CN1422610A - 人重组血管生成素的制备及皮肤增白产品 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种皮肤增白产品,它含有有效浓度的人血管生成素以抑制皮肤黑色素的产生。该有效浓度为总重量的0.000001%至0.1%。本发明的皮肤增白产品可用于抑制皮肤黑色素的产生,从而消除雀斑、黑斑、蝴蝶斑、老年斑、黑晕及其它由于黑色素沉着引起的皮肤异变；和/或用于消除皮肤皱纹,增加皮肤弹性,防止皮肤老化。

Description

人重组血管生成素的制备及皮肤增白产品

技术领域

本发明涉及化妆品领域。更具体地，本发明涉及一种含有人血管生成素以抑制皮肤黑色素的产生的皮肤增白产品。本发明还涉及人血管生成素的新的编码序列和重组表达。

背景技术

人血管生成素(Angiogenin)是一个由123个氨基酸组成的蛋白质[Fett JW，Strydom DJ，Lobb RR，Alderman EM，Bethune JL，Riordan JF，Vallee BL(1985)：Isolation and characterization of angiogenin，an angiogenicprotein from human carcinoma cells.Biochemistry 24：5480-6]。血管生成素存在于正常人的血液中，其含量一般为250-360ng/ml[Blaser J，Triebel S，Kopp C，Tschesche H(1993)：A highly sensitive immunoenzymometricassay for the determination of angiogenin.European Journal ofC1inical Chemistry & Clinical Biochemistry 31：513-6]。

血管生成素的主要生理功能是在特定的条件下刺激血管的生成，维持体内血管的正常功能[Riordan JF(1997)：Angiogenin.In D’Alessio G，RiordanJF(eds)：＂Ribonucleases：Structures and Functions.＂New York：Academic Press，pp 459-489]。由于体内的各种器官和组织的新陈代谢都需要血液循环来输送氧气和养料，排除废气和废料，所以血管生成素对维持体内各种组织和器官的正常生理功能有着重要的作用。

除了刺激血管生成的主要作用外，血管生成素能抑制皮肤表面的促黑细胞(Melanocyte)分泌黑色素从而有皮肤增白的作用。同时，血管生成素能促使促黑细胞，成纤维细胞(Fibroblasts)，角化细胞(Keratinocytes)及表皮细胞(Epithelial Cells)分泌胶原蛋白(Collagen)和弹性蛋白(Elastin)从而有防止皮肤老化和增加皮肤弹性的作用。

皮肤黑斑(Blotches and Freckles)，包括雀斑、蝴蝶斑、老年斑和黑晕的形成，普遍认为是由于黑色素的产生和沉着所致。而黑色素的产生是由于酪氨酸(Tyrosine)的氧化所致。酪氨酸的氧化由酪氨酸酶(Tyrosinase)的催化作用所引发。以前的实验已经证明抑制酪氨酸酶能达到抑制黑色素的产生而起到皮肤增白的作用。到目前为止，酪氨酸酶的抑制剂如Albutin，曲酸以及氢化酪蛋白(Hydrogenated Casein)都已证明有抑制酪氨酸酶的作用从而抑制黑色素的生成，它们已广泛应用于皮肤增白护肤品中。

血管生成素除了存在于正常人的血液中[Shapiro R，Strydom DJ，OlsonKA，Vallee BL(1987)：Isolation of angiogenin from normal humanplasma.Biochemistry 26：5141-6.]，还存在于牛奶中[Maes P，Damart D，Rommens C，Montreuil J，Spik G，Tartar A(1988)：The complete aminoacid sequence of bovine milk angiogenin.FEBS Letters 241：41-5.]。从牛奶中提取的牛血管生成素也有促使血管生成的活力，并且也有皮肤增白的作用(Snow Brand Milk Products Co.，Ltd：美国专利号5698185)。有人认为，牛奶对皮肤的保护作用其有效成分主要是血管生成素。

人血管生成素可以从人血浆中分离，也可以从人肿瘤细胞培养上清液中分离[Fett JW，Strydom DJ，Lobb RR，Alderman EM，Bethune JL，Riordan JF，Vallee BL(1985)：Isolation and characterization of angiogenin，anangiogenic protein from human carcinoma cells.Biochemistry 24：5480-6]。牛血管生成素可以从牛奶中分离。人血管生成素还可以由基因工程的方法制备。基因工程方法制备的人血管生成素和人体内自然产生的血管生成素相比，理化性质和生物活力完全相同[Shapiro R，Harper JW，Fox EA，JansenHW，Hein F，Uhlmann E(1988)：Expression of Met-(-1)angiogenin inEscherichia coli：conversion to the authentic less than Glu-1 protein.Analyticai Biochemistry 175：450-61.]。

血管生成素刺激血管新生的活力可以在受精鸡蛋的绒毛膜(chorioallantoic membrane)上进行。还有，血管生成素对血管内皮细胞和平滑肌细胞的作用包括刺激细胞的生长以及促使管状结构的形成都可以用来测定血管生成素的活力。

日本雪花奶制品公司(Snow Brand Milk Products Co.，Ltd.)在1994年申请了发明名称为“增白化妆品的制备和使用方法(Whitening CosmeticPreparation and Method of Using Same)”美国专利(美国专利号5698185)。该专利报道了使用从牛奶中提取的牛血管生成素粗制品达到皮肤增白的作用。虽然，使用牛血管生成素从成本上考虑是经济的。但他们仅仅得到了牛血管生成素的粗制品，作了用此粗制品抑制人皮肤黑色素瘤(Melanoma)细胞分泌黑色素的实验：并没有使用牛血管生成素的纯制品，也没有使用更具实际意义的人皮肤正常促黑细胞(Melanocytes)进行实验，更没有使用人血管生成素。在该专利中，牛血管生成素的粗制品的用量为总重量的0.001-20％。

总之，到目前为止，出于种种技术和成本等诸方面的因素，尚没有含有人血管生成素的化妆品。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种含有人血管生成素的化妆品。

本发明的另一目的是提供一种重组产生人血管生成素的方法以及相关的编码序列、载体和宿主细胞。

在本发明的第一方面，提供了一种皮肤增白产品，它含有有效浓度的人血管生成素以抑制皮肤黑色素的产生。通常，人血管生成素的有效浓度为总重量的0.000001％至0.1％或更高；较佳地，人血管生成素的有效浓度为总重量的0.000001％至0.001％：更佳地，人血管生成素的有效浓度为总重量的0.000001％至0.00001％。

在另一优选例中，所述的皮肤增白产品还含有选自下组的物质：紫外色吸收剂、紫外色散射剂、调色剂、调味剂、或其混合物。

在一优选例中，所述的皮肤增白产品中的重组人血管生成素是重组产生的，且其N-末端是甲硫氨酸，序列如SEQ ID NO：2所示。

在本发明的第二方面，提供了一种编码人血管生成素的DNA分子，它含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种产生人血管生成素的方法，它包括步骤：

(a)在适合表达人血管生成素的条件下培养宿主细胞，从而表达出人血管生成素，其中所述的宿主细胞含有表达人血管生成素的载体，所述的载体含有SEQID NO：1所示的编码人血管生成素的DNA序列，

(b)分离纯化出步骤(a)中所表达的人血管生成素。

附图说明

图1显示了本发明所使用的编码血管生成素的核苷酸序列。其中，第一行为人工合成的编码人血管生成素的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。此序列不是天然的，而是经过氨基酸序列反编码至细菌所喜爱的核苷酸序列，从而实现了高表达。第二行为人血管生成素的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。第三行为天然的人血管生成素基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。人工合成的和自然存在的人血管生成素的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)是不同的，但是它们所编码的氨基酸序列除了N-末端的第一个残基外全部相同。重组人血管生成素的N-末端多一个甲硫氨酸，功能和自然存在的人血管生成素完全一样。

图2是本发明重组人血管生成素的凝胶电泳图。其中，人重组血管生成素粗制品和经过生化方法提纯的纯品(2微克)经SDS-聚丙烯酰氨凝胶分离，考马斯亮兰染色。本发明的人重组血管生成素由箭头表示，分子量为14KD，纯度达99.9％以上。

图3显示本发明人血管生成素对抑制黑色素的生成的作用。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，通过对人血管生成素编码序列的改造，实现了人血管生成素的高效表达以及高纯度、高活力人血管生成素的分离纯化，从而大幅降低了人血管生成素的生产成本。此外，本发明还意外地发现，人血管生成素对人皮肤黑色素的抑制效果远远优于牛血管生成素，至少为后者的100倍。在此基础上，完成了本发明。

本发明的化妆品，即皮肤增白产品中的有效成分是人血管生成素，以抑制皮肤黑色素的产生。通常，在本发明的皮肤增白产品中，人血管生成素的有效浓度为总重量的0.000001％至0.1％或更高。当然，人血管生成素的浓度也可高于0.1％，因为这仍可达到抑制皮肤黑色素产生的效果。从生产成本考虑，优选的人血管生成素的有效浓度为总重量的0.000001％至0.001％，更佳地0.000001％至0.0001％，最佳地为0.000001％至0.00001％。

用于本发明的人血管生成素可以是天然或重组形式的，优选重组形式的。如本文所用，“人血管生成素”不仅包括氨基酸序列与天然人血管生成素相同的血管生成素，也包括其具有相同活性的变异形式和衍生物。在本发明的一个实施例中，提供的重组人血管生成素是重组产生的，且其N-末端是甲硫氨酸。

用于本发明的人血管生成素宜是纯化的，例如纯度大于80％，较佳地大于90％，更佳地大于95％，最佳地大于99％的人血管生成素。

在本发明的化妆品中，除了含有人血管生成素作为主要的增白有效成分外，还可以含有本领域已知的、在皮肤增白产品中常见的其他增白成分，例如Albutin、曲酸、氢化酪蛋白、牛血管生成素、或其混合物。

此外，本发明的化妆品还可包括本领域通常使用的任何添加剂，如抗氧化剂、芳香剂、香精油、稳定剂、保湿剂、维生素、必需脂肪酸、亲脂性防晒剂、脂溶性聚合物等。当然本领域技术人员应仔细选择任选的添加剂化合物和/或它们的量，使本发明人血管生成素的优点特性不受或基本不受这些添加剂的损害。

例如，本发明的化妆品可含有选自下组的紫外色吸收剂：对-甲氧基肉桂酸2-乙基己酯，2-羟-4-甲氧二苯甲酮，水扬酸-2-乙基己酯，水扬酸-3，3，5-三甲基环己酯。

所述的皮肤增白产品还含有选自下组的紫外色散射剂：氧化锌，氧化钛。

所述的皮肤增白产品还含有选自下组的调色剂：硫酸锰，硫酸镁。

所述的皮肤增白产品还含有选自下组的调味剂：香草醛，丁子香酚，香豆素，香豆酮，双缩松油酯，牦牛醇，乙酸牦牛酯，香茅醇，乙酸香茅酯，2-苯乙醇，乙酸苯乙酯，乙酸苯酯，苯甲酸苯酯。

本发明的皮肤增白产品可以被制成本领域常见的各种配方制剂形式，例如乳霜，乳液，乳膏，洗面奶，防晒霜，面膜，爽肤水，眼霜，按摩霜，护手霜或其他用于脸部、颈部、手部和身体的化妆品。

本发明的皮肤增白产品，在使用时直接涂于皮肤即可。使用本发明的化妆品时，人血管生成素(特别是使用基因工程通过核糖核酸技术生产的高纯度高活力的重组人血管生成素)作用于正常人皮肤促黑细胞，从而达到消除黑斑、雀斑、蝴蝶斑、老年斑、黑晕和皮肤增白的作用。此外，还可消除皮肤皱纹，增加皮肤弹性，防止皮肤老化。

本发明还提供了一种人血管生成素的生产方法，它包括步骤：

(a)在适合表达人血管生成素的条件下培养宿主细胞，从而表达出人血管生成素，其中所述的宿主细胞含有表达人血管生成素的载体，所述的载体含有SEQID NO：1所示的编码人血管生成素的DNA序列，

(b)分离纯化出步骤(a)中所表达的人血管生成素。

在一优选例中，所用的编码人血管生成素的DNA分子是根据选用的宿主细胞的密码子偏爱性进行改造过的。一种具体的编码序列如SEQ ID NO：1和图1所示。

本发明的编码人血管生成素的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。然后，与合适的表达载体相连接，转入合适的宿主细胞，从而在细胞内表达、或分泌到细胞外。

表达后，可利用物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、超过滤、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

利用本发明的改造过人血管生成素编码序列和生产工艺，不仅可实现人血管生成素的高表达，还可分离制备高纯度(99％)、高活力(活力检测低限：1ng/ml)人血管生成素，从而大幅降低生产成本。

利用本发明提供了高纯度人血管生成素，对皮肤细胞所进行的实验表明，本发明的人血管生成素对黑色素生成的抑制作用大大高于已知的几个酪氨酸酶的抑制剂。而且，出乎意料的是，本发明的人血管生成素对人皮肤黑色素的抑制效果远远优于牛血管生成素，至少为后者的100倍。此外，本发明的人血管生成素对于人类皮肤没有副作用。

本发明的具有以下优点：

(1)使用人体内自然存在的血管生成素，所以没有副作用，对正常人皮肤没有刺激和不良反应。

(2)使用基因工程的手段生产高纯度、高活力的血管生成素，有用量少，见效快的优点，并可以通过重组核糖核酸的技术用点突变的方法改良人血管生成素而生产更高活力的制剂。

(3)使用人皮肤的正常促黑细胞作为实验对象。和日本雪花奶制品公司使用的黑色素瘤细胞不同的是正常促黑细胞所分泌的黑色素才是形成黑斑、雀斑、蝴蝶斑、老年斑、和黑晕的原因。因此，本发明所提供的数据和实验结果更具现实意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

实施例1.

人血管生成素的基因表达

在本实施例中，根据人血管生成素的氨基酸序列，用化学合成方法合成其编码核苷酸序列。考虑到基因工程所使用的菌株的特异性，在设计编码核苷酸的过程中使用了大肠杆菌B21细胞所喜爱的密码子。获得的人血管生成素编码序列如SEQ ID NO：1和口图1所示。

图1列出了用于本发明的编码人血管生成素的核苷酸序列。本发明所使用的核苷酸序列和人类天然的编码血管生成素的基因序列(SEQ ID NO：3和图1)是不同的。然而，他们所编码的蛋白的氨基酸序列(SEQID NO：2和图1)是一样的。使用本发明设计的血管生成素的核苷酸序列，用基因工程的手段，在细菌内能得到高表达的血管生成素。

由此合成的血管生成素的基因被组建到pET11的表达载体(Stratagene)中得到pET11-Ang。因为pET11含有噬菌体T7启动子，所以可以在含有T7 RNA合成酶(T7 RNA Polymerase)的基因的宿主中如BL21细菌中表达。而此表达是由lacZ调控子由IPTG诱导的。

本发明所提供的人血管生成素的基因表达的步骤如下：

(1)在LB-氨苄青霉素平板中挑出pET11-Ang的单个菌落，接种于50毫升含有50mg/ml氨苄青霉素的培养基中，于37℃振摇过夜。

(2)于1升2xYT培养基中，加入10毫升上述细菌种液，于37℃振摇直到在600nm的光吸收值达到20D左右。

(3)于此1升细菌培养液中，加入10毫升0.1M的IPTG诱导血管生成素的表达，于37℃继续振摇3小时。

(4)在此表达体系中表达的蛋白是以包含体的形式存在，所以用离心的方法在7000rpm的速度下离心10分钟。

(5)收集的细菌重新悬浮在80毫升的TS溶液中(20mM Tris-HCl，pH7.6，10％蔗糖，加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度2.5mM)。

(6)加入1.5毫升0.5当量的EDTA，3毫升5当量的NaCl，和4毫升2mg/ml的溶菌酶(Lysozyme)使细菌破裂释放包含体。

(7)超声波处理进一步裂解细菌。在12000rpm转速下离心20分钟收集含有血管生成素的包含体，保存于-80℃低温冰箱中。

实施例2.

人血管生成素的生化提纯

在实施例中，用生物化学的方法提纯实施例1中用基因工程技术表达的血管生成素。此提纯方法，经适当改良，同样适用于从其它材料包括人血浆，牛奶和肿瘤细胞分泌液中提取血管生成素。

(1)上述表达制备的含有血管生成素的包含体用7当量的盐酸胍溶解，进一步超声处理后，加入2-巯基乙醇(0.7％终浓度)并于37℃保温3小时使二硫键彻底打开。

(2)慢慢加上述肽链完全伸展的血管生成素的盐酸胍溶液稀释加到100倍体积的肽链重新折叠溶液中(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH8.5)，在4℃静置保温8小时，然后搅拌过夜。

(3)在17000rpm的转速下离心30分钟去掉沉淀。上清通过孔径为0.45mM的滤膜过滤。

(4)通过YM3超滤膜在20psi的压力下超滤浓缩(此步骤可省略，若如此，下一步上柱时间将大大延长)。

(5)通过SP-Sepharose柱层析去除酸性物质。SP-Sepharose柱平衡在50mMTris-HCl，pH8.0，0.15M NaCl的溶液中。每升培养液大约需要10ml的柱子。如果使用直径为3cm的柱子，上柱速度可达每分钟3毫升。

(6)血管生成素粗制品可用50mM Tris-HCl，0-1M氯化钠的30分钟线性梯度洗脱，分部收集，于280nm下自动检测光吸收。血管生成素大概于0.6-0.7M NaCl浓度下被洗脱。

(7)用Mono-S快速液相色谱柱进一步提纯血管生成素。Mono-S柱平衡于10mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，pH 8.0中，用0-1 M NaCl的20分钟线性梯度洗脱。

(8)用反相高压液相色谱法用C-18柱得到高纯度的血管生成素。C-18柱平衡在含有30％有机相的0.1％三氟醋酸(TFA)中。有机相为异丙醇∶乙腈∶H₂O(3∶2∶2，v/v)，0.08％TFA。血管生成素的洗脱条件为30-50％有机相的线性梯度。在常规的C18柱上，血管生成素一般在40％有机相下被洗脱。

(9)反复冷冻干燥去除残留的三氟醋酸，制成血管生成素的干粉。

图2显示用此法提纯的血管生成素的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。其中，人重组血管生成素粗制品和经过生化方法提纯的纯品(2微克)经SDS-聚丙烯酰氨凝胶分离，考马斯亮兰染色，人重组血管生成素由箭头表示，分子量为14KD，纯度达99.9％以上。

此外，本实施例中，人重组血管生成素的产量为15-20毫克/升发酵液，远远高于常规的约1-2毫克/升发酵液的表达水平。

实施例3.

血管生成素的活力测定

在本实施例中，测试了实施例2获得的血管生成素对正常人促黑细胞分泌黑色素的抑制作用。

(1)正常人促黑细胞从美国Clonetics公司购入，培养于由此公司提供的专门培养基中。培养条件为37℃恒温恒湿，5％二氧化碳气相。每二天换一次培养基，以1∶3的比率传代培养。

(2)贴壁生长的促黑细胞用胰蛋白酶-EDTA消化，离心收集细胞，悬浮于完全培养基中，以每孔30000个细胞的密度种于96孔细胞培养板中。

(3)每孔加入不同浓度的待测样品(不同浓度的人血管生成素或牛血管生成素)，于上述的培养条件下在37℃保温。

(4)定期(每天)在490nm测定光吸收，计算黑色素的分泌量以及血管生成素的抑制效果。

图3显示出人血管生成素非常有效地抑制人正常促黑细胞分泌黑色素。在10ng/ml的浓度下(相当于0.000001％)，人血管生成素就完全抑制了黑色素的分泌。然而，在十倍的浓度下，纯牛血管生成素的抑制效率只有26％。所以，人血管生成素抑制黑色素的分泌比牛血管生成素要高起码100倍。在本实施例中所使用的牛血管生成素是从牛奶中分离的纯制品，其纯度要大大高于日本雪花奶制品公司申请的美国专利(US专利5698185)中所用的牛血管生成素粗的制品。所以，与现有的用于化妆品的牛血管生成素粗制品相比，本发明人血管生成素的抑制黑色素产生的效果将更佳。

实施例4.含有人血管生成素的皮肤增白产品的配制

在本实施例中制备了几种含有人血管生成素的皮肤增白产品。其中，不同有效浓度(0.000001％-0.001％)的人血管生成素可以加到各种化妆品和皮肤保健品中而得到系列具有皮肤增白作用的产品。

(1)皮肤增白油性乳液

乳液A(人血管生成素浓度为0.000001％)

成分	含量
		水	70.0g
乙醇	20.0g
		甘油	5.0g
山梨醇	4.0g
		聚氧乙烯硬化海狸油衍生物	0.5g
尿囊素	0.1g
		香料	适量
人血管生成素	0.000001g

乳液B(人血管生成素浓度为0.001％)

成分	含量
		水	70.0g
乙醇	20.0g
		甘油	5.0g
山梨醇	4.0g
		聚氧乙烯硬化海狸油衍生物	0.5g
尿囊素	0.1g
		香料	适量
人血管生成素	0.001g

(2)皮肤增白干性乳液(人血管生成素浓度为0.00001％)

成分	含量
		水	70.0g
乙醇	20.0g
		乙二醇	2.5g
丙二醇	5.0g
		聚氧乙烯单月桂山梨聚糖	1.2g
尿素	1.2g
		e-己氨酸	0.1g
香料	适量
		硅胶	0.0001g
人血管生成素	0.00001g

(3)皮肤增白油性乳霜(人血管生成素浓度为0.00001％)

成分	含量
		水	28.0g
液态石蜡	25.0g
		蜂蜡	10.0g
三十碳六烯	8.0g
		石蜡	6.0g
异丙肉豆蔻酸酯	6.0g
		尿素	5.0g
单硬脂酸山梨聚糖	4.2g
		羊毛脂	3.0g
聚氧乙烯单硬脂酸山梨聚糖	2.0g
		乙二醇	2.0g
硼	0.8g
		香料	适量
人血管生成素	0.00001g

(4)皮肤增白洗面奶(人血管生成素浓度为0.00001％)

成分	含量
		水	56.0g
硬脂酸	20.0g
		肉豆蔻酸	10.0g
氢氧化钾	5.5g
		月桂酸	5.0g
甘油	2.5g
		聚氧乙烯月桂醚	1.0g
香料	适量
		人血管生成素	0.00001g

(5)皮肤增白防晒霜

(人血管生成素浓度为0.00001％)

人血管生成素可以加到各种含有紫外色吸收剂和紫外色散射剂的防晒霜中而制成具有皮肤增白作用的产品。下表所举配方例子SPF高达40以上，并有强烈增白效果。

水	45.0g
		软脂酸异丙酯	17.5g
甘油	11.0g
		对-甲氧基肉桂酸2-乙基己酯	7.5g
水扬酸-2-乙基己酯	6.5g
		硬脂酸山梨聚糖	5.0g
氧化锌	5.0g
		1，2-丙二醇	2.0g
苯乙酯	0.5g
		香料	适量
人血管生成素	0.00001g

上述各产品经自愿者试用后，均有增白效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                  序列表<110>上海福缘生化药学研发有限公司<120>人重组血管生成素的制备及皮肤增白产品<130>016833<160>4<170>Patentln version 3.0<210>1<211>378<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(372)<220><221>misc_feature<223>人工合成的人血管生成素的编码序列<400>1atg cag gac aac tcg agg tat aca cat ttc ctg acc cag cac tat gac    48Met Gln Asp Asn Set Arg Tyr Thr His Phe Leu Thr Gin His Tyr Asp1               5                   10                  15gct aaa ccg cag ggc cgg gac gat cgt tac tgc gaa tcg att atg aga    96Ala Lys Pro Gln Gly Arg Asp Asp Arg Tyr Cys Glu Ser Ile Met Arg

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            85                  90                  95gct act gcc ggc ttc cgt aat gtt gtg gtt gct tgt gaa aac ggt ctg    336Ala Thr Ala Gly Phe Arg Asn Val Val Val Ala Cys G1u Asn Gly Leu

        100                 105                 110cca gtc cat cta gat cag tct atc ttc cga agg cct taatag             378Pro Val His Leu Asp Gln Ser Ile Phe Arg Arg Pro

    115                 120<210>2<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO：1核苷酸序列所编码的氨基酸序列<400>2Met Gln Asp Asn Ser Arg Tyr Thr His Phe Leu Thr Gln His Tyr Asp1               5                   10                  15Ala Lys Pro Gln Gly Arg Asp Asp Arg Tyr Cys 6lu Set Ile Met Arg

        20                  25                  30Arg Arg Gly Leu Thr Ser Pro Cys Lys Asp Ile Asn Thr Phe Ile His

    35                  40                  45Gly Asn Lys Arg Ser Ile Lys Ala Ile Cys Glu Asn Lys Asn Gly Asn

50                  55                  60Pro His Arg Glu Asn Leu Arg Ile Ser Lys Ser Set Phe Gln Val Thr65                  70                  75                  80Thr Cys Lys Leu His Gly Gly Ser Pro Trp Pro Pro Cys Gln Tyr Arg

            85                  90                  95Ala Thr Ala Gly Phe Arg Asn Val Val Val Ala Cys Glu Asn Gly Leu

        100                 105                 110Pro Val His Leu Asp Gin Ser Ile Phe Arg Arg Pro

    115                 120<210>3<211>375<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(369)<400>3cag gat aac tcc agg tac aca cac ttc ctg acc cag cac tat gat gcc    48Gln Asp Asn Ser Arg Tyr Thr His Phe Leu Thr Gln His Tyr Asp Ala1               5                   10                  1588a cca cag ggc cgg gat gac aga tac tgt gaa agc atc atg agg aga    96Lys Pro Gln Gly Arg Asp Asp Arg Tyr Cys Glu Ser Ile Met Arg Arg

        20                  25                  30cgg ggc ctg acc rca ccc tgc aaa gac arc aac aca ttt att cat ggc    144Arg Gly Leu Thr Ser Pro Cys Lys Asp Ile Asn Thr Phe Ile His Gly

    35                  40                  45aac aag cgc agc arc aag gcc atc tgt gaa aac aag aat gga aac cct    192Asn Lys Arg Ser Ile Lys Ala Ile Cys Glu Asn Lys Asn Gly Asn Pro

50                  55                  60cac aga gaa aac cta aga ara agc aag tct tct ttc cag gtc 8cc act    240His Arg Glu Asn Leu Arg Ile Ser Lys Ser Ser Phe Gln Val Thr Thr65                  70                  75                  80tgc aag cra cat gga ggt tcc ccc tgg cct cca tgc cag tac cga gcc    288Cys Lys Leu His Gly Gly Ser Pro Trp Pro Pro Cys Gln Tyr Arg Ala

            85                  90                  95aca gcg ggg ttc aga aac gtt gtt gtt gct tgt gaa aat ggc tta cct    336Thr Ala Gly Phe Arg Asn Val Val Val Ala Cys Glu Asn Gly Leu Pro

        100                 105                 110gtc cac ttg gat cag rca att ttc cgt cgt ccg taacca                 375Va1 His Leu Asp Gin Ser Ile Phe Arg Arg Pro

    115                 120<210>4<211>123<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Gin Asp Asn Set Arg Tyr Thr His Phe Leu Thr Gin His Tyr Asp Ala1               5                   10                  15Lys Pro Gln Gly Arg Asp Asp Arg Tyr Cys Glu Ser Ile Met Arg Arg

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    35                  40                  45Asn Lys Arg Ser Ile Lys Ala Ile Cys Glu Asn Lys Asn Gly Asn Pro

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            85                  90                  95Thr Ala Gly Phe Arg Asn Val Val Val Ala Cys Glu Asn Gly Leu Pro

        100                 105                 110Val His Leu Asp Gln Ser Ile Phe Arg Arg Pro

    115                 120

Claims (10)

1.一种皮肤增白产品，其特征在于，它含有有效浓度的人血管生成素以抑制皮肤黑色素的产生。

2.如权利要求1所述的皮肤增白产品，其特征在于，人血管生成素的有效浓度为总重量的0.000001％至0.1％。

3.如权利要求1所述的皮肤增白产品，其特征在于，人血管生成素的有效浓度为总重量的0.000001％至0.001％。

4.如权利要求1所述的皮肤增白产品，其特征在于，人血管生成素的有效浓度为总重量的0.000001％至0.00001％。

5.如权利要求1所述的皮肤增白产品，其特征在于，所述的皮肤增白产品被直接涂于皮肤。

6.如权利要求1所述的皮肤增白产品，其特征在于，所述的皮肤增白产品包括以下配方制剂：乳霜，乳液，乳膏，洗面奶，防晒霜，面膜，爽肤水，眼霜，按摩霜，护手霜。

7.如权利要求1所述的皮肤增白产品，其特征在于，所述的皮肤增白产品还含有选自下组的物质：紫外色吸收剂、紫外色散射剂、调色剂、调味剂、或其混合物。

8.如权利要求1所述的皮肤增白产品，其特征在于，重组人血管生成素是重组产生的，且其N-末端是甲硫氨酸，序列如SEQID NO：2所示。

9.一种编码人血管生成素的DNA分子，其特征在于，它含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

10.一种产生人血管生成素的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)在适合表达人血管生成素的条件下培养宿主细胞，从而表达出人血管生成素，其中所述的宿主细胞含有表达人血管生成素的载体，所述的载体含有SEQID NO：1所示的编码人血管生成素的DNA序列，

(b)分离纯化出步骤(a)中所表达的人血管生成素。

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