶的重组宿主细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞)中重组表达。在一些情况下，本文提供的重组多肽在缺乏脯氨酰4-羟化酶和/或脯氨酰3-羟化酶的宿主细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞)中重组表达。

在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽缺乏或基本上缺乏赖氨酰氧化。赖氨酰氧化涉及将赖氨酸残基转化为可与其他蛋白质形成交联的高反应性醛。天然存在的胶原可以具有一定程度的赖氨酰氧化。因此，非天然存在的多肽可以与天然胶原不同，因为非天然存在的多肽缺乏或基本上缺乏赖氨酰氧化。在一些情况下，本文提供的非天然存在的多肽的氨基酸序列中存在的小于约50％(例如，小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或更少)的赖氨酸被氧化。

一般而言，本文提供的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以具有与天然或全长胶原相似或基本上相似的功能并且/或者提供与天然或全长胶原相似或基本上相似的益处(例如，如本文所提供的)。在一些情况下，与天然或全长胶原相比，本文提供的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可具有改善或增加的功能和/或益处(例如，如本文提供的)。在一些实施方案中，本文提供的非天然存在的多肽与天然或全长胶原相比可具有一个或多个不同的功能。

本文公开的非天然存在的多肽通常具有与其单体结构相关的有利特性并且/或者缺乏能够与其他胶原链交联的氨基酸(例如，缺乏羟脯氨酸残基)。此外，与全长或天然胶原相比，本文公开的非天然存在的多肽的胶原水解产物还具有增加的溶解度。此外，与天然三螺旋胶原相比，单体结构更容易消化和生物利用，或者被消化蛋白酶分解。其他有利的特性包括在液体组合物中和在纯化过程中改进的物理特性，因为全长或天然胶原或胶原链相互作用形成更强的结构，该结构可以由于羟脯氨酸残基的存在而沉淀。

在某些优选的实施方案中，本文提供的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)包含与它们所衍生自的天然存在的哺乳动物或非哺乳动物胶原的至少一部分具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，天然氨基酸序列的一个或多个部分被删除，但该序列的其余部分与天然氨基酸序列基本上相似或相同。在某些示例性实施方案中，非天然存在的多肽具有与原鸡21型α1胶原或其截短物或片段具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个示例中，非天然存在的多肽具有与史氏鲟2型α1胶原或其截短物或片段具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，重组多肽是截短的胶原。在某些情况下，截短的胶原是比全长(例如，天然的)胶原更小的多肽，其中全长(例如，天然的)胶原的一个或多个部分(例如，内部和/或末端部分)不存在。在各种情况下，本文提供的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)在C末端截短，在N末端截短，通过去除全长胶原多肽的内部部分而截短(例如，内部截短)，在C末端和N末端两者截短，或者包含C末端截短和N末端截短之一或两者以及内部截短。在一些情况下，非天然存在的多肽是天然存在的胶原的片段，其保留天然或天然存在的相应胶原的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的功能(例如，感兴趣的功能)。在一些情况下，术语截短的胶原与术语胶原片段可互换使用。在一些情况下，截短的胶原包括任何连续的胶原片段，即至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％的全长天然或天然存在的相应胶原。在一些实施方案中，截短是内部截短、胶原的N末端部分截短、胶原的C末端部分截短、内部部分截短或C末端和N末端截短。本文提供的截短的胶原可以被截短50个氨基酸至1250个氨基酸、50个氨基酸至1200个氨基酸、50个氨基酸至1150个氨基酸、50个氨基酸至1100个氨基酸、50个氨基酸至1050个氨基酸、50个氨基酸至1000个氨基酸、50个氨基酸至950个氨基酸、50个氨基酸至900个氨基酸、50个氨基酸至850个氨基酸、50个氨基酸至800个氨基酸、50个氨基酸至750个氨基酸、50个氨基酸至700个氨基酸、50个氨基酸至650个氨基酸、50个氨基酸至600个氨基酸、50个氨基酸至550个氨基酸、50个氨基酸至500个氨基酸、50个氨基酸至450个氨基酸、50个氨基酸至400个氨基酸、50个氨基酸至350个氨基酸、50个氨基酸至300个氨基酸、50个氨基酸至250个氨基酸、50个氨基酸至200个氨基酸、50个氨基酸至150个氨基酸或50个氨基酸至100个氨基酸(例如，相对于全长胶原)。在另一个实施方案中，截短的胶原被截短50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200或1250个氨基酸(例如，相对于全长胶原)。

在一些实施方案中，本文提供的多肽(例如，其氨基酸序列)可以在C末端(相对于全长胶原)被截短任何合适数量的氨基酸残基，例如至多10、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100等。在一些情况下，本文提供的多肽(例如，其氨基酸序列)可以在C末端(相对于全长胶原)截短10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸。

在一些实施方案中，本文提供的多肽(例如，其氨基酸序列)可以在N末端(相对于全长胶原)被截短任何合适数量的氨基酸残基，例如至多10、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100等。在一些情况下，本文提供的多肽可以在N末端(相对于全长胶原)截短10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸。

在一些实施方案中，本文提供的多肽(例如，其氨基酸序列)相对于全长胶原可以在N末端和C末端两者被截短。在一些情况下，本文提供的多肽可以在N末端(相对于全长胶原)被截短任何合适数量的氨基酸残基，例如至多10、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100等；并且可以在C末端(相对于全长胶原)被截短任何合适数量的氨基酸残基，例如至多10、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100等。在一些情况下，本文提供的多肽可以在N末端(相对于全长胶原)截短10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸；并且可以在C末端(相对于全长胶原)被截短10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸。

在一些实施方案中，本文提供的多肽(例如，其氨基酸序列)可以被内部截短(相对于全长胶原)任何合适数量的氨基酸残基，例如至多10、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100等。在一些情况下，本文提供的多肽可以被内部截短(相对于全长胶原)10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸。

本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以包含相对于全长(例如，天然的)胶原的截短。在一些实施方案中，本文公开的截短的胶原可以包含相对于全长(例如，天然的)鸡(原鸡)21型α1胶原(例如SEQ ID NO：31)的截短。在一些实施方案中，本文公开的截短胶原可包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约70％序列同一性(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多)的氨基酸序列，其具有N末端截短、C末端截短、内部截短或其组合。在一些实施方案中，本文公开的截短的胶原可以包含相对于全长(例如，天然的)日本鲟鱼(史氏鲟)2型α1胶原(例如，SEQ ID NO：32)的截短。在一些实施方案中，本文公开的截短胶原可以包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少约70％序列同一性(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多)的氨基酸序列，其具有N末端截短、C末端截短、内部截短或其组合。在一些实施方案中，本文公开的截短的胶原可以包含相对于全长(例如，天然的)水母(水螅纲)胶原(例如，SEQ ID NO：39)的截短。在一些实施方案中，本文公开的截短胶原可以包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：39的氨基酸序列具有至少约70％序列同一性(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多)的氨基酸序列，其具有N末端截短、C末端截短、内部截短或其组合。在一些实施方案中，本文公开的截短的胶原可以包含相对于全长(例如，天然的)人21型α1胶原(例如，SEQ ID NO：40)的截短。在一些实施方案中，本文公开的截短胶原可以包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：40的氨基酸序列具有至少约70％序列同一性(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多)的氨基酸序列，其具有N末端截短、C末端截短、内部截短或其组合。下表1中提供了全长(例如，天然的)胶原的非限制性示例。

在一些情况下，本文提供的多肽的长度可以是至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少125个氨基酸、至少150个氨基酸、至少175个氨基酸、至少200个氨基酸、至少225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸、至少300个氨基酸、至少350个氨基酸、至少400个氨基酸、至少450个氨基酸或至少500个氨基酸。

在其他实施方案中，本文公开的多肽可以是与鱼胶原可比的截短的胶原多肽，包括来自鲟鱼的其他物种，或来自产生适用于鱼子酱的鱼子的其他物种，包括鲑鱼、硬头鳟、鳟鱼、圆鳍鱼、白鲑或鲤鱼，以及其他鱼类，诸如罗非鱼和鲨鱼。来自史氏鲟(日本鲟鱼)的合适的可比序列包括NCBI登录号BAO58965.1、BAO58966.1、BAO58967.1、BAT51012.1、BAR72360.1、BAR72359.1、BAR72358.1、BAR72357.1和BAR72356.1。来自小体鲟(Acipenserruthenus)(小体鲟鱼)的合适序列包括NCBI登录号A0A444UGW0、A0A444TZM6、A0A444UC45、A0A444UC53、A0A662YTX1、A0A662Z270、A0A662YZ39、A0A444U1F5、A0A444UJK3、A0A444UNU0、X5HZZ7、X5IHC1、A0A444UPK8、A0A444UBS1、A0A444UYQ7、A0A444TWQ3、A0A444ULY4、A0A444TZ23、A0A662YS48、A0A444U4C8、A0A444UD64、A0A662YX10、A0A662YXI2、A0A444TXQ4、A0A444TZ42、A0A444U8N8、A0A444UJU3、A0A444UQ51、A0A444U2T2、A0A662YJ50、A0A444V1V9、A0A444V113、A0A662YWR6、A0A662YW91、A0A444U5J5、A0A662YR93、A0A444UJB0、A0A444UFS4、A0A444UVK2、A0A444UJU1、A0A444ULY9、A0A444UKA7、A0A444U5L7、A0A444V6M4、A0A444V788、A0A444UFS9、A0A444UVP7、A0A444U4D9、A0A444UHN6、A0A662YJC1、A0A444V1E8、A0A444UPM0、A0A662YU87、A0A444TZS8、A0A444U200、A0A444V2E3、A0A662YXD3、A0A662YQA4、A0A444U1H9、A0A444V7I5、A0A444UFX8、A0A444V7B8、A0A444U2K4、A0A444V762、A0A444UQ49、A0A662YMD3、A0A662YWF2、A0A444UE44、A0A444UAR6、A0A444UX46、A0A444U5P4、A0A662YRG8、A0A444USC3、A0A444UK09、A0A444UNQ7、A0A444UN69、A0A444V5D9、E6Y298、A0A444TZY1、A0A444TYS0和E6Y299。

在其他实施方案中，多肽可以是与鸡胶原或其他家禽胶原(诸如来自家禽，包括鸡、火鸡、鹅和鸭)可比的截短的胶原多肽。来自原鸡(鸡)的合适的可比序列包括NCBI登录号V9GZR2、Q9PSS5、A0A3Q2UDI3、Q90802、A0A1D5PNH7、Q4TZW6、Q90803、Q91014、A0A1D5PPI0、A0A1D5P1A5、A0A3Q2U6K2、A0A3Q2U8F9、Q90689、A0A3Q2U3U6、P13731、A0A1D5PFE0、A0A3Q2TXZ7、Q5FY72、A0A1D5PR16、A0A1D5PKR6、F1NDF5、Q90589、P08125、F1NRH2、P32017、A0A1D5PW49、Q90800、P12108、E1C353、Q7LZR2、P02460、A0A1L1RNI7、Q90796、P12106、F1NQ20、Q9I9K3、P20785、A0A1D5PWN6、P15988、P12105、F1NIL4、O93419、P02467、A0A5H1ZRJ7、A0A1D5PKQ4、A0A5H1ZRK9、Q90W37、A0A1D5NY11、A0A1D5P959、P02457、A0A1D5PYU1、A0A1D5PE57、Q90ZA0、Q90584、A0A1L1RZW7、A0A1D5NVM0、A0A1D5P8P3、F1NIP0、F1P2Q3、A0A1D5PE74、Q9IAU4、A0A3Q2TTC1、F1NHH4、P32018、A0A1D5P0F4、R4GHP9、A0A3Q2UD12、A0A3Q2UMJ2、A0A3Q2U4U7、F1NX22、A0A1D5P8I8、A0A1L1RPW4、P13944、P15989、F1P2F0、A0A1D5PGD5和A0A3Q3AR07。

表1.全长胶原氨基酸序列

在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可包含SEQ IDNO：31的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在从氨基酸位置1至537；从氨基酸位置1至542；从氨基酸位置1至547；从氨基酸位置1至552；从氨基酸位置1至557；从氨基酸位置1至562；从氨基酸位置1至567；从氨基酸位置1至572；或从氨基酸位置1至577的任何氨基酸位置(例如，相对于SEQ ID NO：31)具有N末端截短。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在从氨基酸位置726至957；从氨基酸位置731至957；从氨基酸位置736至957；从氨基酸位置741至957；从氨基酸位置746至957；从氨基酸位置751至957；从氨基酸位置756至957；从氨基酸位置761至957；从氨基酸位置766至957；从氨基酸位置769至957；从氨基酸位置774至957；从氨基酸位置779至957；或从氨基酸位置784至957的任何氨基酸位置(相对于SEQID NO：31)具有C末端截短。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以包含N末端截短和C末端截短两者。例如，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在从氨基酸位置1至537；从氨基酸位置1至542；从氨基酸位置1至547；从氨基酸位置1至552；从氨基酸位置1至557；从氨基酸位置1至562；从氨基酸位置1至567；从氨基酸位置1至572；或从氨基酸位置1至577的任何氨基酸位置(例如，相对于SEQ ID NO：31)具有N末端截短；并且在从氨基酸位置726至957；从氨基酸位置731至957；从氨基酸位置736至957；从氨基酸位置741至957；从氨基酸位置746至957；从氨基酸位置751至957；从氨基酸位置756至957；从氨基酸位置761至957；从氨基酸位置766至957；从氨基酸位置769至957；从氨基酸位置774至957；从氨基酸位置779至957；或从氨基酸位置784至957的任何氨基酸位置(相对于SEQ ID NO：31)具有C末端截短。在一个具体的实施方案中，本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在氨基酸位置557(相对于SEQ ID NO：31)处具有N末端截短；并且在氨基酸位置746(相对于SEQ ID NO：31)处具有C末端截短。在另一个具体实施方案中，本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在氨基酸位置557(相对于SEQ ID NO：31)处具有N末端截短；并且在氨基酸位置769(相对于SEQ ID NO：31)处具有C末端截短。

在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可包含SEQ IDNO：32的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在从氨基酸位置1至660；从氨基酸位置1至665；从氨基酸位置1至670；从氨基酸位置1至675；从氨基酸位置1至680；从氨基酸位置1至685；从氨基酸位置1至690；从氨基酸位置1至695；或从氨基酸位置1至700的任何氨基酸位置(例如，相对于SEQ ID NO：32)具有N末端截短。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在从氨基酸位置855至1420；从氨基酸位置860至1420；从氨基酸位置865至1420；从氨基酸位置870至1420；从氨基酸位置875至1420从氨基酸位置880至1420；从氨基酸位置885至1420；从氨基酸位置890至1420；从氨基酸位置895至1420；或从氨基酸位置900至1420的任何氨基酸位置(相对于SEQ ID NO：32)具有C末端截短。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如截短的胶原)可以包含N末端截短和C末端截短两者。例如，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在从氨基酸位置1至660；从氨基酸位置1至665；从氨基酸位置1至670；从氨基酸位置1至675；从氨基酸位置1至680；从氨基酸位置1至685；从氨基酸位置1至690；从氨基酸位置1至695；或从氨基酸位置1至700的任何氨基酸位置(例如，相对于SEQ ID NO：32)具有N末端截短；并且在从氨基酸位置855至1420；从氨基酸位置860至1420；从氨基酸位置865至1420；从氨基酸位置870至1420；从氨基酸位置875至1420；从氨基酸位置880至1420；从氨基酸位置885至1420；从氨基酸位置890至1420；从氨基酸位置895至1420；或从氨基酸位置900至1420的任何氨基酸位置(相对于SEQ ID NO：32)具有C末端截短。在一个具体的实施方案中，本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在氨基酸位置680(相对于SEQ ID NO：32)处具有N末端截短；并且在氨基酸位置880(相对于SEQ ID NO：32)处具有C末端截短。

在一些情况下，本文所述的截短的胶原可以在SEQ ID NO:39的氨基酸位置16和240之间；氨基酸位置16和245之间；氨基酸位置16和250之间；氨基酸位置16和255之间；氨基酸位置16和260之间；氨基酸位置16和265之间；氨基酸位置6和255之间；氨基酸位置11和255之间；氨基酸位置21和255之间；氨基酸位置26和255之间；氨基酸位置31和255之间；氨基酸位置21和250之间；氨基酸位置21和245之间；氨基酸位置26和250之间；氨基酸位置26和245之间；氨基酸位置31和250之间；或氨基酸位置31和245之间的任何氨基酸位置处包含内部截短。在一个具体的实施方案中，如本文所述的截短的胶原可以在SEQ ID NO:39的氨基酸位置16和255处包含内部截短。

在一些情况下，本文所述的截短的胶原可以在SEQ ID NO:40的氨基酸位置1和548之间；氨基酸位置1和553之间；氨基酸位置1和558之间；氨基酸位置1和563之间；氨基酸位置1和568之间或氨基酸位置1和573之间的任何氨基酸位置包含N末端截短。在一些情况下，如本文所述的截短的胶原可以在SEQ ID NO:40的氨基酸位置726和957之间；氨基酸位置731和957之间；氨基酸位置736和957之间；氨基酸位置741和957之间；氨基酸位置746和957之间；氨基酸位置751和957之间或氨基酸位置756和957之间的任何氨基酸位置处包含C末端截短。在一些情况下，如本文所述的截短的胶原可以包含N末端截短和C末端截短两者。例如，本文所述的截短的胶原可以在SEQ ID NO：40的氨基酸位置1和548之间；氨基酸位置1和553之间；氨基酸位置1和558之间；氨基酸位置1和563之间；氨基酸位置1和568之间；或氨基酸位置1和573之间的任何氨基酸位置包含N末端截短；并且在氨基酸位置726和957之间；氨基酸位置731和957之间；氨基酸位置736和957之间；氨基酸位置741和957之间；氨基酸位置746和957之间；氨基酸位置751和957之间；或氨基酸位置756和957之间的任何氨基酸位置包含C末端截短。在一个具体的实施方案中，本文公开的截短的胶原可以在SEQ ID NO:40的氨基酸位置558处包含N末端截短；并且在SEQ ID NO:40的氨基酸位置746处包含C末端截短。

在一些情况下，非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可包含本文提供的任何氨基酸序列。在一些情况下，非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以由本文提供的任何氨基酸序列组成。在一些情况下，非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以基本上由本文提供的任何氨基酸序列组成。在具体实施方案中，非天然存在的多肽具有或包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:37中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:37中任一项具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的多肽由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:37中任一项的氨基酸序列组成或基本上由其组成。

在一些方面，非天然存在的多肽可包括任何嵌合胶原，其包括至少一种非连续胶原片段。例如，非天然存在的多肽可以是嵌合胶原，其中N末端胶原的一部分与C末端胶原的一部分邻接，其中N末端胶原的该部分和C末端胶原的该部分在天然或天然存在的相应胶原中不邻接。在另一个示例中，非天然存在的多肽可以是嵌合胶原，其中C末端胶原的一部分与N末端胶原的一部分邻接(例如，以翻转或相反的顺序——C末端胶原位于N末端胶原的部分的N末端)，其中C末端胶原的该部分和N末端胶原的该部分在天然或天然存在的相应胶原中邻接或不邻接。在另一个示例中，非天然存在的多肽可以是嵌合胶原，其中胶原多肽的一部分与第二胶原多肽的一部分邻接(例如，包含来自第一物种的胶原的一部分邻接来自第二物种的胶原的一部分的胶原分子是嵌合胶原，等)。

下面提供了示例性氨基酸序列或编码重组多肽的核酸序列：

SEQ ID NO：1-编码来自原鸡(鸡)的截短的21型胶原α1多肽的核苷酸序列

GATACCGGTTTTCCGGGTATGCCTGGTCGTAGCGGTGATCCGGGTCGTAGCGGTAAAGATGGTCTGCCTGGTAGCCCGGGTTTTAAAGGTGAAGTTGGTCAGCCAGGTAGCCCTGGTCTGGAAGGTCATCGTGGTGAACCGGGTATTCCAGGTATTCCGGGTAATCAGGGTGCAAAAGGTCAGAAAGGCGAAATTGGTCCTCCGGGTCTGCCAGGTGCCAAAGGTTCTCCGGGTGAAACCGGTCTGATGGGTCCTGAAGGTAGCTTTGGCCTGCCTGGTGCACCGGGTCCGAAAGGTGACAAAGGTGAACCTGGTCTGCAGGGTAAACCGGGTAGCAGCGGTGCAAAAGGCGAACCAGGTGGTCCGGGTGCTCCGGGTGAACCAGGCTATCCGGGTATTCCTGGTACTCAGGGTATTAAAGGCGATAAAGGTAGCCAGGGTGAAAGCGGTATTCAGGGTCGTAAGGGTGAAAAAGGCCGTCAGGGTAATCCAGGCCTGCAGGGCACCGAAGGTCTGCGTGGCGAACAGGGCGAAAAAGGTGAGAAGGGTGACCCAGGCATTCGT

SEQ ID NO：2-来自原鸡(鸡)的截短的21型胶原α1多肽的氨基酸序列

DTGFPGMPGRSGDPGRSGKDGLPGSPGFKGEVGQPGSPGLEGHRGEPGIPGIPGNQGAKGQKGEIGPPGLPGAKGSPGETGLMGPEGSFGLPGAPGPKGDKGEPGLQGKPGSSGAKGEPGGPGAPGEPGYPGIPGTQGIKGDKGSQGESGIQGRKGEKGRQGNPGLQGTEGLRGEQGEKGEKGDPGIR

SEQ ID NO：3-编码来自原鸡(鸡)的截短的21型胶原α1多肽的核苷酸序列

GATACTGGTTTCCCGGGGATGCCTGGGCGCTCAGGTGATCCGGGGCGTAGTGGAAAAGACGGTCTGCCGGGGTCCCCGGGCTTTAAGGGTGAGGTGGGTCAGCCCGGTAGTCCAGGTTTAGAAGGTCACCGCGGAGAGCCCGGGATTCCAGGCATTCCTGGCAACCAGGGTGCCAAGGGACAGAAAGGCGAAATTGGTCCGCCCGGCCTACCGGGCGCGAAAGGTTCTCCTGGTGAAACCGGTCTCATGGGTCCGGAAGGTAGCTTCGGCCTGCCCGGCGCACCTGGTCCGAAGGGCGATAAGGGGGAGCCTGGGCTGCAAGGTAAACCGGGTAGTTCTGGCGCCAAAGGTGAACCCGGCGGTCCCGGTGCGCCAGGGGAACCAGGTTATCCTGGTATTCCTGGAACCCAAGGAATTAAAGGTGACAAAGGCTCACAGGGCGAAAGTGGTATACAGGGTCGCAAGGGCGAAAAAGGACGTCAGGGCAATCCAGGCCTGCAGGGTACTGAAGGCCTGCGTGGAGAACAGGGTGAGAAAGGTGAAAAAGGAGATCCTGGTATTCGC

SEQ ID NO：4-来自原鸡(鸡)的截短的21型胶原α1多肽的氨基酸序列

DTGFPGMPGRSGDPGRSGKDGLPGSPGFKGEVGQPGSPGLEGHRGEPGIPGIPGNQGAKGQKGEIGPPGLPGAKGSPGETGLMGPEGSFGLPGAPGPKGDKGEPGLQGKPGSSGAKGEPGGPGAPGEPGYPGIPGTQGIKGDKGSQGESGIQGRKGEKGRQGNPGLQGTEGLRGEQGEKGEKGDPGIR

SEQ ID NO：5-编码来自原鸡(鸡)的截短的21型胶原α1多肽的核苷酸序列

GATACTGGTTTCCCGGGGATGCCTGGGCGCTCAGGTGATCCGGGGCGTAGTGGAAAAGACGGTCTGCCGGGGTCCCCGGGCTTTAAGGGTGAGGTGGGTCAGCCCGGTAGTCCAGGTTTAGAAGGTCACCGCGGAGAGCCCGGGATTCCAGGCATTCCTGGCAACCAGGGTGCCAAGGGACAGAAAGGCGAAATTGGTCCGCCCGGCCTACCGGGCGCGAAAGGTTCTCCTGGTGAAACCGGTCTCATGGGTCCGGAAGGTAGCTTCGGCCTGCCCGGCGCACCTGGTCCGAAGGGCGATAAGGGGGAGCCTGGGCTGCAAGGTAAACCGGGTAGTTCTGGCGCCAAAGGTGAACCCGGCGGTCCCGGTGCGCCAGGGGAACCAGGTTATCCTGGTATTCCTGGAACCCAAGGAATTAAAGGTGACAAAGGCTCACAGGGCGAAAGTGGTATACAGGGTCGCAAGGGCGAAAAAGGACGTCAGGGCAATCCAGGCCTGCAGGGTACTGAAGGCCTGCGTGGAGAACAGGGTGAGAAAGGTGAAAAAGGAGATCCTGGTATTCGCGGCATTAACGGTCAAAAGGGTGAAAGTGGGATACAAGGTCTTGTCGGTCCGCCCGGAGTTAGAGGCCAG

SEQ ID NO：6-来自原鸡(鸡)的截短的21型胶原α1多肽的氨基酸序列

DTGFPGMPGRSGDPGRSGKDGLPGSPGFKGEVGQPGSPGLEGHRGEPGIPGIPGNQGAKGQKGEIGPPGLPGAKGSPGETGLMGPEGSFGLPGAPGPKGDKGEPGLQGKPGSSGAKGEPGGPGAPGEPGYPGIPGTQGIKGDKGSQGESGIQGRKGEKGRQGNPGLQGTEGLRGEQGEKGEKGDPGIRGINGQKGESGIQGLVGPPGVRGQ

SEQ ID NO：7-编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的核苷酸序列

GTCTGCAGGGTATGCCTGGTGAACGTGGTGCAAGCGGTATTGCCGGTGCAAAAGGTGATCGTGGTGATGTTGGTGAAAAAGGTCCGGAAGGTGCCAGCGGTAAAGATGGTAGCCGTGGTCTGACCGGTCCGATTGGTCCGCCTGGTCCGGCAGGTCCGAATGGCGAAAAAGGTGAAAGCGGTCCGAGCGGTCCTCCGGGTGCAGCAGGTACTCGTGGTGCACCGGGTGATCGCGGTGAAAATGGTCCACCGGGTCCTGCCGGTTTTGCAGGTCCGCCAGGTGCAGATGGTCAGCCTGGTGCCAAAGGCGAACAAGGCGAAGGTGGTCAGAAAGGTGATGCAGGCGCTCCGGGTCCGCAGGGTCCTTCTGGTGCACCTGGTCCTCAGGGTCCGACCGGTGTTTCTGGTCCGAAAGGCGCACGTGGTGCCCAGGGTCCACCTGGTGCGACCGGTTTTCCTGGCGCAGCAGGTCGTGTTGGTCCTCCAGGTCCTAATGGTAATCCGGGTCCAAGCGGTCCTGCAGGTAGCGCAGGCAAAGATGGTCCTAAAGGTGTACGCGGTGATGCTGGTCCTCCTGGCCGTGCCGGTGATGCCGGT

SEQ ID NO：8-来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的氨基酸序列

GLQGMPGERGASGIAGAKGDRGDVGEKGPEGASGKDGSRGLTGPIGPPGPAGPNGEKGESGPSGPPGAAGTRGAPGDRGENGPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEQGEGGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGVSGPKGARGAQGPPGATGFPGAAGRVGPPGPNGNPGPSGPAGSAGKDGPKGVRGDAGPPGRAGDAG

SEQ ID NO：9-编码名为分泌信号序列1的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCG

SEQ ID NO：10-分泌信号序列1的氨基酸序列

MKKIWLALAGLVLAFSASA

SEQ ID NO：11-编码名为分泌信号序列2的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGAAAAAAGGTTTCATGCTGTTCACCCTCCTCGCTGCGTTCTCTGGTTTCGCGCAGGCT

SEQ ID NO：12-分泌信号序列2的氨基酸序列

MKKGFMLFTLLAAFSGFAQA

SEQ ID NO：13-编码名为分泌信号序列3的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGATGATCACCCTGCGTAAACTGCCGCTGGCTGTTGCTGTTGCTGCTGGTGTTATGTCTGCTCAGGCTATGGCT

SEQ ID NO：14-分泌信号序列3的氨基酸序列

MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA

SEQ ID NO：15-编码名为分泌信号序列4的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGAAAAAAACCGCTATCGCTATCGCTGTTGCTCTGGCTGGTTTCGCTACCGTTGCTCAGGCT

SEQ ID NO：16-分泌信号序列4的氨基酸序列

MKKTAIAIAVALAGFATVAQA

SEQ ID NO：17-编码名为分泌信号序列5的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGAAAGTTAAAGTTCTGTCTCTGCTGGTTCCGGCTCTGCTGGTTGCTGGTGCTGCTAACGCT

SEQ ID NO：18-分泌信号序列5的氨基酸序列

MKVKVLSLLVPALLVAGAANA

SEQ ID NO：19-编码名为分泌信号序列6的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGAAAAAAAACATCCTGTCTCTGTCTATGGTTGCTCTGTCTCTGTCTCTGGCTCTGGGTTCTGTTTCTGTTACCGCT

SEQ ID NO：20-分泌信号序列6的氨基酸序列

MKKNILSLSMVALSLSLALGSVSVTA

SEQ ID NO：21-编码名为分泌信号序列7的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGCTGAACCCGAAAGTTGCTTACATGGTTTGGATGACCTGCCTGGGTCTGACCCTGCCGTCTCAGGCT

SEQ ID NO：22-分泌信号序列7的氨基酸序列

MLNPKVAYMVWMTCLGLTLPSQA

SEQ ID NO：23-编码名为分泌信号序列8的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGAAACAGGCTCTGCGTGTAGCGTTCGGTTTCCTGATACTGTGGGCTTCTGTTCTGCACGCT

SEQ ID NO：24-分泌信号序列8的氨基酸序列

MKQALRVAFGFLILWASVLHA

SEQ ID NO：25-编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的密码子优化的核苷酸序列

GGTCTGCAGGGTATGCCGGGTGAACGTGGTGCCAGCGGTATTGCAGGTGCCAAAGGTGATCGTGGTGATGTTGGTGAAAAAGGTCCGGAAGGTGCAAGCGGTAAAGATGGTAGCCGTGGTCTGACCGGTCCGATTGGTCCGCCGGGTCCGGCCGGTCCGAATGGTGAAAAAGGTGAAAGCGGTCCGAGCGGTCCGCCGGGTGCAGCCGGTACCCGTGGTGCACCGGGTGATCGTGGTGAAAATGGTCCGCCGGGTCCGGCCGGTTTTGCAGGTCCGCCGGGTGCCGATGGTCAGCCGGGTGCAAAAGGTGAACAGGGTGAAGGTGGTCAGAAAGGTGATGCCGGTGCACCGGGTCCGCAGGGTCCGAGCGGTGCCCCGGGTCCGCAGGGTCCGACCGGTGTTAGCGGTCCGAAAGGTGCACGTGGTGCCCAGGGTCCGCCGGGTGCAACCGGTTTTCCGGGTGCCGCAGGTCGTGTTGGTCCGCCGGGTCCGAATGGTAATCCGGGTCCGAGCGGTCCGGCAGGTAGCGCCGGTAAAGATGGTCCGAAAGGTGTTCGTGGTGATGCAGGTCCGCCGGGTCGTGCCGGTGATGCAGGTTAA

SEQ ID NO：26-编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的密码子优化的核苷酸序列

GGCCTGCAAGGCATGCCAGGCGAGCGCGGCGCGTCTGGCATCGCGGGCGCGAAGGGCGACCGCGGCGACGTGGGCGAGAAGGGCCCTGAGGGCGCGTCCGGCAAGGACGGCTCTCGCGGCCTGACAGGCCCAATCGGCCCTCCAGGCCCTGCGGGCCCAAACGGCGAGAAGGGCGAGTCCGGCCCTTCTGGCCCACCTGGCGCGGCGGGCACACGCGGCGCGCCAGGCGACCGCGGCGAGAACGGCCCTCCAGGCCCTGCGGGCTTCGCGGGCCCACCTGGCGCGGACGGCCAACCAGGCGCGAAGGGCGAGCAAGGCGAGGGCGGCCAAAAGGGCGACGCGGGCGCGCCTGGCCCACAAGGCCCTTCTGGCGCGCCAGGCCCTCAAGGCCCAACAGGCGTGTCCGGCCCTAAGGGCGCGCGCGGCGCGCAAGGCCCACCTGGCGCGACAGGCTTCCCAGGCGCGGCGGGCCGCGTGGGCCCTCCAGGCCCTAACGGCAACCCAGGCCCTTCTGGCCCAGCGGGCTCCGCGGGCAAGGACGGCCCTAAGGGCGTGCGCGGCGACGCGGGCCCACCTGGCCGCGCGGGCGACGCGGGCTGA

SEQ ID NO：27-编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的密码子优化的核苷酸序列

GGTTTGCAAGGTATGCCAGGGGAACGGGGTGCGTCCGGGATAGCCGGGGCAAAAGGTGATCGAGGCGATGTAGGAGAAAAAGGCCCAGAAGGGGCGTCAGGTAAGGACGGATCTCGCGGCTTGACGGGACCTATCGGGCCTCCAGGTCCCGCCGGCCCTAATGGGGAAAAAGGCGAGAGTGGGCCGTCTGGTCCGCCCGGCGCCGCTGGCACACGTGGAGCGCCGGGCGATCGTGGTGAGAACGGACCACCGGGTCCTGCTGGTTTTGCGGGACCTCCGGGAGCAGACGGCCAGCCGGGCGCTAAAGGTGAACAGGGTGAAGGTGGCCAAAAAGGCGATGCAGGCGCACCGGGTCCGCAGGGCCCTTCAGGTGCACCGGGTCCACAGGGCCCAACTGGCGTTTCAGGGCCGAAAGGCGCAAGAGGTGCTCAGGGTCCGCCCGGGGCAACTGGGTTTCCTGGAGCGGCCGGCCGTGTTGGACCTCCGGGGCCGAACGGAAACCCTGGACCGTCTGGACCAGCCGGTTCAGCGGGTAAGGATGGTCCTAAGGGTGTAAGGGGTGACGCAGGTCCCCCTGGACGTGCAGGGGATGCGGGGTAG

SEQ ID NO：28-编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的密码子优化的核苷酸序列

GGGTTACAAGGTATGCCGGGAGAACGTGGAGCGTCAGGAATTGCTGGGGCCAAAGGTGATCGTGGTGATGTTGGCGAGAAAGGGCCCGAAGGCGCATCTGGTAAAGATGGCTCACGCGGGTTAACTGGACCAATCGGACCACCAGGCCCCGCTGGGCCTAATGGTGAAAAGGGTGAAAGTGGCCCTTCTGGACCCCCAGGAGCCGCCGGTACACGTGGAGCGCCAGGCGATCGTGGCGAAAACGGACCGCCCGGACCTGCAGGTTTTGCGGGACCCCCTGGAGCAGACGGCCAACCAGGAGCAAAAGGTGAGCAAGGTGAAGGTGGACAAAAGGGAGATGCCGGAGCGCCAGGCCCCCAAGGCCCATCAGGAGCTCCAGGACCTCAAGGTCCAACTGGTGTATCAGGGCCTAAGGGTGCGCGCGGCGCTCAAGGACCGCCTGGCGCAACTGGCTTTCCGGGAGCTGCTGGTCGTGTGGGCCCGCCTGGCCCAAACGGAAATCCAGGCCCTTCAGGCCCGGCGGGCTCAGCCGGAAAAGACGGTCCGAAGGGAGTCCGTGGAGATGCGGGACCGCCAGGACGCGCTGGCGATGCAGGCTAA

SEQ ID NO：29-编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的密码子优化的核苷酸序列

GGTTTACAGGGAATGCCAGGGGAACGCGGCGCCTCAGGGATTGCCGGTGCTAAAGGAGATCGTGGCGACGTGGGTGAAAAGGGTCCCGAGGGAGCATCAGGTAAGGATGGTTCCCGTGGTTTGACGGGACCTATTGGACCTCCGGGTCCTGCAGGTCCGAACGGCGAAAAGGGGGAAAGCGGGCCTAGTGGTCCACCCGGCGCCGCAGGTACCCGTGGTGCCCCAGGCGACCGCGGGGAGAATGGACCGCCTGGCCCTGCCGGTTTTGCGGGTCCTCCAGGAGCCGATGGGCAGCCCGGTGCAAAAGGAGAGCAGGGAGAGGGAGGTCAAAAGGGAGATGCCGGCGCCCCGGGCCCTCAGGGACCAAGCGGTGCGCCAGGCCCCCAGGGTCCTACGGGTGTTAGCGGGCCGAAAGGCGCACGCGGAGCGCAGGGCCCACCTGGTGCAACAGGCTTCCCAGGAGCTGCGGGGCGCGTCGGACCTCCGGGACCCAATGGAAACCCAGGTCCGTCAGGGCCGGCAGGCTCCGCAGGGAAAGATGGTCCCAAAGGCGTGCGTGGAGACGCAGGGCCCCCCGGACGCGCCGGCGATGCGGGATAA

SEQ ID NO：30-编码来自原鸡的截短的21型胶原多肽的密码子优化的核苷酸序列

GATACTGGTTTCCCGGGGATGCCTGGGCGCTCAGGTGATCCGGGGCGTAGTGGAAAAGACGGTCTGCCGGGGTCCCCGGGCTTTAAGGGTGAGGTGGGTCAGCCCGGTAGTCCAGGTTTAGAAGGTCACCGCGGAGAGCCCGGGATTCCAGGCATTCCTGGCAACCAGGGTGCCAAGGGACAGAAAGGCGAAATTGGTCCGCCCGGCCTACCGGGCGCGAAAGGTTCTCCTGGTGAAACCGGTCTCATGGGTCCGGAAGGTAGCTTCGGCCTGCCCGGCGCACCTGGTCCGAAGGGCGATAAGGGGGAGCCTGGGCTGCAAGGTAAACCGGGTAGTTCTGGCGCCAAAGGTGAACCCGGCGGTCCCGGTGCGCCAGGGGAACCAGGTTATCCTGGTATTCCTGGAACCCAAGGAATTAAAGGTGACAAAGGCTCACAGGGCGAAAGTGGTATACAGGGTCGCAAGGGCGAAAAAGGACGTCAGGGCAATCCAGGCCTGCAGGGTACTGAAGGCCTGCGTGGAGAACAGGGTGAGAAAGGTGAAAAAGGAGATCCTGGTATTCGC

SEQ ID NO：35-来自水母的截短的胶原多肽的氨基酸序列

GPQGVVGADGKDGTPGNAGQKGPSGEPGSPGKAGSAGEQGPPGKDGSNGEPGSPGKEGERGLAGPPGPDGRRGETGSPGIAGALGKPGLEGPKGYPGLRGRDGTNGKRGEQGETGPDGVRGIPGNDGQSGKPGIDGIDGTNGQPGEAGYQGGRGTRGQLGETGDVGQNGDRGAPGPDGSKGSAGRPGLR

SEQ ID NO：36-编码来自水母的截短的胶原多肽的密码子优化的核苷酸序列

GGTCCGCAGGGTGTTGTTGGTGCAGATGGTAAAGACGGTACCCCGGGTAATGCAGGTCAGAAAGGTCCGTCAGGTGAACCTGGCAGCCCTGGTAAAGCAGGTAGTGCCGGTGAGCAGGGTCCGCCGGGCAAAGATGGTAGTAATGGTGAGCCGGGTAGCCCTGGCAAAGAAGGTGAACGTGGTCTGGCAGGACCGCCGGGTCCTGATGGTCGCCGCGGTGAAACGGGTTCACCGGGTATTGCCGGTGCCCTGGGTAAACCAGGTCTGGAAGGTCCGAAAGGTTATCCTGGTCTGCGCGGTCGTGATGGTACCAATGGCAAACGTGGCGAACAGGGCGAAACCGGTCCAGATGGTGTTCGTGGTATTCCGGGTAACGATGGTCAGAGCGGTAAACCGGGCATTGATGGTATTGATGGCACCAATGGTCAGCCTGGCGAAGCAGGTTATCAGGGTGGTCGCGGTACCCGTGGTCAGCTGGGTGAAACAGGTGATGTTGGTCAGAATGGTGATCGCGGCGCACCGGGTCCGGATGGTAGCAAAGGTAGCGCCGGTCGTCCGGGTTTACGTTAA

SEQ ID NO：37-来自人的截短的21型α1胶原多肽的氨基酸序列

AGFPGLPGPAGEPGRHGKDGLMGSPGFKGEAGSPGAPGQDGTRGEPGIPGFPGNRGLMGQKGEIGPPGQQGKKGAPGMPGLMGSNGSPGQPGTPGSKGSKGEPGIQGMPGASGLKGEPGATGSPGEPGYMGLPGIQGKKGDKGNQGEKGIQGQKGENGRQGIPGQQGIQGHHGAKGERGEKGEPGVR

SEQ ID NO：38-编码来自人的截短的21型α1胶原多肽的密码子优化的核苷酸序列

TGCAGGTTTTCCGGGTCTGCCTGGTCCGGCAGGCGAACCGGGTCGTCATGGTAAAGATGGTCTGATGGGTAGTCCGGGTTTTAAAGGTGAAGCAGGTTCACCGGGTGCACCTGGTCAGGATGGCACCCGTGGTGAACCGGGTATTCCGGGATTTCCGGGTAATCGTGGCCTGATGGGTCAGAAAGGTGAAATTGGTCCGCCTGGTCAGCAGGGTAAAAAAGGCGCACCGGGTATGCCAGGACTGATGGGTTCAAATGGCAGTCCGGGTCAGCCAGGCACACCGGGTTCAAAAGGTAGCAAAGGCGAACCTGGTATTCAGGGTATGCCTGGTGCAAGCGGTCTGAAAGGCGAGCCAGGTGCCACCGGTTCTCCGGGTGAACCAGGTTATATGGGTCTGCCAGGTATCCAAGGCAAAAAAGGTGATAAAGGTAATCAGGGCGAAAAAGGCATTCAGGGCCAGAAAGGCGAAAATGGCCGTCAGGGTATTCCAGGCCAGCAGGGCATCCAGGGTCATCATGGTGCAAAAGGTGAACGTGGTGAAAAGGGCGAACCAGGTGTTCGTTAA

在一些实施方案中，非天然存在的多肽包含SEQ ID NO：2、4、6、8、35和37中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的多肽包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、35和37中任一项的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％等的同一性的氨基酸序列。可选地和/或另外，非天然存在的多肽由SEQ ID NO：1、3、5、7、25-30、36和38中任一项的核酸序列编码。在一些实施方案中，非天然存在的多肽由与SEQID NO：1、3、5、7、25-30、36和38中任一项的核酸序列具有至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％等的序列同一性的核酸编码。

在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽可以含有或可以不含有来自天然胶原的一个或多个结构域。图1和图2描绘了本公开内容的示例性非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)与相应的天然存在的胶原的比对。图1描绘了SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6的非天然存在的多肽与原鸡21型α1胶原的比对。图2描绘了SEQ ID NO：8的非天然存在的多肽与史氏鲟2型α1胶原的比对。图1和图2证明非天然存在的多肽可以具有在天然胶原中发现的一个或多个结构域(例如，胶原三螺旋重复结构域)。图1和图2进一步证明非天然存在的多肽可以缺乏天然胶原中发现的一个或多个结构域(例如，Von Willebrand因子A型(vWA)结构域、层粘连蛋白G结构域、纤维胶原C末端结构域)。在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽可以含有一个或多个胶原三螺旋重复结构域。在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽可以缺乏Von Willebrand因子A型(vWA)结构域、层粘连蛋白G结构域和纤维胶原C末端结构域中的一者或多者。

在一些实施方案中，非天然存在的多肽(例如，重组多肽)包括分泌信号序列。可以诱导非天然存在的多肽(例如，重组多肽)分泌到周质和/或细胞外空间(例如，当在重组宿主细胞中产生时)的任何合适的分泌信号序列(例如，疏水信号肽、Sec信号肽、Tat信号肽等)。示例性的分泌信号序列包括具有SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22和24中任一项的氨基酸序列的肽。替代地和/或另外地，分泌信号序列包括由SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21和23中任一项的核酸序列编码的肽。分泌信号序列优选位于非天然存在的多肽的N末端(例如，重组多肽)。然而，预期分泌信号序列可以位于N末端以外的位置，在该处分泌信号序列保持功能。

如本文所述的非天然存在的多肽(例如，重组多肽)可以经由编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的核酸序列来表达或产生。因此，本公开内容的另一个方面包括表达载体，其包含编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体是细菌表达载体。在一些实施方案中，表达载体是酵母表达载体。在一些实施方案中，表达载体是昆虫表达载体。可以诱导从编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的插入核酸表达蛋白质的任何合适的表达载体。示例性细菌表达载体可以包括pGEX载体，其中谷胱甘肽S-转移酶被用作融合配偶体并且基因表达在tac启动子的控制下，或使用T7启动子的pET载体(例如，pET28载体等)。示例性酵母表达载体可以包括pPIC载体，其使用可用甲醇诱导的AOX1启动子。在一些实施方案中，表达载体是独立存在于宿主细胞(例如，表达重组多肽的细胞)中的质粒形式(例如，包括细菌人工染色体形式等)。在一些实施方案中，表达载体经由随机或靶向整合稳定整合至宿主细胞的染色体中。

在一些实施方案中，编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的核酸序列经密码子优化以在非动物细胞，优选在细菌细胞中表达。如本文所用，“密码子优化的”意指密码子组成被改进以用于在异源细胞(例如，微生物细胞、细菌细胞等)中的表达，而不改变所编码的氨基酸序列。密码子优化的核酸序列(例如，编码本文所述的非天然存在的多肽)的非限制性示例包括SEQ ID NO：25-30、36和38。

在一些实施方案中，表达载体可以包括一个或多个选择剂。选择剂包括某些糖(包括含半乳糖的糖)或抗生素(包括氨苄青霉素、潮霉素、G418等)。用于赋予对选择剂的抗性的酶包括β-半乳糖苷酶或β-内酰胺酶。替代地和/或另外地，表达载体包括诱导型启动子或组成型启动子(例如，CMV启动子等)，使得编码重组蛋白的核酸可操作地连接至诱导型启动子或组成型启动子。例如，表达载体可以包括四环素诱导型启动子pTET、araC-ParaBAD诱导型启动子或IPTG诱导型lac启动子。如本文所用，“可操作地连接”启动子和核酸意指核酸的表达(例如，转录、翻译等)至少部分地处于启动子的控制之下。

在一些实施方案中，编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的核酸(例如SEQ IDNO：1、3、5、7、25-30、36和38中任一项的核酸)和表达载体可具有20至50bp长、20至40bp长、20至30bp长或30至40bp长的重叠。这种重叠可以使用DNA聚合酶(例如GXL聚合酶(takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polymerase))使用PCR来添加。打开的表达载体和编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的插入核酸可以使用任何合适的克隆系统(例如，IN-克隆(takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning)或SGI Gibson组件(us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc))一起组装成最终质粒。

此类制备的表达载体(或质粒)可用于产生基因工程化或修饰的生物体或重组细胞以产生本文所述的非天然存在的多肽(例如胶原、截短的胶原或胶原片段)。优选地，重组细胞含有至少一个拷贝的质粒或编码非天然存在的多肽(例如胶原、截短的胶原或胶原片段，优选原鸡胶原和/或史氏鲟胶原的或衍生自其的胶原、截短的胶原或胶原片段)的稳定整合的异源核酸序列。在一些实施方案中，重组细胞是微生物细胞。例如，当表达载体是细菌表达载体时，可以将表达载体插入(例如，经由任何合适的转化方法)用于蛋白质表达的细菌细胞(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)，包括BL-21细胞等)中，以独立地存在于细菌的细胞质中(例如，作为质粒形式)或至少暂时和/或稳定地整合到细菌染色体中。

因此，转化的细胞可以在合适的培养基中培养。优选地，合适的培养基包括基本培养基并且以1.5等份将细胞与植物甘油一起冷冻，细胞与甘油的比例为50:50。对于蛋白质表达，可以将一小瓶冷冻培养细胞在适量的细菌培养基(例如，基本培养基、50mL、100mL等)中通过连续摇动培养物(例如，至少100rpm、至少200rpm、至少250rpm等)在至少36℃，优选约37℃下培养至少6小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少过夜。表2和表3显示了可用于细胞培养的基本培养基的示例性制剂。

表2.基本培养基制剂

表3.痕量金属制剂

七水合硫酸亚铁	27.8g/L(Spectrum，7782-63-0)
		七水合硫酸锌	2.88g/L(Spectrum，7446-20-0)
二水合氯化钙	2.94g/L(Spectrum，2971347)
		二水合钼酸钠	0.48g/L(Spectrum，10102-40-6)
四水合氯化锰	1.26g/L(Spectrum，13446-34-9)
		亚硒酸钠	0.35g/L(Spectrum，10102-18-8)
硼酸	0.12g/L(Spectrum，10043-35-3)

在一些实施方案中，然后可以将转化的细胞转移至较大体积的生长培养基(例如，基本培养基)中并生长至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、5至10小时、5至9小时、6至9小时，并且/或者替代地直到培养基中的细胞密度达到600的光密度(OD)。

另外地，发酵过程可以在范围为22℃至33℃、29℃至33℃、30℃至32℃、23℃至29℃或25℃至28℃的各种温度下进行。在一些实施方案中，发酵温度可以维持在恒定温度，并且在发酵完成后可以立即纯化非天然存在的多肽。替代地，可以将发酵温度维持所需的一段时间，并且当达到10-20的OD600的细胞密度时，可以降低温度以诱导蛋白质产生。在这样的实施方案中，通常，将温度从28℃降低至25℃。在发酵期间，可以通过添加诱导试剂来诱导细菌中的蛋白质表达。例如，当表达载体含有lac启动子并且编码非天然存在的多肽(例如，截短的胶原、胶原片段或胶原)的核酸处于lac启动子的控制下时，核酸的表达可以通过添加浓度范围为0.1–1.5mM、0.1–1.0mM或0.1–0.5mM的异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导。发酵可以持续20-24小时，或在一些实施方案中，持续40-60小时。

预期这样产生的重组细胞(例如，用表达载体转化的重组细菌)在细胞内表达由表达载体中的核酸编码的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原、胶原片段或胶原)。然后，此类细胞内表达的多肽(例如，截短的胶原、胶原片段或胶原)可以被分泌(经由分泌信号序列)至细胞外空间(例如，进入培养基)。因此，在一些实施方案中，培养基可含有由核酸编码的分泌的重组蛋白(例如，截短的胶原、胶原片段或胶原)。

因此，本公开内容的另一个方面包括组合物，该组合物包含由核酸编码的非天然存在的多肽(例如重组胶原、截短的胶原、胶原片段或胶原)。在一些实施方案中，组合物可以包括包含编码非天然存在的多肽(例如，胶原、截短的胶原或其片段)的整合的异源核酸序列的重组细胞和/或用于重组细胞的培养基(例如，生长培养基、营养培养基等)。

替代地和/或另外地，组合物可包含来自重组细胞和/或培养基的纯化重组多肽。在一些实施方案中，从重组细胞生长并向其分泌重组多肽的培养基中纯化重组多肽。在一些实施方案中，重组多肽与标签(例如，组氨酸标签等)偶联，使得可以使用称为固定化金属亲和层析(IMAC)的亲和纯化来纯化重组多肽。替代地，可以经由柱层析纯化重组多肽。例如，可以通过均质生长培养基的酸处理来纯化重组多肽。在这样的示例中，可以使用5-50％硫酸将生长培养基(例如，发酵液)的pH降低至3至3.5。然后使用离心分离重组细胞。可以在聚丙烯酰胺凝胶上测试酸化发酵液的上清液并确定其是否含有与起始沉淀相比相对高丰度的重组多肽。获得的重组多肽浆液通常是高盐的。为了实现体积和盐的减少，可以使用过滤步骤进行浓缩和渗滤步骤。例如，过滤步骤可以使用具有每个0.1m²的超滤盒的EMDMillipore切向流过滤系统来进行。在该示例中，使用两个并联的盒的总过滤面积可以是0.2m²。在TFF阶段可实现体积减少至1/5和盐减少至1/19。最终的浆液可以在SDS-PAGE凝胶上运行以确认重组多肽的存在。然后可以在SDS-PAGE凝胶上分析纯化的重组多肽，以鉴定在每个相应多肽的预期大小下观察到的相应的粗且清晰的条带。可以使用反相和尺寸排阻HPLC色谱法进一步进行滴度和纯度的量化。优选纯化的重组多肽的纯度为至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。

本文提供了药物组合物。在一些情况下，药物组合物可以包含本公开内容的多肽。在一些情况下，该多肽包含与SEQ ID NO:32具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％)序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些情况下，该多肽包含与SEQ ID NO:32的截短物(例如，如本文所述，包含N末端截短、C末端截短、内部截短或其任何组合)具有至少约80％(至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％)序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

在某些实施方案中，药物组合物可以包含一个或多个药学上可接受的赋形剂或载体。在一些情况下，药学上可接受的赋形剂或载体选自：抗黏剂、黏合剂、涂层剂、着色剂、崩解剂、调味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、媒介物及其任何组合。

患者和动物的伤口护理是医疗保健和兽医行业面临的常见临床挑战。伤口可以包括例如创伤伤口、烧伤、溃疡、病变、脓肿、糖尿病伤口、压疮或溃疡以及由外科手术和手术造成的移植物或伤口。伤口可以由身体伤害、外科手术和手术、高温或化学灼伤、皮肤压力、辐射、感染、免疫系统缺陷、营养不良以及各种医疗状况(例如血管疾病和糖尿病)引起。伤口还包括更浅表的伤口，例如割伤、撕裂伤、刺伤、轻擦、抓伤、擦伤、摩擦伤(例如皮疹、摩擦水泡等)、疖、疹、疤痕、痤疮、牛皮癣、湿疹、口腔伤口、皮肤或角膜损伤。

已知胶原可以改善伤口愈合并刺激组织生长，并且在伤口部位具有良好的耐受性。尤其是，胶原被认为有助于成纤维细胞和角质形成细胞迁移至伤口部位，从而改善伤口床中的组织生长。

在一些实施方案中，包含非天然存在的多肽(例如，重组多肽和/或纯化的重组多肽)的药物组合物可以配制用于表面施用。表面施用可以用于治疗目的(例如，用于治疗皮肤病况，如本文所述)。表面制剂可以是任何类型的表面制剂，包括但不限于粉末、霜剂、凝胶、凝胶霜、液体、洗剂、油、精华液、糊剂、软膏、药棒、香膏、溶液、混悬剂、泡沫等。在进一步的实施方案中，表面制剂可以包含呈个人护理产品形式的非天然存在的多肽，诸如面膜、皮肤清洁剂、清洁霜、清洁洗剂、面部洗剂、身体洗剂、沐浴露、止汗剂、除臭剂、剃须膏、脱毛剂、面油、唇油、身体油、面部清洁剂、清洁乳、清洁贴、面部清洗剂、面部霜剂、身体霜剂、面部保湿剂、身体保湿剂、面部精华液、面部面膜、身体面膜、面部爽肤水、面部喷雾、粉底、遮瑕膏或有色多功能霜。在此类实施方案中，组合物进一步可包含载体分子(例如，媒介物)、防腐剂和/或附加成分中的至少一种。考虑任何合适的载体分子，并且示例性载体分子可包括水、油、醇、丙二醇或乳化剂。另外，考虑任何合适的防腐剂，并且示例性防腐剂包括氧化锌、对羟基苯甲酸酯、甲醛释放剂、异噻唑啉酮、苯氧乙醇或有机酸诸如苯甲酸、苯甲酸钠或丁二醇、己二醇或山梨酸钾。

在一些实施方案中，包含非天然存在的多肽(例如，重组多肽和/或纯化的重组多肽)的药物组合物可以配制为可注射制剂(例如，用于通过注射施用)。可注射制剂可以用于治疗目的(例如，用于治疗皮肤病况，如本文所述)。本文提供的药物组合物可以配制用于肠胃外注射，包括适合推注(bolus injection)或连续输注的制剂。任选地，将防腐剂添加到注射制剂中。在其他实施方案中，药物组合物被配制为适合于肠胃外注射的形式，作为在油性或水性媒介物中的无菌悬浮液、溶液或乳状液。肠胃外注射制剂任选地含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。在具体的实施方案中，用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的本文公开的多肽的水溶液。在另外的实施方案中，将多肽的混悬液制备为合适的油性注射混悬液。仅举例来说，用于本文所述药物组合物的合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油诸如芝麻油，或合成脂肪酸酯诸如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。在某些实施方案中，水性注射混悬剂含有增加混悬剂黏度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，混悬剂含有合适的稳定剂或增加多肽溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。替代地，在其他实施方案中，多肽为粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水构成。

在某些实施方案中，本文提供治疗对象的伤口的方法。该方法可以包括向对象施用治疗有效量的本公开内容的多肽(例如，在药物组合物中)以治疗伤口。在一些情况下，伤口表现出不良的伤口愈合。在一些情况下，该方法包括向伤口或邻近伤口的皮肤施用多肽(例如，在药物组合物中、在表面制剂中)。

在一些实施方案中，除了促进胶原表达之外，还可以在结缔组织中和周围施用组合物以增加体积、增加支持或以其他方式治疗结缔组织病况。本文描述的组合物可以以多个水平施用在真皮下。一般来说，结缔组织纤维和基质是由称为成纤维细胞的特化细胞合成的。结缔组织主要有三类：疏松结缔组织、致密结缔组织和特化结缔组织。如本文所使用的，术语“结缔组织”可以指连接、支持或包围身体的其他结构和器官的那些组织。例如，本文所述的结缔组织可包括但不限于皮肤、真皮组织、真皮下组织、皮肤组织、皮下组织、硬膜内组织、肌肉、肌腱、韧带、软骨、骨骼、纤维组织、脂肪组织、血管和动脉、神经和滑膜(皮内)组织。

结缔组织病况是指涉及身体一个或多个部位的结缔组织异常的任何病况。某些病症的特征是免疫系统过度活跃，导致组织炎症和系统性损伤，通常用结缔组织替代正常组织(例如，某个器官的正常组织)。其他病症涉及结缔组织本身的生化异常或结构缺陷。这些病症中的一些是遗传性的，并且一些病因不明。当结缔组织疾病是自身免疫性起源时，它们被分类为“风湿性病症”、“自身免疫性风湿性病症”或“自身免疫性胶原血管病症”。

在一些实施方案中，本文提供的组合物可用于治疗结缔组织病况，诸如纤维化或硬化。如本文所用的术语“纤维化”是指身体某一器官或部位的结缔组织或纤维组织(瘢痕组织、胶原)的积累。如果纤维化由单个细胞系引起，则称为“纤维瘤”。当身体试图修复并替换受损细胞时，就会发生纤维化，因此纤维化可以是反应性、良性或病理状态。生理性纤维化与瘢痕形成的过程类似。当相关组织反复持续受损时，就会出现病理状态。单次损伤，即使很严重，通常也不会导致纤维化。如果损伤重复或持续(例如发生在慢性肝炎中)，身体会尝试修复损伤，但这些尝试会导致瘢痕组织过度积累。瘢痕组织开始取代器官的常规组织，常规组织执行瘢痕组织无法执行的某些功能；它还会干扰血流并限制其他细胞的血液供应。结果，这些其他功能细胞开始死亡，并形成更多的瘢痕组织。术语“硬化”是指通常是柔韧的组织或结构或器官的硬化或僵硬化，通常通过用结缔组织替换正常器官特异性组织来实现。

在某些实施方案中，本文提供治疗对象的皮肤增殖性病症的方法。该方法可以包括向对象施用治疗有效量的本公开内容的多肽(例如，在药物组合物中)以治疗增殖性皮肤病症。在一些情况下，增殖性皮肤病症的特征在于皮肤细胞(例如，角质形成细胞、成纤维细胞)的异常(例如，减少的、降低的)增殖、迁移和/或黏附。在一些情况下，增殖性皮肤病症选自：表皮变薄、表皮萎缩、真皮萎缩、表皮变性、棘层松解、落叶性天疱疮、寻常型天疱疮、棘层松解性角化不良、Darier病、Hailey-Hailey病、Grover病、硬化性苔藓、胶原透明化或其组合。

在一些实施方案中，本文提供的组合物可用于治疗病况，包括但不限于关节炎、皮肤病变、寻常痤疮、囊肿性痤疮、牛皮癣、鱼鳞病(例如，高起鱼鳞病、表皮松解性角化过度和层状鱼鳞病)、滤泡病症(例如，假毛囊炎、老年粉刺、黑头粉刺痣(nevus comidonicas)和小棘毛壅病(trichostatis spinulosa))、良性上皮肿瘤(例如，扁平疣、毛发上皮瘤和传染性软疣)、穿通性皮肤病(perforated dematoses)(例如，匐行性穿通性弹性组织变性(elastosis perforans seripiginosa)和Kyrles病)和角化病症(例如，Dariers病、角化病、跖角化过度、毛发红糠疹、扁平苔藓黑棘皮病和牛皮癣)。

在各个方面，在施用组合物(例如，药物组合物)或制剂(例如，施用于对象的皮肤)后，角质形成细胞生长(例如，增殖)增加。在一些情况下，在将组合物(例如，药物组合物)或制剂施用于对象后，角质形成细胞生长(例如，增殖)增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或更多(例如，与施用组合物或制剂之前相比)。

在各个方面，在施用组合物(例如，药物组合物)或制剂(例如，施用于对象的皮肤)后，角质形成细胞再生增加。在一些情况下，在将组合物(例如，药物组合物)或制剂施用于对象后，角质形成细胞再生增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或更多(例如，与施用组合物或制剂之前相比)。

在各个方面，在施用组合物(例如，药物组合物)或制剂(例如，施用于对象的皮肤)后，成纤维细胞产生的胶原增加。在一些情况下，在将组合物(例如，药物组合物)或制剂施用于对象后，成纤维细胞产生的胶原增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或更多(例如，与施用组合物或制剂之前相比)。

在各个方面，在施用组合物(例如，药物组合物)或制剂(例如，施用于对象的皮肤)后，成纤维细胞迁移增加。在一些情况下，在将组合物(例如，药物组合物)或制剂施用于对象后，成纤维细胞迁移增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或更多(例如，与施用组合物或制剂之前相比)。

在各个方面，在施用组合物(例如，药物组合物)或制剂(例如，施用于对象的皮肤)后，成纤维细胞增殖增加。在一些情况下，在将组合物(例如，药物组合物)或制剂施用于对象后，成纤维细胞增殖增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或更多(例如，与施用组合物或制剂之前相比)。

在各个方面，在施用组合物(例如，药物组合物)或制剂(例如，施用于对象的皮肤)后，成纤维细胞黏附增加。在一些情况下，在将组合物(例如，药物组合物)或制剂施用于对象后，成纤维细胞黏附增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或更多(例如，与施用组合物或制剂之前相比)。

在各个方面，在施用组合物(例如，药物组合物)或制剂(例如，施用于对象的皮肤)后，角质形成细胞活力增加。在一些情况下，在将组合物(例如，药物组合物)或制剂施用于对象后，角质形成细胞活力增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或更多(例如，与施用组合物或制剂之前相比)。

在各个方面，在施用组合物(例如，药物组合物)或制剂(例如，施用于对象的皮肤)后，一个或多个基因(例如，涉及细胞增殖、细胞迁移、细胞黏附等的一个或多个基因)的表达(由皮肤中存在的细胞，例如，角质形成细胞、成纤维细胞)增加。在一些情况下，在将组合物(例如，药物组合物)或制剂施用于对象后，一个或多个基因(例如，涉及细胞增殖、细胞迁移、细胞黏附等的一个或多个基因)的表达(由皮肤中存在的细胞，例如角质形成细胞、成纤维细胞)增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或更多(例如，与施用组合物或制剂之前相比)。

在一些实施方案中，一个或多个基因涉及信号传导通路(例如，涉及细胞增殖、细胞迁移、细胞黏附)。在一些情况下，一个或多个基因涉及VEGFA/VEGFR2信号传导通路。在一些情况下，涉及VEGFA/VEGFR2信号传导通路的一个或多个基因选自：MYOC1、FLII、ROCK1、ROCK2、CLTC、LIMK1、EGR1及其任何组合。

在一些情况下，一个或多个基因涉及黏着斑信号传导通路。在一些情况下，涉及黏着斑信号传导通路的一个或多个基因选自：ITGA3、TNC、LAMC1、FLNA、TLN1、ZYX、DIAPH1及其任何组合。

在一些情况下，一个或多个基因涉及内皮素信号传导通路。在一些情况下，涉及内皮素信号传导通路的一个或多个基因选自：TRIOBP、WNK1、MMP2、VCAN、ACTA2、GNA12、EGR1及其任何组合。

在一些情况下，一个或多个基因涉及EGF/EGFR信号传导通路。在一些情况下，涉及EGF/EGFR信号传导通路的一个或多个基因选自：ATXN2、JAK1、RPS6KA2、ROCK1、SHC1、IQGAP1、PLCG1及其任何组合。

在一些情况下，一个或多个基因涉及转化生长因子-β(TGF-β)信号传导通路。在一些情况下，涉及TGF-β信号传导通路的一个或多个基因选自：SMURF1、SPTBN1、PAK2、ROCK1、SHC1、TGFBR3、TGFBR1及其任何组合。

本文的某些实施方案中提供了包含本文提供的一个或多个非天然存在的多肽(例如，用于治疗用途)的组合物(例如，药物组合物)和制剂(例如，表面制剂)。在一些实施方案中，组合物和制剂提供治疗有效量的本文提供的多肽(例如，当施用于个体或细胞时适合提供治疗益处的量)。在一些具体的实施方案中，组合物(例如，药物组合物)和制剂(例如，表面制剂)包含当施用至个体的皮肤时适合为个体的皮肤提供治疗有益效果的量。在具体实施方案中，组合物(例如，药物组合物)和/或制剂(例如，表面制剂)包含约0.001％至约30％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)。在更具体的实施方案中，组合物(例如，药物组合物)和/或制剂(例如，表面制剂)包含约0.001％至约20％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约10％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约5％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约4％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约3％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约2％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约1％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约0.5％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)和约0.001％至约0.2％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)。

在各种实施方案中，本文提供的非天然存在的多肽(例如，重组蛋白)的浓度或量以任何合适的量存在于本文提供的组合物(例如，药物组合物)和/或制剂(例如，表面制剂)中，并且例如，可以根据用途或制剂(例如凝胶、胶囊、液体、粉末等)而变化。组合物(例如，药物组合物)和/或制剂(例如，表面制剂)中非天然存在的多肽(例如，重组蛋白)的示例性浓度可以是至少约0.01％、至少约0.05％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.5％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％(w/v或w/w)。替代地和/或另外地，组合物(例如，药物组合物)和/或制剂(例如，表面制剂)中非天然存在的多肽(例如，重组蛋白)的示例性浓度可以是约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.2％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％(w/v或w/w)。替代地和/或另外地，组合物(例如，药物组合物)和/或制剂(例如，表面制剂)中非天然存在的多肽(例如，重组蛋白)的示例性浓度可以在约0.01％至约99％、约0.05％至约99％、约0.1％至约99％、约0.1％至约99％、约0.5％至约99％、约0.1％至约10％、约1％至约99％、约5％至约99％、约10％至约99％、约15％至约99％、约20％至约99％、约25％至约99％、约30％至约99％、约35％至约99％、约40％至约99％、约45％至约99％、约50％至约99％、约55％至约99％、约60％至约99％、约65％至约99％、约70％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约0.1％至约90％、约1％至约90％、约5％至约90％、约10％至约90％、约15％至约90％、约20％至约90％、约25％至约90％、约30％至约90％、约35％至约90％、约40％至约90％、约45％至约90％、约50％至约90％、约55％至约90％、约60％至约90％、约65％至约90％、约70％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约85％至约90％、约20％至约80％、约25％至约80％、约30％至约80％、约35％至约80％、约40％至约80％、约45％至约80％、约50％至约80％、约55％至约80％、约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至约80％、约75％至约80％、约70％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％等(w/w或w/v)的范围内。替代地和/或另外地，组合物(例如，药物组合物)和/或制剂(例如，表面制剂)中非天然存在的多肽(例如，重组蛋白)的示例性浓度可以小于约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％等(w/w或w/v)。

在一些实施方案中，施用时间表根据对象的目的、性别、年龄或健康状况而变化。例如，在一些实施方案中，组合物(例如，药物组合物)和/或制剂(例如，表面制剂)中的每天一次、每天两次、每天三次、每天最多6次、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天等施用(例如，经表面)。替代地和/或另外地，在一些实施方案中，组合物(例如，药物组合物)和/或制剂(例如，表面制剂)中的以不规则的间隔或增加的间隔或减少的间隔多次施用(例如，经表面)。在某些实施方案中，组合物(例如，药物组合物)和/或制剂(例如，表面制剂)中的以足以或有效提供治疗益处(例如，本文所描述的)的剂量和/或时间表施用(例如，经表面)。

实施例

实施例1.本公开内容的非天然存在的多肽的生成。

该实施例示出了通过基因工程化微生物生成本公开内容的重组多肽以及此类生成的多肽的纯化过程。

合成SEQ ID NO：1、3、5和7的多核苷酸，并将这些多核苷酸中的至少一种插入pET载体中。设计pET载体与SEQ ID NO：1、3、5和7之间的重叠为20至30bp长，并使用用酶GXL聚合酶(takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polymerase)的PCR进行添加。使用IN-Cloning(takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning)将打开的pET载体和插入DNA(例如，SEQ ID NO：1的多核苷酸)一起组装成最终质粒。在所有情况下，核酸序列以公开为SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21或23的分泌信号序列为先导。通过Sanger测序验证质粒序列。

用最终质粒转化细胞，并随后在基本培养基中培养，并与植物甘油以50:50的细胞与甘油比例冷冻成1.5等份。将一小瓶该冷冻培养物在50ml基本培养基中于37℃、200rpm下复苏过夜。本实施例中基本培养基的制剂如表2和表3所示。然后将细胞转移至300ml基本培养基中并生长6-9小时以达到5-10的光密度(OD)600。

在范围为25℃至28℃的不同温度下进行发酵。对于一些发酵，将发酵的温度维持在恒定温度，并且在发酵完成后立即纯化多肽。对于其他发酵，将发酵温度维持所需的一段时间，并且当达到10-20的OD600的细胞密度时，降低温度以诱导蛋白质的产生。通常，将温度从28℃降低至25℃。通过向培养基中添加浓度范围为0.1-0.5mM的IPTG来进行诱导。发酵持续40-60小时。

如下对重组多肽进行纯化：使用5-50％硫酸将发酵液的pH降低至3-3.5。然后使用离心或离心后微滤将细胞分离。在聚丙烯酰胺凝胶上测试酸化发酵液的上清液，并发现与起始沉淀相比含有相对高丰度的重组多肽。为了实现体积和盐的减少，超滤进行浓缩和渗滤步骤。在SDS-PAGE凝胶上运行最终的多肽浆液以确认重组多肽的存在。

为了验证产生了所需蛋白质，收集来自携带SEQ ID NO：1、3、5或7的微生物的培养物的上清液，并通过如上所述降低它们的pH来纯化。通过SDS-PAGE分析酸化发酵液，并以相对纯度检测与预期大小的蛋白质相对应的条带。如图3所示，在每种相应蛋白质的预期大小处观察到粗且清晰的条带。随后通过反相和尺寸排阻HPLC色谱法和质谱法对样品进行分析以用于定量重组多肽滴度和纯度，这确认了各个感兴趣蛋白质的正确身份。

图4A-图4C描绘了在pH 3.0处理之前和之后本公开内容的非天然存在的多肽的SDS-PAGE凝胶。图4A描绘了在pH 3.0处理之前(泳道1)和之后(泳道2)的发酵上清液的SDS-PAGE凝胶，该发酵上清液含有具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的非天然存在的多肽。这种多肽的预期分子量约为17.9kDa。通过质谱法证实了多肽的身份(数据未显示)。图4B描绘了在pH 3.0处理之前(泳道3)和之后(泳道4)的发酵上清液的SDS-PAGE凝胶，该发酵上清液包含具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽。这种多肽的预期分子量约为17.6kDa。通过质谱法证实了多肽的身份(数据未显示)。图4C描绘了在pH 3.0处理之前(泳道3-5)和之后(泳道6-8)的发酵上清液的SDS-PAGE凝胶，该发酵上清液包含在各种细菌宿主菌株中产生的具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽。

实施例2.产物的多肽序列确认和羟脯氨酸残基的缺失

使用质谱法来确认通过根据本公开内容的方法产生的SEQ ID NO：2的多肽序列。表4和表5提供了该多肽的肽图谱结果。

表4.SEQ ID NO：2的多肽的肽图谱。

表5.SEQ ID NO：2的多肽的肽图谱。

还进行分析以评估所产生的SEQ ID NO：2的多肽中存在的任何氨基酸或肽修饰(表6)。在少数情况下，进行了额外的验证性分析，以区分甲硫氨酸氧化与羟脯氨酸残基的存在。例如，基于MS/MS扫描的片段结果，显示胰蛋白酶肽T1(序列DTGFPGMPGR)包含甲硫氨酸氧化而不是脯氨酸羟基化。基于这些结果，最终确定胰蛋白酶肽1(T1)在第7位的甲硫氨酸具有氧化，并且在第5或第8位没有羟脯氨酸的证据。类似地，在胰蛋白酶肽9(T9)的第83位有另一个甲硫氨酸的情况下，多肽的第77、85、92、95和97位没有可检测水平的甲硫氨酸氧化、羟脯氨酸或第98位没有可检测水平的羟赖氨酸。因此，本公开内容的截短的胶原多肽与天然存在的胶原多肽的不同之处还在于它们缺乏羟脯氨酸残基。

表6.SEQ ID NO：2的多肽的氨基酸和肽修饰的分析。

实施例3.具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽对人成纤维细胞和 角质形成细胞无毒

用具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽(在图5A-图5C中表示为“Cav”)在体外处理的人原代成纤维细胞、HaCaT细胞和人原代角质形成细胞没有显示出毒性迹象，如图5A-图5C所示，表明该产品在测试剂量下作为表面成分是安全的。

方案：

将细胞在汇合时接种到96孔板中。24小时后，将培养基更换为低血清培养基(以避免由于血清造成的任何影响)。将细胞用具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽在相同的低血清培养基中处理24小时。用多肽处理后，保存上清液，并将细胞与MTT染料于37℃下温育60分钟。MTT被活细胞代谢为甲臜(formazan)盐。使用异丙醇溶解这些盐，并使用细胞板读数器对产生的颜色进行定量。

包含本公开内容的非天然存在的多肽的制剂的毒理学分析。

在体外进行多种毒理学测定以筛查含有具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然多肽的制剂的任何潜在负面影响。

1)细菌回复突变测定

评估了多肽在四种不同的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株和大肠杆菌菌株中诱导诱变反应的能力。在不同剂量水平下筛选样品，该筛选为通过将不同剂量水平的样品以及具有和不具有Arocolor^TM 1254诱导的大鼠肝微粒体(S9)的测试菌株接种进行筛选。如果样品导致回复体菌落增加高于自发背景水平，则认为样品具有诱变性。该测定是本领域已知的并且按照OECD 4714化学品测试指南：细菌回复突变测定(OECD4714Guideline for Testing of Chemicals:Bacterial Reverse Mutation Assay)进行。

在无菌去离子水中以5mg/板、1mg/板、0.5mg/板、0.1mg/板和0.05mg/板的5个浓度制备具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽的粉末。使用适当的溶剂对照进行测试，并将阳性对照在存在和不存在Aroclor诱导的大鼠肝S9的情况下接种于选择性基础琼脂培养基中并过夜培养。所有样品均接种三份。

结果表明，测试菌株对阳性对照诱变剂敏感，并表现出适当的诱变反应。自发回复率表明菌株对潜在基因毒性剂检测敏感。未发现该制剂对测试系统具有细胞毒性。使用S9活化混合物进行的代谢活化显示出活化的微粒体制剂。无论是否存在S9酶激活，该制剂在任何浓度下均未显示出可检测到的基因毒性活性。

2)EpiDerm^TM皮肤模型体外毒性测试系统

利用本领域已知的MatTek公司的EpiDerm^TM体外毒性测试系统评估鲟鱼胶原的刺激潜力。简而言之，用物质对已培养形成多层、高度分化的人表皮模型的正常人源表皮角质形成细胞(NHEK)进行测试，并通过颜色反应监测，评估对线粒体酶琥珀酸脱氢酶的损害。该酶将水溶性黄色MTT转化为紫色不溶性产物，并且转化的MTT的量与活细胞数量成比例。将Triton X-100(1％)用作阳性对照。结果描绘于表7中(GEL-CAV-A表示用具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽处理)。

表7.体外毒性测试结果

确定多肽的生存力为50％的时间(ET-50)大于24小时，并且阳性对照为9.4小时。根据制造商，标准范围如表8所示。

表8.EpiDerm^TM皮肤模型体外毒性测试系统的标准范围

因此，该多肽具有在非刺激性范围内的预期体内皮肤刺激潜力。

3)EpiOcular^TM组织模型体外毒性测试系统

利用本领域已知的MatTek公司的EpiOcular^TM体外毒性测试系统评估多肽的刺激潜力。简而言之，用物质对已培养形成类似于角膜中发现的分层鳞状上皮的正常人源表皮角质形成细胞进行测试，并通过颜色反应监测，评估对线粒体酶琥珀酸脱氢酶的损害。该酶将水溶性黄色MTT转化为紫色不溶性产物，并且转化的MTT的量与活细胞数量成比例。将Triton X-100(0.3％)用作阳性对照。结果描绘于表9中(GEL-CAV-A表示用具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽处理)。

表9.体外毒性测试结果

确定活力为50％的时间ET-50，并且然后用于估计兔子Draize眼睛评分：如本领域已知的Draize＝-4.74+101.7/(ET-50)^0.5。发现该多肽的ET-50大于256分钟，并且估计的Draize眼部刺激评分为0(阳性对照为19.6分钟/Draize 18.2)。根据制造商，标准范围如表10所示。

表10.EpiOcular^TM组织模型体外毒性测试系统的标准范围

因此，该多肽具有非刺激性的刺激分类。

4)重复性损伤性斑贴研究

使用本领域已知的封闭型重复性损伤斑贴研究评价多肽以确定其使具有正常皮肤的志愿者对象的皮肤敏感的能力。简而言之，重复性损伤性斑贴评估是一种改进的预测性斑贴研究，可以检测需要多次施用才能诱导足以引起过敏反应的细胞介导(IV型)免疫反应的弱敏化剂。使用此评估方法也可以检测刺激反应，尽管这不是本程序的主要目的。0.2％十二烷基硫酸钠水溶液作为阳性对照。

九十五(95)名对象完成了研究。在本研究所采用的条件下，没有证据表明对多肽制剂敏化。

实施例4.具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽促进角质形成细胞 生长和再生

健康的皮肤主要由I型和III型胶原、透明质酸、纤连蛋白和弹性蛋白以及包含其他蛋白质(如层粘连蛋白和IV型胶原)的基底层组成。成纤维细胞是产生这些结构蛋白(包括胶原)的主要细胞类型。这些蛋白质统称为细胞外基质(ECM)，它们支持皮肤的结构。成纤维细胞产生的胶原会随着年龄的增长而减少，因此成纤维细胞是尝试挽救皮肤衰老的化妆品活性的主要目标。

角质形成细胞是形成表皮或皮肤外层的主要细胞类型。HaCaT细胞是一种衍生自成人皮肤的永生角质形成细胞细胞系。两种细胞类型均用于证明具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽(在图中表示为“Cav”)对皮肤的益处。这些细胞的更新很高，并且受到日常污染和辐射的冲击。它们受到所处环境的负面影响，导致炎症加剧以及天然皮肤屏障受损。用于评估角质形成细胞健康的特征包括炎性标志物、细胞更新和DNA完整性。

用具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽处理的角质形成细胞显示出角质形成细胞生长和再生的剂量依赖性增加。在永生化HaCaT角质形成细胞中也看到了类似的结果。如图6(人原代角质形成细胞)所示，当与对照细胞相比，多肽(在图6中表示为“Cav”)表现出对角质形成细胞中细胞生长和再生的剂量依赖性刺激，在0.2％(w/w)和0.1％(w/w)处理下，细胞数量增加40％。

实施例5.具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽刺激胶原的产生和 涉及细胞增殖、迁移和黏附的基因的上调。

如图7所示，具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽(在图7中表示为“Cav”)刺激体外成纤维细胞产生I型胶原。

ELISA方案：将原代人成纤维细胞在标准培养基DMEM/F12+10％FBS中培养。上清液用于确定存在的I型胶原的水平。所用试剂盒为Takara I型前胶原C-肽检测ELISA试剂盒。按照制造商的方案测量上清液中I型胶原的数量。

在第二种分析方法中，报告多种人类胶原RNA水平的微阵列数据显示，用多肽处理的成纤维细胞中这些胶原的表达增加至2.5-3倍。表11描绘了微阵列数据。

微阵列RNA分析方案：将细胞在汇合时接种到6孔板中。24小时后，将培养基更换为低血清培养基。用0.05％(w/w)的多肽和对照处理细胞。使用QIAGEN RNeasy试剂盒提取RNA并将提取的RNA用于分析。

表11.微阵列数据

除了胶原的上调之外，发现多肽可以提高涉及负责增殖、迁移和黏附的若干途径的多个基因的RNA水平。

上调通路：

VEGFA-VEGFR2信号传导通路

上调基因数量：74

下调基因数量：12

显著性：7.74

表12.VEGFA-VEGFR2信号传导通路中的示例性上调基因

黏着斑通路

上调基因数量：53

下调基因数量：0

显著性：9.93

表13.黏着斑通路中的示例性上调基因

内皮素通路

上调基因数量：48

下调基因数量：4

显著性：3.57

表14.内皮素通路中的示例性上调基因

EGF/EGFR信号传导通路

上调基因数量：32

下调基因数量：4

显著性：4.83

表15.EGF/EGFR信号传导通路中的示例性上调基因

TGF-β信号传导通路

上调基因数量：33

下调基因数量：3

显著性：6.92

表16.TGF-β信号传导通路中的示例性上调基因

实施例6.具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽促进伤口愈合活性

伤口愈合是一个动态过程，包括一系列事件，包括细胞增殖和迁移。成纤维细胞迁移和增殖通过分泌各种化学物质，包括胶原和其他基质蛋白，在伤口闭合中起至关重要作用。

用具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽处理体外人真皮成纤维细胞，在体外伤口愈合模型中显示出伤口愈合活性，如图8所示，由于细胞增殖而闭合了通过刮擦成纤维细胞汇合层而诱导的间隙。另外，微阵列数据与多肽具有伤口愈合益处一致。数据还显示，涉及细胞增殖、迁移和黏附的若干通路的基因上调。

方案：将细胞在汇合时接种到24孔板中。24小时后，将培养基更换为低血清培养基并将细胞饥饿6-8小时。饥饿后，对含有细胞的孔进行刮擦和处理。图像是在此时(时间0小时)和24小时后拍摄的。使用Image J软件分析图像。

尽管本文已经示出和描述了本公开内容的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以例举的形式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将构思到许多变化、改变和替换。应理解，在实施本公开内容的实施方案时可以采用本文所述本公开内容的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本公开内容的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (69)

1.一种治疗对象的伤口的方法，所述方法包括：

向所述对象施用治疗有效量的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，

从而治疗所述伤口。

2.一种治疗皮肤增殖性病症的方法，所述方法包括：

向对象施用治疗有效量的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，

从而治疗所述皮肤增殖性病症，

其中所述皮肤增殖性病症的特征在于皮肤细胞(例如，成纤维细胞、角质形成细胞)的异常增殖、迁移和/或黏附。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述伤口表现出不良的伤口愈合。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用包括向所述伤口或邻近所述伤口的皮肤施用所述多肽。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述异常增殖、迁移和/或黏附为降低或减少的增殖、迁移和/或黏附。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述皮肤病况为表皮变薄、表皮萎缩、真皮萎缩、表皮变性、棘层松解、落叶性天疱疮、寻常型天疱疮、棘层松解性角化不良、Darier病、Hailey-Hailey病、Grover病、硬化性苔藓、胶原透明化或其组合。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中SEQ ID NO：32的所述截短物相对于SEQ ID NO：32包含N末端截短、C末端截短或两者。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述N末端截短是相对于SEQ ID NO：32的50个氨基酸至750个氨基酸的N末端截短。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述C末端截短是相对于SEQ ID NO：32的50个氨基酸至600个氨基酸的C末端截短。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由其组成。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽具有50个氨基酸至1250个氨基酸的总截短。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽的长度为至少50个氨基酸。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽的长度为50个氨基酸至250个氨基酸。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽不包含以下中的一者或多者：层粘连蛋白G结构域、Von Willebrand因子A型(vWA)结构域和纤维胶原C末端结构域。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽包含一个或多个胶原三螺旋重复。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽为单体的。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽不形成天然存在的胶原的稳定的三螺旋结构。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽基本上不含其他胶原链。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽相对于天然存在的胶原具有非天然存在的羟基化水平。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽中存在的少于10％的脯氨酸被羟基化。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽为非羟基化的。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽相对于天然存在的胶原具有非天然存在的糖基化水平。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽包含小于5wt.％的糖基化。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽作为药物组合物施用。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述药物组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述药学上可接受的赋形剂选自：抗黏剂、黏合剂、涂层剂、着色剂、崩解剂、调味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、媒介物及其任何组合。

32.根据权利要求29-31中任一项所述的方法，其中所述药物组合物被配制用于表面施用。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述药物组合物被配制为凝胶、霜剂、洗剂、油、泡沫、软膏、精华液及其任何组合。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述施用之后，所述皮肤中的角质形成细胞生长和/或再生增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述施用之后，所述皮肤中的胶原产生增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述施用之后，所述皮肤中的成纤维细胞迁移、增殖和/或黏附增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述施用之后，暴露于城市灰尘后的角质形成细胞活力增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述施用之后，涉及选自以下信号传导通路的一个或多个基因的表达(例如，由角质形成细胞、成纤维细胞)增加：VEGFA/VEGFR2信号传导通路、黏着斑信号传导通路、内皮素信号传导通路、EGF/EGFR信号传导通路、TGF-β信号传导通路及其任何组合。

39.根据权利要求38所述的方法，其中涉及VEGFA/VEGFR2信号传导通路的所述一个或多个基因选自：MYOC1、FLII、ROCK1、ROCK2、CLTC、LIMK1、EGR1及其任何组合。

40.根据权利要求38或39所述的方法，其中涉及黏着斑信号传导通路的所述一个或多个基因选自：ITGA3、TNC、LAMC1、FLNA、TLN1、ZYX、DIAPH1及其任何组合。

41.根据权利要求38-40中任一项的方法，其中涉及内皮素信号传导通路的所述一个或多个基因选自：TRIOBP、WNK1、MMP2、VCAN、ACTA2、GNA12、EGR1及其任何组合。

42.根据权利要求38-41中任一项所述的方法，其中涉及EGF/EGFR信号传导通路的所述一个或多个基因选自：ATXN2、JAK1、RPS6KA2、ROCK1、SHC1、IQGAP1、PLCG1及其任何组合。

43.根据权利要求38-42中任一项所述的方法，其中涉及TGF-β信号传导通路的所述一个或多个基因选自：SMURF1、SPTBN1、PAK2、ROCK1、SHC1、TGFBR3、TGFBR1及其任何组合。

44.一种药物组合物，所述药物组合物包含多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；以及药学上可接受的赋形剂。

45.根据权利要求44所述的药物组合物，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

46.根据权利要求44或45所述的药物组合物，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

47.根据权利要求44-46中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

48.根据权利要求44-47中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

49.根据权利要求44-48中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

50.根据权利要求44-49中任一项所述的药物组合物，其中SEQ ID NO：32的所述截短物相对于SEQ ID NO：32包含N末端截短、C末端截短或两者。

51.根据权利要求50所述的药物组合物，其中所述N末端截短是相对于SEQ ID NO：32的50个氨基酸至750个氨基酸的N末端截短。

52.根据权利要求50或51所述的药物组合物，其中所述C末端截短是相对于SEQ ID NO：32的50个氨基酸至600个氨基酸的C末端截短。

53.根据权利要求44-52中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由其组成。

54.根据权利要求44-53中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽具有50个氨基酸至1250个氨基酸的总截短。

55.根据权利要求44-54中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽的长度为至少50个氨基酸。

56.根据权利要求44-55中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽的长度为50个氨基酸至250个氨基酸。

57.根据权利要求44-56中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽不包含以下中的一者或多者：层粘连蛋白G结构域、Von Willebrand因子A型(vWA)结构域和纤维胶原C末端结构域。

58.根据权利要求44-57中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽包含一个或多个胶原三螺旋重复。

59.根据权利要求44-58中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽为单体的。

60.根据权利要求54-59中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽不形成天然存在的胶原的稳定的三螺旋结构。

61.根据权利要求44-60中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽基本上不含其他胶原链。

62.根据权利要求44-61中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽相对于天然存在的胶原具有非天然存在的羟基化水平。

63.根据权利要求44-62中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽中存在的少于10％的脯氨酸被羟基化。

64.根据权利要求44-63中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽为非羟基化的。

65.根据权利要求44-64中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽相对于天然存在的胶原具有非天然存在的糖基化水平。

66.根据权利要求44-65中任一项所述的药物组合物，其中所述多肽包含小于5wt.％的糖基化。

67.根据权利要求66所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂选自：抗黏剂、黏合剂、涂层剂、着色剂、崩解剂、调味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、媒介物及其任何组合。

68.根据权利要求44-67中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于表面施用。

69.根据权利要求68所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为凝胶、霜剂、洗剂、油、泡沫、软膏、精华液及其任何组合。